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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
FREDERICO JEHÁR OLIVEIRA QUINTÃO
CARACTERIZAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAS DE Microlicia graveolens, Melaleuca
leucadendron E DE EXTRATOS HIDROALCOÓLICOS DAS FOLHAS E CAULES DE
Vellozia Squamata PARA O DESENVOLVIMENTO DE NANOEMULSÕES PARA USO
FARMACÊUTICO
OURO PRETO
2013
ii
FREDERICO JEHÁR OLIVEIRA QUINTÃO
CARACTERIZAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAS DE Microlicia graveolens, Melaleuca
leucadendron E DE EXTRATOS HIDROALCOÓLICOS DAS FOLHAS E CAULES DE
Vellozia Squamata PARA O DESENVOLVIMENTO DE NANOEMULSÕES PARA USO
FARMACÊUTICO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Biotecnologia da
Universidade Federal de Ouro Preto como
requisito parcial para obtenção do Título de
Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Orlando David Henrique dos
Santos
OURO PRETO
UFOP
2013
Catalogação: [email protected]
Q79c Quintão, Frederico Jehár Oliveira.
Caracterização dos óleos essenciais de Microlicia graveolens, Melaleuca
leucadendron e de extratos hidroalcoólicos das folhas e caules de Vellozia
Squamata para o desenvolvimento de nanoemulsões para uso farmacêutico
[manuscrito] / Frederico Jehár Oliveira Quintão - 2013.
xvi, 116f.: il., color; graf.; tab.
Orientador: Prof. Dr. Orlando David Henrique dos Santos.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia Industrial.
1. Essências e óleos essenciais - Teses. 2. Nanoemulsões - Teses.
3. Melastomatoceae - Microlicia graveolens - Teses. 4. Myrtaceae -
Melaleuca leucadendron - Teses. 5. Velloziaceae - Vellozia Squamata -
Teses. I. Santos, Orlando David Henrique dos. II. Universidade Federal de
Ouro Preto. III. Título.
CDU: 665.52/.54:615.012
iii
iv
Dedico este Trabalho aos meus pais , Valter e Lúcia,
aos meus irmãos Vinícius e Mariana, aos meus avós,
à Julia e a todos que me ajudaram de alguma forma
nessa caminhada.
v
AGRADECIMENTOS
À Deus por mais essa conquista.
Ao meu orientador prof. Dr. Orlando Henrique David dos Santos pelos ensinamentos e por ter me
concedido essa oportunidade única de realizar uma Pós-Graduação.
Aos professores Dr. Gustavo Henrique da farmacognosia e ao Dr. Sidnei (Bibo) pelo apoio e
colaborações no trabalho.
Às amigas Izabel e Shiara pela amizade e pela convivência nesses últimos anos no laboratório.
Aos amigos Simone, Ricardo, Vanessa e Karen que proporcionaram não só discussões
interessantes que contribuiram para o meu crescimento profissional, mas também, pelos
momentos únicos de descontração.
Aos Professores Dr. Robson Afonso e Dr. Luiz Fernando por cederem os equipamentos e os
laboratórios para as análises e experimentos realizados ao longo desse trabalho.
À Ananda pela ajuda nas análises realizadas.
Ao Sr. Jorge da botânica pela ajuda constante nas coletas.
À Kyssia, Michele, Luísa e Nayara alunas de IC e TCC, as quais me acompanharam nos
experimentos e nos desenvolvimentos de projetos.
À Julia pelo amor, carinho e dedicação em todos os momentos.
Aos amigos Francisco e Victor por todos esses anos de convivência.
À equipe de professores do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e do CIPHARMA.
Ao técnico Adão pela ajuda e acompanhamento durante os esperimentos realziados no
laboratório de farmacognosia da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto.
À Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto por ceder o espaço.
Aos colegas do laboratório de Farmacognosia e do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica e
Nanobiotecnologia .
vi
RESUMO
Espécies vegetais representam fontes de matéria-prima para a indústria farmacêutica,
cosmética, alimentícia, química e outras, assim como para a agricultura. Substâncias químicas
específicas presentes em espécies vegetais possuem propriedades terapêuticas e são utilizadas
como princípios-ativos de produtos farmacêuticos. Em indústrias de medicamentos, o uso de
matéria-prima vegetal na elaboração de fitoterápicos está aumentando nos últimos anos. O Brasil
é um país que possui grande diversidade de espécies vegetais, em função dos seus diferentes
biomas. O cerrado mineiro contem uma vasta biodiversidade a qual ainda não foi totalmente
estudada. Esta biodiversidade nos propicia a obtenção de uma gama de matérias-primas adequada
para a produção de produtos farmacêuticos e cosméticos. Este estudo teve como objetivo obter e
caracterizar química e biologicamente, óleos essenciais das espécies Melaleuca leucadendron e
Microlicia graveolens. Obter extratos hidroalcoólicos de folhas e caules de Vellozia squamata e
submete-los a uma prospecção fitoquímica para identificar os principais grupos de constituintes.
A obtenção de nanoemulsões do tipo óleo/água contendo os óleos essenciais e extratos, pelo
método de inversão de fases, também foi um dos objetivos. Os resultados obtidos nesse trabalho
nos permitiram concluir que o rendimento e a constituição química dos óleos essenciais de M.
graveolens e M. leucadendron sofreram variações em função da época das respectivcas coletas.
Potencial propriedade antimicrobiana foi identificada nos óleos essenciais isolados de ambas
espécies. A capacidade desses óleos de inibir o crescimento microbiano mostrou-se significativa
em relação a bactérias Gram-positivas. Os extratos hidroalcoólicos obtidos de folhas e caules de
V. squamata apresentaram elevada capacidade antioxidante identificada através do método de
DPPH. Essa propriedade foi atribuída aos constituintes fenólicos identificados nos extratos por
testes fitoquímicos. O método de inversão de fases foi eficiente no preparo de nanoemulsões
estáveis contendo óleos essenciais de M. graveolens e M. leucadendron ou extratos de V.
squamata. Sob a forma de nanoemulsão a propriedade antioxidante dos extratos permaneceu a
mesma encontrada em sua solução.
vii
ABSTRACT
Plant species represent sources of raw materials to be applyed in pharmaceutical,
cosmetic, feed, chemical and other industries, such as in agriculture. Specific chemical
substances present in vegetable species have therapeutic properties and are used as active
principles of pharmaceutical products. The use of vegetable raw materials by pharmaceutic
industries in the preparation of phytotherapeutics has been increasing in the last decades. Brazil is
a country with great diversity of vegetable species in function of its different bioms. Cerrado
region of Minas Gerais State has a big biodiversity, which has not been fully studied. This
biodiversity provides obtention of a range of raw materials adequated for pharmaceutical and
cosmectic production. The objective of this work was to obtain and characterize essential oils
from the species Melaleuca leucadendron and Microlicia graveolens. Obtain hydroalcoholic
extracts from leaves and stems of Vellozia squamata and submit them to phytochemical
prospection to identify the main groups of constituents. The obtaintion of nanoemulsions type
oil/water with the essential oils and extracts, by inversion phase method, also was an objective.
The results foud in this work permits conclud that yeld and chemical constitution of essential oils
of M. graveolens e M. leucadendron suffer variation in function of the moment of respective
collects. Antimicrobian potential properties were attributed to essential oils isolated from both
species. The capacity of these oils to inhibite the microbian growth was significative in relation
to Gram-positive bacteria. The hydroalcoholic extracts from leaves and stems of V. squamata
showed good antioxidant property determined by DPPH method. This property was attributed to
phenolic compounds identified by phytochemical assays. The inversion phase method was
efficient to preparing stable nanoemulsions containing essential oils of M. graveolens and M.
leucadendron or extracts of V. squamata. As nanoemulsions the antioxidant property of the
extracts was the same found in its solution.
viii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1.1 Ciclo biossintético geral dos metabólitos secundários. ........................................... 22
FIGURA 1.2 Biossíntese dos terpenos. ......................................................................................... 24
FIGURA 1.3 Estrutura do alcalóide codeína. ................................................................................ 25
FIGURA 1.4 Estrutura geral dos flavonóides. .............................................................................. 26
FIGURA 1.5 Equipamento de prensagem utilizado para extração de óleos essenciais. ............... 29
FIGURA 1.6 Representação do aparelho de Clevenger. ............................................................... 30
FIGURA 1.7 Esquema representativo do equipamento utilizado para extração supercrítica de
óleos essenciais. ............................................................................................................................. 31
FIGURA 1.8 Equipamento de Soxhlet. ......................................................................................... 32
FIGURA 1.9 Esquema representado funcionamento de um cromatógrafo gasoso. ...................... 33
FIGURA 1.10 Estabilização do radical livre DPPH. .................................................................... 36
FIGURA 2.1 Microlicia graveolens (Roxinha). ............................................................................ 52
FIGURA 2.2 Hidrodestilador Linax®. .......................................................................................... 55
FIGURA 2.3 GCMS-QP2010 Plus Shimadzu. .............................................................................. 56
FIGURA 2. 4 Inibição do radical DPPH pelo óleo essencial de M. graveolens. .......................... 63
FIGURA 2. 5 Reogramas da nanoemulsão contendo óleo essencial de M. graveolens. ............... 68
FIGURA 3.1 Folhas e flores da M. Leucadendron.........................................................................76
FIGURA 3.2 Árvores de M. leucadendron.................................................................................77
FIGURA 3.3 Inibição do radical DPPH pelo óleo essencial da M. leucadendron (ML-1)............85
FIGURA 4. 1 Vellozia squamata localizada na Serra de Ouro Branco. ........................................ 94
FIGURA 4. 2 Flor da Vellozia squamata. ..................................................................................... 94
FIGURA 4. 3 Porcentagem de inibição do DPPH induzido pelo extrato hidroalcoolico de folhas e
a das nanoemulsões preparadas com estes. ................................................................................. 104
FIGURA 4.4 Porcentagem de inibição do DPPH induzido pelo extrato hidroalcoólico de caules e
a das nanoemulsões preparadas com estes...................................................................................104
ix
LISTA DE TABELAS
TABELA 2. 1 Composição das formulações. ............................................................................... 59
TABELA 2. 2 Constituintes químicos majoritários do óleos essencial de M. graveolens. ........... 62
TABELA 2.3 Avaliação da atividade antimicrobiana do óleo essencial de M. graveolens...........64
TABELA 3.1 Composição das formulações..................................................................................82
TABELA 3. 2 Constituintes químicos majoritários do óleo essencial de M. leucadendron (ML-1).
....................................................................................................................................................... 84
TABELA 3. 3 Constituintes químicos majoritários do óleo essencial de M. leucadendron (ML 2).
....................................................................................................................................................... 84
TABELA 3. 4 Avaliação da atividade antimicrobiana do óleo essencial de M. leucadendron. ... 86
TABELA 4.1 Composição das Formulações. ............................................................................. 100
TABELA 4. 2 Testes de prospecção fitoquímica de classes químicas da planta V. squamata. .. 103
TABELA 4.3 Valores de IC 50 para os extratos hidroalcoólicos e nanoemulsõees contendo os
mesmos.........................................................................................................................................105
TABELA 4.4 Conteúdo de fenólicos totais expressos em equivalente de ácido gálico (EAG) por
grama de extrato hidroalcoólico seco de caules e folhas V. squamata.........................................106
TABELA 4.5 Determinação do valor de pH das nanoemulsões formuladas com extratos
hidroalcoólicos de caules e folhas de Vellozia squamata.............................................................107
TABELA 4.6 Distribuição do tamanho de partículas das nanoemulsões preparadas a partir dos
extratos hidroalcoólicos de V. squamata em função do tempo após o preparo............................108
TABELA 4.7 Parâmetros do comportamento reológico das nanoemulsões formuladas com
extratos hidroalcoólicos de caules e folhas de Vellozia squamata................................................109
x
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
ABS Absorbância
ABTS• 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
A/O Água em óleo
ATCC American type culture collection
BHA Butil - hidroxianisol
BHT Butil - hidroxitolueno
CCD Cromatografia em camada delgada
CG Cromatografia gasosa
CIM Concentração inibitória mínima
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CUPRAC Cupric ion reducing antioxidant capacity
DMSO Dimetilsufóxido
DPPH• 2,2-difenil-1- picril-hidrazil
EAG Equivalente de ácido gálico
ECD Detectores de captura de elétrons
EM Espectrometria de Massas
ERNs Espécies Reativas de Nitrogênio
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FID Detector de ionização de chama
FRAP Ferric ion reducing antioxidant power
IV Infravermelho
LPS Lipopolissacarídeos
m/z Massa carga especifica
NIST National Institute of Standards and Technology
O/A Óleo-água
OE Óleos essenciais
OMS Organização Mundial da Saúde
ORAC Oxygen radical antioxidant capacity
xi
P.I. Índice de polidispersividade
TBARS Thiobarbituric acid reactive substances
TIF Temperatura de inversão de fases
TRAP Total radical trapping antioxidant parameter
UV Ultravioleta
xii
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO, REVISÃO DA LITERATURA e OBJETIVOS GERAIS
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 18
2 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................................. 20
2.1 Plantas Medicinais ............................................................................................................... 20
2.2 Metabolismo Secundário ..................................................................................................... 21
2.2.1 Terpenóides ................................................................................................................... 23
2.2.2 Alcalóides ...................................................................................................................... 24
2.2.3 Compostos Fenólicos .................................................................................................... 25
2.3 Óleos Essenciais .................................................................................................................. 26
2.3.1 Métodos de obtenção de óleos essenciais ..................................................................... 29
2.3.2 Caracterização química de óleos essenciais ................................................................. 32
2.4 Atividade Antioxidante ........................................................................................................ 34
2.5 Atividade Antimicrobiana .................................................................................................... 36
2.6 Emulsões .............................................................................................................................. 38
2.6.1 Nanoemulsões................................................................................................................ 39
3. OBJETIVOS GERAIS .............................................................................................................. 42
3.1 Objetivo Geral ...................................................................................................................... 42
3.1 Objetivos Específicos .......................................................................................................... 42
8 REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 43
CAPÍTULO 2 - Microlicia graveolens
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 50
2 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 53
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................................... 53
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................................... 53
3 MATERIAIS .............................................................................................................................. 54
4 MÉTODOS ................................................................................................................................. 55
4.1 Obtenção dos Materiais vegetais ......................................................................................... 55
xiii
4.2 Extração dos Óleos Essenciais ............................................................................................. 55
4.3 Caracterização Química dos Óleos Essenciais .................................................................... 56
4.4 Avaliação da atividade antioxidante .................................................................................... 57
4.5 Avaliação da Atividade Antimicrobiana .............................................................................. 58
4.6 Obtenção das Formulações .................................................................................................. 58
4.7 Ensaios de estabilidade acelerada ........................................................................................ 59
4.7.1 Centrifugação ................................................................................................................ 59
4.7.2 Estresse térmico ............................................................................................................ 59
4.7.3 Determinação do valor de pH ....................................................................................... 60
4.7.4 Determinação do tamanho de partícula........................................................................ 60
4.7.5 Determinação do comportamento reológico das nanoemulsões .................................. 60
5 RESULTADOS .......................................................................................................................... 61
5.1 Obtenção do material Vegetal .............................................................................................. 61
5.2 Extração dos óleos essenciais .............................................................................................. 61
5.3 Caracterização Química dos Óleos Essenciais de M. graveolens ........................................ 62
5.4 Avaliação da Atividade Antioxidante .................................................................................. 63
5.5 Avaliação da Atividade Antimicrobiana .............................................................................. 64
5.6 Obtenção das Formulações .................................................................................................. 65
5.7 Ensaios de estabilidade acelerada ........................................................................................ 65
5.7.1 Processo de centrifugação ............................................................................................ 66
5.7.2 Estresse térmico ............................................................................................................ 66
5.7.4 Determinação do tamanho de partícula........................................................................ 67
5.7.5 Análises reológicas ....................................................................................................... 67
7 CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 69
8 REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 70
CAPÍTULO 3 - Melaleuca Leucadendron
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 75
2 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 78
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................................... 78
xiv
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................................... 78
3 MATERIAIS .............................................................................................................................. 79
4 MÉTODOS ................................................................................................................................. 80
4.1 Obtenção dos Materiais vegetais ......................................................................................... 80
4.2 Extração dos Óleos Essenciais ............................................................................................. 80
4.3 Caracterização Química dos Óleos Essenciais .................................................................... 80
4.4 Avaliação da atividade antioxidante .................................................................................... 81
4.5 Avaliação da Atividade Antimicrobiana .............................................................................. 81
4.6 Obtenção das Formulações .................................................................................................. 81
4.7 Ensaios de estabilidade acelerada ........................................................................................ 82
5 RESULTADOS .......................................................................................................................... 83
5.1 Obtenção do material Vegetal .............................................................................................. 83
5.2 Extração dos óleos essenciais .............................................................................................. 83
5.3 Caracterização Química dos Óleos Essenciais de M. leucadendron ................................... 83
5.4 Avaliação da Atividade Antioxidante .................................................................................. 85
5.5 Avaliação da Atividade Antimicrobiana .............................................................................. 85
5.6 Obtenção das Formulações .................................................................................................. 87
5.7 Ensaios de estabilidade acelerada ........................................................................................ 87
5.7.1 Processo de centrifugação ............................................................................................ 87
5.7.2 Estresse térmico ............................................................................................................ 87
5.7.3 Determinação do valor de pH ....................................................................................... 88
5.7.4 Determinação do tamanho de partícula........................................................................ 88
5.7.5 Análises reológicas ....................................................................................................... 89
6 CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 90
7 REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 91
CAPÍTULO 4 - Vellozia squamata
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 94
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................................................... 96
2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................... 96
xv
3 MATERIAIS .............................................................................................................................. 97
4 MÉTODOS ................................................................................................................................. 98
4.1 Obtenção dos Materiais vegetais ......................................................................................... 98
4.2 Preparação dos extratos hidroalcoolicos .............................................................................. 98
4.3 Estudo Farmacognóstico ...................................................................................................... 98
4.4 Atividade Antioxidante ........................................................................................................ 99
4.5 Avaliação da atividade antimicrobiana ................................................................................ 99
4.6 Dosagem de Fenólicos Totais ............................................................................................ 100
4.7 Obtenção das Formulações ................................................................................................ 100
4.8 Ensaios de estabilidade acelerada ...................................................................................... 101
5 RESULTADOS ........................................................................................................................ 102
5.1 Obtenção do material vegetal ............................................................................................ 102
5.2 Obtenção dos Extratos Hidroalcoólicos ............................................................................. 102
5.3 Estudo Farmacognóstico .................................................................................................... 102
5.4 Avaliação da Atividade Antioxidante ................................................................................ 103
5.5 Dosagem de fenólicos totais .............................................................................................. 105
5.6 Avaliação da atividade Antimicrobiana ............................................................................. 106
5.7 Obtenção das formulações ................................................................................................. 106
5.8 Ensaios de estabilidade acelerada ...................................................................................... 106
5.8.1 Processo de centrifugação .......................................................................................... 106
5.8.2 Estresse térmico .......................................................................................................... 107
5.8.3 Determinação do valor de pH ..................................................................................... 107
5.8.4 Determinação do tamanho de partícula...................................................................... 107
5.8.5 Análises reológicas ..................................................................................................... 108
7 CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 110
8 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 111
CAPÍTULO 5 - CONCLUSÃO GERAL
1 CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 114
CAPÍTULO 6 - PERSPECTIVAS
xvi
1 PERSPECTIVAS ..................................................................................................................... 116
17
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
REVISÃO DA LITERATURA E
OBJETIVOS GERAIS
CAPÍTULO 1
ITNRODUÇÃO GERAL
18
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais têm sido utilizadas tradicionalmente na medicina popular com
finalidade terapêutica para o tratamento de várias enfermidades. Geralmente, são administradas
oralmente na forma de chás, infusões, elixires e extratos (FOGLIO et al., 2006).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) aproximadamente 80% da
população mundial utilizam a medicina não convencional, principalmente medicamentos
provenientes de produtos naturais, para suprir a ausência de atendimento médico primário. Na
África, por exemplo, 80% da população dependem destes medicamentos, os quais representam
terapias alternativas frente ao alto custo dos fármacos sintéticos (ASCHWANDEN, 2001).
