Revista Científica Agropecuaria 12(2): 71-84 (2008) © 2008 Facultad de Ciencias Agropecuarias - UNER

CARACTERIZACIÓN DE SEMILLAS DE Pinus elliottii Engelm. A TRAVÉS DE VARIABLES FÍSICAS Y RADIOGRÁFICAS*

Adriana SALINAS1; Roque CRAVIOTTO2; Vilma BISARO1; Sabina FERRARI1; Carina

GALLO2; Mirian ARANGO2; Judith SEGUETTI1

1Facultad de Ciencias Agrarias – CIUNR, UNR. C.C. 14. C.P. (S 2125 ZAA), Zavalla, Santa Fe, Argentina 2INTA Oliveros, Ruta 11, km 353. C.P. (2206), Oliveros, Santa Fe. Argentina RESUMEN

P. elliottii no es una especie nativa de Argentina, pero presenta una gran adaptabilidad y plasticidad; es cultivada en la región centro-norte de nuestro país. Es utilizada en carpintería, en la construcción y para obtener pulpa de celulosa y resinas. Los rayos X son una herramienta útil para la estimación de la calidad de semillas en muestras de conos. El objetivo del trabajo fue caracterizar las semillas de P. elliottii a través de variables físicas y radiográficas mediante: a) la verificación que las mediciones sobre las imágenes radiográficas de las semillas en relación a su tamaño y las del embrión, pueden ser reemplazadas por las mediciones realizadas con calibre manual y b) la realización de un patrón de imágenes radiográficas digitales de semillas y sus correspondientes imágenes fotográficas digitales. Se tomó una muestra de 20 semillas y se sometieron a los rayos X para obtener imágenes radiográficas digitales con el equipo SEMAX (INTA-Facultad de Ciencias Agrarias (UNR) -TEXEL, Argentina). La longitud y el ancho de las semillas se midieron con un calibre manual y se tomaron mediciones digitales sobre las imágenes radiográficas. La longitud del embrión y la longitud y ancho del tejido materno se midieron solamente en forma digital. Para describir las características físicas de las semillas relacionadas con el tamaño y la presencia de embriones, se realizaron análisis multivariados de componentes principales (CP) y análisis de conglomerados. La primer CP explicó el 38 % de la variabilidad total de los datos y las tres primeras CP juntas, explicaron el 82 %. Las variables que significativamente se correlacionaron con la segunda CP fueron la longitud y el ancho del tejido materno, separando las semillas llenas de las vacías. La tercer CP solamente se correlacionó con la longitud del embrión. En el dendrograma obtenido por el análisis de conglomerados solo se consideró la longitud y el ancho del tejido materno por el método de Ward separando las semillas en cuatro grupos. El primer grupo fue representado por las semillas con los menores anchos de tejido materno; el segundo grupo estuvo compuesto por semillas con tejido materno corto y angosto; el tercer grupo estuvo representado por semillas grandes, con tejido materno largo y ancho y el cuarto grupo estuvo representado por semillas vacías. La metodología usada permitió una buena caracterización de la especie estudiada. Las mediciones realizadas con calibre digital sobre las imágenes radiográficas permitieron reemplazar a las mediciones realizadas con calibre manual.

*Original recibido (14/11/08) *Original aceptado (17/12/08)

Adriana Salinas et al.

