分子生物学技术（一）

医学实验教学中心

王松梅

东5号楼405室

smwang2@fudan.edu.cn

基因工程

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第一节

基因工程(Genetic Engineering)概述

3

4

基因工程 (genetic engineering)

定义：是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。

目的:是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗传。

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基因工程的重要特征：

1、可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状

2、某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能

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基因工程所采用的基本技术： DNA体外重组技术（in vitro DNA recombination technology） 又称基因克隆（gene cloning） 或分子克隆（molecular cloning）技术

什么是重组DNA技术？

重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）

是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行剪切和拼

接，形成重组分子，再将重组分子导入受体细胞，

使其在细胞中扩增，以获得该DNA的大量拷贝。

重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。

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载体

目的基因

重组体

表达 表达产物的分离鉴定 大量生产

基因工程的基本过程

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酶切

连接

导入受体细胞 扩增、抽提和鉴定

重组DNA技术的基本步骤

①目的DNA的获得与载体的制备；

②目的DNA与载体的连接；

③重组DNA导入受体细胞；

④重组DNA的筛选和鉴定；

⑤目的DNA的表达及表达产物的检测与分离纯化。

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重组DNA技术的四大要素

目的DNA

载体（Vector）

工具酶

宿主细胞

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要把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：

1、准确切割DNA分子的工具（“分子手术刀”）

------限制性内切酶

2、DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）

------DNA连接酶

第二节 工具酶

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1、限制性核酸内切酶------ “分子手术刀”

限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease, RE）：

是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列并将

其切断的核酸水解酶。

GGATCC CCTAGG

G CCTAG

GATCC G

+

BamHⅠ

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命名：

EcoRI：

E＝Escherichia属

co＝coli种

R＝RY13株

I＝该菌株第一个被发现的核酸内切酶

分类: I、II、III（重组DNA技术中常用II型）

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限制性核酸内切酶的类型和主要特征

特性 I 型 II 型 III 型

结构 三种不同的亚基

组成

单一的同源二

聚体

两种不同的亚

基构成

辅助因子 Mg2+、SAM、ATP Mg2+ Mg2+、SAM、ATP

限制和修饰活性 单一的多功能酶 分别具有限制

酶和修饰酶

一种共同亚基

的双功能酶

识别序列 呈滚环形式 呈回文结构 呈滚环形式

切割位点 无固定 特异 距识别位点一

侧约 25bp处

切割特点 随机切割 特异切割 特异切割

甲基化作用位点 宿主特异位点 宿主特异位点 宿主特异位点

在分子克隆中的

用途 无用 十分有用 意义不大

识别序列特点—— 回文结构(palindrome)

即反向重复结构

每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切

割的特异序列，称为限制性位点或切点（多为4~6bp）。

识别序列：

GGA TCC CCT AGG

BamHⅠ

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Bam HⅠ

CCC GGG

G CCTAG

GATCC G

+

GGATCC CCTAGG

Sma I

CCCGGG GGGCCC

GGG CCC +

平末端（Blunt end）：

对称轴切割

粘性末端（Sticky end）：

交错切割

切口：平端切口、粘端切口

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切割位点和切割片段的末端：

平末端 粘性末端：5’粘性末端 3’粘性末端

如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，

产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的

DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。

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2、DNA连接酶------ “分子缝合针”

DNA连接酶（DNA Ligase）：

催化两条DNA链的3´-OH和5´-P之间形成磷酸二酯键

而把两个DNA分子连接在一起。例如:T4 DNA连接酶。

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20

DNA连接酶（T4 DNA ligase）：

基本活性:

1）修复双链DNA上单链缺口

2）连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺口

3）连接完全断开两个平头双链DNA分子。

反应温度：

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1. DNA聚合酶I：

5’ → 3’聚合酶活性

3’ → 5’外切酶活性

5’ → 3’外切酶活性

3、 DNA聚合酶（DNA polymerase ）

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2. Klenow酶

5’ → 3’聚合酶活性

3’ → 5’外切酶活性

作用：

1）修复限制性内切酶造成3’凹端，成为平末端。

2）探针DNA的标记

3）催化第二链合成

4）测定DNA序列

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3. Taq DNA聚合酶：

4. 逆转录酶（reverse transcriptase）：

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末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）

（terminal transferase，TdT）： 1） 适合于带有3’游离羟基的双链分子。

2) DNA双链3’端突出时，TdT将脱氧核苷酸聚合在两条链的3’端。

作用：TdT在人工粘性末端的构建极为有用。

核酸外切酶exoIII：

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）：

4、 DNA片段末端修饰酶：

重组DNA实验中常见的主要工具酶

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第三节 常用的目的基因制备方法：

1.聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）：

2.反转录PCR（retrotranscription PCR, RT－PCR）：

3.基因文库筛选：

基因组文库：

cDNA文库：

4.化学合成：

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Denaturing Template DNA

Heat causes DNA strands to separate

3′

5′

5′

3′

Denaturation of DNA at 94oC

5′

3′

3′

5′

PCR

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Annealing Primers

•Primers bind to the template sequence

•Taq polymerase recognizes double-stranded substrate

3′

5′

5′

3′

Primers anneal at 55oC

3′

5′

5′

3′ 3′ 5′ 3′ 5′

PCR

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3′ 5′ 3′

Taq polymerase extends......

3′

5′ 5′

Extend at 72oC

5′

3′

•Taq polymerase extends primer

•DNA is replicated

Repeat denaturing, annealing, and extending 30 cycles

5′ 3′ 5′ 3′

3′

5′

5′

3′

PCR

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RT-PCR

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基因文库的筛选

基因组DNA文库 （Genomic DNA library）:

是指汇集某种生物全部遗传信息（基因组DNA中所有

序列信息）的重组DNA分子的克隆总和，就称为该生物基因

组DNA文库。

cDNA文库 （Complementary DNA library）:

是指含有某种生物体全部cDNA的随机片段的重组DNA

克隆群体。

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基因组文库 cDNA文库

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第三节 载体（Vector)和宿主细胞

载体（Vector)

一个目的基因DNA片段只有与适合的载体

(vector)DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，

才可以高效率地进入宿主细胞(host cell)，并在其中

复制及表达。 可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或

酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。

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载体应当具备的条件

（1）能自主复制。容易获得大量的重组的DNA分子；

（2）具有合适的外源DNA插入的位点（克隆位点或限制性内切酶的切点）。便于接纳不同的DNA片段。

（3）具备可供选择的遗传标记。便于进行重组体筛选和鉴定。

（4）载体本身应尽量小。不含或尽量少含多余的DNA

部分，这样可以容纳较大的外源DNA。

（5）在宿主细胞内的稳定性高。

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载体（Vector）的分类：是指能运载外源性DNA

克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被扩

增而特意设计的载体。复制起始点、多克隆位点、选择标记

表达载体(expression vector)：为使插入的外源DNA序列

可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。复制起始点、多克隆位点、选择标记、启动子、终止子、翻译信号、调控序列

（1）按功能分类：

35

36

克隆载体

复制起始位点

多克隆位点

筛选标记

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表达载体

（2）按受体细胞类型分类：

原核细胞载体： 质粒、噬菌体等 真核细胞载体： 哺乳动物细胞载体：

• SV40衍生载体 • 逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关载体 • 痘苗病毒载体

酵母细胞的载体： 昆虫细胞的载体： 植物细胞载体

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质粒(plasmid):

是存在于细菌染

色体外的小型环状双

链DNA分子。大小约

为数千碱基对。常有

1-3个抗药性基因，

以利于筛选。

39

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1. 三种分子构型：

线性

环状

超螺旋

cccDNA（covalently closed circular double-stranded DNA）

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2.质粒的复制类型

• 两种不同的复制型： “严紧型” (stringentplasmid) “松驰型” (relaxedplasmid) • 质粒拷贝数的定义： 每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目