As espécies vegetais são fontes de matéria-prima em diversas indústrias, como a
farmacêutica, cosmética, alimentícia, química e também para a agricultura e horticultura.
Substâncias químicas específicas presentes em espécies vegetais possuem ação terapêutica e são
utilizadas como princípios-ativos de produtos farmacêuticos. O uso da matéria-prima vegetal na
elaboração de fitoterápicos por indústrias de medicamentos está aumentando nos últimos anos
(FLORES et al., 2011).
A biodiversidade vegetal é enorme e ainda não foi totalmente pesquisada, estima-se que
apenas 10% da biodiversidade vegetal mundial tenham sido estudadas. Entretanto, nesta pequena
porcentagem, aproximadamente 140 mil metabólitos secundários provenientes de plantas já
foram isolados e caracterizados. Na Terapêutica moderna estima-se que cerca de 40% dos
medicamentos disponíveis tenham sido desenvolvidos a partir de fontes naturais, sendo 25%
provenientes de plantas, 13% de micro-organismos e 3% de animais (CALIXTO, 2000).
O Brasil é o país que possui a maior diversidade de espécies vegetais, esta classificação se
dá pelos diferentes biomas existentes. Esta grande diversidade vegetal, e consequentemente
diversidade de compostos químicos, existente no Brasil é um dos fatores que justifica as
pesquisas realizadas em busca de novas e promissoras moléculas candidatas a serem princípios
ativos de medicamentos pelas indústrias farmacêuticas (GUERRA; NODARI, 2001).
Em Minas Gerais há o domínio de três biomas brasileiros: o cerrado, a mata atlântica e a
caatinga. O domínio do cerrado, localizado na porção centro-ocidental, ocupa cerca de 57% da
extensão territorial do Estado, o domínio da mata atlântica, localizado na porção oriental, é de
CAPÍTULO 1
ITNRODUÇÃO GERAL
19
cerca de 41% da área do Estado. O domínio na caatinga, restrito ao norte do Estado, ocupa cerca
de 2% do território mineiro (IEF, 2013). Esta biodiversidade nos permite a obtenção de uma
gama de matérias-primas para a produção de produtos farmacêuticos e cosméticos. Entretanto,
pouco dela foi estudado quanto a sua ação e eficácia.
As emulsões são amplamente empregadas como veículos para fármacos e/ou ativos pela
indústria cosmética e farmacêutica. As vantagens deste sistema são a veiculação de fármacos
lipofílicos e hidrofílicos em uma mesma formulação, além de possibilitarem um perfil sustentado
de liberação dos fármacos e ativos.
O desenvolvimento de nanoformulações, envolvendo sistemas emulsionados é uma
alternativa para melhorar as vias de administração de fármacos. O uso de nanoemulsões é
interessante por causa das suas propriedades que estão intimamente associadas com o tamanho de
partícula. O uso de nanoemulsões pode ser vantajoso quando relacionamos a utilização dessas
como veículos de produtos farmacêuticos ou de componentes dos cosméticos, principalmente
aqueles para os cuidados da pele. Como a busca pelo uso de componentes naturais em
formulações vem crescendo nos últimos anos, estudos demonstram que extratos e óleos
essenciais podem ser facilmente veículados em nanoemulões.
Esse trabalho tem como objetivo caracterizar os óleos essenciais das espécies Microlicia
graveolens, Melaleuca leucadendron e os extratos hidroalcoólicos obtidos a partir de folhas e
caules da Vellozia squamata visando a obtenção de nanoemulsões estáveis contendo os produtos
isolados.
Para alcançar o objetivo de forma didática, o trabalho foi estruturado em capítulos, sendo
que o primeiro capítulo apresenta a introdução geral, revisão da literatura e objetivos. O segundo
capítulo apresenta estudo do óleo essencial da espécie vegetal Microlicia graveolens. O terceiro
capítulo expõe os resultados referentes ao óleo essencial da espécie vegetal Melaleuca
leucadendron. O quarto capítulo apresenta o estudo da espécie vegetal Vellozia squamata. O
quinto capítulo apresenta a conclusão geral. Finalizando no sexto capítulo com as perspectivas
futuras.
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
20
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Plantas Medicinais
O homem sempre fez uso dos recursos fornecidos pela natureza. Entre as formas de
utilização de plantas pela humanidade podem ser citadas: fonte de alimentos, bebidas, pigmentos,
fibras têxteis, materiais para a construção de moradias, dentre outros. Recentemente, foi possível
o isolamento de moléculas com potencial farmacológico, tais como taninos, flavonóides, fenóis,
alcalóides, terpenóides, entre outras classes (GURIB-FAKIM, 2006).
A utilização de produtos vegetais com objetivo de promoção e/ou manutenção da
saúde é comprovada historicamente por registros, como por exemplo: os egípcios, assírios,
mesopotâmicos, indianos, chineses e outras civilizações que sempre contavam com a figura de
curandeiro ou equivalente. Os romanos utilizavam de plantas para obtenção de venenos. Os
gregos e romanos faziam uso de plantas aromáticas como medicamentos e preparação de
perfumes. Os incas utilizavam a casca da quina no combate à malaria. Na idade média, o uso das
plantas com fins medicinais se desenvolveu bastante com os alquimistas principalmente com
Paracelso (CARRAZZONI, 2000).
O conhecimento científico sobre espécies vegetais, em particular as de uso terapêutico,
pode levar a melhoria na qualidade de medicamentos já existentes assim como na descoberta de
novos princípios ativos. Sabe-se que a utilização de produtos naturais simboliza muitas vezes o
único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. As observações populares
sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais de todo mundo, fortalece a prática do consumo de
fitoterápicos, tornando válidas as informações terapêuticas que foram sendo acumuladas durante
séculos (VEIGA-JUNIOR, 2008).
Em alguns países, como França, Itália e Alemanha, estima-se que entre 70 e 90% da
população recorrem ao conhecimento popular, sob a forma de “medicina complementar”,
“alternativa” ou “não convencional”. O mesmo pode ser observado em países em
desenvolvimento, sob outra perspectiva, uma vez que o acesso aos medicamentos ocorre de
forma precária, sendo a medicina popular a principal fonte de prevenção, tratamento e
manutenção da saúde de grande parte da população nestes países (PROBST, 2012).
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
21
O mercado de produtos farmacêuticos derivados de plantas é um segmento promissor, já
que o crescimento dos medicamentos fitoterápicos é da ordem de 15 % ao ano, enquanto os
medicamentos sintéticos crescem em torno de 3 a 4 % no mesmo período. Além disso, podem
constituir-se em uma opção terapêutica eficaz e culturalmente apropriada (SIMÕES, 2003).
2.2 Metabolismo Secundário
O metabolismo das plantas pode ser dividido em metabolismo primário e secundário. O
metabolismo primário é considerado essencial a todas as espécies, tendo caráter conservativo e
universal e é responsável pelo desenvolvimento e manutenção celular. Substâncias comuns tais
como carboidratos, lipídeos, proteínas, clorofila e ácidos nucleicos são derivados destes
processos.
A função do metabolismo secundário nas plantas não era bem compreendida até pouco
tempo. Acreditava-se que os compostos provenientes do metabolismo secundário eram produtos
sem valor, ou mesmo resultante de erro metabólico, super-expressão protéica, excreta ou
desintoxicação das plantas. A partir de 1950, estudos envolvendo diversas áreas do conhecimento
elucidaram melhor o papel do metabolismo secundário nos vegetais, associando a produção de
metabólitos com funções fisiológicas importantes (HERRMANN, 1995).
Os metabólitos secundários podem ser comuns entre certos grupos taxonômicos, ou
exclusivos para determinada espécie, e geralmente oferecem vantagens para a manutenção e
desenvolvimento das espécies vegetais que os sintetizam. Processos como a defesa contra
microrganismos patogênicos e herbívoros, atração de polinizadores existem graças a esses
metabólitos. Além disso, alguns destes metabólitos são importantes compostos que absorvem a
luz ultravioleta evitando que as folhas sejam danificadas (SIMÕES, 2003).
A farmacofagia é um comportamento nutricional realizado por animais na busca de
compostos não-nutritivos. Huffman (1997) relata que algumas espécies de macacos e outros
primatas incluem em sua dieta plantas com intuito de obter efeitos analgésicos, antimicrobianos,
anti-inflamatórios, anti-diarrêicos, entre outros. Esses efeitos são obtidos graças aos produtos
provenientes do metabolismo secundário das plantas.
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
22
Devido as extensas atividades biológicas dos metabólitos secundários de plantas, estes são
utilizados há séculos na medicina popular e nos dias atuais como medicamentos, cosméticos,
matéria-prima para a química fina, ou mais recentemente como nutracêuticos (FUMAGALLI et
al., 2008).
Os metabólitos secundários podem ser classificados dentro de três grandes grupos:
terpenóides, compostos fenólicos e alcalóides. Embora não sejam necessários ao ciclo de vida da
planta, desempenham importante papel na interação das plantas com o meio ambiente
(OLIVEIRA et al., 2003).
FIGURA 1.1 Ciclo biossintético geral dos metabólitos secundários.
Fonte: LUPE , 2007.
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
23
2.2.1 Terpenóides
Os terpenóides são também conhecidos como isoprenóides e constituem a classe de
produtos naturais obtidos de plantas com a maior variedade estrutural e funcional. Alguns
Terpenóides participam de processos como respiração e desenvolvimento celular, desse modo são
importantes ao metabolismo primário. Pode-se citar como exemplos: produção de hormônios
(giberelinas), pigmentos fotossintéticos (carotenóides), carreadores de elétrons (ubiquinonas),
além de atuarem em mecanismos de defesa e comunicação (BAKKALI et al., 2008).
Os terpenos são formados a partir do ácido mevalônico, no citoplasma, ou do piruvato e
3-fosfoglicerato, no cloroplasto (FIGURA 1.2). A maioria dos terpenos são produtos do
metabolismo secundário, tendo como função intermediar a relação planta versus ambiente.
Grande parte desses compostos apresenta baixo peso molecular, natureza lipofílica, grande
variedade de estruturas e alta pressão de vapor à temperatura ambiente (PHILLIPS et al., 2008).
Os terpenos ou terpenóides podem ser classificados de acordo com o número de isoprenos
que constituem: hemiterpenóides, monoterpenóides, sesquiterpenóides, diterpenóides,
triterpenóides, tetraterpenóides e politerpenóides (OLIVEIRA et al., 2003).
Os monoterpenos são constituintes da fração volátil de flores e óleos essenciais extraídos
de plantas e ervas aromáticas, justificando sua importância para a indústria de cosméticos,
perfumes e aromatizantes. O geraniol, mentol, linalol e o citral são exemplos de monoterpenos.
Os monoterpenos podem atuar como compostos antimicrobianos (PROBST, 2012).
Os sesquiterpenos (C15) são encontrados nos óleos essenciais e em hormônios vegetais,
constituindo a maior classe de terpenóides (OLIVEIRA et al., 2003).
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
24
FIGURA 1.2 Biossíntese dos terpenos.
Fonte: TAIZ e ZEIGER, 2004.
2.2.2 Alcalóides
Alcalóides são compostos orgânicos cíclicos, de caráter básico, derivados principalmente
de plantas, mas que também podem ser encontradas em fungos, bactérias e até mesmo em
animais, podendo influenciar o metabolismo destes organismos produtores. A sua estrutura
química, contém basicamente nitrogênio, oxigênio, hidrogênio e carbono. Possuem importância
econômica e social, além da biológica. Constituem uma classe numerosa que é dividida em
subclasses por apresentarem vias de síntese não relacionadas evolutivamente (MITHEN et al.,
2000).
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
25
Podem existir no estado livre nas plantas, bem como na forma de sais ou óxidos. Eles
também correspondem aos principais agentes terapêuticos naturais com ação: anestésica,
analgésica, psico-estimulantes, neurodepressores, entre outras atividades farmacológicas. Um
exemplo de alcalóide com atividade farmacologia é a codeína (HENRIQUES, et al., 2000)
FIGURA 1.3 Estrutura do alcalóide codeína.
Existe um consenso entre diversos autores e pesquisadores da área de química, de que
alcalóides verdadeiros são compostos que possuem um ou mais nitrogênio(s) pertencente(s) a um
anel heterocíclico com propriedades alcalinas, apresentando intensa atividade biológica quando
interagem com organismos vivos (BERGAMASCHI, 2010).
2.2.3 Compostos Fenólicos
Os compostos fenólicos são substâncias que possuem pelo menos um anel aromático no
qual ao menos um hidrogênio é substituído por um grupamento hidroxila. Os compostos
fenólicos estão presentes em todos os órgãos das plantas, sendo abundantes em legumes, frutas,
cereais, além de se manterem presente em produtos derivados de vegetais como chocolate, vinho
tinto, azeite de oliva, chá verde e café. Os flavonoides e taninos são exemplos de compostos
fenólicos (BRAVO, 1998).
A função dos compostos fenólicos, principalmente os fenilpropanóides, está relacionada
com a síntese das ligninas que são comuns a todas as plantas superiores, atrativos aos seres
humanos devido ao odor, sabor e coloração agradáveis. Além disso, participam da interação da
planta com animais, os quais são atraídos para polinização ou dispersão de sementes. Esse grupo
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
26
de compostos é também importante para proteger as plantas contra os raios ultravioleta, insetos,
fungos, vírus e bactérias (CROTEAU et al., 2000)
Os Flavonóides (
FIGURA 1.4) são muito importantes no que se refere à sinalização entre plantas e outros
organismos, pode se incluir nesse item a relação entre os vegetais e seus agentes polinizadores,
sendo a coloração das flores um dos principais mecanismos de atração. A capacidade de
sequestrar radicais livres é uma importante função desses compostos (BERGAMASCHI 2010).
FIGURA 1.4 Estrutura geral dos flavonóides.
O
O
8
7
6 3
5
2'
3'
4'
5'
6'
Os taninos são compostos fenólicos solúveis em água com massa molecular entre 500 a
3.000 Daltons. Esses compostos são responsáveis pela adstringência de muitos frutos. Taninos
são defesas contra pragas, pois se ligam a proteínas digestivas dos insetos.
2.3 Óleos Essenciais
Óleos essenciais (OE) são derivados orgânicos de estrutura química heterogênea que
se apresentam, em certos gêneros de plantas superiores e inferiores, bem como em
microrganismos. São líquidos viscosos e podem ou não exalar odor. O termo óleo essencial foi
definido no século XVI por Paracelso, médico e alquimista suíço (SIMÕES, 2003).
O termo “óleo volátil” tem sido mais usado devido à relação com as propriedades físico-
químicas da planta, já que “óleo essencial” pode designar também outros produtos odorantes não
provindos de origem vegetal, que são as “essências heterosídicas” obtidas através da hidrólise
enzimática de heterosídeos (BUSATTA, 2006).
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
27
Os OEs são originados do metabolismo secundário das plantas e possuem composição
química complexa. São compostos de hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples e terpenos,
aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas,
cumarinas e compostos contendo enxofre, apresentando diferentes concentrações. Entre esses
compostos destacam-se os fenilpropanóides, preponderando os terpenóides (DABAGUE, 2008).
Estes materiais também são conhecidos por óleos etéreos e são líquidos oleosos,
aromáticos obtidos a partir de material vegetal (flores, brotos, sementes, folhas, galhos, cascas,
ervas, madeira, frutas e raízes) (BURT,2004). Podem ser extraídos de plantas através da técnica
de arraste a vapor, na grande maioria das vezes, e também pela prensagem do pericarpo de frutos
cítricos, que no Brasil dominam o mercado de exportação (BIZZO et al., 2009).
