Capítulo I Métodos de Detecção de Enterotoxinas ... · produção de SEs (Stiles e Krakauer,...
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Capítulo I
Métodos de Detecção de Enterotoxinas
Estafilocócicas
1- Introdução
1.1 – Aspectos gerais sobre as enterotoxinas estafilocócicas
As enterotoxinas estafilocócicas (SEs) são proteínas monoméricas de peso
molecular variando entre 22 e 31 kDa, termoestáveis e de vida média longa, que são
secretadas e acumuladas durante a fase estacionária de crescimento in vitro e in
vivo de diferentes cepas de Staphylococcus aureus enterotoxigênicas (Balaban e
Rasooly, 2000). Essas proteínas são determinantes de intoxicações alimentares, na
ordem de microgramas (3,5 – 150 µg, dependendo da sensibilidade da espécie e do
indivíduo), após a ingestão acidental ou intencional de alimento contaminado (Ilbäck
et al., 2003; Rusnak et al., 2004; Mantis, 2005).
As intoxicações ocorrem frequentemente após ingestão de carnes processadas
e produtos derivados do leite contaminados por causa do manuseio impróprio dos
alimentos e subseqüente acondicionamento inadequado, por exemplo,
armazenamento em altas temperaturas, levando ao crescimento de S. aureus e à
produção de SEs (Stiles e Krakauer, 2005a).
As SEs interagem com vários alvos celulares desencadeando reações
biológicas e fisiológicas que conduzem às manifestações clínicas características de
intoxicação alimentar: náuseas, vômitos, vertigens e ocorrência de diarréia entre
uma a seis horas após ingestão do alimento contaminado (Mantis, 2005).
Hipotensão, deficiência nas funções renais e edema pulmonar são também
alterações freqüentes em casos de intoxicação. A recuperação ocorre no período de
vinte e quatro horas, porém, óbitos entre neonatos e idosos não são raros (Medina-
Acosta et al., 2003).
Tradicionalmente, cinco tipos de SEs antigênicas clássicas são reconhecidas
(SEA, SEB, SEC, SED e SEE (Dinges et al., 2000)). Entretanto, durante os anos 90,
novas enterotoxinas (SEG, SEH, SEI e SEJ) foram descritas e seus genes
identificados (Zhang et al., 1998). Recentemente, dados resultantes das análises
genômicas têm levado a uma expansão rápida do alfabeto de SEs e à descrição de
novos genes (sek, sel, sem, seo, seq, ser e seu) (Jarraud et al., 2001; Orwin et al.,
2001, 2002, 2003; Letertre et al., 2003; Omoe et al., 2003).
Entre as SEs, os sorotipos SEA, SED e SEE compartilham
maior homologia, variando entre 53 e 81%. Elas também apresentam uma
conformação tri-dimensional conservada, que separa dois domínios distintos de
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ligação ao receptor de célula T (TCR) (Hurley et al., 1995). Uma outra característica
indicativa da similaridade estrutural das enterotoxinas é a reatividade cruzada e
neutralização com anticorpos (Kum e Chow, 2001).
As SEs são estruturalmente semelhantes entre si e na localização das pontes
dissulfeto. Análises cristalográficas revelaram que estas moléculas possuem forma
elipsoidal e que são pregueadas de modo a formar dois domínios contendo uma
mistura de estruturas α-hélices e folhas-β pregueadas, conforme observado na
figura 1. As enterotoxinas compartilham várias regiões conservadas e possuem o
duplo domínio separado por uma pequena cavidade. A união entre esses domínios,
que dá a conformação tridimensional, parece ser bastante conservada, mas a
seqüência de aminoácidos nestas regiões não (Balaban e Rassoly, 2000).
Além das semelhanças estruturais (Balaban e Rassoly, 2000), as SEs exibem
similaridades biológicas de superantigenicidade e enterotoxigenicidade (Jarraud et
al, 2001).
Figura 1: Modelo da estrutura tridimensional da enterotoxina B, demonstrando os
dois domínios da molécula (Georgiou et al., 1998).
1.2 – Atividades enterotoxigênica e superantigênica das enterotoxinas
Harris et al. (1993) propuseram que existe uma relação entre a atividade
superantigênica e enterotoxigênica das toxinas, e que na maioria dos casos, a perda
da atividade superantigênica resulta na perda de enterotoxigenicidade. Porém,
essas duas atividades são atribuídas a domínios distintos da molécula (Hoffman et
al., 1996). Assim sendo, o fato de a proteína ser superantigênica não significa
necessariamente que ela seja enterotoxigênica.
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A superantigenicidade está relacionada à capacidade da proteína estimular
inespecificamente a proliferação de células T, enquanto que a enterotoxigenicidade
e o efeito emético estão relacionados com a estimulação do sistema nervoso central,
após atuação da toxina nos receptores neurais intestinais (Monday e Bonach, 1999).
O efeito emético está associado a náuseas, vômitos, dores abdominais,
prostração e diarréias. Os primeiros acontecem de duas a seis horas após a atuação
da toxina sobre os receptores neurais no intestino. Na maioria dos hospedeiros, a
diarréia ocorre devido ao aumento do peristaltismo intestinal e perda de líquido pelo
organismo (Balaban e Rasooly, 2000)
A administração via oral de SEA não resulta em danos na membrana da
mucosa gastrointestinal como edema, citólise, necrose do tecido do lúmen ou
alterações na morfologia do epitélio. Esses fatos dificultam os estudos do
mecanismo pelo qual a toxina induz a intoxicação alimentar e resulta em vômitos e
diarréia. Hu et al. (2005a), sugerem ainda que o contato direto da enterotoxina com
o epitélio intestinal afeta a função epitelial, pelo aumento da liberação de cálcio
intracelular, e seu efeito sobre a sinalização celular deste tecido, já que o cálcio é
importante regulador de muitos processos fisiológicos e respostas patológicas.
Analisando estruturalmente a SEA carboximetilada foi revelado que a histidina
na posição 61 é importante para o evento emético, mas não para a
superantigenicidade (Hoffman et al., 1996). Entretanto, foi descrita como
responsável pela êmese na SEA, a região peptídica dos resíduos 121 a 180 que não
possui a alça dissulfeto e histidinas (Hu et al., 2001). As regiões dos domínios
central e C-terminal das SEs parecem ser responsáveis por causarem tais efeitos
uma vez que a remoção de 59 resíduos da região N-terminal, testada em SEC 1,
não altera essa propriedade (Spero et al., 1976).
Tais toxinas possuem dois domínios principais responsáveis por sua ligação às
cadeias Vβ das moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade Classe II
(MHC II), estimulando inespecificamente as células apresentadoras de antígenos
(APCs) (Dinges et al., 2000) (figura 2). Para realizar tal função, as APCs requerem o
reconhecimento da cadeia β do TCR para interação deste com as proteínas do MHC
II nas APCs, sem o processamento do antígeno. Devido a essa interação, as SEs
causam ativação de até 25% dos linfócitos T (Kappler et al., 1994). Em contraste, os
antígenos clássicos ativam 0,0001-0,01% das células T (Fink et al., 1986). Como
resultado da ativação celular ocorre um excesso na produção de citocinas, tais como
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fator de necrose tumoral (TNF) α e β, interleucinas (IL) 1 e 2 e interferon (INF) γ.
Estas citocinas são responsáveis por vários sintomas clínicos observados em
septicemias e na síndrome do choque tóxico, levando as células à apoptose e
resultando em imunossupressão (Rellahan et al., 1990).
O choque tóxico tem como manifestações clínicas febre acima de 39ºC,
exantema com descamação, hipotensão, podendo afetar os sistemas muscular
(mialgia severa), mucoso (com enantema), renal (elevação de uréia e creatinina),
hepático (elevação da transaminases e hiperbilirubinemia, levando a lesão),
hematológico (trombocitopenia e linfocitopenia) e nervoso central (desorientação,
sem sinais neurológicos focais) (Veronesi et al., 1997).
Figura 2: Esquema de ativação de linfócito T por antígenos clássicos e
superantígenos (Phillips, 2002, adaptado).
Experimentos usando mutantes do TCR sugerem que as três alças, CDR1,
CDR2 e CDR3, da cadeia Vβ contactam uma cavidade nas moléculas de SEA, SEB
e SEC, formada por resíduos de aminoácidos de pelo menos três regiões separadas
na estrutura primária da toxina, porém aproximadas durante a organização
tridimensional da molécula (Bentley, 1995). A diferença na seqüência de
aminoácidos na cavidade das SEs permite a diversidade de suas interações com as
regiões Vβ (Balaban e Rassoly, 2000), que possuem um repertório de
aproximadamente 25 famílias.
1.3 – Estado-da-arte da detecção de enterotoxinas
Além de ser um problema de ordem de saúde pública, a presença das SEs
resulta em perda econômica para o produtor de leite (Wilson et al., 1997). A infecção
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intramamária em gado leiteiro com S. aureus causam a doença típica de mastite,
que resulta em perda da produção e da qualidade do leite para consumo (Weigler et
al., 1990; Beck et al., 1992).
Ainda, as SEs estão classificadas na Categoria B de agentes de risco biológico
e são considerados de fácil disseminação (Kaempfer et al., 2002) e, se distribuídas
acidental ou intencionalmente na população, resultam em morbidade moderada e
mortalidade baixa. Por causa da situação de bioterrorismo, os Institutos de Saúde
dos EUA (NIH) e o Centro para o Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC)
colocaram essas toxinas na lista de agentes biológicos que têm o potencial de ser
utilizadas como armas biológicas (Mantis, 2005).
Os problemas associados às SEs alertam sobre a necessidade de rápida
detecção em produtos de consumo humano, para que os tratamentos sejam
providenciados antecipadamente a doença clínica.
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para detecção de SEs. Basicamente se
resumem a ensaios biológicos e imunológicos. Os ensaios imunológicos são mais
sensíveis e específicos e são base para detecção das SEs identificadas
sorologicamente. Entretanto, qualquer SE não caracterizada pode ser detectada
apenas pela sua atividade emética em macacos. A quantidade de SE requerida para
causar doença em homens depende da susceptibilidade dos indivíduos, dessa
forma, o ensaio diagnóstico, além de específico, deve ser sensível o suficiente.