Palabras clave: rayos X - P. elliottii - calidad de semillas SUMMARY

Characterization of Pinus elliottii Engelm. seeds through physical and radiographic variables P. elliottii is not native from Argentina, but it has a great adaptability and plasticity, and is cultivated in the center-north region of our country. It is used in carpentry, construction and to obtain cellulose pulp and resins. X-raying is a tool for quick estimation of seed quality in cone samples. The aim of this work was to characterize P. elliottii seeds through physical and radiographic variables by: a) verifying if digital measurements of the radiographic images of seed size and the presence of embryo can replace the measurements made with a manual caliper and to elaborate a radiographic pattern of the species; b) making a pattern of digital radiographic pictures of seeds and their corresponding digital photographic pictures. A sample of 20 seeds was used and they were submitted to X-rays to obtain digital radiographic images with the SEMAX (INTA-Agricultural Science Faculty (UNR) -TEXEL, Argentina) X-ray equipment. The length and width of the seeds were measured with a manual caliper and digital measurements were taken on radiographic images. The length of the embryo, the length and width of the maternal tissue were only digitally measured. To describe the physical characteristics of the seeds related to the size and the presence of embryos, a multivariate analysis of principal components (PC) and a conglomerated analysis were used. The first PC explained 38% of the total variability of the data and the three first PC together, explained 82%. The variables that significantly correlated with the first PC were length and width of the seeds measured digitally or with a manual caliper. The variables that significantly correlated with the second PC were the length and the width of the maternal tissue, separating the filled seeds from the empty ones. The third PC was only correlated with the length of the embryo. The dendrogram obtained by the analysis of conglomerates only considered the length and the width of the maternal tissue by the Ward method and separated the seeds in four groups. The first group was represented by seeds with the lowest width of maternal tissue; the second group was composed by seeds with short and narrow maternal tissue; the third group was represented by big seeds with long and wide maternal tissue and the fourth group was represented by empty seeds. The methodology used permitted a good characterization of the species studied. The measurements made with digital caliper on the radiographic images could replace the measurements made with manual caliper. Key words: X ray - P. elliottii - seed quality

Introducción El P. elliottii corresponde al “slash pine”,

que crece al estado natural, en la parte sur de los Estados Unidos de Norteamérica (Vidal, 1962).

En Argentina, la especie encuentra sus mejores áreas en Santa Fe, Entre Ríos, Corrientes y Misiones donde hay terrenos bajos, suelos arenosos y húmedos (Celulosa Argentina, 1977).

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Caracterización de semillas de Pinus elliottii Engelm. a través de variables físicas y radiográficas

El pino es un árbol diclino-monoico, es decir que se encuentran flores unisexuales, femeninas y masculinas en el mismo pie pero en distintas ramas. Las flores masculinas o conos portadores del polen aparecen en los extremos de los brotes, integrando inflorescencias amentiformes de color amarillo anaranjado, sobre las que van insertos estambres o microsporofilos que se disponen en espiral alrededor del eje, portando dos sacos polínicos cada uno. Las flores femeninas, verdosas o purpurinas, constituyen una inflorescencia llamada estróbilo o cono femenino o piña la cuál está formada por un eje con pequeñas brácteas en espiral y en la axila de cada una de ellas hay una escama leñosa que son las hojas carpelares o megasporofilos. En la base de cada una de las escamas leñosas hay dos óvulos (Vidal, 1962; Valla, 1996; Strasburger et al., 1997).

Los conos femeninos son subterminales, reflexos, de forma ovoide o cónica, de 10-12,5 cm de longitud y 5-6 cm de diámetro, cortamente pedicelados. Después de la fertilización, este cono adquiere desarrollo y las escamas leñosas se cierran fuertemente, permaneciendo comprimidas, unas contra otras, hasta la madurez, aprisionando en su interior las semillas, que debido a los apéndices alados que poseen, pueden ser arrastradas por acción del viento, facilitando de esta forma la dispersión. El cono no tarda en desprenderse y caer. Al producirse la dispersión quedan adheridos a la ramita con algunas brácteas basales. El cono se forma en la primavera, el polen es depositado por el viento y su misión es fertilizar los óvulos contenidos en su interior, en la primavera del segundo año. A partir de ese momento, la semilla alcanza un rápido desarrollo, madurando a fines del verano u otoño (Vidal, 1962; Valla, 1996; Strasburger et al, 1997).

La semilla, de forma triangular, de 6 mm de largo aproximadamente, negra y rugosa, lleva un ala bien desarrollada de 25 mm o

aún más de longitud, delgada y transparente. Posee además del embrión, el tejido materno con reservas amiláceas y aceitosas (Vidal, 1962). En realidad la acumulación de reservas en las células del protalo femenino o megagametófito, forma un endosperma rico en proteínas y lípidos y pobre en carbohidratos (Besnier Romero, 1989).

En estudios para determinar la calidad de semillas, William (1985) informó que los métodos radiográficos para tales fines, comenzaron a utilizarse a comienzos del siglo XX (Lundstrom, 1903, citado por Kamra 1964). Posteriormente, los estudios de Simak y Gustafsson (1953) resaltaron la importancia de la utilización de la técnica de rayos X como un método de diagnóstico para el análisis de semillas de árboles. El método de contraste por rayos X, el cual utiliza varios agentes de contraste o radio opacos, fue desarrollado y aplicado éxito-samente en especies de Pinus y Picea (Simak, 1957; Kamra, 1963; Stockwell, 1942).