Os óleos essenciais obtidos por destilação por arraste a vapor e seus derivados podem ser
utilizados como repelentes e são considerados como uma alternativa aos convencionais pesticidas
químicos sintéticos, devido ao reduzido risco a saúde e da sua biodegradabilidade (VARONA et
al., 2010).
Estima-se que 3000 OEs são conhecidos, dos quais cerca de 300 são importantes
comercialmente, destinados principalmente para o mercado de flavorizantes e fragrancias.
(BURT,2004). Atualmente os óleos essenciais, além de serem utilizados como conservantes
naturais e fragrâncias em produtos cosméticos, novas aplicações como conservantes de alimentos,
promotores de crescimento em gado, pesticidas naturais em Agricultura Orgânica e inseticidas
estão surgindo. Tais aplicações são possiveis devido as propriedade químicas e biológicas que
esses óleos apresentam (RODRÍGUEZ-ROJO et al., 2012).
O Brasil tem lugar de destaque na produção de OEs, ao lado da Índia, China e Indonésia,
que são considerados os 4 grandes produtores mundiais. A posição do Brasil deve-se aos OEs de
cítricos, que são subprodutos da indústria de sucos. No passado, o país teve destaque como
exportador de OE de pau-rosa, sassafrás e menta. Nos dois últimos casos, passou à condição de
importador (BIZZO et al., 2009).
Embora todos os órgãos de uma planta possam acumular óleos essenciais, sua composição
pode variar conforme a localização (a exemplo, o óleo das cascas de canela é rico em aldeído
cinâmico, enquanto, as folhas e raízes dessa planta são ricas, respectivamente, em eugenol e
cânfora). Os óleos constituem os elementos essenciais contidos em muitos órgãos vegetais e estão
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
28
relacionados com diversas funções necessárias à sobrevivência vegetal exercendo papel
fundamental na defesa contra microrganismos (BIZZO et al., 2009).
O ambiente no qual o vegetal se desenvolve e o tipo de cultivo influem na composição
química dos óleos essenciais. A temperatura, umidade relativa do ar, duração total da exposição
ao sol e o regime de ventos exercem influência direta, principalmente nas espécies que possuem
estruturas histológicas de estocagem de óleos na superfície. A variabilidade na produção e teor de
óleos essenciais é conhecida por ser afetada por fatores ambientais tais como luz, disponibilidade
de nutrientes, estação do ano, período do dia, ciclo e parte da planta (POTZERNHEIM et al.,
2006).
O uso terapêutico de óleos essenciais tem se expandido por todo o mundo, sendo
amplamente utilizados contra doenças inflamatórias, alérgicas, reumáticas e artrite. Esses
tratamentos são reconhecidos através de experimentações clinicas, em especial por aplicação
tópica, via massagens. São poucos os estudos científicos sobre as ações biológicas dos OEs. Até
então, tem sido estabelecido, cientificamente, que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem
propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (OLIVEIRA et al.,2006).
Na aromaterapia, a via de administração mais comum para utilização de OEs é a cutânea,
porém a escolha de outras vias, tais como: oral, parenteral, retal, vaginal, sublingual ou nasal,
depende da orientação de um profissional habilitado como médicos, farmacêuticos, odontólogos e
enfermeiros, além da indicação clínica ou da forma farmacêutica em que está incorporado o óleo
essencial, ou das condições do paciente havendo, portanto, uma via adequada para cada caso
(BURT,2004). Os OEs, por serem naturais e biodegradáveis, podem atuar sobre várias
moléculas-alvo ao mesmo tempo, quando comparado a fármacos sintéticos, sendo assim, tornam-
se substâncias chave para a pesquisa de novos medicamentos. Os OEs são voláteis, ou seja,
durante o preparo de formulações é necessario encontrar a sua concentração ideal com intuito de
minimizar a evaporação e proteger o óleo da luz, oxidação e altas temperaturas. Para obter esse
resultado, as emulsões óleo-água (O/A) são uma das formulações preferidas para os OEs
(RODRÍGUEZ-ROJO et al., 2012).
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
29
2.3.1 Métodos de obtenção de óleos essenciais
Os OEs podem ser obtidos através de diferentes processos, dependendo da localização no
vegetal, quantidade e das características requeridas para o produto final. Os processos usuais são:
prensagem ou expressão, destilação por arraste a vapor, extração com solventes orgânicos
(extração por Soxhlet) e com Gás Carbônico (CO2) supercrítico. Dentre as técnicas citadas,
destacam-se a destilação por arraste a vapor e extração com solventes orgânicos, por serem de
extrema simplicidade e reduzido custo (BUSATTA, 2006).
O método de prensagem (FIGURA 1.5) faz uso de prensas hidráulicas. Após a extração é
necessária a utilização de solventes orgânicos para separar o óleo presente na torta obtida após a
prensagem. Os solventes mais utilizados são éter etílico, diclorometano e hexano, porém esses
solventes também extraem outros compostos lipofílicos além dos OEs. É necessário ressaltar que
mesmo após a separação do solvente do óleo podem ser encontrados resíduos de solvente
contaminando o mesmo.
FIGURA 1.5 Equipamento de prensagem utilizado para extração de óleos essenciais.
Fonte: ALEXANDRE, 2010.
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
30
O processo de extração de OEs por arraste a vapor é o mais utilizado. Tal método consiste
em colocar o material vegetal em um compartimento o qual pode ser uma dorna ou um balão de
fundo redondo. O vapor de água ao passar pelo material vegetal extrai os compostos voláteis da
planta. O vapor condensa ao chegar ao sistema de condensação sendo assim possível coletar o
óleo extraído no sistema de decantação. O óleo essencial, assim que obtido, é colocado em funil
de decantação para que haja uma separação minuciosa da água através da diferença de densidade
e imiscibilidade das fases. O método de extração utilizando o aparelho de Clevenger (FIGURA
1.6) é um exemplo de processo de arraste a vapor (CASTRO et al., 2005).
FIGURA 1.6 Representação do aparelho de Clevenger.
A extração por CO2 supercrítico (FIGURA 1.7) tem elevado custo devido ao fato de
trabalhar com altas pressões. Para a extração o CO2 é liquefeito através de compressão e em
seguida aquecido a 31oC . Nessa temperatura o CO2 atinge um estado no qual sua viscosidade é
igual à de um gás mas a capacidade de dissolução é semelhante a de um líquido. Após a extração
é realizada a conversão do CO2 ao estado gasoso novamente o que resulta em sua total
eliminação. Como vantagens da extração por CO2 supercrítico pode-se notar a não utilização de
solventes orgânicos, sendo assim o produto final obtido é mais puro já que não há traços de
solvente após a extração.
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
31
FIGURA 1.7 Esquema representativo do equipamento utilizado para extração supercrítica de óleos essenciais.
Fonte: Coelho et al., 1997
Na extração por Soxhlet (FIGURA 1.8) são utilizados solventes orgânicos para extração
preferencialmente apolares. A desvantagem é que os solventes apolares podem extrair também
outros compostos lipofílicos além do OE. Na extração o solvente passa através de um cartucho ou
compartimento contendo o vegetal, produzindo uma solução e levando-a consigo até o balão de
aquecimento. Como o solvente está sendo destilado, o soluto vai se concentrando no balão de
aquecimento. Tal método é útil quando a diferença de solubilidade do soluto em ambos os
solventes não é muito grande.
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
32
FIGURA 1.8 Equipamento de Soxhlet.
2.3.2 Caracterização química de óleos essenciais
A análise química de separação e identificação dos constituintes dos óleos é feita por
meio de técnicas cromatográficas como Cromatografia Gasosa (CG) e Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE). Técnicas espectrométricas também podem ser utilizadas acopladas à
separação, dentre as quais as mais frequentes são: Espectroscopia de Ultravioleta (UV),
Infravermelho(IV), Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono e
Espectrometria de Massas (EM). O uso de bibliotecas e bancos de dados informatizados contendo
informações já existentes na literatura a respeito de um grande número de substâncias conhecidas
é padronizado e constitui-se em ferramenta que facilita e acelera a caracterização do material
(TELES, 2003).
Para a avaliação da composição química dos OEs, considera-se que os avanços das
técnicas analíticas instrumentais, aliadas à simplicidade, precisão e rapidez, tornaram a CG um
dos processos mais difundidos para análises químicas, por ser uma técnica de separação eficiente
para esclarecer uma determinada estrutura, tanto na indústria quanto nos laboratórios de pesquisa
científica. Diversos pesquisadores destacam a CG entre as melhores ferramentas analíticas e de
extrema utilidade na análise de misturas complexas (CARVALHO, 2010)
Para as análises cromatográficas de amostras que possuem componentes com uma larga
faixa de pontos de ebulição deve-se utilizar programas de variação de temperatura. Estes são
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
33
utilizados para simplificar e/ou acelerar a separação, que é condição básica para quantificação e
identificação de componentes da amostra. Na análise de OEs, é necessário começar com
temperaturas mais baixas para a separação de componentes mais voláteis e depois aumentar
controladamente para separação dos componentes com pontos de ebulição mais elevados.
A CG é uma técnica muito utilizada em análises de substâncias termoestáveis e voláteis
ou passíveis de derivatização. Nela os detectores de captura de elétrons (ECD), espectrometria de
massas (EM), detector de ionização de chama (FID) são os mais citados. A CG-EM oferece ótima
combinaçao de compatibilidade, sensibilidade e especificidade dos dados. (PEREIRA; AQUINO
NETO , 2000)
FIGURA 1.9 Esquema representado funcionamento de um cromatógrafo gasoso.
Fonte: EBAH, 2013.
A combinação da CG com a EM é relativamente simples, uma vez que as características
de funcionamento do cromatógrafo a gás são suficientemente compatíveis com a necessidade de
alto vácuo do espectrômetro de massas (CHIARADIA et al., 2008).
O funcionamento de um EM pode ser descrito, resumidamente, da seguinte forma: a
substância de interesse é bombardeada com um feixe de elétrons, ocorrendo sua fragmentação na
forma de íons positivos, estes íons possuem uma relação massa carga específica (m/z). Esses são
então direcionados ao analisador de massas onde, devido à diferença na relação m/z, são
diferentemente acelerados e com isto separados. Existem muitos aceleradores de massas:
quadrupolos, focalização simples, dupla entre outros. A função do detector é coletar o íons e
amplificar o sinal gerado por eles, geralmente utilizando um multiplicador de elétrons. O registro
de sinais é chamado de espectro de massas. A intensidade do sinal é proporcional à quantidade de
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
34
íons formados. Outra informação importante obtida através do espectro é a massa da molécula e
de seus fragmentos (CHIARADIA et al., 2008).
2.4 Atividade Antioxidante
Por definição os radicais livres são qualquer átomo, molécula ou fragmento de molécula
contendo um ou mais elétrons desemparelhados no seu orbital mais externo, sendo que esse
elétron desemparelhado ocupa sozinho um orbital atômico ou molecular. Esse elétron não
emparelhando torna o átomo extremamente instável. Na tentativa de estabilizar-se, ele reage com
um elétron de outro átomo. Em sistemas biológicos os radicais livres reagem com os elétrons das
biomoléculas que estão a sua volta, ou seja, proteínas, lipídios, carboidratos e ácidos nucleicos.
Estas reações podem, consequentemente, levar a alterações de função e a morte celular
(LAGUERRE et al., 2007).
Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) e as Espécies Reativas de Nitrogênio (ERNs) são
compostos formados quando as moléculas de oxigênio ou nitrogênio se combinam com outras
moléculas gerando um grande número de elétrons livres ( SILVA et al., 2010).
No organismo, os radicais livres encontram-se envolvidos na fagocitose, regulação do
crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes. No
entanto, seu excesso traz efeitos prejudiciais, tais como a lipoperoxidação de membranas e
oxidação de proteínas. EROs incluem os radicais livres, como o ânion superóxido, radicais
hidroxila e peroxila, bem como espécies não radicalares, como peróxido de hidrogênio,
peroxinitrito e oxigênio singlete. NAD(P)H oxidase, xantina oxidase, mieloperoxidase,
cicloxigenase e lipoxigenase são grandes fontes enzimáticas de EROs em células de mamíferos,
enquanto a radiação UV representa um exemplo de um fator ambiental de geração de EROs
(SILVA et al., 2011).
A formação de radicais livres conduz ao estresse oxidativo, processo no qual uma série de
reações é iniciada originando alterações em proteínas extracelulares e modificações celulares
sendo que o maior dano é a peroxidação de ácidos graxos presentes na dupla camada lipídica das
células causando morte celular (PODSEDEK, 2007).
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
35
Um antioxidante é qualquer substância capaz de retardar ou impedir danos devidos à
oxidação (como rancificação e formação de off-flavors em alimentos) quando utilizada em
pequenas concentrações, quando em comparação com o agente oxidante. As substâncias
antioxidantes apresentam diferentes modos de proteção contra a oxidação. Os antioxidantes
podem agir em diversas etapas do processo oxidativo, funcionando por diferentes mecanismos e
são, portanto, classificadas em duas categorias principais: antioxidantes primários e secundários
(SILVA et al., 2010).
São considerados antioxidantes primários os compostos capazes de inibir ou retardar a
oxidação por inativação de radicais livres graças à doação de átomos de hidrogênio ou de
elétrons, o que os transforma em substâncias estáveis. Os antioxidantes secundários apresentam
uma grande variedade de modos de ação: ligação de íons metálicos (alteração de valência);
inativação de EROs, conversão de hidroperóxidos em espécies não-radicalares ou absorção de
radiação UV (SILVA et al., 2010; SILVA et al., 2011)
Vários estudos epidemiológicos indicaram que a alta ingestão de produtos vegetais está
associada com uma redução no risco de uma série de doenças crônicas como aterosclerose e
câncer. Estes efeitos têm sido particularmente atribuídos aos compostos que possuem atividade
antioxidante. Os principais antioxidantes nos vegetais são as vitaminas C e E, os carotenóides e
os compostos fenólicos, especialmente os flavonóides (PODSEDEK, 2007)
Os métodos para determinar a capacidade antioxidante podem ser baseados na captura do
radical peroxila: Oxygen Radical Antioxidant Capacity (ORAC) e Total Radical Trapping
Antioxidant Parameter (TRAP); poder de redução do metal: Ferric Ion Reducing Antioxidant
Power (FRAP) e Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity (CUPRAC), captura do radical
hidroxila (método de desoxirribose), captura do radical orgânico 2,2'-azino-bis(3-
ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS•), e 2,2-difenil-1- picril-hidrazil (DPPH•),
quantificação de produtos formados durante a peroxidação de lipídios: Thiobarbituric Acid
Reactive Substances (TBARS) e , oxidação do LDL (SÁNCHEZ-MORENO, 2002, SILVA et al.,
2011).
O método DPPH• é baseado na captura do radical 2,2-difenil-1- picril-hidrazil por
antioxidantes, produzindo um decréscimo da absorbância a 518 nm (FIGURA 1.10). O DPPH• é
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
36
um radical livre estável que pode ser obtido diretamente por dissolução do reagente em meio
orgânico.
FIGURA 1.10 Estabilização do radical livre DPPH.
A busca por antioxidantes naturais para uso em produtos alimentícios, cosméticos e
farmacêuticos vem representando um importante desafio para a pesquisa industrial nos últimos
20 anos, tendo como intuito substituir os antioxidantes sintéticos. Os antioxidantes sintéticos
mais utilizados pela indústria são o butil - hidroxitolueno (BHT) e o butil - hidroxianisol (BHA),
sendo que estes têm despertado preocupação quanto às doses de segurança e toxicidade, pois
podem estar envolvidos em muitos riscos à saúde, incluindo câncer (BERGAMASCHI, 2010).
2.5 Atividade Antimicrobiana
O desenvolvimento de resistência de patógenos humanos e animais a antimicrobianos é
um dos casos mais bem documentados de evolução biológica e um sério problema tanto em
países desenvolvidos como em desenvolvimento. O uso irracional de antimicrobianos em alguns
países da Europa tem resultado na resistência de cepas de bactérias, causando assim um sério
problema de saúde pública (DUARTE, 2006).
Infecções humanas, particularmente aquelas envolvendo a pele e mucosas constituem um
sério problema, especialmente em países desenvolvidos tropicais e subtropicais. Muitas plantas
dos biomas brasileiros, tais como o cerrado, a floresta amazônica e a mata atlântica têm sido
utilizadas como medicamentos naturais pelas populações locais no tratamento de várias doenças
tropicais, incluindo esquistossomose, leishmaniose, malária e infecções fúngicas e bacterianas.
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
37
Além disso, muitas plantas exóticas foram introduzidas no Brasil desde a colonização e
incorporadas na medicina popular (FIORENTINI et al., 2001; DUARTE, 2006).
Tem sido estabelecido cientificamente que cerca de 60% dos OE possuem propriedades
antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas. Alguns OEs têm sido usados como
terapia complementar em infecções com fungos e bactérias incluindo acne, gengivites e
candidiase vaginal (OLIVEIRA et al., 2006). O óleo de melaleuca, derivado da planta nativa da
Austrália Melaleuca alternifolia (Myrtaceae), tornou-se um agente antimicrobiano tópico
alternativo, com propriedades antibacteriana e antifúngica (OLIVEIRA et al., 2011)
A literatura científica na área da ciência e tecnologia de alimentos tem mostrado, nos
últimos anos, um enfoque no estudo do potencial antimicrobiano dos óleos essenciais
considerando a sua inclusão nos chamados sistemas de bioconservação de alimentos. A
bioconservação de alimentos é um sistema de preservação amplamente aceito, sendo referido
como um procedimento natural capaz de prover a extensão da vida útil e satisfatória segurança
microbiológica de alimentos (FIORENTINI et al., 2001; )
A atividade antimicrobiana foi documentada para os óleos essenciais, extraídos de várias
espécies de vegetais, tais como, hortelã-pimenta (Mentha piperita), Achillea frangatissima,
melaleuca (Melaleuca alternifólia), rosa-de-Jericó (Althea rósea) e capim-limão (Cymbopogon
citratus), pela presença de componentes como timol, carvacrol, eugenol, 1,8-cineol, linalol,
pineno, cariofileno e citral (AMARAL, 2004).