1.3.1 – Detecção baseada em ensaios biológicos
A maioria dos ensaios biológicos utiliza macacos, gatos e cobaias (Su e Wong,
1997). As enterotoxinas são detectadas pela sua atividade emética em macacos.
Classicamente, as amostras suspeitas são aplicadas intragastricamente em
macacos Rhesus jovens e os efeitos eméticos podem ocorrer em até cinco horas
após ingestão, caso a amostra contenha alguma enterotoxina. A dose efetiva média
(ED50) varia de 5 a 20 µg. Dentre as desvantagens deste método estão a variação
na sensibilidade dos animais, a inabilidade de diferenciação entre os sorotipos das
SEs, o desenvolvimento de resistência em animais a repetidas administrações de
SEs, além do alto custo dos ensaios (Surgalla et al., 1953).
Em gatos, SEC só é capaz de produzir efeitos eméticos quando utilizada cinco
vezes acima da concentração de SEA ou SEB (Bergdoll, 1972). Além das SEs,
outras substâncias tóxicas presentes no meio de cultura são capazes de causar
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vômitos nestes animais. Dessa forma, o resultado deve ser analisado
criteriosamente (Dolman et al., 1936).
A injeção cutânea de toxina após injeção intravenosa com azul de Evans (1%)
em cobaias sensibilizadas com imunoglobulina E anti-SEB resulta na produção de
uma área sensibilizada de aproximadamente 5 mm de diâmetro. Por este método é
possível detectar 10 pg de enterotoxina num período de dez a quinze minutos,
porém é impraticável o uso deste ensaio para analisar um grande número de
amostras para SEB (Scheuber et al., 1983).
1.3.2 – Técnicas baseadas em ensaio enzimático imunoabsorvente
O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) é uma ferramenta fundamental
na detecção de agentes biológicos, incluindo toxinas como as SEs. Baseado nos
princípios de interações antígeno-anticorpo, o ELISA permite uma fácil visualização
de resultados e pode ser finalizado sem a adição de materiais radioativos (Khan et
al., 2003).
Uma variedade de técnicas qualitativas para detecção dessas toxinas está
disponível no mercado (figura 3). Essas técnicas incluem os ensaios
imunoabsorventes radioativos e os kits EIA (enzyme immunosorbent assay), alguns
dos quais estão disponíveis como kits comerciais. A sensibilidade dessas técnicas
difere, e o menor limite de detecção tem sido de 0,1 ng/mL de enterotoxina B
estafilocócica (SEB) com o kit SET-EIA (Kijet et al., 2000).
Figura 3: Kit comercial de diagnóstico. Em geral, os kits são compostos de soluções
de incubação, lavagem, revelação, reagentes e recipientes previamente preparados
para a reação.
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Vernozy-Rozand et al. (2004), compararam especificidade e sensibilidade de
três kits (VIDAS SET - bioMérieux, VIDAS SET2 - bioMérieux e TRANSIA PLATE –
Diffchamb, Lon, France) disponíveis no mercado para detecção de SEs. Realizaram
ensaios em diversos tipos de alimentos, a saber: cozidos, crus (delicatessen e
produtos do mar), enlatados, líquidos, desidratados e derivados do leite. Desses
alimentos, apenas os crus apresentaram falso-positivos, com especificidade de 82%
e 78%, para os kits, VIDAS SET e TRANSIA PLATE, respectivamente.
Quanto à sensibilidade, o kit VIDAS SET2 foi o melhor e os resultados foram
comparáveis com os imunoensaios Western blot (Rasooly e Rasooly, 1998),
biosensores bidifrativos (O`Brien et al., 2000), e sensores baseados em
fluorescência (Rowe-Taitt et al., 2000). Vale ressaltar que os tempos necessários
para realizar os ensaios são de oitenta minutos para VIDAS SET e VIDAS SET2 e
cento e quarenta e cinco minutos para TRANSIA PLATE. Os dois primeiros, por
serem automatizados, podem ser incorporados no programa Hazard Critical Controle
Point (Su e Wong, 1997), e serem usados para análise de SEs em larga escala.
Também foram considerados dois outros métodos capazes de detectar toxinas
em amostras mais difíceis como leite seco (contendo 5% de umidade). Esses
métodos são o biosensor de ressonância de superfície de plasma (Homola et al.,
2002) e o citômetro imunomagnético (Miyamoto et al., 2003).
Além dos métodos qualitativos, também existem os quantitativos. Sasaki et al.
(2005), estabeleceram um imunoensaio específico e quantitativo, utilizando
anticorpos monoclonais num sistema, baseado no ELISA sanduíche, o ABS-ELISA
(avidin-biotin sandwich ELISA). O método é sensível e confiável, comparado com o
SET RPLA (DENKA SEIKEN Co., Tókio) comercial, baseado em aglutinação em
látex (quantitativo), porém foi considerado superior porque o tempo requerido para
medição é menor (três horas para o RPLA versus dezoito horas para o ABS-ELISA)
e a exatidão na determinação da concentração dos antígenos foi maior (desvio
padrão de 0,01-0,87 para o ABS-ELISA e de 0,0009-6,2 para o SET RPLA).
Um método sensível e mais rápido foi desenvolvido por Alefantis et al. (2004).
Neste método utiliza-se um sistema de dois anticorpos onde um anticorpo policlonal
anti-SEB está ligado a esferas magnéticas e o outro, um anticorpo monoclonal anti-
SEB marcado, está ligado com Alexa flúor 647 (figura 4).
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Figura 4: Esquema representativo do funcionamento do imunoensaio para detecção
de S
numerosas aplicações dos chips de proteínas, produzidos acoplando-se tais
proteínas a uma estrutura bi ou tridimensional, incluem a detecção de marcadores
de doenças e alérgenos, estudos de interações entre proteínas em células e em
plasma e para análise de proteoma (Zhy e Snyder, 2003; Seong e Choi, 2003;
Glokler e Angenent, 2003).
Rubina et al. (2005), desenvolveram e aperfeiçoaram microchips de proteínas
baseados em imunoensaios direto, competitivo e sanduíche. Estes microchips são
capazes de detectar, em horas, algumas biotoxinas, dentre elas SEB, toxinas do
EB baseado em esferas magnéticas. Basta misturar a amostra problema aos
dois componentes, incubar trinta minutos a 37ºC, lavar e medir a presença do
anticorpo marcado em um espectrofotômetro. O tempo total deste ensaio é de
aproximadamente quarenta e cinco minutos (Alefantis et al., 2004, adaptado).
Atualmente, a pesquisa científica e tecnológica está na fase dos microchips,
que são arranjos de microelementos individuais contendo várias sondas. Ao
contrário dos métodos comuns, os microchips permitem análises paralelas de
amostras, para diversos parâmetros, utilizando baixas quantidades de material.
Entretanto, essas análises são feitas de forma sensível, segura e eficiente. As
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tétano e da difteria e fator letal de antraz (figura 5). Os resultados dos imunoensaios
podem ser alcançados por vários métodos: intensidade de fluorescência, pela
intensidade de quimioluminescência da proteína conjugada a peroxidase e por
espectrometria de massa direta (MALDI TOF) dos elementos do microchip.
Microarranjos semelhantes foram desenvolvidos por Rucher et al. (2005), porém
estes eram específicos para a subunidade b da toxina do cólera, toxina da difteria,
fator letal e o antígeno protetor do antraz, SEB e o fragmento C da toxina do tétano.
Figura 5: Microchips de proteínas para detecção de toxinas. Os pontos brancos
intensos são indicativos de presença de toxina nas amostras testadas (Rubina et al.,
2005, modificado).
1.3.3 – Detecção por Western blot
A técnica Western blot supera alguns dos problemas associados com os
ensaios de ELISA. O Western blot é um método amplamente usado para análise de
proteínas e, assim, tem sido usado para detectar SEA e SEC (Orden et al., 1992;
Uhl, 2004). Em um imunoblot, as proteínas são separadas por tamanho usando a
eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) ou por
ponto isoelétrico usando gel de enfoque isoelétrico, transferido para uma membrana,
que é, então, incubada com anticorpos específicos (figura 6). Uma vez que o ELISA
e o Western blot se baseiam em detecção imunológica, os imunoblots apresentam
duas vantagens para o teste em alimentos. Primeiro, mesmo que o tratamento
térmico possa causar agregados protéicos, os agregados são solubilizados e
desenovelados em gel de SDS. Não existe um passo de solubilização em ELISA
porque a amostra é diretamente aplicada no anticorpo, e SDS na amostra
10
desnaturaria o anticorpo. Segundo, a reação cruzada entre antígenos pode ser
caracterizada em Western blot, enquanto no ELISA, eles apenas aumentam o
background. No blot, o peso molecular (ou o ponto isoelétrico) identifica o antígeno
e está reagindo com o anticorpo (Rasooly e Rasooly, 1998). qu
Figura 6: Esquema representativo da transferência de proteínas para membrana de
nitrocelulose e marcação de anticorpos que reconhecem as proteínas presentes em
uma amostra desconhecida.
1.3.4 – Detecção pela PCR
Como técnica moderna da Biologia Molecular, a PCR (polymerase chain
reaction) também tem sido utilizada na detecção dos genes que codificam
enterotoxinas (figura 7). Ela se faz de forma específica, porém, a amplificação das
seqüências não é evidência da toxina no material biológico (Sasaki et al., 2005).
Entretanto, apesar de ser executado em horas e até mesmo em dias, uma vantagem
deste método é o fato de possuir uma alta sensibilidade e precisão, mesmo numa
amostra com baixa concentração de microrganismos. É possível amplificar a cópia
de uma seqüência para enterotoxina em 1 pg de DNA, o que corresponde a 10
CFU/mL (Cremonesi et al., 2005).
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Figura 7: Esquema representativo do funcionamento da técnica da PCR.
A polimerase sintetiza a molécula de DNA. Estes processos
esnaturação, anelamento e alongamento) ocorrem em vários ciclos de forma que,
ilhões de fragmentos de DNA de peso
mole
o. Esta técnica é aprovada pela Associação Oficial
de A
nas técnicas de microlâmina e ótima sensibilidade em placa (Robbins et al., 1974).