La técnica de rayos X es ampliamente utilizada en Medicina, Biología y distintas industrias (ISTA, 2003). Por otro lado, la Asociación Oficial de Analistas de Semillas (AOSA) elaboró un manual de rayos X sobre el uso de esta técnica en semillas de especies agrícolas y forestales (Belcher y Vozzo, 1979). También ISTA (1991) elaboró un manual sobre semillas de árboles y arbustos.

La técnica de rayos X permite la detección de semillas atacadas por insectos o enfermedades, con daños mecánicos, anormalidades en el desarrollo de las estructuras internas de las semillas y semillas completamente llenas o vacías.

Varios estudios fueron realizados utilizando el equipo de rayos X SEMAX específico para análisis de semillas (Craviotto et al, 2004) en diversas especies de cultivo (Craviotto et al., 2006) y forestales como Ginkgo biloba, Taxodium distichum (Salinas et al., 2007; Salinas et al.,

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2008). Kamra (1963) determinó el daño mecánico en semillas de Pinus sylvestris (L.) a través del método de rayos X. Luego, en 1964, el mismo autor determinó la calidad de semillas empleando rayos X.

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El objetivo del trabajo fue caracterizar las semillas de P. elliottii a través de variables físicas y radiográficas mediante: a) la verificación que las mediciones sobre las imágenes radiográficas de las semillas en relación a su tamaño y las del embrión, realizadas con el calibre digital del software del equipo de rayos X SEMAX, pueden ser reemplazadas por las mediciones realizadas con calibre manual y b) la realización de un patrón de imágenes radiográficas digitales de semillas y sus correspondientes imágenes fotográficas digitales. Materiales y métodos

El trabajo se realizó en el laboratorio de semillas de la Estación Experimental Oliveros del INTA, Oliveros, Santa Fe, Argentina.

Se utilizaron semillas comerciales de P. elliottii provenientes de la E. E. A. 25 de Mayo (Provincia de Buenos Aires) del INTA.

Para la toma de imágenes radiográficas de P. elliottii, se utilizó el equipo de rayos X SEMAX (INTA Oliveros - Facultad de Ciencias Agrope-cuarias (UNR) – TEXEL, Argentina), que utiliza una metodología no destructiva para la semilla (Craviotto et al, 2004). Este equipo cumple con las normas de seguridad exigidas por radiofísica sanitaria utilizando las últimas técnicas de imágenes digitales radiográficas a una potencia de 35 KW y una intensidad de 10 Ma.

Se tomó una muestra de 20 semillas que se consideró adecuada para la evaluación del tamaño de las simientes debido a la gran uniformidad de las mismas y a los fines estadísticos también se consideró adecuado el tamaño de la muestra. Se les midió la longitud (mm) y el ancho (mm) con calibre manual y estas mediciones también se realizaron en forma digital, utilizando el software VixWin (2000), sobre las imágenes radiográficas visualizadas en el monitor de la computadora del equipo SEMAX. Por otro lado, se midió en forma digital solamente la longitud (mm) del embrión y la longitud (mm) y ancho (mm) del tejido materno.

Para describir las características físicas de las semillas en cuanto a tamaño y presencia de embriones, se utilizó un análisis multivariado de componentes principales y un análisis de conglomerados con el programa Infostat (2002).

Para la elaboración del patrón de imágenes radiográficas digitales, se tomaron imágenes fotográficas digitales que se correspondieron con las primeras. Para ello se sometieron las semillas a diferentes tratamientos: a) semillas secas; b) semillas secas y punzadas; c) semillas quebradas; d) semillas sumergidas en agua a 25 ºC durante 24 horas; e) imbibición de las semillas dispuestas en rollos de papel a 25 ºC durante 72 horas y; f) semillas embebidas en agua a temperatura ambiente 20 ºC durante 24 horas. Para cada tratamiento se utilizaron 200 semillas y para armar el patrón se eligieron las imágenes radiográficas más representativas.