Os OEs podem ser incorporados em formulações farmacêuticas de uso tópico para o
tratamento de doenças da pele. No entanto, devido à complexidade química dos OEs,
susceptibilidade à degradação, volatilidade e insolubilidade em água, é necessário utilizar de
mecanismos que os protejam contra tais problemas. As emulsões Óleo em Água (O/A) são as
mais interessantes para veiculação de OEs (FLORES et al., 2011)
A pesquisa de novos agentes antimicrobianos se faz necessária devido ao surgimento de
microrganismos resistentes e de infecções oportunistas fatais, associadas a AIDS, quimioterapia
antineoplásica e transplantes. O estudo de agentes antimicrobianos tem grande abrangência,
sendo ponto crucial em vários setores do campo farmacêutico e cosmético. Atualmente, existem
vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica dos extratos vegetais. Os
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
38
mais conhecidos incluem método de difusão em ágar, método de macrodiluição e microdiluição.
(OSTROSKY et al., 2008)
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada através da determinação da
menor quantidade da substância necessária para inibir o crescimento do microrganismo-teste;
esse valor é conhecido como Concentração Inibitória Mínima (CIM). Um aspecto bastante
relevante na determinação da CIM de extratos vegetais é a preocupação em relação aos aspectos
toxicológicos, microbiológicos e legais pertinentes aos compostos naturais ou suas combinações
(OSTROSKY et al., 2008)
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um método físico,
no qual um microrganismo é desafiado contra uma substância biologicamente ativa em meio de
cultura sólido e relaciona o tamanho da zona de inibição de crescimento do microrganismo
desafiado com a concentração da substância ensaiada (PINTO et al., 2003). A aplicação do
método de difusão se limita a microrganismos de crescimento rápido, sendo eles aeróbios ou
aeróbios facultativos. A avaliação é comparativa frente a um padrão biológico de referência
(controle positivo) e a zona ou o halo de inibição de crescimento é medida partindo-se da
circunferência do disco ou poço, até a margem onde há crescimento de microrganismos
(OSTROSKY et al., 2008).
O uso de extratos vegetais com conhecida atividade antimicrobiana pode adquirir grande
importância nos tratamentos de diversas doenças. Inúmeros estudos, em diferentes países, são
realizados para comprovação da eficácia desses produtos naturais. Estes produtos são
reconhecidos por suas substâncias ativas, como é o caso dos compostos fenólicos, que fazem
parte dos OEs e dos taninos (NASCIMENTO et al., 2000).
2.6 Emulsões
Emulsão é um sistema termodinamicamente instável resultante da mistura de dois líquidos
imiscíveis entre si e uma terceira fase contendo agente emulsificante (PIANOVSK et al., 2008).
De acordo com a natureza da fase externa, contínua ou ainda conhecida como dispersante,
podem ser classificadas em: emulsão água em óleo (A/O) a que contém água como fase dispersa
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
39
sob a forma de pequenas partículas na fase oleosa e óleo em água (O/A) a emulsão composta pela
dispersão de material oleoso/graxo na fase aquosa (LACHAMAN et. al 2001).
A instabilidade de uma emulsão pode se manifestar das seguintes formas: cremeação,
quando as partículas menos densas sobem para o topo da formulação; floculação: a força de
repulsão entre as moléculas é diminuída e elas se associam de maneira fraca e reversível por
agitação; coalescência: as gotículas da fase interna se unem e formam outra gotícula sendo este
processo irreversível; e a inversão quando ocorre a inversão de fase, a externa torna-se interna e
vice-versa (PIANOVSK et al., 2008).
2.6.1 Nanoemulsões
A nanotecnologia é focada em caracterização, fabricação, manipulação e aplicação de
estruturas biológicas e não biológicas na escala nanométrica. O prefixo “nano” está relacionado a
uma escala de medida em que um nanômetro representa um bilionésimo do metro ou um
milionésimo do milímetro. Estruturas nessa escala apresentam propriedades funcionais únicas
não encontradas na escala macro. Os nanocompósitos são materiais híbridos, nos quais pelo
menos um de seus componentes tem dimensões nanométricas. A principal razão para as
diferenças no comportamento entre materiais compostos e nanocompósitos está relacionada com
a elevada área superficial destes últimos, resultando em intensa interação entre a matriz na qual
estão inseridos e as nanopartículas (ASSIS et al., 2012).
As nanoemulsões são sistemas coloidais carreadores de fármacos promissores para
diversas aplicações terapêuticas. Sistemas veículos para uso oral, ocular e intravenoso foram
desenvolvidos e demonstraram uma redução dos efeitos colaterais de vários fármacos potentes e
efeitos farmacológicos prolongados dos mesmos na forma de nanoemulsão (GERSHANIK;
BENITA, 1996; ABDULRAZIK et al., 2001). As propriedades específicas de tamanho reduzido
de glóbulo e maior área interfacial permitem que as nanoemulsões apresentem velocidade e taxa
de penetração superior a das macroemulsões correspondentes, sendo com isto úteis para produtos
de uso tópico (SONNEVILLE-AUBRUN et al., 2004) ou mesmo parenteral (MULLER et al.,
1998).
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
40
A aplicação de nanoemulsões tem se intensificado nos últimos anos em função de
diversas vantagens apresentadas por este sistema. Entre elas, a prevenção de processos de
instabilidade como cremeação, sedimentação, floculação e coalescência, em função da presença
de gotículas de tamanho reduzido; além proporcionar maior penetração na pele, tornando a
absorção de ativos mais eficiente por esta via. As nanoemulsões são melhores absorvidas pela via
oral e em geral aumentam a biodisponibilidade de fármacos por essa via (MULLER et al., 1998).
As nanoemulsões são largamente empregadas na substituição de lipossomos e vesículas, pois
possuem maior capacidade de encapsulação de fármacos lipofílicos. Além disso, na preparação
de lipossomos são utilizados métodos de preparação laboriosos e lipídios muito onerosos
comparados aos métodos utilizados para nanoemulsões (TADROS et al., 2004).
Basicamente, estes sistemas podem ser produzidos através de dois processos clássicos: da
emulsificação espontânea como o método TIF (temperatura de inversão de fases) ou através da
inversão de fases por composição ou utilizando um agitador de alto poder de cisalhamento,
permitindo um maior controle do tamanho da gotícula, bem como, uma maior opção de
componentes. Pode-se também obter nanoemulsões por uma adaptação do método descrito por
Fessi e colaboradores (1989), baseado na formação cineticamente controlada de nanogotas
geradas pela difusão de um solvente orgânico em água (efeito Marangoni).
O maior problema na manipulação de emulsões O/A nanométricas é a instabilidade física,
a qual pode aparecer como separação de fases devido à cremagem, provocada por diferenças de
densidade, floculação, devida à agregação das partículas em colisão; a maturação de Ostwald,
que é a difusão molecular dependente do tamanho, polidispersividade e solubilidade da fase
dispersa. Consequentemente é extremamente importante determinar os processos e condições
ótimos de emulsificação e de homogeneização requeridos para a obtenção de emulsões
nanométricas com alta estabilidade física. (YILMAZ e BORCHERT, 2005).
Micro e nanoemulsões podem ser veículos excelentes para fármacos pouco permeáveis
e/ou altamente lipofílicos visto que podem ser manufaturados com excipientes que possuem ação
solubilizante ou mesmo promotora de absorção. Nanoemulsões para uso oral são quase que
exclusivamente do tipo O/A, e similarmente a macroemulsões promovem absorção gastrintestinal
aumentada e reduzem variações intra e inter-indivíduos para uma grande variedade de fármacos.
Além disso, devido a sua grande área interfacial exibem excelentes propriedades de liberação de
CAPÍTULO 1
REVISÃO DA LITERATURA
41
fármacos e também oferecem certo grau de proteção contra degradação e melhoram algumas
propriedades organolépticas dos ativos (ECCLESTON, 2002).
CAPÍTULO 1
OBJETIVOS GERAIS
42
3. OBJETIVOS GERAIS
3.1 Objetivo Geral
Caracterização dos óleos essencias de Microlicia graveolens, Melaleuca leucadendron e
de extratos hidroalcoólicos das folhas e caules de Vellozia squamata para o desenvolvimento de
nanoemulsões para uso farmacêutico
3.1 Objetivos Específicos
Obter dos óleos essenciais através de hidrodestilação das partes aéreas das espécies
vegetais Melaleuca leucadendron e Microlicia graveolens.
Caracterizar quimicamente os óleos essenciais das espécies vegetais Melaleuca
leucadendron e Microlicia graveolens através de Cromatografia Gasosa acoplada a
Espectrometria de Massas.
Avaliar a atividade antioxidante in vitro dos óleos essenciais de Melaleuca leucadendron
e Microlicia graveolens.
Desenvolver nanoemulsões a partir dos óleos essenciais utilizando os métodos de inversão
de fases.
Obter de extratos hidroalcoólicos de folhas e caules de Vellozia squamata.
Realizar o estudo farmacognóstico dos extratos hidroalcoolicos das folhas e do caule de
Vellozia squamata.
Avaliar a atividade antioxidante in vitro dos extratos hidroalcoólicos das folhas e do caule
de Vellozia squamata.
Desenvolver nanoemulsões a partir dos extratos utilizando os métodos de inversão de
fases.
Caracterizar e avaliar a estabilidade das nanoemulsões obtidas.
CAPÍTULO 1
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49
CAPÍTULO 2
Microlicia graveolens
CAPÍTULO 2
INTRODUÇÃO
50
1 INTRODUÇÃO
A Família Melastomataceae possui aproximadamente 4.570 espécies e 150 a 166 Gêneros
e têm distribuição tropical. No Brasil é a sexta maior Família de Angiospermas com 68 gêneros e
mais de 1.500 espécies, que se distribuem desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul, estando
presente em praticamente todas as formações vegetacionais com um número variável de espécies
(CASSIANO et al., 2010).
Segundo a última classificação realizada por RENNER (2004), Melastomataceae foi
divida em duas subfamílias: Kibessioideae Naudin e Melastomatoideae Naudin. A subfamília
Kibessioideae, com apenas uma tribo, Kibessieae Krasser, apresenta ocorrência restrita ao
continente Asiático. Já a subfamília Melastomatoideae engloba oito tribos: Astronieae Triana,
Sonerileae Triana, Rhexieae DC., Microlicieae Triana, Melastomeae DC., Miconieae DC.,
Merianieae Triana e Blakeeae Hook. Dentre as oito tribos atribuídas a esta subfamília, apenas
Blakeeae, Merianieae e Microlicieae possuem ocorrência restrita à América do Sul, sendo as
demais distribuídas tanto pela América do Sul, como também pela Ásia, África e Madagascar. De
todas as tribos citadas anteriormente, Miconieae é a mais diversa, compreendendo cerca de 30
Gêneros e aproximadamente 2.200 Espécies (MORLEY; DICK, 2003).
Os estudos sobre as características anatômicas de espécies de Melastomataceae são
escassos, destacando-se o trabalho de Vale (1999) que fez uma comparação morfoanatômica
entre populações de Marcetia taxifolia (A. St.-Hil.) DC. e o trabalho de Reis e colaboradores
(2005) sobre a anatomia foliar de Melastomataceae, entretanto, apenas uma espécie do Gênero
Microlicia foi descrita, a M. polystemma. Segundo Wurdack (1973), o polimorfismo existente em
espécies de Microlicia é muito comum, sendo esta a razão das espécies serem de difícil
identificação.
A tribo Microlicieae, recentemente circunscrita por Fritsch et al. (2004), compreende 6
Gêneros e cerca de 250 espécies. A maior parte dos Gêneros (Lavoisiera DC., Stenodon Naudin,
Trembleya DC., Chaetostoma DC.) é endêmica no Brasil. Já os Gêneros Microlicia D. Don e
Rhynchanthera DC. apresentam distribuição mais ampla, pois algumas de suas espécies ocorrem
em outros países da América do Sul.
CAPÍTULO 2
INTRODUÇÃO
51
O Gênero Microlicia (micros = pequeno, elikia = estatura) foi estabelecido por Don
(1823), e circunscrito originalmente por apresentar hipanto globoso, cálice com cinco lacínias
persistentes, cinco pétalas, dez estames, anteras oblongas, obliquamente deiscentes por poro
simples, e conectivo longamente filiforme com base calcarada (Romero, 2003).
O Gênero Microlicia apresenta aproximadamente 170 espécies. As Espécies de Microlicia
distribuem-se principalmente em Minas Gerais, Bahia e Goiás, com algumas ocorrendo no
Paraná, São Paulo, Rio de Janeiro, Mato Grosso do Sul e Mato Grosso e em menor número, no
Piauí, Maranhão, Pará, Amazonas e Rondônia. Apenas três espécies são encontradas no Peru,
Bolívia, Venezuela e Guianas. No Brasil, as espécies ocupam, preferencialmente, os campos
rupestres e adjacências, campos de altitude e campos limpos associados a cerrado formando, na
maioria das vezes, grandes populações. As Espécies apresentam grande diversidade de hábitos,
desde herbáceo até arbustivo, ocorrendo muitas espécies arbóreas, e mais raramente trepadeiras e
epífitas, que permitem a ocupação de ambientes distintos e diversificados (CASSIANO et al.,
2010; ROMERO 2003).
As espécies oriundas da Família Melastomataceae possuem um número reduzido de
espécies conhecidas como medicinais e tradicionalmente a família apresenta plantas de uso
ornamental. Várias espécies são utilizadas em tratamentos tópicos, sendo digno de nota o uso de
espécies do Gênero Tibouchina para aliviar dores. Entretanto, poucos estudos etnomedicinais,
fitoquímicos e farmacológicos existem sobre essa importante família.
A M. graveolens DC.,(FIGURA 2.1) também é endêmica de Minas Gerais (Grão Mogol,
Serra do Cabral, Diamantina, Serro, Itambé do Mato Dentro, Serra do Cipó, Serra do Caraça,
Ouro Preto e Ouro Branco). A M. graveolens tem o nome popular de "Roxinha" e apresenta nos
ramos, folhas, hipanto e lacínias do cálice tricomas glandulares pedicelados, com glândulas
translúcidas e amarelas. A M. graveolens apresenta o indumento denso, constituído também por
tricomas glandulares sésseis, e as glândulas apresentam um forte odor de terebentina. O epíteto
específico refere-se à margem crenulada e ciliada das folhas, formadas de tricomas glandulares
pedicelados longos (ROMERO, 2010).
CAPÍTULO 2
INTRODUÇÃO
52
FIGURA 2.1 Microlicia graveolens (Roxinha).
A M. graveolens é endemica do Morro Sant’Ana em Ouro Preto sendo assim de fácil
coleta. O uso popular dessa planta é principalmente ornamental, mas devido ao odor de
terebentina dessa espécie, há relatos de uso dessa planta para tratamentos tópicos de algumas
doenças como dermatites e micoses. A escolha dessa espécie vegetal para o estudo é
principalmente devido ao relato popular de seu uso assim como a facilidade de obtenção do
material vegetal.
CAPÍTULO 2
OBJETIVOS
53
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Obter e caracterizar química e biologicamente os óleos essenciais da espécie Microlicia
graveolens. Produzir e caracterizar nanoemulsões do tipo O/A contendo os óleos essenciais pelo
método de inversão de fases.
2.2 Objetivos específicos
Obter óleos essenciais através de hidrodestilação das partes aéreas da espécie vegetais M.
graveolens.
Caracterizar quimicamente os óleos essenciais da espécie vegetal M. graveolens através
de Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas.
Avaliar a atividade antioxidante in vitro dos óleos essenciais de Microlicia graveolens.
Avaliar a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de M. graveolens.
Desenvolver nanoemulsões a partir do óleos essencial utilizando os métodos de inversão
de fases;
Caracterizar e avaliar a estabilidade das nanoemulsões obtidas.
CAPÍTULO 2
MATERIAIS
54
3 MATERIAIS
Fase aquosa
A fase aquosa utilizada foi água recém destilada.
Tensoativos
Como tensoativos foram utilizados o PEG-40 Hydrogenated castor oil que é tensoativo
não-iônico etoxilado derivado de vegetais e o SPAN 80 tensoativo não-iônico baseado no ácido
oleico e sorbitol. Ambos foram gentilmente cedidos pela empresa Croda do Brasil Ltda.
DPPH
O reagente DPPH (2,2 – difenil – 1 – picrilhidrazil) foi adquirido da empresa Sigma.
CAPÍTULO 2
MÉTODOS
55
4 MÉTODOS
4.1 Obtenção dos Materiais vegetais
A espécie vegetal M. graveolens DC foi coletada na região do Morro Sant’Ana em Ouro
Preto-MG (Latitude : 20o22’36’’S; Longitude: 43
o29’20’’O; Altitude: 1436.5 m). Foram
realizadas duas coletas no mesmo local. A primeira coleta ocorreu em dezembro de 2011 e a
segunda em agosto de 2012. O material vegetal foi identificada por Maria C.T.B. Messias e o
voucher da espécime (n º OUPR-5731) foi depositado no Herbário do Departamento de Botânica
localizado no Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto-MG.
Foram utilizadas as folhas frescas no processo de extração do OE.
4.2 Extração dos Óleos Essenciais
A extração dos OE foi realizada através de hidrodestilação das partes aéreas das espécies
vegetais com a utilização de um hidrodestilador de caldeira aquecida Hidrodestilador Linax® (
FIGURA 2.2) o qual foi utilizado para extração de óleos essenciais. As folhas foram retiradas dos
caules e em seguida rasuradas. O material foi pesado e depositado numa dorna de 2,6 L, montada
com um fundo móvel perfurado para facilitar a descarga. Em seguida o aparelho foi abastecido
com água e teve inicio o processo de hidrodestilação.