Inicialmente o DNA de interesse é desnaturado e os iniciadores presentes na
solução se ligam de forma complementar e antiparalelamente a uma das fitas. Em
seguida, a DN
(d
ao final do processo, são amplificados m
cular específico correspondente a seqüência de interesse.
1.3.5 – Detecção por Imunodifusão
Um dos métodos de referência, a imunodifusão ou técnica de Ouchterlony foi
desenvolvida por Casman et al. (1969); requer de três a dez dias para obtenção dos
resultados. Neste método, a proteína e um anticorpo específico difundem por um gel
e a reação entre ambos forma uma linha de precipitação característica de
positividade (figura 8). É um método que detecta cerca de 500 ng/mL de
enterotoxina no material suspeit
nálises Químicas (AOAC), adotada pelo FDA e é recomendada como método
padrão para avaliação de novos ensaios. Outras variações do método são utilizadas
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Figura 8: Imunodifusão em ágar. As linhas de precipitação são indicativas de reação
1.3.6 – Detecção por aglutinação em látex
ade
e especificidade. Em comparação com outros métodos de detecção são mais
de não necessitarem de técnicos
a izá-lo, equipamentos sofistic
ais elevados (L 200 po inda ser c ado para clínicas,
equenos centro ença p o paciente
e , 2003).
, o anticorpo e fico adsorvido ou ligado covalentemente
misturado com a amostra suspeita e é monitorado se há ou não aglutinação. A
e antígeno na a ra permite reconhecimento pelo anti
o do complexo formado no látex (figura 9). Existem algumas modificações
a utiliza lá ohne l., 1992; L t al., 1
o (Lim et al., 1998).
entre as amostras T, 2 e 4 com o antisoro (AS) que difundiram no gel (reproduzido
de Uhl, 2004).
Os testes de aglutinação em látex têm sido utilizados para vários alvos e
apesar de não serem métodos padrões de detecção têm mostrado alta sensibilid
rápidos – o tempo varia de um minuto (Lu et al., 2002) a dezesseis horas (Igarashi et
al., 1986) –, econômicos e fáceis de utilizar, além
especializados p ra real
ee et al.,
s de do
a
ados ou reagentes de custos
de a
o e realizad
m 4). O teste
o cam
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ao leito dop s e n
(Chandrakesan
Neste teste
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specí ao látex
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most corpo e
a
do teste, nas qu
magnetizad
is se tex colorido (R r et a im e 998) ou
13
Figura 9: Aglutinação em látex. As amostras 2 e 4 representam anticorpos
adsorvidos ao látex, que aglutinaram na presença de amostras suspeitas
(http
tecção de fatores de virulência de
taphylococcus aureus por aglutinação em látex.
://www.rapid-diagnostics.org/images/Image5.jpg).
A tabela 1 apresenta comparativamente a especificidade e sensibilidade de
alguns testes padronizados para detecção em látex de amostras de S. aureus.
Tabela 1: Testes padronizados para de
S
Alvo de detecção
Método padrão de detecção (padrão ouro)
Tempo necessário (padrão ouro/ latex)
Especificidade (em comparação com o padrão ouro)
Sensibilidade (em comparação com o padrão ouro)
Referência
Staphylococcus aureus resistente a meticilina
PCR 1-1,5 h/3-15 min
99,2 100 Cavassini et al., 1999
Staphylococcus resistente a meticilina
PCR 1-1,5 h/12-15 min
99,1 100 Sakoulas et al., 2001
Staphylococcus aureus resitente a meticilina
PCR 1-1,5 h/20 min 100 100 Lee et al., 2004
Staphylococcus coagulase-
PCR
negatresistente a
1-1,5 h/não informado
100 100 Louie et al., 2001
ivo
oxacilina TSST-1
Ouchterlony ~24 h/16 h ND ND Igarashi et al., 1986
Em resumo, dentre os métodos disponíveis para detecção de SEs, existem
vantagens e desvantagens (tabela 2). Os métodos biológicos ainda são utilizados,
14
15
e torna impraticável, devido a
quantidade de animais e aos cuidados de manutenção e análise de resultados.
Em comparação com os métodos biológicos, os métodos imunoquímicos, como
o Western blot, imunodifusão em ágar, ELISA, aglutinação em látex, PCR,
microarranjos, são mais sensíveis, específicos práticos, rápidos e bem-vistos quando
há a necessidade de analisar um grande número de materiais, embora necessitem
de certos equipamentos, reagentes e de padronização para que os resultados
possam ser analisados com confiabilidade.
1.4 – Justificativa
As SEs são proteínas secretadas por 30-50% das cepas de S. aureus e podem
ser encontradas em alimentos contaminados cozidos e mantidos à temperatura
ambiente, ricos em carboidratos e proteínas, como as carnes processadas,
presuntos, carne de porco salgada, massas recheadas com cremes, salada de
batata, sorvete, leite e seus derivados. Essas toxinas são resistentes às altas
temperaturas (cozimento), às enzimas intestinais tripsina e pepsina e podem ser
facilmente produzidas a partir de culturas obtidas de procedimentos laboratoriais mais
simples. Além disso, pertencem à Categoria B de agentes de risco biológico,
causando morbidade e mortalidade moderadas, tendo como alvo sua utilização como
agente bioterrorista.
Por causa da exposição e dos riscos causados pelas enterotoxinas, torna-se
necessário o desenvolvimento de métodos rápidos, seguros e baratos de detecção
dessas toxinas, de modo que possam ser utilizados ao leito do paciente, como
também no controle de alimentos e bebidas nas indústrias, principalmente em
amostras de leite em rebanhos suspeitos de infecção estafilocócica, como em
procedimentos que exijam monitoramento em ampla escala. Sendo assim, neste
trabalho propomos desenvolver um teste piloto de aglutinação em látex, utilizando
anticorpo anti-SEC recombinante, para detectar proteína SEC de forma rápida e
mais barata que os métodos convencionais. Visamos também comparar a
especificidade e sensibilidade deste e de outros métodos, como os testes de ELISA,
de Imunodifusão, de Western blot, com a PCR.
entretanto, não quando se deseja determinar a classe da toxina em questão. Para
estes métodos existem casos em que é possível determinar a concentração da
toxina. De qualquer forma, quando é necessário a detecção de SEs em um grande
número de amostras, a utilização de animais s
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Tabela 2: Características apresentadas pelos métodos de detecção de enterotoxinas. Método de detecção*
Vantagem Desvantagem Sensibilidade Especificidade Custopor amostra
Tempo Necessário
Ouchterlony e variações
Aprovada pela AOAC e adotada pelo FDA
É subjetivo 100 ng/mL Tipagem Baixo 18-72 horas
ELISA kits diagnósticos
Sensibilidade Não distingue proteína A produzida pelos S. aureus
0,2 ng/mL Tipagem Moderado 1,5 - 4 horas
Radioimuno-ensaio
Sensibilidade Utiliza material radioativo
1 ng/mL Tipagem Moderado 3-4 horas
Western blot Há solubilização de agregados
Necessidade de equipamentos exclusivos
100 pg/mL Tipagem Moderado 4--6 horas
Aglutinação em látex
Rápido É subjetivo 2,5 ng/mL Tipagem Baixo 20 minutos
Microarranjo
Sistematização
Exige profissional qualificado
100 pg/mL Tipagem Alto 1,5 horas
PCR Muito sensível,altamente específico
Exige profissional qualificado, a presença do gene não é necessariamente indicativa da presença da proteína
1 pg Todos os genes Alto 4-6 horas
Biológico É possível visualizar o efeito causado pela toxina
Utiliza um animal por amostra 10 pg Inespecífico Alto 15 minutos-6horas
* Os testes necessitam de preparação da amostra.
2 – Objetivos
2.1 – Desenvolver um teste piloto para detecção de enterotoxina C por aglutinação
em látex.
2.2 – Avaliar comparativamente a sensibilidade e especificidade do teste piloto em
relação aos testes de ELISA, Western blot, Imunodifusão e PCR.
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3 – Materiais e Métodos
3.1 – Material biológico
3.1.1 – Obtenção da proteína SEC nativa
SEC foi gentilmente cedida pelo prof. Dr. Olney Vieira da Motta, Laboratório de
Sanidade Animal (LSA), Centro de Ciências e Tecnologias Agrárias (CCTA),
Universidade Estadual Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) – Campos dos
Goytacazes/Rio de Janeiro. Brevemente: a proteína foi purificada a partir da cultura
em saco de diálise da cepa bovina de S. aureus LSA 88 em coluna Sephadex G-100
(Sigma), seguida de cromatografia líquida de alta eficiência, em coluna C4 (GE
Healthcare) (Vieira-da-Motta, 2001).
3.1.2 – Obtenção da proteína SEC recombinante
A construção pEMA-30 contém a região que codifica a seqüência da proteína
SEC madura e foi utilizada como controle positivo sec+ nos ensaios. Este plasmídeo
foi utilizado para transformar Escherichia coli M15-pREP4 (Invitrogen) e os
transformantes para induzir a superexpressão de SEC recombinante, que foi
purificada em coluna de afinidade de Ni2+ agarose (Sigma, EUA), dessalinizada em
coluna de gel filtração Sepharose Dessalting HiTrap (GE Healthcare, Alemanha) e
dosada pelo método do ácido biscinconínico (Sigma, EUA; Redinbaugh e Turley,
1986) (Uhl, 2004).
3.1.3 – Soros
3.1.3.1 – Produção e purificação de IgG anti-SEC recombinante (R18)
O sangue total de um coelho foi coletado, via punção cardíaca, sete dias após a
última das quatro imunizações, realizadas em intervalos de sete dias. O animal
recebeu 60 µg de SEC recombinante, no ponto “BaiHui”, e foi observado durante 28
dias, por um veterinário. Após a coleta, o sangue foi incubado por uma hora a 37ºC
para coagulação e, em seguida, o soro, denominado R18, foi separado e
acondicionado congelado até o momento da utilização (Uhl, 2004).