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3. 不相容性

4. 复制型质粒和表达型质粒

复制型质粒：只能在细胞中进行复制而不能表达

表达型质粒：除能进行复制外还能进行表达

5. 优缺点

优点： 1) 分子量小，容易操作

2)大多有抗药性标记

3)易导入宿主细胞

缺点：插入外源基因的片段不能太大

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pBR322质粒的物理图谱

44

pUC18质粒的物理图谱

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噬菌体和粘性质粒 外源基因的容量大， 常用于构建真核生物基因组文库

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宿主细胞

原核：细菌：大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等 真核：酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞等

大肠杆菌应具备以下性能： 感受态细胞 限制性内切酶缺陷型 DNA重组缺陷型 符合安全标准

第四节 目的基因和载体的体外连接

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1. 同一限制性内切酶切点的连接

（一）粘性末端连接

GGATCC

CCTAGG GGATCC

CCTAGG

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目的基因插入方向不确定

49 碱性磷酸酶防止载体的自身环化

2. 双酶切片段的定向克隆

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（二）. 平端连接

适用于：① 限制性内切酶作用产生的平端

② 粘端经特殊酶处理变为平端

51 目的基因插入方向不确定

Sma I

EcoR I

EcoR I 和Sma I双酶切

连接

Sma I EcoR I

Sma I EcoR I

Sma I EcoR I

EcoR I Sma I

EcoR I 和Sma I

双酶切

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（三）. 粘－平末端的连接

定向克隆

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（四） 某些特殊的限制性酶切片段的连接

1. 某些同尾酶切割后的片段或着不同的平端酶切割后的片段之间也可以进行连接，但是连接后原有的酶切位点可能消失。

2. 末端不匹配的DNA片段可以经过一定的处理后进行连接

–同聚物加尾连接

–人工接头

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目的基因与载体DNA的同聚物加尾连接

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利用人工接头（linker）连接

第五节 将重组DNA分子导入宿主细胞

宿主细胞 导入方法

大肠杆菌 CaCl2 、电击、体外包装感染

酵母 完整细菌转化、原生质转化、电击

哺乳动物细胞 显微注射、电穿孔、磷酸钙共沉淀、病毒感染、脂质体、原生质、微细胞

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（一）、转化(transformation)：

最常用的最有效的基因克隆方法之一。

细菌转化是指一种细菌菌株捕获了来自体外的另一种生物的DNA片段，从而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。

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1．CaCl2转化法：

感受态（competent）细胞：细菌一般都是在

进入了一种叫做感受态(competence)的特殊生理状态时，才能够捕获外源的DNA。 生长中的大肠杆菌在0℃下加入到低渗的氯化钙溶液中，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取DNA的能力。 转化效率：105-106转化子/mg环状DNA

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2. 电击法，又叫电穿孔法(electroporation)

一般转化效率可达109～1010 操作简单，成本高

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用于以lDNA、粘尾质粒或病毒为载体构建的重组DNA分子导入宿主细胞

效率高于CaCl2转化法

（二）、感染(infection)：

61

l噬菌体DNA体外包装感染法

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（三）、转染(transfection):

指真核细胞主动摄取或被动导入外援DNA片段而获得新的表型的过程

第六节 目的基因的筛选和鉴定

步骤：筛选出转化菌 筛选出带有重组体的克隆 对DNA重组体进行鉴定

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（一） 筛选出转化菌

利用载体上的遗传学标记如抗生素抗性基因

能生长出的细菌就是已转化的细菌

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（二） 筛选出带有重组体的克隆

插入灭活法(insertion inactivation)：

适用于具有两个或两个以上选择标记的质粒 如: pBR322的双抗生素抗性标记 pUC18的蓝-白斑筛选

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66

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宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同