FIGURA 2.2 Hidrodestilador Linax®.
Fonte: Disponível em: www.linax.com.br.
CAPÍTULO 2
MÉTODOS
56
O tempo de extração foi de aproximadamente 3 horas. Os óleos essenciais obtidos foram
em seguida secos com sulfato de sódio anidro e mantidos sob refrigeração até as análises
posteriores.
4.3 Caracterização Química dos Óleos Essenciais
Para análises de Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM)
foi utilizado um cromatógrafo a gás GCMS-QP2010 Plus Shimadzu (FIGURA 2.3) disponível no
Laboratório de Caracterização Molecular e Espectrometria de Massas. Como fase estacionária foi
utilizada uma coluna capilar de sílica fundida Zebron™ Inferno™ (ZB-5HT) com dimensões: 30
m x 0,25 mm x 0,10 µm. As condições foram:
Temperatura inicial: 60 °C
Temperatura final: 240 °C
Rampa: 5 °C/ min.
Injetor: 240 °C
Detector: 260 °C
Gás de arraste: Hélio, fluxo: 1,0 mL/min
FIGURA 2.3 GCMS-QP2010 Plus Shimadzu.
CAPÍTULO 2
MÉTODOS
57
Os espectros de massas dos constituintes foram comparados com os padrões existentes na
biblioteca digital do National Institute of Standards and Technology (NIST) do equipamento. Em
seguida, foram feitas comparações visuais com espectros de massa de substâncias encontrados na
literatura. Os tempos de retenção dos picos maiores, mais facilmente identificados pelo espectro
de massa, foram comparados com os tempos de retenção destas substâncias registrados em
catálogos, observando-se a diferença que se manteve aproximadamente constante para as demais
substâncias identificadas.
4.4 Avaliação da atividade antioxidante
Os óleos essenciais foram avaliados quanto à capacidade de sequestrar o radical DPPH
(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), que é estável e de coloração roxa à temperatura ambiente.
Foram utilizados 2,5 mL de soluções dos óleos essenciais em etanol, nas concentrações de 0,5;
1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 mg/mL misturadas com 1,0 mL da solução de DPPH em etanol a 0,3 mM.
A absorbância foi medida em 518 nm, em espectrofotômetro da marca Thermo
Spectronic, modelo Helios α, após os tempos de 30 e 60 minutos de reação à temperatura
ambiente (25°C). Solução dos óleos essenciais (2,5 mL) com etanol (1,0 mL) foi utilizada como
branco. Como controle negativo foi utilizado 1,0 mL da solução de DPPH 0,3mM com 2,5 mL de
etanol.
O decréscimo na absorbância das soluções foi medido e a porcentagem de inibição do
DPPH foi calculada a partir da fórmula:
% I = (ABScontrole-ABSamostra/ABScontrole) x 100 (EQUAÇÃO 2.1)
Onde:
% I é o percentual de inibição
ABScontrole é a absorbância do controle negativo
ABSamostra é a absorbância da amostra diminuído o valor da absorbância do branco de cada concentração dos extratos.
A partir dos dados obtidos foram feitos gráficos relacionando a porcentagem de inibição
com os valores das concentrações dos óleos essenciais. O (IC 50%). Foi obtido através da
regressão linear e determinando a concentração que causa 50% de inibição do DPPH.
CAPÍTULO 2
MÉTODOS
58
4.5 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
As seguintes bactérias foram utilizadas na investigação da atividade antimicrobiana:
Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Staphylococcus saprophyticus (ATCC 15305),
Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Escherichia coli
(ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC
25923).
A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método de difusão em disco, medindo os
diâmetros dos halos de inibição formados. Os óleos essenciais em estudo foram utlizados puros e
diluídos em concentrações que 1:2 em dimetilsufóxido (DMSO). Discos de papel filtro medindo
6 mm de diâmetro foram impregnados com 10 µL dos óleos essenciais e as diluições, e em
seguidas colocados na superfície de placas de petri contendo Agar Mueller Hinton previamente
inoculado com uma suspensão bacteriana com turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala de Mc
Farland. As culturas foram incubadas a 35 ± 2ºC por 18-24h (OSTROSKY et al., 2008). Como
controle negativo usou-se disco impregnado com DMSO e como controles positivos tetraciclina e
fluconazol. Os resultados foram classificados de acordo com o critério: halo de inibição maior
que 8,0 mm – positivo (+) e halo de inibição menor que 8,0 mm ou ausente – negativo (-)
(PAREKH; CHANDA , 2007; SANTOS et al., 2007).
4.6 Obtenção das Formulações
As nanoemulsões foram preparadas pelo método de inversão de fases. A técnica consistiu-
se em aquecer as fases aquosa e oleosa separadamente até 75 2 ºC e, em seguida, verteu-se a
fase aquosa sobre a fase oleosa sob agitação constante a 600 rpm (Agitador Fisatom, mod 713D)
até resfriamento à temperatura ambiente, conforme método descrito por Santos et al (2005,
2006).
CAPÍTULO 2
MÉTODOS
59
TABELA 2. 1 Composição das formulações.
Componentes da formulação Porcentagem (%)
Monooleato de Sorbitano 4,0
PEG-40 Hydrogenated Castor Oil 6,0
Óleo de soja 5,0
Óleo essencial de M. graveolens 5,0
Água destilada 80,0
4.7 Ensaios de estabilidade acelerada
Após 24 horas da sua manipulação, as nanoemulsões foram submetidas a ensaios
preliminares para determinar a sua estabilidade por meio de centrifugação e processos de estresse
térmico (FERRARI; ROCHA FILHO, 2011).
4.7.1 Centrifugação
3,0 mL de nanoemulsão foram acondicionados em tubos de ensaio e centrifugados a 2500
rpm (1398 g) por 1h. Foi utilizada a Centrifuga Excelsa Baby FANEM® Centrifuge II. Em
seguida, as amostras foram analisadas macroscopicamente quanto à cremeação e separação de
fases. O teste foi realizado em triplicata. Foram consideradas pré-estáveis as formulações que não
apresentaram cremeação ou separação de fases após o teste.
4.7.2 Estresse térmico
As nanoemulsões foram submetidas a aquecimento em banho-maria (Thermomix BM 18
BU da Braun. Biotech Internacional, Alemanha) sendo gradualmente aquecidas de 40 a 80°C. O
aumento da temperatura ocorreu de 5 em 5°C, mantendo-se cada temperatura por 30 minutos. As
nanoemulsões foram analisadas macroscopicamente quanto à ocorrência de cremeação e
separação de fases após cada aumento de temperatura.
CAPÍTULO 2
MÉTODOS
60
4.7.3 Determinação do valor de pH
A determinação do valor de pH foi feita através de pHmetro Lutron ® modelo PH-221. O
valor de pH foi determinado em triplicata . O pH foi medido inserindo-se o eletrodo diretamente
na amostra em temperatura ambiente de 25°C (SANTOS et al., 2005).
4.7.4 Determinação do tamanho de partícula
A distribuição do tamanho de partícula foi determinada, no equipamento N5 Submicron
Particle Size Analyzer (Beckman Coulter). Para isto 20,0 uL da nanoemulsão foram diluídos em
4980,0 µL de água ultrapura (Milli-Q Millipore) à temperatura ambiente. O ângulo de incidência
do laser na amostra foi de 90°. As medidas foram realizadas em triplicata (OLIVEIRA et al.,
2011a).
4.7.5 Determinação do comportamento reológico das nanoemulsões
As determinações do comportamento reológico das formulações foram realizadas no
equipamento Brookfield Rheometer model RVDV-III tipo cone/placa, acoplado a um Software
Rheocalc versão V 3.0, utilizando o spindle CP 40 e com a amostra (0,50 g) à 25 °C. As
medições foram feitas utilizando uma faixa de velocidade de rotação de 50 a 250 rpm, com uma
variação 50 rpm para se obter uma curva ascendente. A curva descendente foi obtida diminuindo
as rotações 250-50 rpm (Santos et al., 2011). O comportamento reológico das formulações foi
avaliado por meio da Lei das Potências (GUARANTINI et al, 2006).
= k .n
(EQUAÇÃO 2.2)
Onde τ: tensão de cisalhamento; κ: índice de consistência; γ: taxa de deformação e n: taxa de
fluxo.
CAPÍTULO 2
RESULTADOS
61
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Obtenção do material Vegetal
O ambiente onde a espécie vegetal M. graveolens foi coletada apresenta solo arenoso,
pedregoso e úmido, além de apresentar poucos indivíduos esparsos, não caracterizando uma
grande população dessa espécie. Durante a coleta, foi necessário coletar de parte do caule da
planta já que as folhas são muito pequenas e de difícil retirada. Ocorreram duas coletas sendo
uma realizada em dezembro de 2011 e outra em agosto de 2012. Foram obtidos na primeira
coleta 720 g de material vegetal e na segunda 850 g.
5.2 Extração de óleos essenciais
Foram utilizados no primeiro processo de extração 400 g de folhas frescas de M.
graveolens. Na segunda extração foram utilizados 540 g de folhas frescas. O rendimento final foi
de 3.5 % para a primeira extração e de 6 % para a segunda extração. Pode-se notar que a maior
parte do óleo essencial extraído (aproximadamente 80 % do total ) foi obtido na primeira hora de
destilação em ambas as destilações.
Castro e colaboradores (2008) estudaram o rendimento de óleos essenciais de eucalipto
em diferentes épocas do ano de plantas colhidas em reflorestamentos da GERDAU nas cidades
de Bom Sucesso, São Bento Abade e São João del Rei, essas cidades apresentam como
característica climática o verão chuvoso e inverno seco. Para obtenção do óleo essencial das
folhas frescas, os autores empregaram a técnica de hidrodestilação, utilizando o aparelho
Clevenger modificado. O estudo mostra que independente do local, quando a colheita foi
realizada no mês de fevereiro os resultados foram superiores para o rendimento de óleo essencial
de eucalipto do que no mês de agosto. Os dados obtidos no estudo dos óleos essenciais de M.
graveolens diferem dos resultados obtidos por Castro e colaboradores uma vez que o maior
rendimento para o óleo essencial de M. graveolens ocorre no período de estiagem.
Os resultados encontrados por Andrade e Gomes (2000), que estudaram o rendimento de
óleo essencial de E. citriodora no município de Seropédica, RJ, onde foram obtidos maiores
CAPÍTULO 2
RESULTADOS
62
rendimentos de óleo extraído de folhas colhidas no outono (início da estiagem), quando
comparado com folhas colhidas no verão (período chuvoso). De maneira semelhante, Galanti
(1987) e Vitti e Brito (1999) relataram que a colheita de folhas de eucalipto realizada nos meses
mais secos do ano (abril a setembro) propicia um maior rendimento de óleo essencial e
consideram que nesse período essa concentração é maior em função do menor teor de umidade
nas folhas, obtendo-se melhor qualidade da essência. Pode-se inferir que houve uma influência da
época de colheita, no rendimento do óleo essencial de M. graveolens .
5.3 Caracterização Química dos Óleos Essenciais de M. graveolens
Com relação aos constituintes químicos majoritários presentes no óleo essencial de M.
graveolens estão representados na TABELA 2. 2.
TABELA 2. 2 Constituintes químicos majoritários do óleos essencial de M. graveolens.
Constituinte químico Tempo de retenção (min) % Área
(+)-trans-Pinocarvyl acetate 12,283 47,97242
β.-Pinene 8,068 24,71254
Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide 5,921 13,76966
Myrcene 8,392 13,54538
O constituinte químico (+)-trans-Pinocarvyl acetate foi encontrado em maior
concentração no óleo essencial de M. graveolens. Os dados obtidos nesse estudo vão ao encontro
com dados presentes na literatura. Em estudo realizado por Toudahl e colaboradores (2012) em
que foi determinada a composição química do óleo essencial de M. graveolens os constituintes
químicos majoritários encontrados foram o (+)- trans-pinocarvyl acetate (78.9%), (-)-trans-
pinocarvyl acetate (5.5%) and β-pinene (3.8%). A composição química do óleo essencial pode
variar consideravelmente dentro da mesma espécie vegetal, em função de parâmetros climáticos
e de fatores agronômicos como fertilização, irrigação, colheita e, especialmente a fase de
desenvolvimento da planta na época da colheita. Muitas plantas existem sob vários fenótipos, isto
CAPÍTULO 2
RESULTADOS
63
é, diferindo na sua aparência e diversidade qualitativa e quantitativa, geralmente detectada na
composição do óleo essencial obtido (KERROLA et al., 1994).
O (+)-trans-Pinocarvyl acetate foi anteriormente detectado em Dracocephalum
speciosum, uma espécie de Lamiaceae do Himalaia, onde esse constituía 60,5% do óleo essencial.
5.4 Avaliação da Atividade Antioxidante
FIGURA 2. 4 Inibição do radical DPPH pelo óleo essencial de M. graveolens.
0 2 4 60
20
40
60
80
100Inibição 30 min
Inibição 60 min
mg/mL
% d
e in
ibiç
ão
do
rad
ical D
PP
H
Podemos observar que a atividade antioxidante associada à inibição do radical DPPH do
óleo essencial de M. graveolens é próxima de 60%. Melo e colaboradores (2003) ao avaliarem a
atividade antioxidante dos extratos aquosos de Coriandrum sativum L encontraram a atividade
máxima de inibição do radical com concentrações menores que 500 µg/mL. De acordo com os
autores a alta atividade antioxidante com baixas concentrações dos extratos se deve à composição
química dos extratos, os quais possuem uma quantidade de compostos fenólicos. Os compostos
fenólicos de plantas enquadram-se em diversas categorias, como fenóis simples, ácidos fenólicos
(derivados de ácidos benzóico e cinâmico), cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos
condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas.. Sabe-se que os compostos fenólicos são os
principais responsáveis pela capacidade antioxidante de extratos (SOUSA et al., 2007). Ao se
comparar a atividade antioxidante de óleos essenciais e de extratos, percebe-se que a atividade
dos óleos é inferior. Sabe-se que os compostos fenólicos citados anteriormente são os principais
responsáveis pela capacidade antioxidante de extratos. Os OEs possuem baixa concentração
CAPÍTULO 2
RESULTADOS
64
desses compostos fenólicos, uma vez que em grande parte são formados por terpenos. Isso
explica a diferença de atividade antioxidante dos OE quando comparadas aos extratos.
5.5 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
Para a avaliação da atividade antimicrobiana o resultado foi dado em relação à inibição do
crescimento microbiano (TABELA 2.3). Os halos formados foram medidos e foram considerados
como positivos para atividade antimicrobiana os halos maiores que 8 mm.
TABELA 2.3 Avaliação da atividade antimicrobiana do óleo essencial de M. graveolens.
Microorganismos Óleo Puro Óleo diluído
1:2 DMSO
Controle
positivo
Controle
negativo
Staphylococcus aureus + - + -
Enterococcus faecalis + - + -
Staphylococcus
saprophyticus
+ - + -
Streptococcus pyogenes + - + -
Pseudomonas aeruginosa - - + -
E.coli - - + -
Proteus mirabilis - - + -
+ apresentou inibição do crescimento microbiano- halos maiores que 8 mm
- não apresentou inibição do crescimento microbiano- halos menores que 8 mm
Os resultados obtidos no teste de atividade antimicrobiana mostram que as bactérias
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus
pyogenes sofreram inibição do crescimento microbiano. Essas quatro bactérias são Gram-
positivas. As bactérias Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Proteus mirabilis não
sofreram inibição do crescimento microbiano.
De acordo com Probst (2012) as bactérias Gram-positivas apresentam uma maior
sensibilidade quando expostas aos óleos essenciais in vitro que as bactérias Gram-negativas. As
Gram-negativas possuem parede bacteriana diferenciada, apresentando uma membrana externa
CAPÍTULO 2
RESULTADOS
65
composta por lipopolissacarídeos (LPS), conferindo maior resistência por evitar a difusão e
acúmulo de OE na célula bacteriana. Os resultados encontrados no estudo vão ao encontro aos
dados mostrados na literatura uma vez que a inibição do crescimento microbiano ocorreu
somente em bactérias Gram-positivas.
A composição química dos OE também interferem com o seu potencial antimicrobiano,
sendo esta atividade associada com o conteúdo de terpenóides presente no óleo. De acordo com
os resultados obtidos na análise química (CG-EM) do óleo utilizado neste estudo, foi possível
demonstrar que os principais compostos encontrados são, em sua maioria, terpenos ou derivados
desta classe. Embora estudos mais recentes apresentem sempre a composição química da amostra
do óleo essencial utilizado, inferimos que, embora neste estudo também seja apresentada uma
caracterização química dos óleos essenciais, nem sempre a atividade antibacteriana está
relacionada com os compostos majoritários, e, portanto, não é possível relacionar a atividade
antibacteriana do OE com determinados compostos com exata precisão (PROBST, 2012).
5.6 Obtenção das Formulações
As formulações obtidas foram analisadas macroscopicamente para a avaliação de
alterações como separação de fases e também para definir suas características organolépticas. As
formulações contendo o óleo essencial de M. graveolens apresentavam aspecto translúcido e com
o odor característico do óleo essencial. Após a análise macroscópica das formulações observou-se
que não houve alterações como a separação de fases e as características organolépticas das
formulações também não alteraram.
A análise macroscópica das formulações-base foi feita 24 horas após o seu preparo, pois
podem demonstrar sinais de instabilidade prévios, como separação de fases e cremeação. As
formulações apresentaram boa aparência e estabilidade.
5.7 Ensaios de estabilidade acelerada
Este teste tem como objetivo fornecer dados para prever a estabilidade do produto, tempo
de vida útil e compatibilidade da formulação com o material de acondicionamento (Brasil, 2004).