IgG anti-SEC recombinante foi purificado em coluna montada com resina
Sepharose 4B ativada por brometo de cianogênio (GE Healthcare), a qual foi
18
imobilizada a proteína SEC recombinante. A resina Sepharose 4B (1 g) foi dissolvida
em 1 mL de 1 mM HCl durante quinze minutos. Em seguida, foi lavada com 200 mL
de 1 mM HCl, em alíquotas de 20 mL. Dez miligramas de SEC recombinante foram
suspensas em 5 mL de solução de 0,1 M NaHCO3 , 0,5 M NaCl, pH 8,3 e misturada
com a resina durante uma hora, a temperatura ambiente. O excesso de ligante foi
retirado após lavagem da resina com 5 volumes de solução 0,1 M NaHCO3, 0,5 M
NaCl, pH 8,3. A coluna foi bloqueada com 1 M de etanolamina, pH 8,0 durante duas
horas. A seguir, foi lavada com 3 ciclos dos tampões: 0,1 M de tampão acetato, pH
4,0 contendo 0,5 M de NaCl (5 volumes da coluna); e, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0,
contendo 0,15 M de NaCl (5 volumes da coluna). A quantidade de proteína
desacoplada nos sobrenadantes foi dosada pelo método do ácido biscinconínico. O
soro R18, previamente diluído (4 volumes), foi incubado com a resina por duas horas
a temperatura ambiente. A coluna foi lavada, com PBS 1X, com 5 volumes da coluna
e o material foi coletado. A eluição foi feita com 2 volumes de 100 mM de glicina, pH
2,5; o anticorpo foi coletado em um tubo contendo 0,1 volume de tampão fosfato 1M,
pH 8,0. A seguir, a coluna foi lavada com 10 volumes de tampão fosfato 10 mM, pH
6,8 (Harlon e Lane, 1998a). A dosagem foi realizada pelo método de Bradford
(Bradford, 1976). A presença de anticorpos foi verificada por ELISA.
IgG de soro pré-imune de coelho foi purificado em coluna de afinidade de
proteína A (Protein A Antibody Purification - Sigma) segundo as especificações do
fabricante e foi denominado IgG controle.
3.1.3.2 – Soros e proteínas padrões
Os soros anti-SEA, anti-SEB, anti-SEC, anti-SED e anti-TSST-1 e as proteínas
padrões (SEA, SEB, SEC, SED e TSST-1) utilizados nos testes de imunodifusão,
Western blot, ELISA foram desenvolvidos pelo Dr. Luis Simeão, Fundação Ezequiel
Dias – Belo Horizonte/Minas Gerais e gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Olney Vieira
da Motta, LSA, CCTA, UENF.
3.1.3.3 – Soros de pacientes
Os soros de pacientes pediátricos NN1, NN2 e NN3 internados com sintomas
de choque tóxico no Hospital Ferreira Machado foram gentilmente cedidos pela Dra.
Regina Célia de Souza Campos Fernandes, Faculdade de Medicina de Campos/RJ.
19
Os soros foram utilizados após verificação da presença de anticorpos anti-SEC por
ELISA ou por imunodifusão em ágar.
3.1.4 – Isolados de S. aureus
Amostras de Staphylococcus sp da bacterioteca do professor Dr. Olney Vieira
da Motta, LSA, CCTA, UENF foram obtidas de leite coletado de rebanhos bubalinos
e bovinos, principalmente das regiões Norte e Noroeste do Estado do Rio de Janeiro
(Vieira-da-Motta, 2001). As amostras de leite foram semeadas em placas contendo:
ágar sangue (Base ágar sangue, OXOID); ágar MacConkey (Ágar MacCONKEY,
Merck, Alemanha); ágar Sabouraud (Ágar Sabouraud Dextrose, OXOID), e ágar
Vogel Johnson (Ágar Vogel-Johnson, OXOID). O ágar sangue é utilizado para
crescimento de qualquer microrganismo e observação do padrão de hemólise; o
cultivo em ágar MacConkey seleciona as enterobactérias presentes no leite; ágar
Sabouraud é especifico para fungos e leveduras e o Ágar Vogel Johnson é seletivo
para Staphylococcus sp. As placas com os diferentes meios de cultura foram
incubadas a 37ºC por vinte e quatro horas. Após crescimento bacteriano foi feita a
coloração de Gram. As colônias cujas bactérias foram confirmadas como cocos
Gram-positivos, associados em forma de cachos, foram submetidas aos testes
produção de coagulase, de catalase, de Voges Proskauer e fermentação do manitol.
Trinta e três amostras, sendo uma bovina e trinta e duas bubalinas, apresentaram
colônias hemolíticas coagulase positivas, catalase positivas, produtoras de acetoína
e fermentadoras do manitol e, portanto, foram consideradas Staphylococcus aureus.
Estas cepas foram denominadas LSA88, B35, B315, B78, B47, B34, B352, B77,
B243, B260, B361, B327, B194, B112, B196, B326, B10, B193-2, B295, B102, B44,
B48, B6, B5, B117, B188, B118 B221, B193-1, B195, B316, B184 e B85. O
sobrenadante destas cepas foi denominado amostra de conveniência. A cepa FRI-
S6, também cedida pelo professor Olney, foi positiva para SEB pelo kit TECRA e por
isso foi usada como controle positivo.
3.2 – Padronização das técnicas de detecção de enterotoxinas
3.2.1 – Detecção de enterotoxinas por ELISA
Foram utilizados 50 µL de 2 µg/mL de soluções controles das proteínas SEC
recombinante ou das proteínas SEA, SEB, SEC ou SED padrões, diluídas em 50
20
mM de tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6 ou 50 µL do sobrenadante das culturas
de cepas de S. aureus (previamente fervidos ou não), para sensibilizar a placas de
96 poços (Nunc, Copanhagen, Denmark), por dezesseis horas a 4ºC. Cada amostra
foi testada em duplicata. Os poços foram lavados três vezes com solução de
lavagem. Após bloqueio por uma hora, a 37ºC, com 100 µL de 1% de leite em pó
desnatado (Molico, Nestle) (diluído em PBS 1X, Tween-20 0,05%) e três lavagens
com solução de lavagem, foram adicionados à placa 100 µL dos soros (R18 ou anti-
SEA-D padrões) diluídos 1000 vezes em 0,2% de leite/PBS/Tween-20 0,05%, que
foram incubados por duas horas, a 37ºC. As placas foram lavadas por mais três
vezes e incubadas com 100 µL de proteína A conjugada a peroxidase diluída
1:15000 (em 0,2% de leite/PBS/Tween-20 0,05%) e após dez lavagens foram
incubadas com 100 µL da solução de revelação durante vinte e cinco minutos, na
ausência de luz. A reação foi terminada com a adição de 20 µL de ácido sulfúrico,
diluído 1:20. A leitura das reações colorimétricas foi realizada em leitor de placas
Multiskan, Labsystems Uniscience, a 492 nm (Coligan et al., 1991).
3.2.2 – Detecção de enterotoxinas por Western blot
O sobrenadante de cada uma das cepas estafilocócicas foi misturado ao
tampão de amostra e fervidos por 3 minutos. O perfil de proteínas foi analisado por
eletroforese a 100 V, utilizando-se o sistema de SDS-PAGE (Bio-Rad, EUA) em gel
de separação 15% (Laemmli, 1970). Foram aplicados 18 µL da amostra. As
proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 µm, por
duas horas e trinta minutos a 10 V, em tampão fosfato, no sistema transblot (Bio-
Rad, EUA), segundo a metodologia descrita por Towbin et al. (1979). A membrana
foi então bloqueada em 0,3% de leite desnatado (diluído em TST). A presença das
proteínas SEA-D nos sobrenadantes foi validada por imunodetecção com soros anti-
SEA-D padrões e R18, diluídos 1:8000. As membranas foram incubadas por duas
horas com os respectivos anticorpos e após 3 lavagens com 50 mL de TST 1X,
foram incubadas com proteína A conjugada a peroxidase (1:15000) por duas horas e
reveladas com solução de revelação.
3.2.3 – Detecção de enterotoxinas por imunodifusão em ágar
Para a detecção de SEC em sobrenadantes das cepas estafilocócicas foram
utilizadas placas de Petri (Falcon, EUA) com 5 cm de diâmetro e contendo 3,5 mL de
21
ágar “Noble” (Difco, EUA) a 1,2% em 1,5 M NaCl adicionada de timerosal na diluição
1:1000. Foram vasados sete poços (2 poços de 6,7 mm e 5 poços 8,3mm de
diâmetro) no ágar e aspirados, conforme molde FRI (figura 10). O soro R18 (50 µL),
diluído 1:4, foi colocado no orifício central de cada placa, juntamente com a SEC
recombinante (25 µL de uma solução 4 µg/mL), que foi colocada em dois orifícios
menores. Nos outros orifícios foram colocados 50 µL de sobrenadantes de cultura de
cepas estafilocócicas a serem testadas. Passadas quarenta e oito horas de
incubação a 37°C em câmara úmida foram considerados como positivos os testes
que apresentaram a formação de uma linha de precipitação entre a anti-SE e as
amostras testadas (Robbins et al., 1974). Após três lavagens dos géis com solução
salina, durante um período de quarenta e oito horas, os géis foram corados com azul
brilhante de Coomassie R-250, e em seguida descorados com solução descorante
de ácido acético e metanol (Robbins et al., 1974).
Figura 10: Molde de placa para realização do teste de imunodifusão. Modelo FRI.
3.3 – Comparação das técnicas de detecção com a técnica padrão ouro
.3.1 – Iniciadores
Os iniciadores utilizados nas reações de PCR foram sintetizados pela Genemed
ynthesis Inc., CA, EUA, a partir das seqüências codificadoras das enterotoxinas A-
e do gene 16S de S. aureus, disponíveis no GeneBank (tabela 3).
3
S
E
22
Tabela 3: s s PCRs.