时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ

基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操

纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。 68

X-gal 蓝色化合物

X-gal

β-半乳糖苷酶

IPTG

69

pUC18的蓝-白斑筛选

70

71

2. 插入表达法： 如：pTR262质粒

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3. 遗传互补法：

重组体在宿主细胞中的表达产物可弥补宿主细胞的营养代谢缺陷 外源基因导入哺乳动物细胞后的阳性克隆筛选常用此方法 如HAT培养基选择出tk基因转染的tk-细胞

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4. 噬菌斑形成实验：

噬菌体包装外源DNA分子后重组分子的长度为其野生型的 75％-105％时，能形成有活性的噬菌体颗粒

（三）对DNA重组体进行鉴定

核酸水平上的检测

1. 质粒大小与酶切图谱鉴定： 提取重组质粒后直接进行琼脂糖凝胶电泳或经限制性内切酶酶切后进行琼脂糖凝胶电泳

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2. 核酸探针杂交法：

菌落（噬菌斑）原位杂交（spot hybridization）:

需有针对目的片段的特异探针

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3. PCR技术：

引物

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4. DNA序列测定：是检测插入载体的外源基因是否正确的最确凿证据

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（一）体外表达系统 包括： 目的基因 表达载体 宿主细胞

第七节 克隆基因的表达

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（二）、体外表达过程 1．DNA复制及重组体的筛选 载体的复制起始位点(ori) 筛选标记（如抗药性基因） 穿梭载体 2．目的基因的转录 启动子 阻遏物基因 转录终止子 3．蛋白质的翻译 核糖体识别位点（SD顺序） 翻译起始密码子：通常为ATG 终止密码子

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（三）、克隆基因在大肠杆菌中的表达

宿主细胞 原则 易于进行重组体筛选。 遗传稳定性高，易于培养或发酵。 利于外源蛋白表达产物积累。 宿主细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性。 无致病性。 具有好的转译后加工机制。

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1、目的基因

目的基因处于正确的阅读框架

目的基因，尤其是基因编码序列的5’端使用偏倚密码子更能提高表达效率

表达真核基因时应注意：

使用大肠杆菌启动子 真核基因必须置于载体的SD序列下 使用cDNA 不含信号肽编码序列 当影响产物的活性时应选用真核系统表达

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2、载体的选择

强的启动子，可诱导 强的终止子 好的核糖体结合位点：SD序列、ATG 目的基因插入位点 筛选标记

必要条件

根据位点构造不同，表达载体可分为：

完整蛋白表达载体 融合蛋白表达载体

83

一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的形体图

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BamHI EcoRI NheI 6His- stop HindIII