Resultados y discusión

El estudio de las características físicas de las semillas de P. elliottii a través de las mediciones del tamaño, longitud y ancho de las semillas, realizadas con calibre digital sobre las imágenes radiográficas y con calibre manual sobre las semillas, permitie-ron realizar la caracterización de las mismas. Esta caracterización se complementó a través de la determinación de la presencia o ausencia de embriones y del grado de desarrollo de las semillas, visualizados a través de las imágenes radiográficas, donde se consideraron semillas llenas aquellas que mostraron la presencia de tejido materno y embrión ocupando la totalidad de la cavidad seminal la cual está rodeada por los tegumentos seminales. Por otro lado, se consideró semilla parcialmente llena aquella que no completó el llenado de la cavidad seminal y semilla vacía aquella que solamente mostraba el tegumento seminal.

A través del análisis multivariado de Componentes Principales, la primer CP (Cuadro 1) explicó el 38 % de la variabilidad total de los datos y las 3 primeras CP en forma conjunta, explicaron el 82 %.

Caracterización de semillas de Pinus elliottii Engelm. a través de variables físicas y radiográficas

Cuadro 1. Proporción de la variancia explicada para cada componente principal (CP) de la longitud (mm) y ancho (mm) de semillas medidos con calibre digital; longitud (mm) digital del embrión y del tejido materno (mm); ancho (mm) digital del tejido materno (mm) y longitud (mm) y ancho de semillas (mm) con calibre manual

CP Valor Proporción Proporción Acumulada

1 2,69 0,38 0,38 2 2,18 0,31 0,70 3 0,90 0,13 0,82

__________________________________________________________________________ Un detalle de las correlaciones parciales de cada variable con respecto a cada

componente principal se muestra en el Cuadro 2. Cuadro 2. Correlaciones de las tres primeras Componentes Principales (CP) con las variables originales

Variables (mm) CP1 CP2 CP3 Longitud digital semillas - 0,71 0,07 -0,48 Ancho digital semillas - 0,77 0,44 -0,05 Longitud digital embrión - 0,51 -0,43 -0,55 Longitud digital tejido materno - 0,39 -0,89 0,14 Ancho digital tejido materno - 0,30 -0,85 0,33 Longitud semillas con calibre manual - 0,75 0,08 0,32 Ancho semillas con calibre manual - 0,73 0,51 0,36

-2.54 -0.80 0.93 2.66 4.39

CP 1

-3.05

Figura 1. Biplot de la distribución de las variables y de las semillas de P. elliottii Engelm. según el análisis de CP

Las variables correlacionadas significati-

vamente con la primer CP fueron: longitud y ancho de las semillas medidas en forma digital o con calibre, separando de izquierda

-1.00

1.04

3.08

5.12

CP 2

1

2 3

4

5

6

7 8

9 10

11

12

13

14

15 16

17

1819

20

1

2 3

4

5

6

7 8

9 10

11

12

13

14

15 16

17

1819

20

Ancho semillas (mm) medición digital

Dlogem

Ancho tejido materno (mm) medición digital

Longitud semillas (mm) medición digital

Longitud embrión (mm) medición digital

Longitud tejido materno (mm) medición digital

Longitud semillas (mm) medición calibre

Ancho semillas (mm) medición calibre

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a derecha en la Figura 1, las semillas con mayor longitud y ancho de aquellas que presentaron menor tamaño. Generalmente, las semillas de mayor tamaño y que contienen gran cantidad de sustancias de reservas muestran una mejor calidad fisiológica respecto a las semillas de menor tamaño. Las variables correlacionadas

significativamente con la segunda CP fueron la longitud y el ancho del tejido materno, separando las semillas llenas de las vacías (1 y 14, Fig. 1). La tercera CP sólo estuvo correlacionada con la longitud del embrión, identificándose a la semilla 4 como aquella que no lo poseía (Figuras 2 y 3).