Gene
Amplicon
(pares de
base)
GeneBank
Informações obre os iniciadores utilizados na
Iniciador Sequência Código
Iniciador 5` GGTTATCAATGTGCGGTGC sea
Iniciador 3` CGGCACTTTTTTCTCTTCCG
102 L22565
Iniciador 5` GTATGGTGGTGTAACTGAGC seb
Iniciador 3` CCAAATAGTGACGAGTTAGG
164 M11118,
ENSAB6
Iniciador 5` AGATGAAGTAGTGATGTGTATGG
Iniciador 3` CACACTTTTAGAATCAACCG
451 XO5815
CAATAATAGGAGAAAATAAAAG 278 M28521,
7.1
sec
Iniciador 5` Csed
Iniciador 3` TGTTGAACTTTATCTAAAGA P20723
Iniciador 5` CAGCTCGTGTCGTGAGATGT 16s
Iniciador 3` GTCCATTGTAGCACGTGTGTA
170 BX57185
3.3.2 – Extração de DNA
Trinta e duas cepas bubalinas, uma bovina e a cepa FRI-S6 de S. aureus e o
clone pEMA-30 de Escherichia coli foram cultivados em meio BHI (Merk, Alemanha),
por dezoito horas a 37ºC. As cepas bubalinas e bovina foram previamente testadas
para presença de enterotoxinas A-D e TSST-1, através de imunodifusão. O cultivo
foi centrifugado e o DNA cromossômico foi extraído pelo método TELT (Medina-
Acosta e Cross, 1993). As culturas foram distribuídas em tubos para microcentrífuga
de 1,5 mL e centrifugadas por três minutos a 13000 x g. O sedimento celular
formado foi suspenso em 250 µL de TELT, misturado vigorosamente por alguns
segundos e incubado por cinco minutos. Foram adicionados 500 µL da solução
fenol:cloforórmio:álcool isoamílico (50:49:1), que foram misturados por inversão
durante cinco minutos. Em seguida, os tubos foram centrifugados por dez minutos a
13000 x g e a fase aquosa foi transferida para tubos novos, nos quais foram
adicionados 2 volumes de etanol absoluto refrigerado (Merck). Após misturados
dez minutos a
13000 x g. Logo foi adicionado 1 mL de etanol 70%, para lavagem, seguida de
vigorosamente por cinco segundos, os tubos foram centrifugados por
23
centr
as reações, o DNA foi amplificado em 1 ciclo inicial de
cubação a 95ºC por cinco minutos, seguido de 30 ciclos de incubação a 94ºC por
e meio e 72ºC por um minuto, seguido por uma incubação final a 72ºC por
quinze . As t testadas para cada SE estão
descritas na tabela 4.
Tabela emperatur rentes iniciadores nas reações da
PCR.
s
ifugação a 13000 x g, dez minutos. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado foi seco na estufa a 37ºC, suspenso em 50 µL de TE-RNAse (20 µg/mL),
incubado por duas horas a 37ºC e utilizado para realização da PCR.
3.3.3 - Detecção da seqüência específica de enterotoxinas pela PCR
As seqüências específicas para SEA-D e para a região codificadora da porção
16S ribossomal (rDNA) de S. aureus foram amplificadas por PCR, a partir do DNA
extraído das diversas cepas estafilocócicas. Foram utilizados iniciadores específicos
para as SEs, conforme indicado na tabela 3. Os oligonucleotídeos para 16S rDNA
foram utilizados como controle interno para verificação de DNA bacteriano.
Para cada reação foram utilizados aproximadamente 100 ng de DNA; 50 pM de
cada iniciador; 0,2 µM de dNTPs (Invitrogen); 0,25 – 4 mM de MgCl2; Tampão
caseiro 1X e 0,1 U de Taq polimerase. As reações foram preparadas para um
volume final de 50 µL, sob as mesmas condições de temperatura, com exceção das
temperaturas de anelamento dos iniciadores, que variaram para as diferentes
seqüências. Em todas
in
um minuto, temperatura de anelamento específica para cada seqüência por um
minuto
minutos emperaturas de anelamento
4: T as testadas para os dife
Par de
Iniciadore
Temperaturas testadas (ºC)
sea 47; 50; 52; 54; 56; 58
seb
Curva 1
52; 54; 56; 58
,2; 59,4; 62,2; 64,4; 66,2
5
Curva 2
Curva 3
46; 47,2; 48,08; 50,9; 53,2; 55,7; 58,2; 60,4; 62,3; 63,8
43; 45,2; 46,8; 48,9; 51,2; 53,7; 56,1; 58,4; 60,3; 61,8
sec 47; 50; 55
sed 47; 50; 55
16s 50; 5
50; 55; 47;
56,1; 57
24
Foram utilizados dois termocicladores, de acordo com a necessidade de fazer a
uma curva de temperatura. Para amplificar a uma temperatura foi utilizado o
termiciclador PCR Sprint (Thermo, Electron Corporation, Needham Heights, MA) e
para curva de temperaturas foi utilizado o termociclador Mastercycler Gradient
(Eppendorf AC, Germany).
Os produtos amplificados foram misturadas com tampão de DNA 6X e
resolvidos em gel de agarose 1,2%, preparado em TAE 1X juntamente com 0,5
isualização foi possível por exposição do gel à
diação UV. As respectivas imagens foram registradas no fotodocumentador Image
plicons está indicado na
tabel
3.4 –
µg/mL de brometo de etídeo. Sua v
ra
Master – VDS (Pharmacia Biotech). O tamanho dos am
a 3.
Teste de aglutinação em látex
3.4.1 - Acoplamento de proteínas em látex de poliestireno
O látex, utilizado como indicador de aglutinação, foi acoplado em três
condições.
Condição 1: látex tratado conforme a literatura
Um volume de quinhentos microlitros de látex de poliestireno (latex beads
polystirene, 0,807 micron, aqueous suspension, solids content 10%, lote 11K05685 -
Sigma) foram suspensos em 8,5 mL de solução GBS. A seguir, 200 µg e 1 mg de
SEC recombinante de 2 lotes diferentes, 750 µg de IgG anti-SEC recombinante ou 1
mg de IgY anti-SEC (cedido pelo Prof. Dr. Olney), diluídas em 1 mL de 50 mM MES
(USB) foram misturados ao látex diluído e incubados, em banho-maria, a 37ºC por
duas horas (Lu et al., 2002). O material lavado com 1mL de PBS foi centrifugado por
cinco minutos, 3000 x g (3 vezes). Depois de suspenso em 1mL de 1% BSA Fração
V (Sigma), diluído em PBS, a mistura foi incubada por trinta minutos, 37ºC. O
material foi novamente lavado com PBS e centrifugado por cinco minutos, 3000 x g
(3 vezes). O látex, acoplado a proteína, foi suspenso em 1 mL de 1% BSA. A
conc foi
colet
entração final do látex foi de 5%. O material das primeiras três lavagens
ado e dosado, pelo método de Bradford, para verificação da quantidade de
proteína acoplada ao látex.
25
Condição 2: látex tratado conforme condições recomendadas pelo fabricante
O acoplamento de SEC recombinante e IgG anti-SEC recombinante ao látex
(latex beads polystirene, 0,807 micron, aqueous suspension, solids content 10%, lote
11K05685 - Sigma) foi realizado da seguinte forma: as proteínas de interesse (1 mg)
foram suspensas em 2 mL e 10 mL, respectivamente, de 50 mM de MES (USB),
misturadas com 10 e 100 µL, respectivamente, de látex e incubadas a 37ºC, por
duas horas, sob agitação de 150 rpm. Passado o período de incubação, o material
foi centrifugado por cinco minutos, 3000 x g e lavado com 1 mL de MES (3 vezes).
Então, foi suspenso em 1mL de 1% BSA (diluído em MES), e incubado por trinta
minutos, 37ºC sob agitação de 150 rpm. O material foi centrifugado por cinco
minu
te. O material das primeiras três lavagens foi coletado
e dosado, pelo método de Bradford, para verificação da quantidade de proteína
acop
tos, 3000 x g e novamente lavado com MES (3 vezes). O látex, acoplado a
proteína, foi suspenso em 1 mL de 1% BSA Fração V. A concentração final do látex
foi de 0,1 e 1%, respectivamen
lada ao látex.
Adicionalmente, em condições semelhantes à condição 2, o acoplamento de
IgG anti-SEC recombinante, foi refeito, porém em duas diferentes concentrações
finais de látex: 0,1% e 0,25%.
Condição 3: látex tratado conforme condições recomendadas pelo fabricante
O acoplamento de anticorpo anti-SEC ao látex (latex beads, deep blue dyed
0,80 micron, aqueous suspension, solids content 10%, lote 034K1174 – Sigma) foi
realizado da seguinte forma: 500 µg de IgG anti-SEC recombinante foi suspenso em
5 mL de 50 mM de MES (Sigma), misturados a 50 µL de látex e incubadas a 37ºC,
por duas horas, sob agitação de 150 rpm. Passado o período de incubação, o
material foi centrifugado por cinco minutos, 3000 x g e suspenso em 1mL de 1%
BSA (diluído em MES). Em seguida o material foi incubado por trinta minutos, 37ºC
sob agitação de 150 rpm. Após centrifugação por cinco minutos, 3000 x g, foi lavado
com 1 mL de 50 mM de MES (3 vezes). O látex, acoplado a proteína, foi suspenso
entração final do látex foi de 0,5%. O sobrenadante da
prime
em 1% BSA Fração V. A conc
ira centrifugação foi coletado e dosado, pelo método de Bradford, para
verificação da quantidade de proteína acoplada ao látex.
26
3.4.2 – Teste de aglutinação
As preparações de látex acoplado às diferentes proteínas foram testadas para
verificação do seu potencial de aglutinação em amostras controles. A visualização
da aglutinação foi feita em lâmina de vidro (Bioslide) sobre fundo escuro, nas
preparações com látex de poliestireno e em um local de fundo branco, nas
preparações com látex azul. Para o teste foram utilizados 50 µL do látex misturado a
or aproximadamente um minuto e o material foi
bservado por até trinta minutos (Kasempimolporn et al., 2000; Attar, et al., 2002; Lu
et al., 2002; Chandrakesan, 2003; 04).
Tabela 5: Misturas utiliz a verifica
iferentes cond
50 µL de amostras controle (tabela 5) ou 50 µL de amostras de conveniência (tabela
6). A mistura foi feita manualmente p
o
Lee, et al., 20
adas par ção da aglutinação em látex com amostras
controles, sob d ições.