Plpp lac operator RBS—ATG—OmpA signal—MCS—

融合蛋白表达载体

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3、外源蛋白表达形式

1）. 包涵体颗粒

优点： ※ 表达载体构建简单 ※ 表达量高 ※ 可表达对宿主细胞有毒或有致死作用的蛋白质 ※ 能避免细胞内蛋白水解酶的作用 ※ 有利于目的蛋白的富集和分离纯化

缺点： ※ 要用变性剂溶解，再复性才能得到溶解性蛋白质 ※ 处理后的蛋白质不一定能完全恢复生物学活性 ※ 处理工艺使蛋白质制备成本上升

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2）. 可溶性形式

可避免包涵体复性带来的问题 缺陷：需二硫键形成来维持构象的蛋白质

往往无法正确折叠 分离纯化过程较复杂 被蛋白酶降解

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3）. 融合蛋白（fusion protein）

表达的蛋白质或多肽的一部分由载体DNA编码， 一部分由克隆的外源DNA编码

优点： ※ 稳定 ※ 如果载体编码的是一段信号肽，则可产 生分泌型表达产物 ※ 可用亲和层析纯化表达产物 ※ 用蛋白酶切获得表达产物

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GST融合蛋白表达载体pGEX 89

4）.分泌型蛋白

外源蛋白可分泌到细菌细胞的周质空间或直接分泌到培养基中 可避免表达产物的降解 方便纯化表达产物

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原核宿主(E.coli)表达真核基因或原核基因

需要的基本元件：

1.完整的编码基因，无内含子，5’有ATG，3’有终止信号

2.原核启动子：控制基因表达(如PL，PR)，SD顺序

3.信号肽编码顺序：分泌表达产物

局限性：

1.无糖基化和组装二硫键等翻译后加工系统

2.无剪切内含子等转录加工系统

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（四）、真核细胞表达系统表达外源基因

真核表达系统包括： 酵母表达系统 昆虫表达系统

哺乳动物细胞表达系统

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真核宿主表达系统的基本元件：

1.编码基因可含内含子 ， 5’ATG ， 3’终止和加尾信号

2.真核启动子: 如 SV40 ，CMV ，LTR

3.信号肽

4.筛选基因的转录单位

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优点：内含子可被自动剪切，并成功表达蛋白质 外源蛋白可被正确地翻译后加工

缺点：外源基因导入宿主细胞的效率低 外源基因表达水平低 细胞培养要求高，大量生产困难，成本高，操作条件复杂

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真核宿主表达外源基因

第八节 外源蛋白表达产物的鉴定

利用蛋白质表达产物的分子量大小及其抗原性

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（一） SDS－PAGE：

蛋白质溶液中加入SDS和还原剂

蛋白质－SDS复合物在凝胶中的迁移速率只与分子量大小有关

用于外源蛋白有足够的表达量的时候

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（二）、Western blot

标记抗体与固定在膜上的蛋白作用。

根据信号强弱判断蛋白表达强度。

根据信号位置判断蛋白分子量。

标准分子量 蛋白

特异性反应带

（三） ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）：

（四） 固相放射免疫测定：

（五） 免疫沉淀反应：

（六） 放射免疫沉淀法：

（七） 表达产物的生物学活性检测：

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第九节、基因工程在医学中的的应用

1. 用于生产蛋白质类药物

2. 用于疫苗生产

3. 用于基因治疗

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胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰

岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，一名糖尿病患者每年需用的胰岛素需要从40头牛或50头猪的胰脏中才能提取到。

1982年，美国Genetech公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，是第一个上市的基因工程药物。

• 基因工程药品 —— 胰岛素

100

治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而

生长激素的获得很困难。治疗一名侏儒症患者每年需要从80具尸体的脑下垂体中提取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。

• 基因工程药品 —— 生长激素

101 生产hGH-分泌到周质空间

传统疫苗存在许多缺点：生产过程需大量繁殖病原体，对工作人员健康造成很大威胁；病原体的减毒、灭活有可能不够彻底，导致接种者直接感染。 基因工程疫苗：将起关键作用的、序列保守的蛋白质基因重组到细菌或真核细胞内，生产蛋白质，制作成疫苗。它不使用病原体本身，所以安全，还可以把不同病原体的抗原基因重组到同一受体细胞，生产多价疫苗。

• 基因工程药品 —— 基因工程疫苗

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• 基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达

产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。

是指是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，

达到治疗疾病的目的。

患半乳糖血症的患者，由于细胞内半乳糖苷转移酶

基因缺陷而缺少半乳糖苷转移酶，使过多的半乳糖在体内积聚，引起肝、脑等功能受损。

1971年，美国科学家在体外做了试验，用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患者的离体组织细胞，结果发现这些组织细胞能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的方法治疗这种遗传病是可能的。

103

首例基因治疗的受益者（美国1990年）

到1998年底，世界范围内累计3134人接受了基因转移试验

104

用显微注射法产生转基因小鼠

105

利用转基因羊在乳汁中生产重要的转基因蛋白

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谢谢大家！