CAPÍTULO 2
RESULTADOS
66
5.7.1 Processo de centrifugação
A nanoemulsão óleo em água (O/A) contendo o óleo essencial de M. graveolens
apresentou-se estável no ensaio de centrifugação. A centrifugação acelera a desestabilização
simulando o período de validade do produto. Segundo Latreille e Paquin (2006), se a estabilidade
é diretamente proporcional à força gravitacional, o comportamento a longo prazo das
nanoemulsões pode ser estimada pela centrifugação em velocidades moderadas. Existe consenso
científico de que o tempo de validade de um produto cosmético em condições normais de
estocagem possa ser rapidamente prevista pela observação da separação da fase dispersa devido à
cremeação ou coalescência quando a emulsão é submetida à centrifugação. Portanto, os
resultados demonstraram que a nanoemulsão do presente estudo apresenta-se fisicamente estável
conforme literatura (MASSON et al, 2005).
5.7.2 Estresse térmico
Segundo Auton (2005), o aumento da temperatura pode ocasionar aumento da velocidade
de cremeação, devido à diminuição da viscosidade aparente da fase contínua, bem como
ocasionar o aumento da motilidade cinética, tanto da fase dispersa quanto do tensoativo na
interface da emulsão, favorecendo a coalescência.
Ao ser submetido a estresse térmico a nanoemulsão contendo o óleo essencial de M. graveolens
não apresentou separação de fases.
5.7.3 Determinação do valor de pH
O pH final das nanoemulsões deve levar em consideração a estabilidade do fármaco no
veículo e a estabilidade da forma farmacêutica, bem como aspectos fisiológicos relacionados com
a via de administração.
O valor do pH da nanoemulsão contendo o óleo essencial de M. graveolens foi de 5,9 ±
0.02.
CAPÍTULO 2
RESULTADOS
67
Nanoemulsões são física e quimicamente mais estáveis em pH de 5,5 a 8,0. Esse fato está
relacionado à taxa de hidrólise dos triglicerídeos e fosfolipídeos que, ao dissociarem-se, liberam
ácidos graxos livres. Os ácidos graxos livres formados reduzem o pH das formulações, sendo
empregados como indicadores de estabilidade de nanoemulsões em diferentes condições de
temperatura e armazenamento e frente à operação de esterilização (FRONZA et al., 2004)
O pH final das formulações também pode ter uma influência na localização e estabilidade
do fármaco associado à nanoemulsão. A indometacina representa um exemplo clássico da
influência do pH. Muchtar e colaboradores(1997) desenvolveram nanoemulsões cujo pH final foi
ajustado até 3,8, visando prevenir a ionização do fármaco, e consequentemente, promover sua
localização na fase oleosa, uma vez que o pKa indometacina é 4,5 .
5.7.4 Determinação do tamanho de partícula
A caracterização do tamanho de partícula é utilizada na investigação da estabilidade física
de nanoemulsões. Fenômenos de instabilidade de sistemas emulsionados como agregação,
floculação e coalescência podem ser acompanhados através da evolução do diâmetro médio, bem
como da distribuição do tamanho de partícula.
O tamanho de partícula encontrado foi de 88.3 ± 0.45 nm caracterizando assim a
formulação como uma nanoemulsão. O índice de polidispersividade (P.I.) encontrado foi 0.191 ±
0.024 indicando que a distribuição do tamanho de partículas é homogênea.
5.7.5 Análises reológicas
A reologia, na última década, adquiriu posição permanente nos testes de estabilidade, uma
vez que as características reológicas são propriedades importantes a serem consideradas na
fabricação, estocagem e aplicação de produtos de uso tópico, interferindo na forma de utilização
do produto, na adesão ao tratamento e, também, na aceitação do produto pelo consumidor
(ISAAC et al., 2008).
A caracterização reológica completa de um sistema pode, então, ser útil desde o
desenvolvimento do produto cosmético até a determinação do prazo de validade, incluindo
CAPÍTULO 2
RESULTADOS
68
influência em testes sensoriais, que auxiliam verificar a aceitação do consumidor (ISAAC et al.,
2008).
As características reológicas das nanoemulsões estão estreitamente relacionadas com
enchimento e retirada do material de acondicionamento, com a espalhabilidade e a aderência
destas sobre a pele (CORRÊA et al, 2005). Portanto, o estudo de características reológicas
(viscosidade, ponto de fluidez, espalhabilidade e estabilidade físico-química) pode ser utilizado
como meio de seleção entre diferentes formulações de emulsões cosméticas.
FIGURA 2. 5 Reogramas da nanoemulsão contendo óleo essencial de M. graveolens.
A medida do comportamento reológico das formulações, mostra que a nanoemulsão
apresenta comportamento Newtoniano, ou seja, apresentam um comportamento viscoso ideal.
Esse comportamento Newtoniano é representado graficamente na FIGURA 2.5 onde é mostrado
que a relação entre a tensão de cisalhamento (“Shear Stress”) e a taxa de cisalhamento (“Shear
rate”) é linear. Isso significa que para uma dada temperatura, a viscosidade permaneceu constante
durante sua medição, independentemente do tempo e da taxa de cisalhamento empregada.
CAPÍTULO 2
CONCLUSÃO
69
7 CONCLUSÃO
A extração do óleo essencial de Microlicia graveolens por um aparelho de hidrodestilação
por arraste a vapor de grande porte é vantajosa, uma vez que demanda um menor tempo e
a quantidade de material vegetal usada para a extração é grande.
O rendimento de óleo essencial obtido de plantas coletadas em épocas de estiagem é
maior do que em épocas chuvosas.
O constituinte químico (+)-trans-Pinocarvyl acetate foi o componente majoritário do óleo
essencial de M. graveolens. Sendo assim a espécie em questão pode ser considerada como
uma fonte natural rica nesse componente.
De acordo com a atividade antimicrobiana, conclui-se que o óleo essencial de M.
graveolens constitui uma perspectiva para obtenção de antibiótico natural, por apresentar
atividade antimicrobiana frente aos microrganismos utilizados no estudo.
Os resultados para atividade antioxidante mostraram resultados promissores, onde o óleo
essencial de M. graveolens apresentou 60% de atividade para uma concentração de
5mg/mL, após em um período de 60 minutos. Considerando que a atividade antioxidante
está relacionada com outras atividades farmacológicas como cicatrização, atividade anti-
inflamatória, desordens degenerativas dentre outras, é de grande valia a extensão dos
estudos.
As formulações produzidas com o óleo de M. graveolens foram caracterizadas como
nanoemulsões e apresentaram- se estáveis.
CAPÍTULO 2
REFERÊNCIAS
70
8 REFERÊNCIAS
AULTON, M. E. Delineamento de formas farmacêuticas. 2.ed. Porto Alegre: Artmed; 2005.
677p.
ANDRADE, A. M.; GOMES, S. S. Influência de alguns fatores não genéticos sobre o teor de
óleo essencial em folhas de Eucalyptus citriodora Hook. Floresta e Ambiente, v.7, n.1, p.181-9,
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CAPÍTULO 2
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74
CAPÍTULO 3
Melaleuca Leucadendron
CAPÍTULO 3
INTRODUÇÃO
75
1 INTRODUÇÃO
Espécies da família Myrtaceae ocorrem tanto em regiões tropicais quanto subtropicais,
sendo divididas em duas subfamílias: Myrtoidea, a qual tem ampla ocorrência na América
tropical e Leptospermoideae, que ocorre, principalmente, na Austrália, Malásia e Polinésia. O
gênero Melaleuca, pertencente à subfamília Leptospermoideae, inclui aproximadamente 100
espécies nativas da Austrália e Ilhas do Oceano Índico (VIEIRA et al., 2004).
Espécies de Myrtaceae são empregadas principalmente em distúrbios gastrointestinais,
estados hemorrágicos, doenças infecciosas, sua ação podendo estar relacionada às propriedades
adstringentes da planta. As partes mais usadas são as folhas, cascas e também os frutos que são
comumente consumidos (VIEIRA et al., 2004).
A melaleuca (Melaleuca alternifolia Cheel.), é internacionalmente conhecida como “tea
tree” ou árvore do chá . Originária da Austrália possui um grande valor econômico devido à
presença de óleo essencial armazenado em seus tecido foliares. O OE de Melaleuca alternifolia é
utilizado principalmente na produção de cosméticos, germicidas e agentes anti-sépticos. Eles são
também utilizados como carminativos e no tratamento de várias doenças (FARAG et al., 2004).
No Brasil, o cultivo de M. alternifolia voltado para a extração do OE é recente. Entretanto,
esta atividade apresenta grande potencial, tendo em vista a grande aplicabilidade, já descrita, que
o seu óleo essencial possui. O OE das plantas de M. alternifolia, cultivadas na Austrália,
caracteriza-se pela mistura aproximada de 97 compostos, a maioria já identificados. Os principais
constituintes são os compostos terpinen-4-ol, 1,8-cineol, α-terpineno, γ- terpineno, α-pineno, β-
pineno, α-terpineol, p-cimeno e álcoois sesquiterpênicos, que representam cerca de 90% do óleo.
O rendimento obtido da extração do OE de M. alternifolia é de aproximadamente 1 a 2% da
massa fresca da planta utilizada (OLIVEIRA, 2009).
O OE de M. artenifolia possui comprovada ação antimicrobiana contra bactérias, fungos,
alguns vírus e possui forte atividade repelente contra mosquitos, pulgas, piolhos entre outros.
Devido às suas propriedades farmacológicas é utilizado em formulações farmacêuticas de vários
produtos como xampus, sabonetes, cremes dentais, antisséptico bucal, repelente de insetos,
produtos veterinários, germicidas de condicionadores de ar, dentre outros (SILVA et al., 2002).
Estudos in vitro evidenciaram o seu potencial antifúngico e antibacteriano contra vários
CAPÍTULO 3
INTRODUÇÃO
76
microrganismos. Testes utilizando C. albicans, Trichophyton rubrum, T.mentagrophytes, T.
tonsurans, Aspergillus niger, Penicillium sp, Epidermophyton floccosum e Microsporum gypsum
revelaram uma atividade antimicrobiana significante contra esses microrganismos, sugerindo que
o óleo pode ser útil no tratamento de infecções fúngicas da pele (CONCHA et al., 1998).
O Comitê Australiano de Padronização estabeleceu que o óleo deve conter quantidades de
cineol abaixo de 15% e de terpinen-4-ol acima de 30% para que tenha eficácia mínima como
anti-séptico (SIMÕES et al., 2003). Estudos sobre o teor, a composição química e atividade
antimicrobiana do óleo essencial de M. alternifolia cultivada no Brasil, indicam que o óleo possui
as mesmas características qualitativas e quantitativas do óleo australiano (SILVA, 2001).
A espécie Melaleuca leucadredon (FIGURA 3.1), conhecida popularmente como
cajuputi, caracteriza-se por ser uma planta lenhosa com distribuição na Austrália e sudoeste da
Ásia sendo nativa de regiões pantanosas e florestas tropicais (TANAKA et al., 2011).
FIGURA 3.1 Folhas e flores da M. leucadendron.
A árvore é muito versátil e se desenvolve em uma grande variedade de ambientes, muitas
vezes ocorrem em solos pobres em nutrientes ou degradados e pode ser utilizada para inúmeros
fins: obtenção de OE com atividade biológica, lenha, madeira de construção civil e carvão
vegetal (BRINKMAN; XUAN, 1991).
CAPÍTULO 3
INTRODUÇÃO
77
Segundo Brinkman e Xuan (1991) a espécie é bem adaptada a áreas úmidas ou
parcialmente inundadas, devido principalmente á germinação das sementes, entretanto é tolerante
á solos ácidos e água salobra.
A espécie vegetal M. leucadendron foi escolhida para o estudo devido as inúmeras
aplicações de óleos essenciais de plantas do mesmo gênero. Assim como também pelo relato
popular de uso do OE de M. leucadendron para infecções de pele causadas por bactérias ou
fungos. Várias árvores da espécie são encontradas localizadas no Campus da Universidade
Federal de Ouro Preto (FIGURA 3.2) o que facilitou a coleta e obtenção do material vegetal.
FIGURA 3. 2 Árvores de M. leucadendron.
CAPÍTULO 3
OBJETIVOS
78
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Obter e caracterizar química e biologicamente os óleos essenciais da espécie Melaleuca
leucadendron. Produzir nanoemulsões do tipo O/A contendo os óleos essenciais pelo método de
inversão de fases.
2.2 Objetivos específicos
Obter dos óleos essenciais através de hidrodestilação das partes aéreas da espécie vegetais
M. leucadendron.
Caracterizar quimicamente o óleo essencial da espécie vegetal M. leucadendron através
de Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas.
Avaliar a atividade antioxidante in vitro dos óleos essenciais de M. leucadendron
utilizando o reagente DPPH.
Avaliar a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de M. leucadendron
Desenvolver nanoemulsões a partir dos óleos essenciais utilizando os métodos de inversão
de fases;
Caracterizar e avaliar a estabilidade das nanoemulsões obtidas.
CAPÍTULO 3
MATERIAIS
79
3 MATERIAIS
Fase aquosa
A fase aquosa utilizada foi água recém destilada.
Tensoativos
Como tensoativos foram utilizados o PEG-40 Hydrogenated castor oil e o SPAN 80.
Ambos foram gentilmente cedidos pela empresa Croda do Brasil Ltda.
DPPH
O reagente DPPH (2,2 – difenil – 1 – picrilhidrazil) foi adquirido da empresa Sigma.
CAPÍTULO 3
MÉTODOS
80
4 MÉTODOS
4.1 Obtenção dos Materiais vegetais
A espécie vegetal M. leucadendron foi coletada no campus da Unversidade Federal de
Ouro Preto localizado na cidade de Ouro Preto-MG. Foram realizadas 2 coletas no mesmo local.
A primeira coleta ocorreu em junho de 2011, a segunda coleta em janeiro de 2012.. Foram
utilizadas as folhas frescas no processo de extração do óleo essencial.
4.2 Extração dos Óleos Essenciais
A extração dos OE foi realizada através de hidrodestilação das partes aéreas das espécies
vegetais com a utilização de um hidrodestilador de caldeira aquecida. As folhas foram retiradas
dos caules e em seguida rasuradas. O material foi pesado e foi depositado numa dorna de 2,6 L,
montada com um fundo móvel perfurado para facilitar a descarga. Em seguida o aparelho
preenchido com água e teve inicio o processo de hidrodestilação.
O tempo de extração foi de aproximadamente 3 horas. Os OEs obtidos foram em seguida
secos com sulfato de sódio anidro e mantidos sob refrigeração até as análises posteriores.
4.3 Caracterização Química dos Óleos Essenciais
Para análises de Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM)
foi utilizado um cromatógrafo a gás GCMS-QP2010 Plus Shimadzu. A coluna usada foi uma
coluna capilar de sílica fundida Zebron™ Inferno™ (ZB-5HT) com dimensões: 30 m x 0,25 mm
x 0,10 µm). As condições foram:
Temperatura inicial: 40 °C
Temperatura final: 220 °C
Rampa: 5 °C/ min.
Injetor: 240 °C
Detector: 260 °C
CAPÍTULO 3
MÉTODOS
81
Gás de arraste: Hélio, fluxo: 1,0 mL/min
Os espectros de massas dos constituintes foram comparados com os padrões existentes na
biblioteca NIST do computador no aparelho. Em seguida, foram feitas comparações visuais com
espectros de massa de substâncias encontrados na literatura. Os tempos de retenção dos picos
maiores, mais facilmente identificados pelo espectro de massa, foram comparados com os tempos
de retenção destas substâncias registrados em catálogos, observando-se a diferença que se
manteve aproximadamente constante para as demais substâncias identificadas.
4.4 Avaliação da atividade antioxidante
A avaliação da atividade antioxidante foi realizada de acordo com o procedimento
descrito no item 4.4 do capítulo 2.
4.5 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
As seguintes bactérias foram utilizadas na investigação da atividade antimicrobiana:
Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Staphylococcus saprophyticus (ATCC 15305),
Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Proteus mirabilis (ATCC 25933), Escherichia coli
(ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC
25923).
O método utilizado para determinação da atividade antimicrobiana foi o mesmo método
descrito no item 4.5 do capítulo 2.
4.6 Obtenção das Formulações
As nanoemulsões foram preparadas pelo método de inversão de fases. A técnica consiste
em aquecer as fases aquosa e oleosa separadamente até 75 2 ºC e, em seguida, verter a fase
aquosa sobre a fase oleosa sob agitação constante a 600 rpm (Agitador Fisatom, mod 713D) até
resfriamento à temperatura ambiente, conforme método descrito por Santos et al (2005, 2006).
CAPÍTULO 3
MÉTODOS
82
TABELA 3. 1 Composição das formulações.
Componentes da formulação Porcentagem (%)
Monooleato de Sorbitano 4,0
PEG-40 Hydrogenated Castor Oil 6,0
Óleo de soja 5,0
Óleo essencial de M. leucadendron 5,0
Água destilada 80,0
4.7 Ensaios de estabilidade acelerada
Os testes de estabilidade foram realizados de acordo com o item 4.7 do capítulo 2.
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
83
5 RESULTADOS
5.1 Obtenção do material Vegetal
O ambiente onde a espécie vegetal M. leucadendron foi coletada apresenta solo arenoso,
úmido e com gramíneas ao redor. Os indivíduos apresentam-se esparsos. Todas as coletas foram
realizadas nas mesmas árvores. A primeira coleta ocorreu em junho de 2011 e a segunda coleta
em janeiro de 2012. Foram obtidos na primeira coleta 1000 g de material vegetal (caules e folhas)
e na segunda 900 g.