Condição 1
Material de captura es) Amostras controles (reagent
IgG anti-SEC,
látex 5%
o/bicarbonato;
/mL) lote 1;
nhecida);
SEC recombinante 2 µg/mL em tampão
carbonat
SEC recombinante (0,6 µg/mL) lote 1;
SEC recombinante (6 mg
SEC recombinante (concentração desco
Eluídos 1 e 2 da coluna de afinidade;
PBS 1X
IgY anti-SEC,
látex 5% combinante 2 µg/mL em tampão
carbonato/bicarbonato;
SEC recombinante (0,6 µg/mL) lote 1;
SEC recombinante (6 mg/mL) lote 1;
Eluído 1 da coluna de afinidade;
PBS 1X
SEC re
27
Continuação da tabela 5 Condição 1
Material de captura Amostras controles (reagentes)
SEC recombinante (lote 1),
látex 5%
Soro R18;
IgG anti-SEC recombinante;
Soro paciente NN1;
Soro anti-SEC padrão;
PBS 1X
SEC recombinante lote 2,
látex 5%
Soro R18;
IgG anti-SEC recombinante;
Soro paciente NN1
Soro paciente NN2;
Soro anti-SEC padrão;
PBS 1X
Condição 2
IgG Anti-SEC,
látex 1% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão
carbonato/bicarbonato;
SEC recombinante (concentração desconhecida);
SEC recombinante (6 mg/mL) lote 1;
Eluídos 1 e 2 da coluna de afinidade;
SEC recombinante não acoplada ao látex
(lavados);
Sobrenadante da cultura da cepa B48;
PBS 1X;
Meio BHI
IgG Anti-SEC,
látex 0,25%
Sobrenadante da cultura da cepa B48 sem ferver,
Sobrenadante da cultura da cepa B48 fervidas 3
minutos,
Meio BHI
28
Continuação da tabela 5 Condição 2
Material de captura Amostras controles (reagentes)
IgG Anti-SEC ,
látex 0,1% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão
carbonato/bicarbonato;
SEC recombinante (0,6 mg/mL) lote 1,
SEC recombinante (0,06 mg/mL) lote 1;
SEC recombinante (0,9 mg/mL) lote 2;
SEC recombinante (10 µg /mL) lote 1;
Sobrenadante da cultura da cepa B48;
SEC padrão;
PBS 1X;
Meio BHI
SEC recombinante (lote
2),
látex 0,1%
Soro R18;
Soro paciente NN1;
Soro paciente NN2;
PBS 1X
Condição 3
IgG Anti-SEC,
látex 0,5% SEC nativa (1,0; 0,5; 0,25; 0,125 e 0,06 µg/mL);
Sobrenadante da cultura da construção pEMA-30;
Sobrenadante da cultura da cepa B48 ;
SEC recombinante lote 3 (1,2 µg/mL);
PBS 1X,
Meio BHI
Tabela 6: Misturas utilizadas para verificação da aglutinação em látex com amostras
de conveniência, sob a condição 3.
Material de captura Amostras de conveniência
IgG Anti-SEC,
látex 0,5%
Sobrenadante da cultura das cepas LSA 88, B188, B48,
B195, B10, B77
29
3.5 - Dosagem de proteínas
A dosagem de proteínas foi feita segundo a metodologia descrita por
Redinbaugh e Turley (1986), utilizando BSA como padrão.
A dosagem de anticorpos foi feita segundo a metodologia descrita por Bradford
(1976), utilizando BSA como padrão.
3.6 – Cálculos utilizados para determinar sensibilidade e especificidade dos métodos
de detecção descritos
A PCR foi considerada como teste padrão ouro nesta tese. Dessa forma, os
resultados apresentados nos ensaios de ELISA, Western blot, Imunodifusão e
Aglutinação em látex foram comparados aos resultados da PCR.
Considerando a Imunodifusão como método padrão adotado pelo FDA e
AOAC, os resultados dos testes de ELISA, Western blot e Aglutinação em látex
também foram comparados a este teste.
A seguir, a fórmula utilizada para os cálculos (figura 11).
Figura 11: Fórmulas descritas por Jordan et al, 2006, para calcular a sensibilidade e
a especificidade dos testes de ELISA, Imunodifusão, Western blot e Aglutinação em
látex.
30
4 – Resultados
4.1 – Purificação de anti-SEC recombinante
Após dosagem do excesso de ligante coletado durante o acoplamento de
proteína à coluna Sepharose 4B verificamos que toda proteína, disponibilizada para
tal, foi acoplada. Foi possível purificar cerca de 10 mg de anticorpo anti-SEC na
coluna anti-SEC montada e 5 mg de anticorpo IgG controle da coluna de proteína A.
4.2 – Detecção de enterotoxinas
4.2.1 – Detecção de enterotoxinas por ELISA
Dos sobrenadantes das 33 cepas estafilocócicas (fervidas ou não) testadas,
9% reagiram com o soro anti-SEA, 81% com o soro anti-SEB, 27% com o soro anti-
SEC, 64% com o soro anti-SED e 24% com o soro R18.
Os códigos das referidas cepas estafilocócicas estão contidas nos quadros 1-
9, em anexo, que demonstram o tipo de enterotoxina secretada pelas cepas
testadas. Foram consideradas positivas as amostras que indicaram DO492nm maior ou
igual a 2 vezes o valor do controle negativo, descontando-se o valor do controle
negativo.
As toxinas padrões SEA, SEB, SEC e SED utilizadas como controles positivos
não apresentaram sinais positivos no ensaio de ELISA (valor para DO492nm igual ao
controle negativo). A SEC recombinante teve um excelente sinal (valor para DO492nm
acima de 3.6).
4.2.2 – Imunodetecção de enterotoxinas por Western blot
A título de comparação o sobrenadante das culturas das cepas estafilocócicas
também foi testado em Western blot. Destas, 3% reagiram com o soro anti-SEA, 9%
com o soro anti-SEB e 6% com soro anti-SEC, 12% com o soro anti-SED e 21% com
o soro R18. Na figura 12 e quadros 1-9, em anexo, estão indicadas as amostras
positivas para os soros específicos utilizados.
31
Figura 12: Membranas de nitrocelulose incubadas e reveladas com os anticorpos: A) anti-SEA padrão; B) anti-SEB padrão; C) anti-SEC padrão; Kaleidoskope (Bio-Rad); sobrenadantes da
D) anti-SED padrão e E) R18. Raias: M) marcador s cepas: 1) B316; 2) B85; 3) B195; 4) B77; 5) B47; 6)
) 27,1 kDa; SEB) 28,3 kDa; SEC) 27,6 kDa, SED) 26,3 kDa, SEC recombinante: 28,58 kDa.
B327; 7) B243; 8) B194; 9) B44; 10) B221; 11) B6; 12) LSA 88; 13) B118; 14) B361; 15) B117; 16) B196; 17) B193-1; 18) B260; 19) B193-2; 20) B184; 21) B10; 22) B352; 23) B35; 24) B188; 25) B78; 26) B326; 27) B295; 28) B48; 29) B102; 30) B112; 31) clone pEMA-30; 32) B315; 33) B5; 34) B34. Peso Molecular das proteínas: SEA
32
4.2.3 – Imunodifusão em ágar
ilizadas no ensaio de
uns dos resultados da imunodifusão estão exemplificados na figura 13. Em
ção
ouro de comparação foi realizada a PCR para as cepas em estudo. Foram utilizados
iniciadores desenhados a partir das seqüências de enterotoxinas obtidas em bancos
de dados para sea-sed e da subunidade ribossomal 16S, conforme indicado na
tabela 3.
Das cepas estudadas, 9% foram positivas para a seqüência sea, 39% para a
seqüência sec e 15% para a seqüência sed. Os quadros 1-4, em anexo, especificam
o resultado de todas as amplificações realizadas para as 33 cepas de S. aureus.
O DNA das cepas bubalinas B315, B6 e B118 amplificou na temperatura de
anelamento 47ºC, 1,5 minutos e 2 mM de magnésio, com os iniciadores específicos
para a seqüência sea, conforme pode ser visto na figura 14. O DNA das cepas B77
e B361 amplificou de forma inespecífica para este par de iniciadores.
A seqüência seb foi testada sob várias condições para sua amplificação.
Desde gradiente de temperaturas, gradiente de magnésio, tentativas de
amplificações utilizando temperaturas individuais. Pelo fato de não termos um
controle positivo de referência, foi necessário fazê-la com DNA das cepas positivas
Os sobrenadantes de todas as cepas estafilocócicas ut
ELISA foram utilizados para verificação de sua reação com soro R18, em ágar Noble
(figura 13 e quadros 4 e 9, em anexo). Antes de serem trabalhadas nos ensaios
desta tese, todos os sobrenadantes foram testados para as proteínas SEA-D
(quadros 1-3 e 5-8, em anexo) pela aluna de Iniciação Científica do curso de
Medicina Veterinária do CCTA, UENF, Giseli dos Santos Ferreira.
Alg
cada placa há formação de uma linha de precipitação entre o poço correspondente
ao anticorpo e os poços correspondentes à toxina padrão, assim como para as
amostras correspondentes aos sobrenadantes das cepas positivas. A visualiza
foi feita por mais de um observador.
No ensaio de imunodifusão, 30% das cepas reagiram com o soro anti-SEA,
51% reagiram com o soro anti-SEB, 45% com o soro anti-SEC, 61% com o soro anti-
SED e 33% com o soro R18.