-2.54 -0.80 0.93 2.66 4.39

CP 1

-2.54

-1.22

0.10

1.42

2.74

1

2

3

4

5

67 8

9

10

11

12

1314

15

16

17

18

19

20

1

2

3

4

5

67 8

9

10

11

12

1314

15

16

17

18

19

20

dLogsem

Dlogem

Danchtejma

Longitud semillas (mm) medición digital

Ancho semillas (mm) medición digital

Longitud embrión (mm) medición digital

Longitud tejido materno (mm) medición digital

Ancho tejido materno (mm) medición digital

Longitud semillas (mm) medición calibre

Ancho semillas (mm) medición calibre

Figura 2. Biplot de la distribución de las variables y de las semillas de P. elliottii Englem. según el análisis de CP

Evidentemente, un alto porcentaje de las semillas de P. elliottii de la muestra analizada poseían embrión.

El dendrograma obtenido por el análisis de conglomerados (Figura 4) se realizó considerando la longitud y el ancho del tejido materno según el método de Ward. Los números de 1 a 20 representan las 20 semillas utilizadas para la realización del trabajo. A través del análisis del dendrograma, se pueden observar 4 grupos de semillas: el grupo I está representado por semillas con el menor ancho de tejido materno; el grupo II está compuesto por

semillas con tejido materno corto y angosto; el grupo III está representado por semillas grandes, con tejido materno largo y ancho y el grupo IV muestra a las semillas vacías.

Tanto las mediciones realizadas con el calibre manual como aquellas realizadas con el digital, permitieron una buena caracteriza-ción de las semillas, lo que indica que las mediciones digitales pueden reemplazar a las realizadas con calibre manual.

Las semillas medidas con calibre manual presentaron una longitud promedio de 7,07 mm y un ancho promedio de 4,75 mm.

CP 3

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Figura 3. Tres primeras CP mostrando la distribución espacial de las semillas en P. elliottii Englem.

Figura 4. Dendrograma obtenido por el método de Ward que caracteriza a las semillas de P. elliottii en cuanto a su tamaño. Referencias: I, Semillas con tejido materno angosto; II, con tejido materno corto y angosto; III, con tejido materno largo y ancho y IV, semillas vacías

I

II

III

IV

0.00 2.74 5.47 8.21 10.95Distancia

1

14

2

3

15

4

7

5

9

6

11

8

17

19

20

12

10

18

13

16

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Las imágenes radiográficas y fotográficas digitales obtenidas en los distintos tratamientos para la realización del patrón radiográfico de la especie en estudio (Láminas I a V), mostraron diferentes grados de nitidez en orden decreciente: semillas secas, embebidas y sumergidas.

Las mencionadas imágenes posibilitaron además, realizar una nítida diferenciación entre semillas vanas y llenas y aquellas que presentaron daño artificial simulando ataque de insectos y quebrado. Por lo expuesto, se deduce que el uso de la técnica de rayos X fue una buena herramienta para caracterizar lotes de semillas de P. elliottii por su constitución botánica y por la visualización de daños simulando aquellos provocados por factores bióticos, como el ataque de insectos o patógenos y abióticos como los de tipo ambiental, ya que permitió realizar un patrón

radiográfico de la especie en estudio. Simak (1957) también utilizó exitosamente la técnica de rayos X pero con líquidos de contraste y revelado tradicional en varias clases de semillas de coníferas como Pinus sylvestris y Picea abies.

El patrón radiográfico de P. elliottii formará parte de un manual de patrones radiográficos de especies forestales, que será de gran utilidad para interpretar imágenes radiográficas de esta especie por personal entrenado en el uso de esta técnica en laboratorios de semillas, semilleros y viveros. Salinas et al. (2007 a y b) y Salinas et al. (2008), realizaron patrones radiográ-ficos de especies forestales como Ginkgo biloba, Acacia longifolia y Taxodium distichum, así como también Craviotto et al (2006), realizaron el patrón radiográfico para la especie Albizia julibrissin.

LÁMINA I

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LÁMINA II

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LÁMINA III

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LÁMINA IV

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LÁMINA V

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Conclusiones

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La técnica de rayos X permite caracterizar la especie en relación a sus características anátomo – morfológicas, detectar daños por insectos o quebrado y realizar un patrón radiográfico de semillas de la especie en estudio.

Las mediciones realizadas con calibre digital sobre las imágenes radiográficas permiten reemplazar a las mediciones realizadas con calibre manual. Referencias bibliográficas BELCHER, E.; VOZZO, J.A. (1979).

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Nota del Editor: La imágenes digitales a color de las Láminas I a V están disponibles a quien las

solicite a la dirección rca@fca.uner.edu.ar

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