5.2 Extração dos óleos essenciais
Nos dois processos de extração realizados a quantidade de folhas foi aproximadamente a
mesma. Na primeira extração foram utilizados 440 g de folhas frescas de M. leucadendron
rasuradas. Na segunda extração foram utilizados 460 g de folhas frescas rasuradas. O rendimento
final foi de 4.2 % para a primeira extração (ML-1) e de 2 % para a segunda extração(ML-2).
Pode-se notar que a maior parte do óleo essencial extraído (aproximadamente 80 % do total ) foi
obtido na primeira hora de destilação em ambas as destilações. Nota-se que assim como no item
5.2 do capítulo 2 que trata do rendimento do óleo essencial de M. graveolens, os OE de M.
leucadendron obtidos de plantas coletadas no período de seca (Junho) obtiveram um maior
rendimento que OE obtidos de plantas coletadas no período chuvoso (Janeiro).
5.3 Caracterização Química dos Óleos Essenciais de M. leucadendron
A constituição química dos óleos essenciais de M. leucadendron variou de acordo com a
época do ano. Os constituintes químicos majoritários presentes no OE de M. leucadendron ML-1
estão representados TABELA 3.2. e os constituintes do OE ML-2 na TABELA 3.3.
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
84
TABELA 3. 2 Constituintes químicos majoritários do óleo essencial de M. leucadendron (ML-1).
Constituinte químico Tempo de retenção (min) % Área
Veridiflorol 14,743 38,0
Eucaliptol 8,395 17,0
α- pineno 7,838 7,0
Outros - 38,0
O constituinte químico majoritário encontrado em ML-1 foi o veridiflorol com 38% da
área total do cromatograma. O viridiflorol é um constituinte químico encontrado em outras
espécies de Melaleuca. Wherler (2005) estudou a respeito da variação de quimiotipos de
Melaleuca quinquenervia. O autor relata o constituinte viridiflorol como componente de folhas
de M. quinquenervia e conclui que tal componente pode ser utilizado como referência para a
diferenciação de quimiotipos de M. quinquenervia.
TABELA 3. 3 Constituintes químicos majoritários do óleo essencial de M. leucadendron (ML-2).
Constituinte químico Tempo de
retenção (min)
% Área
Veridiflorol 14,743 9,4
p-menth-1-en-8-ol 11,058 22,5
Lup-20(29)-ene-3,21,28-triol,
28-acetate (3β,21β)
9,03 53,8
Outros - 14,3
A concentração de viridiflorol encontrado em Ml-2 é mais baixa que em ML-1. O
constituinte químico majoritário de ML-2 é o Lup-20(29)-ene-3,21,28-triol, 28-acetate (3β,21β).
O componente terpinen-4-ol foi encontrado em ambos os óleos em concentrações
menores que 2%. Tais diferenças podem estar relacionadas com as condições edafoclimáticas
sob as quais as plantas se desenvolveram. Tais condições incluem o solo, umidade, insolação,
além de componentes tóxicos aos quais as plantas estão submetidas (KERROLA et al., 1994). De
acordo com Souza (2007) podem ocorrer reações de oxidação dos componentes do OE em altas
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
85
temperaturas o que pode acarretar em modificação dos constituintes químicos dos OE quando é
realizado o processo de hidrodestilação.
5.4 Avaliação da Atividade Antioxidante
A capacidade de inibição do radical DPPH pelo OE de M. leucadendron ML-1(FIGURA
3.3) foi de aproximadamente 70%. Não ocorreu nenhuma variação significativa da atividade
antioxidante entre os tempos de 30 e 60 minutos.
FIGURA 3.3 Inibição do radical DPPH pelo óleo essencial da M. leucadendron (ML-1).
0 2 4 60
20
40
60
80
100Inibição 30 min
Inibição 60 min
mg/mL
% d
e in
ibiç
ão
do
rad
ical D
PP
H
Estudos recentes apontam a ação fotoproterora e antioxidante de monoterpenos de
plantas, relacionadas especialmente a sua capacidade de captar radicais de oxigênio oriundos da
fotossíntese. A atividade antioxidante de óleos voláteis dificilmente pode ser atribuída a
compostos isolados. Sendo assim pode-se considerar que vários constituintes químicos atuam de
forma sinérgica como compostos antioxidantes em OE (SOUZA ,2007)
5.5 Avaliação da Atividade Antimicrobiana
Para a avaliação da atividade antimicrobiana o resultado foi dado em relação à inibição do
crescimento microbiano (TABELA 3.4). Os halos formados foram medidos e foram considerados
como positivos para atividade antimicrobiana os halos maiores que 8 mm.
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
86
TABELA 3. 4 Avaliação da atividade antimicrobiana do óleo essencial de M. leucadendron.
Microorganismos Óleo Puro Óleo diluído
1:2 DMSO
Controle
positivo
Controle
negativo
Staphylococcus aureus + - + -
Enterococcus faecalis - - + -
Staphylococcus
saprophyticus
+ - + -
Streptococcus pyogenes + - + -
Pseudomonas aeruginosa - - + -
E.coli - - + -
Proteus mirabilis - - + -
+ apresentou inibição do crescimento microbiano- halos maiores que 8 mm
- não apresentou inibição do crescimento microbiano- halos menores que 8 mm
Os resultados obtidos no teste de atividade antimicrobiana mostram que as bactérias
gram-positivas Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus e Streptococcus pyogenes
sofreram inibição do crescimento microbiano. A bactéria gram-positiva Enterococcus faecalis
não sofreu inibição do crescimento. As bactérias Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e
Proteus mirabilis não sofreram inibição do crescimento microbiano.
De acordo com Probst (2012) a bioatividade de alguns óleos é produto da interação de
vários compostos, e não apenas devido ação de substâncias isoladas. Além disto, as bactérias
gram-positivas apresentam uma maior sensibilidade quando expostas aos óleos essenciais in vitro
que as bactérias gram-negativas. As gram-negativas possuem parede bacteriana diferenciada,
apresentando uma membrana externa composta por lipopolissacarídeos (LPS), conferindo maior
resistência por evitar a difusão e acumulo de OE na célula bacteriana. Os resultados encontrados
no estudo estão de acordo com os dados mostrados na literatura uma vez que a inibição do
crescimento microbiano ocorreu somente em bactérias Gram-positivas com exceção da
Enterococcus faecalis.
Um dos mecanismos de ação bactericida consiste no comprometimento da integridade da
membrana celular, consequente perda de material intracelular, incapacidade de manter a
homeostase e inibição da respiração . O Terpinen-4-ol está presente em 30-40% da composição
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
87
de OE de M. artenifolia sendo o componente que detêm a principal atividade antimicrobiana
(OLIVEIRA et al., 2011).O terpinen-4-ol foi encontrado concentrações menores que 2 % em
ML-1 e ML-2. É possível que outros elementos, ainda não avaliados, contribuam para a atividade
antimicrobiana com mecanismo de ação diferente daquele já encontrado.
5.6 Obtenção das Formulações
As formulações obtidas foram analisadas macroscopicamente para a avaliação de
alterações como separação de fases e também para definir características organolépticas das
formulações. As formulações contendo o óleo essencial de M. leucadendron apresentavam
aspecto translucido e com o odor característico do óleo essencial. Após a análise macroscópica
das formulações observou-se que não houve alterações como a separação de fases e as
características organolépticas das formulações também não alteraram.
A análise macroscópica das formulações-base foi feita 24h após o seu preparo, pois
podem demonstrar sinais de instabilidade prévios, como separação de fases e cremeação. As
formulações apresentaram boa aparência e estabilidade.
5.7 Ensaios de estabilidade acelerada
5.7.1 Processo de centrifugação
A nanoemulsão óleo em água (O/A) contendo o óleo essencial de M. leucadendron
apresentou-se estável no ensaio de centrifugação não apresentando separação de fases.
5.7.2 Estresse térmico
Segundo Auton (2005), o aumento da temperatura pode ocasionar aumento da velocidade
de cremeação, devido à diminuição da viscosidade aparente da fase contínua, bem como
ocasionar o aumento da motilidade cinética, tanto da fase dispersa quanto do tensoativo na
interface da emulsão, favorecendo a coalescência.
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
88
Ao ser submetido a estresse térmico a nanoemulsão contendo o óleo essencial de M.
leucadendron não apresentou separação de fases.
5.7.3 Determinação do valor de pH
O pH final das nanoemulsões deve levar em consideração a estabilidade do fármaco no
veículo e a estabilidade da forma farmacêutica, bem como aspectos fisiológicos relacionados com
a via de administração.
O valor do pH da nanoemulsão contendo o óleo essencial de M. leucadendron foi de 6.02
± 0.12.
Nanoemulsões são fisica e quimicamente mais estáveis em pH de 5,5 a 8,0. Esse fato está
relacionado à taxa de hidrólise dos triglicerídeos e fosfolipídeos que, ao dissociarem-se, liberam
ácidos graxos livres. Os ácidos graxos livres formados reduzem o pH das formulações, sendo
empregados como indicadores de estabilidade de nanoemulsões em diferentes condições de
temperatura e armazenamento e frente à operação de esterilização (FRONZA et al., 2004)
5.7.4 Determinação do tamanho de partícula
A caracterização do tamanho de partícula é utilizada na investigação da estabilidade física
de nanoemulsões. Fenômenos de instabilidade de sistemas emulsionados como agregação,
floculação e coalescência podem ser acompanhados através da evolução do diâmetro médio, bem
como da distribuição do tamanho de partícula.
O tamanho de partículas encontrado para a formulação contendo ML-1 foi de 42.9 ± 1.15
nm e o indice de polidispersividade foi de (P.I.) 0.259 ± 0.179. Pode-se concluir com os
resultados a obtenção de uma nanoemulsão que apresentaram uma distribuição uniforme de
tamanho de partículas.
CAPÍTULO 3
RESULTADOS
89
5.7.5 Análises reológicas
A reologia, na última década, adquiriu posição permanente nos testes de estabilidade, uma
vez que as características reológicas são propriedades importantes a serem consideradas na
fabricação, estocagem e aplicação de produtos de uso tópico, interferindo na forma de utilização
do produto, na adesão ao tratamento e, também, na aceitação do produto pelo consumidor
(ISAAC et al., 2008).
A caracterização reológica completa de um sistema pode, então, ser útil desde o
desenvolvimento do produto cosmético até a determinação do prazo de validade, incluindo
influência em testes sensoriais, que auxiliam verificar a aceitação do consumidor (ISAAC et al.,
2008).
As características reológicas das nanoemulsões estão estreitamente relacionadas com
enchimento e retirada do material de acondicionamento, com a espalhabilidade e a aderência
destas sobre a pele (CORRÊA et al, 2005). Portanto, o estudo de características reológicas
(viscosidade, ponto de fluidez, espalhabilidade e estabilidade físico-química) pode ser utilizado
como meio de seleção entre diferentes formulações de emulsões cosméticas.
A medida do comportamento reológico das formulações, mostra que a nanoemulsão
apresenta comportamento Newtoniano, ou seja, apresentam um comportamento viscoso ideal.
Esse comportamento Newtoniano é representado graficamente na FIGURA 2.5 onde é mostrado
que a relação entre a tensão de cisalhamento (“Shear Stress”) e a taxa de cisalhamento (“Shear
rate”) é linear. Isso significa que para uma dada temperatura, a viscosidade permaneceu constante
durante sua medição, independentemente do tempo e da taxa de cisalhamento empregada.
CAPÍTULO 3
CONCLUSÃO
90
6 CONCLUSÃO
O rendimento de óleo essencial obtido de folhas coletadas em épocas de estiagem é maior
do que em épocas chuvosas.
O constituinte químico viridiflorol foi encontrado como constituinte químico majoritário
no ML-1 mas em ML-2 a concentração do mesmo foi muito menor. Tal componente pode
ser utilziado como marcador químico para a espécie M. leucadendron
O óleo essencial de M. leucadendron (ML-1) apresentou atividade antimicrobiana contra
bactérias gram-positivas. O óleo essencial (ML-2) não foi capaz de inibir o crescimento
microbiano de nenhuma bactéria.
Os resultados para atividade antioxidante mostraram resultados promissores, onde o óleo
essencial de M. leucadendron apresentou cerca de 70% de inibição do DPPH para uma
concentração de 5mg/mL, após em um período de 60 minutos.
As formulações produzidas com o óleo de M. leucadendron foram caracterizadas como
nanoemulsões e apresentaram- se estáveis.
CAPÍTULO 3
REFERÊNCIAS
91
7 REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 3
RESULTADOS
92
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93
CAPÍTULO 4
Vellozia squamata
CAPÍTULO 4
INTRODUÇÃO
94
1 INTRODUÇÃO
A família Velloziaceae possui ocorrência na África e América do Sul, expandindo-se até o
Panamá. Possui cerca de 250 espécies de ervas e arbustos perenes, que crescem em solos
rochosos ou arenosos, sob alta incidência solar e pouca água (SILVA et al., 2001).
A longevidade dessas plantas e sua resistência às queimadas vem motivando por mais de
duas décadas um estudo fitoquímico, visando encontrar as possíveis substâncias responsáveis por
esse comportamento. Mais de trinta espécies brasileiras dessa família de plantas foram estudas e
conseguiram isolar cerca de 180 diterpenóides, com nove diferentes tipos de esqueleto, cerca de
trinta triterpenóides com seis diferentes tipos de esqueleto e flavonóides (BRANCO, 1998).
A Vellozia squamata (FIGURA 4.1) conhecida popularmente como canela-de-ema tem
como sinonímia a Vellozia flavicans Mart. ex Schult. f., pertencente a família Velloziacea e ao
gênero Vellozia. Tal espécie pode ser encontrada no cerrado e possui porte de arbusto
(ALMEIDA, 1998). Uma das colorações de suas flores é a lilás (FIGURA 4.2).
FIGURA 4. 1 Vellozia squamata localizada na Serra de Ouro Branco.
FIGURA 4. 2 Flor da Vellozia squamata.
CAPÍTULO 4
INTRODUÇÃO
95
Estudos anteriores também identificaram a presença de compostos químicos de atividade
farmacológica, como terpenos (triterpenos e diterpenos) e flavonóides no gênero Vellozia,
(HARBORNE et al. 1994; HARBORNE; BAXTER, 1995).
E na espécie em questão, foi descrita a presença de três diterpenóides novos, isolados do
extrato hexânico de raízes, caule e folhas da mesma espécie (PINTO et al, 1995).
Na medicina popular a Canela de Ema é muito utilizada como anti-inflamatório para
luxação, dor de ouvido e dores em geral, podendo assim tal atividade estar ligada a sua
composição fitoquímica.
A espécie V. squamata é um arbusto nativo do Cerrado brasileiro que apresenta grande
potencial ornamental. A análise anatômica mostra que as raízes adventícias se diferenciam na
região do periciclo e nos feixes vasculares, indicando que a vascularização da raiz está conectada
com a do caule (FREITAS NETO, 2009).
Cientificamente, a espécie V. squamata foi utilizada em estudos que abordam aspectos
florísticos, taxonômicos, morfológicos e reprodutivos. Entretanto, ainda são escassos estudos
químicos e utilitários da mesma. Devido a esses fatores e ao relato popular do uso da canela-de-
ema como anti-inflamatório tópico tal espécie vegetal foi escolhida para o estudo de seus extratos
hidroalcoólicos.
CAPÍTULO 4
MATERIAIS
96
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Obter e caracterizar química e biologicamente os extratos hidroalcoólicos de caules e
folhas da espécie Vellozia squamata. Produzir nanoemulsões do tipo O/A contendo os óleos
essenciais pelo método de inversão de fases.
2.2 Objetivos Específicos
Obter de extratos hidroalcoólicos de folhas e caules de Vellozia squamata
Realizar o estudo farmacognóstico dos extratos hidroalcoólicos das folhas e do caule de
V. squamata
Avaliar a atividade antioxidante in vitro dos extratos hidroalcoólicos das folhas e do caule
de V. squamata utilizando o reagente DPPH.
Desenvolver nanoemulsões a partir dos extratos utilizando os métodos de inversão de
fases;
Caracterizar e avaliar a estabilidade das nanoemulsões obtidas.
CAPÍTULO 4
MATERIAIS
97
3 MATERIAIS
Fase oleosa
A fase oleosa utilizada foi o óleo de Babaçu (Orbignya Oleifera) fornecido pela empresa
Croda do Brasil Ltda.
Fase aquosa
A fase aquosa utilizada foi água recém destilada.
Tensoativos
Como tensoativos foram utilizados o PEG-40 Hydrogenated Castor Oil e o SPAN 80.
Ambos foram gentilmente cedidos pela empresa Croda do Brasil Ltda
DPPH
O reagente DPPH (2,2 – difenil – 1 – picrilhidrazil) foi adquirido da empresa Sigma.
CAPÍTULO 4
MÉTODOS
98
4 MÉTODOS
4.1 Obtenção dos Materiais vegetais
A espécie vegetal Vellozia squamata foi coletada na "Serra de Ouro Branco" localizada na
cidade de Ouro Branco-MG (20°31'2"S, 43°42'0" O). As folhas e os caules foram separadas e
secas em estufa a 45 ° C e sob circulação de ar. Depois, cada parte foi fragmentada em um
moinho de facas para se obter um pó fino. Foram utilizados os pós das folhas e do caule para
obtenção dos extratos hidroalcoólicos.
4.2 Preparação dos extratos hidroalcoólicos
O pó das folhas secas (100 g) e de caules (100 g) de V. squamata, foram submetidos,
respectivamente a extração exaustiva com uma solução de etanol-água (70:30 v / v) em um
percolador de aço inoxidável, em temperatura ambiente. Após 48 h, as soluções foram filtradas e
o solvente recuperado, num evaporador rotativo a 40 ° C, sob vácuo. A proporcionalidade do
solvente foi ajustado em um refractómetro Abbe e reutilizados no processo de percolação, até a
extração completa.