4.3 – Detecção das seqüências codificantes das enterotoxinas
Com o propósito de comparar com os outros métodos aqui descritos (ELISA,
Imunodifusão, Western blot e Aglutinação em látex) e utilizá-la como método padrão
33
Figura 13: Imunodifusão em ágar. Painel superior - Ágar Noble 1,2%. AC) soro R18, T) Toxina SEC
el inferior - Esquema representativo das observações. A identificação às amostras no ágar. A intensidade da banda no esquema não
equivale a intensidade da banda observada no gel original.
recombinante, 1) soro de paciente NN3; sobrenadante das cepas: 2) B48; 3) B193-1; 4) B85; 5) B352; 6) B5; 7) B47; 8) B243; 9) B188; 10) B35; 11) B48; 12) clone pEMA-30; 13) B194; 14) B193-2; 15) B118; 16) B221; 17) BHI; 18) B117; 19) B102; 20) LSA 88; 21) B195; 22) B361; 23) B260; 24) B196; 25) clone pEMA-30; 26) B44; 27) B327; 28) B10; 29) B184; 30) B34; 31) B112; 32) B295; 33) B6; 34) B315; 35) B78 e 36) B326. Paindo esquema é correspondente
34
para SEB, pelo teste de imunodifusão. Neste caso, foi utilizado DNA das cepas
B316, B195 e B1931, escolhidas de forma aleatória. Para as três amostras
testadas, em todas as condições, observam-se amplificações de bandas
inespecíficas (figura 15).
Posteriormente, foi utilizado DNA de uma cepa comprovadamente positiva
entração de
gCl2
i amplificada a 55ºC e 2
reu a 47ºC com 2 mM de cloreto de magnésio.
Todas as amostras testadas para amplificar a seqüência 16S do ribossomo de
. aureus foram positivas (figuras 18 e 19). Isso demonstra que os resultados
para SEB, através do kit de diagnóstico TECRA: a cepa FRIS6. Embora o DNA
dessa amostra tenha sido positivo para o gene 16S ribossômico (figura 19); em
nenhuma das condições testadas de temperatura de anelamento e conc
M foi obtido o amplicon de aproximadamente 280 pb.
A seqüência sec presente nas cepas B48, B118, B6, B188, B77, B316, clone
pEMA-30, LSA88, B195, B184, B193-1, B47, B44 e B5 fo
mM de cloreto de magnésio, conforme pode ser verificado na figura 16.
As cepas identificadas como B6, B85, B102, B327 e LSA 88 tiveram seu DNA
amplificado durante a PCR utilizando iniciadores para a seqüência sed (figura 17). A
reação ocor
S
negativos com os iniciadores específicos para SEs devem ser tidos como reais
negativos.
Figura 14: Amplificação da seqüência sea. Gel de agarose 1,2%, corado com
brometo de cianogênio. M) marcador 1Kb (Promega); DNA das cepas: 1) B48; 2)
B315; 3) B361; 4) B6; 5) B352; 6) B77; 7) B188; 8) B47; 9) B221; 10) B44; 11) B5;
12) B117; 13) B193-2; 14) B10; 15) B78; 16) B243; 17) B194; 18) B316; 19) H2O; 20)
B295; 21) B260; 22) B102; 23) B184; 24) B327; 25) B34; 26) B112; 27) B326; 28)
B193-1; 29) LSA 88; 30) B35; 31) B85; 32) B118; 33) B195; 34) B196; 35) paciente
NN3 e 36) H2O.
35
Figura 15: Amplificação da seqüência seb. Gel de agarose 1,2%, corado com
brometo de cianogênio. Temperatura de anelamento: 47ºC, concentrações de 1, 2, 3
e 4 mM de cloreto de magnésio, respectivamente para cada amostra. M) marcador
1Kb (Promega); DNA das cepas: 1-4) B316; 5-8) B195; 9-12) B193-1 e 13-15) H2O.
Figura 16: Amplificação da seqüência sec. Gel de agarose 1,2%, corado com
brometo de cianogênio. M) marcador 1Kb (Promega); DNA das cepas: 1) B361; 2)
B315; 3) B48; 4) B196; 5) B118; 6) B85; 7) B35; 8) B326; 9) B352; 10) B6; 11) B243;
12) B78; 13) B327; 14) B102; 15) B260; 16) B295; 17) B188; 18) B77; 19) H2O; 20)
B194; 21) B316; 22) clone pEMA-30; 23) LSA 88; 24) B195; 25) B184; 26) B193-1;
27) B47; 28) B221; 29) B44; 30) B5; 31) B117; 32) 193-2; 33) B10; 34) B112; 35)
B34; 36) paciente; 37) H2O.
36
Figura 17: Amplificação da seqüência sed. Gel de agarose 1,2%, corado com
brometo de cianogênio. Temperatura de anelamento: 47ºC, concentração de 2 mM
de cloreto de magnésio.M) marcador 1Kb (Promega); DNA das cepas: 1) B6; 2)
B315; 3) B85; 4) B195; 5) B193-1; 6) B326; 7) B102; 8) B5; 9) B188; 10) B48; 11)
B193-2; 12) B10; 13) B44; 14) B196; 15) B295; 16) B47; 17) H2O; 18) B327; 19) B48;
20) B34; 21) B117; 22) LSA 88; 23) B221; 24) B112; 25) B316; 26) B118; 27) B194;
28) B243; 29) B78; 30) B35; 31) B184; 32) B352; 33) B361; 34) B77 e 35) B260.
Figura 18 e 19: Amplificação da seqüência 16S. Gel de agarose 1,2%, corado com
brometo de cianogênio.Temperatura de anelamento: 55ºC, concentração de 2 mM
de cloreto d dor a) ) B47; 2)
B194; 3) B102; 4) B44; 5) B48; 6) B6; 7) B5; 8) B117; 9) B188; 10) B221; 11) B193-
1; 12) B195; 13) B184; 14) B85; 15) LSA 2O;
19) B35; 20) B78; 21) )
B112; 28 10; 31) B 2) B295; 33) B118; 34) B117; 35)
B195; 36 9) B22 RIS-6.
e magnésio. M) marca 1Kb (Promeg ; DNA das cepas: 1
88; 16) clone pEMA-30; 17) B48; 18) H
B34; 22) B352; 23) B243; 24) B260; 25) B361; 26) B327; 27
) B196; 29) B326; 30) B 193-2; 3
) H2O; 37) B44; 38)B 47; 3 1 e 40) F
37
4.4 – Teste de aglutinação em
4.4.1 - Ac átex d stireno
O s ao i feito em condições: uma
conforme lporn et al, 2000; Lu et al, 2002; Attar et al, 2002) e
outras duas recomendadas
O material de todas as lavagens colet
acoplamento do reagente (tabela 7). Em todos os casos houve acoplamento de
Tabela 7: Quantidade de proteína acoplada
látex
oplamento de proteína em l e polie
acoplamento de proteína látex fo três
a literatura (Kasempimo
pelo fabricante.
adas foi dosado para verificar se houve
proteínas, em maior ou menor quantidade.
ao látex, sob diferentes condições.
Reagente de captura Quantidade
acoplada % de acoplamento
Condição 1 (literatura)
IgG Anti-SEC, látex µ 5% 675 g 90
IgY anti-SEC, látex 5% 960 µg 96
SEC rec lote 1, látex 5% 500 µg 50
SEC rec lote 2, látex 5% 144 µg 72
Condição 2 (fabricante)
IgG Anti-SEC, látex 1% 660 µg 66
IgG Anti-SEC, látex 0,25% 1 mg 100
IgG Anti-SEC, látex 0,1% 280 µg 28
SEC lote 2, látex 0,1% 300 µg 30
Condição 3 (azul, fabricante)
IgG Anti-SEC, látex 0,5% 320 µg 64
4.4.2 – Aglutinação em látex
Para realizar este ensaio foram colocados em uma lâmina de vidro 50 µL do
látex acoplado a IgG anti-SEC recombinante, IgY anti-SEC ou à SEC recombinante
e 50 µL de algumas amostras controles (contendo proteína SEC recombinante de
diferentes lotes e de concentrações conhecidas), incluindo dois controles negativos,
38
que no caso foram PBS 1X e BHI. O tempo de observação de aglutinação foi de até
trinta minutos, porém o resultado, ivo, foi visto entre cinco e treze
minutos.
observação de aglutinação da mistura látex/controle negativo, no mesmo intervalo
possível ver , onde o látex foi tratado conforme
condições apresentad látex não aglutinou na
presença de toxina. N ncentrações, foi tratado
com MES. Nesta cond ão do látex
para algumas amostras. Em outras concentrações, não foi observada reação. A
única condição em qu resultados esperado foi a
3, utilizando MES. Nessa condição, amostras de sobrenadantes das cepas foram
testadas e tiveram resultados coerentes com aqueles observados para os outros
testes aqui apresentados (tabela 8).
Tabela 8: Resultado do teste piloto de aglutinação em látex utilizando amostras
controles e amostras de conveniência das cepas de S. aureus (quadros 4 e 9, em
anexo). O sinal (+) indica que as amostras aglutinaram e o sinal (–) indica que as
amostras não aglutinaram.
Condição 1
quando posit
A observação de aglutinação da mistura látex/amostra associado com a não
de tempo, foi o critério de positividade analisado.