4.3 Estudo Farmacognóstico
O estudo farmcognóstico dos extratos hidroalcoólicos foi realizado de acordo com a
metodologia sugerida por Wagner e Bladt (1996) para a detecção de ácidos graxos,
antraquinonas, alcalóides, cumarinas, flavonóides e terpenóides através de Cromatografia em
camada delgada (CCD). Compostos químicos específicos foram identificados através de
metodologia descrita por Matos (1988), através do qual é analisada a presença de fenóis, taninos,
triterpenos, flavonóides, saponinas, xantonas, cumarinas e alcalóides.
Inicialmente, os extratos foram fracionados por partição líquido / líquido com clorofórmio
para separar os compostos lipofílicos. A presença dos metabólitos secundários das classes listadas
acima foram determinados na fração hidroalcoólica utilizando as reações seguintes:
CAPÍTULO 4
MÉTODOS
99
1) A presença de fenóis e taninos foi determinada por reação com cloreto férrico
(FeCl3), 2% (m/v);
2) A presença de flavonóides foi investigada através da reação de Shinoda e foi
comparada por Cromatografia em camada delgada;
3) Para analisar a presença de xantonas foi utilizado magnésio em ácido clorídrico;
4) O índice de espuma foi utilizada para indicar a presença de saponinas;
5) A reação de Liebermann-Bouchard foi utilizada para investigar a presença de
triterpenos e esteróides;
6) Após a extração ácido-base, a presença de alcalóides foi determinada através de
reações gerais de precipitação.
4.4 Atividade Antioxidante
Os extratos hidroalcoólicos das folhas e caules de V. squamata foram respectivamente
avaliados quanto à sua atividade antioxidante utilizando o método descrito no item 4.4 do
capítulo 2. A diferença do método é em relação às soluções etanólicas de cada extrato as quais
foram preparadas nas concentrações: 10,0, 25,0, 75,0, 150,0, 300,0 e 400,0 μg/mL.
4.5 Avaliação da atividade antimicrobiana
O método utilizado para determinação da atividade antimicrobiana foi o método descrito
no item 4.5 do capítulo 2. Os extratos foram diluídos em DMSO. As concentração dos extratos
utilizadas no teste foram de 400 e 200 µg/ mL.
As seguintes bactérias foram utilizadas na investigação da atividade antimicrobiana:
Staphylococcus saprophyticus (ATCC 15305, Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus aureus (ATCC 25923).
CAPÍTULO 4
MÉTODOS
100
4.6 Dosagem de Fenólicos Totais
Os compostos fenólicos foram determinados usando o método de Folin-Ciocalteu. O
reagente consiste de uma mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico, no qual o
molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6+ porém, em presença de certos
agentes redutores, como os compostos fenólicos, formam-se os chamados molibdênio azul e
tungstênio azul, nos quais a média do estado de oxidação dos metais está entre 5 e 6 e cuja
coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras, que não
necessariamente precisam ter natureza fenólica. A partir da solução dos extratos (15,0 mg / mL),
67 μL foram adicionados 3 mL de água e 250 μL do reagente de Folin-Ciocalteu . A mistura foi
agitada durante 1 minuto, 1 mL de uma solução de carbonato de sódio saturada (15 g/100 mL) foi
adicionado em seguida. O volume final foi aferido para 5,0 mL e a solução foi homogeinizada
por 1 minuto. Após 2 horas a absorbância foi medida em 750 nm. Os resultados foram calculados
por comparação entre a curva padrão de ácido gálico (10-350 μg /mL) e as amostras. O resultado
foi expresso em equivalente de ácido gálico (EAG) por grama de extrato seco.
4.7 Obtenção das Formulações
As nanoemulsões foram preparadas pelo método de inversão de fases descrito no item 4.6
do capítulo 2.
TABELA 4.1 Composição das Formulações.
Componentes da Formulação Porcentagem (%)
Extrato hidroalcoólico 1,0
Óleo de babaçu 10,0
Monooleato de Sorbitano 4,0
PEG-40 Hydrogenated Castor Oil 6,0
Água destilada 79,0
CAPÍTULO 4
MÉTODOS
101
4.8 Ensaios de estabilidade acelerada
Os testes de estabilidade foram realizados de acordo com os métodos descritos no item
4.7 do capítulo 2.
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
102
5 RESULTADOS
5.1 Obtenção do material vegetal
Foram obtidos um total de 1 Kg de material vegetal o que depois foi separado em folhas e
caule. Após a separação das folhas foram trituradas separadamente em um moinho de facas as
folhas e os caules. Foi obtido ao final quantidade equivalente a 400 g de pó de caule e 200 g de
pó de folhas.
5.2 Obtenção dos Extratos Hidroalcoólicos
Foram obtidos 9,1 g; (9,1%) do extrato hidroalcoólico de folhas e 7,3 g; (7,3%) do caule.
5.3 Estudo Farmacognóstico
Através das cromatoplacas obtidas utilizando-se reagentes específicos foi possível
detectar as principais classes químicas de componentes presentes nos extratos de hidroalcoólicos
de folhas e caules de V. squamata. Nos extratos dos caules foram detectados: antraquinonas,
cumarinas e flavonóides, enquanto os ácidos graxos, os alcalóides e terpenóides não foram
detectados. Todos os resultados para a detecção das classes químicas principais dos extratos das
folhas foram negativos. Depois disso, a confirmação dos constituintes químicos foi feita pela
mudança de cor, precipitação ou pela formação de espuma estável, demonstrando a
predominância de certas classes de compostos orgânicos presentes nos extratos hidroalcoólicos
das folhas e caules de V. squamata (TABELA 4.2).
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
103
TABELA 4. 2 Testes de prospecção fitoquímica de classes químicas da planta V. squamata.
Classes químicas Extrato bruto hidroetanólico
Caules Folhas
Auronas + -
Catequinas + +
Esteróides - +++
Flavonóis - +++
Flavanonas - +++
Flavanonois - +++
Saponinas - +++
Taninos catéquicos + _
Taninos pirogálicos + _
Triterpenóides +++ _
Xantonas _ +++
Forte: +++ Médio: ++ Fraco: + Ausente: -
Através dos resultados obtidos percebe-se que os triterpenóides são os constituintes
principais do extrato hidroalcoólico de caules de V. squamata.
5.4 Avaliação da Atividade Antioxidante
As atividades antioxidantes dos extratos do caule e folhas tiveram bons resultados como
pode ser visto na FIGURA 4.3 e. FIGURA 4.4.
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
104
FIGURA 4. 3 Porcentagem de inibição do DPPH induzido pelo extrato hidroalcoolico de folhas e a das
nanoemulsões preparadas com estes.
▲ Inibição caule ● Inibição formulação caule após 30 min ▼ Inibição caule ■ inibição
formulação caule após 60 min.
0 100 200 300 400 5000
50
100
150
g/mL
In
ibiç
ão
DP
PH
(%
)
FIGURA 4. 4 Porcentagem de inibição do DPPH induzido pelo extrato hidroalcoólico de caules e a das
nanoemulsões preparadas com estes.
▲ Inibição folha ● Inibição formulação folha após 30 min ▼ Inibição caule ■ inibição
formulação caule após 60 min.
0 100 200 300 400 5000
50
100
150
g/mL
Inib
ição
DP
PH
(%
)
Os resultados obtidos demonstram que a capacidade de inibir o radical DPPH não foi
perdida quando os extratos foram incorporados às formulações.
A TABELA 4.3 mostra os resultados para o IC 50 dos extratos e formulações contendo
os mesmos.
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
105
TABELA 4.3 Valores de IC 50 para os extratos hidroalcoólicos e nanoemulsões contendo os mesmos.
Amostras utilizadas no teste de DPPH 30 min 60 min
Valores de IC 50 em µg Valores de IC 50 em µg
Extrato hidroalcoólico dos caules 0,535 0,527
Nanoemulsão (Caule) 0,544 0,516
Extrato hidroalcoólico das folhas 7,663 5,266
Nanoemulsão (folhas) 0,577 0,565
Djeridane e colaboradores. (2006) demonstraram uma correlação linear entre o conteúdo
de compostos fenólicos totais e as propriedades antioxidantes de extratos vegetais. Os resultados
encontrados para as atividades antioxidantes podem estar relacionados com os polifenóis que
foram identificados por testes fitoquímicos nas folhas e caules de V. squamata. De acordo com
Wojdyło e colaboradores (2007) os ácidos fenólicos representam a principal classe de compostos
fenólicos que são amplamente distribuídos no reino vegetal.
5.5 Dosagem de fenólicos totais
O teor de fenólicos totais dos extratos hidroalcoólicos de V. squamata apresentaram
valores na faixa de 26,52 EAG / g de extrato de folhas e 48,86 EAG/g de extrato do caule em
peso seco (TABELA 4.4) Os compostos fenólicos são utilizados pelas plantas como mecanismos
de defesa para neutralizar EROs, a fim de sobreviver e evitar danos moleculares e também para
impedir a ação de microrganismos, insetos e herbívoros (VAYA et al., 1997). Os resultados
mostram uma correlação positiva entre o conteúdo fenólico total e o ensaio de atividade
antioxidante. No presente estudo percebe-se que o maior teor de compostos fenólicos totais de
extratos de plantas resultou em maior atividade antioxidante como igualmente relatado por Cai e
seus colaboradores (2004).
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
106
TABELA 4. 4 Conteúdo de fenólicos totais expressos em equivalente de ácido gálico (EAG) por grama de extrato
hidroalcoólico seco de caules e folhas V. squamata.
Extrato
Hidroalcoolico ABS EAG/g extrato seco
Extrato caule 2,6109 48,85912
Extrato folhas 1,4188 26,52679
5.6 Avaliação da atividade Antimicrobiana
Os extratos não foram capazes de inibir o crescimento microbiano. Devido a composição
química encontrada no estudo farmacognóstico era esperado alguma ação antibacteriana.
Machado e colaboradores (2003) estudando 14 extratos de plantas usadas tradicionalmente no
Brasil para tratamento de doenças infecciosas, verificaram que P. granatum inibiu linhagens de
S. aureus. Djipa et al. (2000) estudando a atividade antimicrobiana de extratos de jambolão sobre
vários microrganismos, entre eles, S. aureus, verificaram que esta propriedade foi devida à alta
concentração de taninos contida nos extratos.
5.7 Obtenção das formulações
As nanoemulsões obtidas do caule apresentaram cor alaranjada e as nanoemulsões das
folhas cor verde.
5.8 Ensaios de estabilidade acelerada
5.8.1 Processo de centrifugação
A nanoemulsão óleo em água (O/A) contendo os extratos hidroalcoólicos de caules e
folhas de extratos hidroalcoólicos de caules e folhas apresentaram-se estáveis no ensaio de
centrifugação não apresentando separação de fases.
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
107
5.8.2 Estresse térmico
Ao ser submetido a estresse térmico as nanoemulsões contendo os extratos
hidroalcoólicos de caules e folhas de V. squamata não apresentaram separação de fases.
5.8.3 Determinação do valor de pH
A determinação de valores de pH é de grande importância em formulações tópicas, uma
vez que esse valor deve estar em conformidade com o pH natural da pele. As formulações
mostraram um pH ligeiramente ácido, compatível com o pH da pele, que possui valores de 4,1-
5,8 (SEGGER et al., 2008). Houve mudanças nos valores de pH após um mês, mas ainda tais
valores estão dentro do intervalo esperado (TABELA 4.5) não comprometendo a estabilidade da
formulação.
TABELA 4.5 Determinação do valor de pH das nanoemulsões formuladas com extratos hidroalcoólicos de caules e
folhas de Vellozia squamata.
Nanoemulsões Formuladas com
Extratos Hidroalcoólicos
Valor de pH das formulações
Inicial Após 30 dias
Caule 5,12 ± 0,01 5,18 ± 0,01
Folhas 4,95 ± 0,02 5,13 ± 0,02
5.8.4 Determinação do tamanho de partícula
O tamanho de partículas é um parâmetro importante para avaliar nanoemulsões devido ao
fato de que o tamanho da partícula é o principal fator responsável pelo efeito de maior permeação
de componentes ativos nas camadas da pele. Além do tamanho de partícula, é essencial saber o
índice de polidispersidade, estes fatores em conjunto influenciam a estabilidade destes sistemas.
A distribuição do tamanho de partícula das nanoemulsões obtidas a partir dos extratos
hidroalcoólicos de folhas e caules de V. Squamata foram medidos por sete dias (TABELA 4.6).
Ambas as nanoemulsões apresentaram tamanho de partículas reduzidos não sofreram alterações
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
108
significativas em relação aos sete dias as quais foram analisadas. Isso mostra que ambas as
formulações são altamente estáveis. A avaliação do índice de polidispersividade mostra que
ambas nanoemulsões foram homogêneas em relação aos tamanhos de partículas e estas são
adequadas para aplicação e uso tópico.
TABELA 4.6 Distribuição do tamanho de partículas das nanoemulsões preparadas a partir dos extratos
hidroalcoólicos de V. squamata em função do tempo após o preparo.
Período após o
preparo das
formulações
Tamanho de Partículas das Nanoemulsões dos Extratos
Hidroalcoolicos
Folha Caule
Diâmetro (nm) P.I. Diâmetro (nm) P.I.
0h 154,6 ± 9,59 0,284 ± 0,034 147,6 ± 33,32 0,351 ± 0,254
24h 138,4 ± 1,69 0,154 ± 0,037 132,0 ± 4,94 0,275 ± 0,055
48h 154,2 ± 2,43 0,361 ± 0,254 167,7 ± 7,51 0,528 ± 0,105
72h 155,0 ± 4,41 0,289 ± 0,073 180,2 ± 23,48 0,733 ± 0,196
6 Dias 144,4 ± 1,06 0,239 ± 0,017 144,4 ± 1,06 0,239 ± 0,017
7 Dias 144,5 ± 4,02 0,310 ± 0,022 157,4 ± 6,90 0,490 ± 0,128
P.I.= Índice de polidispersividade
5.8.5 Análises reológicas
O comportamento reológico das formulações foi avaliado utilizando a lei de potência.
Assim, depois de medir o comportamento reológico das formulações, observa-se que ambas as
formulações que contêm os extratos hidroalcoólicos das folhas e caules exibem um
comportamento newtoniano, ou seja, têm uma viscosidade ideal comportamento (Tabela 4.7).
Mostrou-se que a relação entre tensão de corte e a taxa de cisalhamento é linear. Isto significa
que, para uma dada temperatura, a viscosidade manteve-se constante durante a sua medição,
independentemente do tempo e o cisalhamento empregadas (CORRÊA et al., 2005).
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
109
TABELA 4.7 Parâmetros do comportamento reológico das nanoemulsões formuladas com extratos hidroalcoólicos
de caules e folhas de Vellozia squamata.
Nanoformulações
↓
Índice de
fluxo
Índice de
consistência (cP)
Viscosidade Aparente
(cP)
Extrato caule 1,00 2,39 99,70
Extrato folha 1,00 2,39 99,70
cP = centi Poise.
CAPÍTULO 4
110
7 CONCLUSÃO
A caracterização farmacognóstica mostrou uma presença de várias classes químicas
presentes nos extratos hidroalcoólicos destacando-se os compostos fenólicos.
Através da avaliação da atividade antioxidante percebeu-se uma inibição significativa do
DPPH ●por ambos os extratos hidroalcoólicos de folhas e caules.
A alta capacidade de inibir o DPPH ● está relacionada com moléculas com grupos
fenólicosos como flavonóides, flavanonas e flavanonois os quais são capazes de
neutralizar os radicais livres
Ambos extractos hidroalcoólicos apresentaram no teste de dosagem de fenólicos totais
altas concentração de tais compostos.
O método de inversão de fase foi eficiente na preparação de nanoemulsões estáveis as
quais são adequadas para aplicação tópica destes extratos.
Mesmo sob a forma de nanoemulsão a atividade antioxidante dos extratos permaneceu a
mesma encontrada em sua solução, conclui-se então que o veículo não influencia nessa
atividade.
As nanoemulsões utilizando extratos hidroalcoólicos de folhas e caules de V. squamata
mostraram-se promissoras para o desenvolvimento de fitomedicamentos e cosméticos.
111
8 REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 4
REFERÊNCIAS
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113
CAPÍTULO 5
CONCLUSÃO GERAL
CAPÍTULO 5
CONCLUSÃO GERAL
114
1 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos nesse estudo nos permitem concluir que o rendimento e a
constituição química dos OE de M. graveolens e M. leucadendron sofreram variações com a
época da coleta das espécies. Os OE mostraram-se agentes antimicrobianos em potencial. A
capacidade desses óleos em inibir o crescimento microbiano mostrou-se significativa contra
bactérias Gram-positivas. Já os extratos hidroalcoólicos de folhas e caules de V. squamata
apresentaram elevada capacidade antioxidante. Essa habilidade pode ser atribuida aos
constituintes fenólicos encontrados nos extratos. Mesmo sob a forma de nanoemulsão a
atividade antioxidante dos extratos permaneceu a mesma encontrada em sua solução. O
método de inversão de fase foi eficiente na preparação de nanoemulsões estáveis as quais são
adequadas para aplicação tópica dos óleos e extratos. Sendo assim, os resultados obtidos
apontam para a importância dos estudos de óleos essenciais e extratos vegetais de espécies da
flora brasileira visando a identificação de espécies promissoras, para utilização como insumos
e na obtenção de ativos para potenciais candidatos a novos fármacos.
115
CAPÍTULO 6
PERSPECTIVAS FUTURAS
CAPÍTULO 6
PERSPECTIVAS FUTURAS
116
1 PERSPECTIVAS FUTURAS
É necessario um estudo mais completo sobre a variação do rendimento e constituintes
químicos dos óleos essenciais de M. graveolens e M. leucadendron quando coletadas
em diferentes épocas do ano, locais e horários.
A avaliação da atividade antimicrobiana deve ser realizada com óleos essenciais em
diferentes épocas com intuito de avaliar a capacidade antimicrobiana ao longo do
tempo.