ificar que na condição 1Foi
as na literatura, utilizando glicina, que o
a condição 2, o látex, utilizado em 3 co
ição e utilizando 1% de látex, verificamos aglutinaç
e todos os controles apresentaram s
Reagente de
captura
Amostras Resultado
IgG Anti-SEC,
látex 5% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão
carbonato/bicarbonato;
SEC recombinante (0,6 µg/mL) lote 1 ;
SEC recombinante (6 mg/mL) lote 1;
SEC recombinante (concentração desconhecida)
Eluído 1 da coluna de afinidade;
Eluído 2 da coluna de afinidade;
PBS 1X
+ - - - - - -
39
Continuação da tabela 8 Condição 1
Reagente de
captura
Amostras Resultado
IgY anti-SEC,
látex 5% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão
carbonato/bicarbonato;
SEC recombinante (0,6 µg/mL) lote 1;
SEC recombinante (6 mg/mL) lote 1;
Eluído 1 da coluna de afinidade;
PBS 1X
- - - - -
SEC recombinante
(lote 1),
látex 5%
Soro R18;
IgG anti-SEC recombinante;
Soro paciente NN1;
Soro anti-SEC padrão;
PBS 1X
- - - - -
SEC recombinante
(lote 2),
látex 5%
Soro R18;
IgG Anti-SEC recombinante;
Soro paciente NN1
Soro paciente NN2;
Soro anti-SEC padrão;
PBS 1X
- - - - - -
Condição 2
IgG Anti-SEC,
látex 1% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão
carbonato/bicarbonato;
SEC recombinante (concentração
desconhecida);
SEC recombinante (6 mg/mL) lote 1;
Eluído 1 da coluna de afinidade;
Eluído 2 da coluna de afinidade;
SEC recombinante não acoplada ao látex;
Sobrenadante da cultura B48;
PBS 1X;
Meio BHI
+
+ - + - + + - -
40
Continuação da tabela 8
Condição 2
Reagente de
captura
Amostras Resultado
IgG Anti-SEC,
látex 0,25%
Sobrenadante da cultura da cepa B48 sem
ferver;
Sobrenadante da cultura da cepa B48 fervidas
3 minutos;
Meio BHI
- - -
IgG Anti-SEC,
látex 0,1% SEC recombinante 2 µg/mL em tampão
carbonato/bicarbonato;
SEC recombinante (0,6 mg/mL) lote 1;
SEC recombinante (0,06 mg/mL) lote 1;
SEC recombinante (0,9 mg/mL) lote 2;
SEC recombinante (10 µg /mL) lote 1;
Sobrenadante da cultura da cepa B48;
SEC padrão;
PBS 1X;
Meio BHI
- - - - - - - - -
SEC recombinante
lote 2,
látex 0,1%
Soro R18;
Soro paciente NN1;
soro paciente NN2;
PBS 1X
- - - -
41
Continuação da tabela 8 Condição 3
Reagente de
captura
Amostras Resultado
IgG Anti-SEC,
látex 0,5% SEC nativa 1,0 µg/mL;
SEC nativa 0,5 µg/mL;
SEC nativa 0,25 µg/mL;
SEC nativa 0,125 µg/mL;
SEC nativa 0,06 µg/mL;
Sobrenadante da cultura da cepa B48;
SEC recombinante lote 3 (1,2 µg/mL);
Sobrenadante da cultura do clone pEMA-30; PBS 1X;
Meio BHI
+ + + + + + + + - -
IgG Anti-SEC,
látex 0,5%
Sobrenadante da cultura da cepa B188;
Sobrenadante da cultura da cepa B48;
Sobrenadante da cultura da cepa LSA 88;
Sobrenadante da cultura da cepa B195;
Sobrenadante da cultura da cepa B10;
Sobrenadante da cultura da cepa B77
+ + + + - -
4.5 – Cálculos de sensibilidade e especificidade
Pelo fato da PCR ser considerada, neste trabalho, a técnica padrão ouro, os
resultados dos ensaios de ELISA, do Western blot, da Imunodifusão e da
Aglutinação em Látex foram comparados àqueles obtidos para o padrão ouro.
Os cálculos de sensibilidade e especificidade foram realizados pela aplicação
da quantidade de amostras real-positivas ou negativas e falso-positivas ou negativas
nas fórmulas descritas por Jordan et al., 2006.
A identificação das amostras falso-positivas e falso-negativas, considerando a
PCR como padrão está disponível nos quadros 1-4, em anexo. As amostras real-
positivas ou negativas são aquelas que apresentaram, para cada teste, o resultado
positivo ou negativo, respectivamente, idêntico à técnica padrão ouro. Amostras
falso-positivas ou negativas são aquelas que discordam, neste caso, da PCR. Por
exemplo, para a proteína SEC, a cepa B35 é considerada real-negativa, uma vez
42
que foi negativa para os testes de ELISA, Western blot e Imunodifusão e foi negativa
para a técnica da PCR. A cepa B78 é considerada falso-positiva em ELISA, já que
foi positiva em ELISA e negativa para a técnica padrão ouro (PCR). Real-positiva foi
a cepa B316 para o teste de ELISA, uma vez que positiva em ELISA, resultado que
concorda com a técnica padrão ouro, entretanto, foi falso-negativa em Western blot,
já que foi negativa para este teste, resultado que discorda da PCR (técnica padrão
ouro).
Os resultados dos cálculos de sensibilidade e especificidade para cada tipo
de ensaio de detecção de SEs e para cada toxina estão apresentados na tabela 9.
Como não foi possível amplificar seb por causa da inespecificidade dos iniciadores,
estes cálculos não foram realizados para SEB. Foi possível verificar que o teste
piloto de aglutinação em látex para detecção de enterotoxina C foi o que apresentou,
concomitantemente, melhores resultados de sensibilidade e especificidade. O teste
piloto apresentou também especificidade absoluta e maior sensibilidade,
comparando com os outros métodos (tabela 9).
A Imunodifusão é o método padrão adotado pelo FDA e AOAC para
identificação de enterotoxinas. Com a finalidade de verificar a sensibilidade e
especificidade dos métodos e se os altos percentuais de sensibilidade e
especificidade obtidos pelo teste de aglutinação em látex e os resultados obtidos
para os outros testes se reproduziam, os cálculos descritos por Jordan et al., 2006,
também foram realizados, considerando a Imunodifusão como técnica padrão ouro.
A identificação das amostras falso-positivas e falso-negativas está disponível
nos quadros 5-9, em anexo. As amostras real-positivas ou negativas são aquelas
que apresentaram, para cada teste, o resultado idêntico à técnica padrão ouro. Por
exemplo, para a SEC, a cepa B35 é considerada real-negativa, uma vez que foi
negativa para os testes de ELISA, Western blot e foi negativa para a imunodifusão.
A cepa B327 é considerada falso-positiva em ELISA, já que foi positiva em ELISA e
negativa para a técnica padrão ouro (imunodifusão). Real-positiva foi a cepa B47
para o teste de ELISA, uma vez que foi positiva em ELISA, resultado que concorda
com a técnica padrão ouro, entretanto, foi falso-negativa em Western blot, já que foi
negativa para este teste, resultado que discorda da imunodifusão (técnica padrão
ouro).
Os resultados dos cálculos de sensibilidade e especificidade para cada tipo
de ensaio de detecção de SEs e para cada toxina, considerando a Imunodifusão
43
como técnica padrão ouro, estão apresentados na tabela 10. Foi possível verificar
que o teste piloto de aglutinação em látex foi o que apresentou, concomitantemente,
melhores resultados de sensibilidade e especificidade. O teste piloto apresentou
também sensibilidade absoluta (tabela 10), que é mais significante que a
especificidade, uma vez que, mais importante do que saber qual tipo de enteroxotina
está presente no alimento, é saber que há enterotoxina e isso o método
desenvolvido realiza com segurança.
Tabela 9: Relação da quantidade de amostras real-positivas e negativas
(observadas pelos resultados da PCR) e das amostras falso-negativas e positivas
(observadas pelos resultados de ELISA, Imunodifusão, Western blot e Aglutinação
em látex). Sensibilidade e especificidade foram calculadas pelas fórmulas
RP/(RP+FN) e RN/(RN+FP), respectivamente.
REAGENTE DE CAPTURA
REAL POSITIVO
(RP)
FALSO NEGATIVO
(FN)
FALSO POSITIVO
(FP)
REAL NEGATIVO
(RN)
SENSIBILIDADE %
ESPECIFICIDADE %
ELISA anti-SEA padrão
3 3 3 30 50 91
anti-SEC padrão
13 10 6 20 50 80
anti-SED padrão
5 1 17 28 83 62
anti-SEC Recombinante
13 10 5 20 56 80
WESTERN BLOT anti-SEA padrão
3 3 1 30 50 97
Anti-SEC padrão
13 11 0 20 54 100
Anti-SED padrão
5 4 3 28 55 90
anti-SEC Recombinante
13 9 2 20 59 90
IMUNODIFUSÃO anti-SEA padrão
3 0 7 30 100 81
anti-SEC padrão
13 3 5 20 81 80
anti-SED padrão
5 1 16 28 83 64
anti-SEC Recombinante
13 11 9 20 54 69
AGLUTINAÇÃO EM LATEX anti-SEC Recombinante*
5 1 0 1 83 100
*Foram consideradas 6 amostras.
44
Tabela 10: Relação da quantidade de amostras real-positivas e negativas
(observadas pelos resultados da Imunodifusão) e das amostras falso-negativas e
positivas (observadas pelos resultados de ELISA, Western blot e Aglutinação em
látex). Sensibilidade e especificidade foram calculadas pelas fórmulas RP/(RP+FN) e
RN/(RN+FP), respectivamente.
REAGENTE DE CAPTURA
REAL POSITIVO
(RP)
FALSO NEGATIVO
(FN)
FALSO POSITIVO
(FP)
REAL NEGATIVO
(RN)
SENSIBILIDADE %
ESPECIFICIDADE %
ELISA anti-SEA padrão
10 10 3 23 50 88
anti-SEB padrão
17 4 14 16 81 53
anti-SEC padrão
15 10 4 18 60 81
anti-SED padrão
20 8 9 13 71 59
anti-SEC Recombinante
11 8 5 23 58
82
Western blot anti-SEA padrão
10 10 1 23 50 96
anti-SEB padrão
17 16 2 16 51 89
anti-SEC padrão
15 13 0 18 54 100
anti-SED padrão
20 17 0 13 54 100
anti-SEC Recombinante
11 11 6 23 50 79
AGLUTINAÇÃO EM LATEX anti-SEC Recombinante*
2 0 2 4 100 67
*Foram consideradas 6 amostras.
45
5 – Discussão
Tendo como referência a técnica da PCR, a sensibilidade e a especificidade do
teste piloto de aglutinação em látex, descrito no presente trabalho, foi de 83 e 100%,
respectivamente. Esses resultados são melhores do que aqueles obtidos para outros
testes, incluindo o de Imunodifusão, um dos métodos padrões de detecção (Casman et
al, 1969; Su e Wong, 1997). Os resultados de sensibilidade e especificidade,
respectivamente, dos testes de detecção para SEC com soro anti-SEC recombinante
(soro R18) através de Imunodifusão foram de 54 e 69%, através de Western blot, 59 e
88% e, através de ELISA foram de 56 e 80%. Além do mais, o tempo de detecção para
o teste em questão foi de aproximadamente oito minutos, tempo extremamente
reduzido em comparação com os outros métodos.
A técnica da PCR foi considerada como método padrão ouro porque, além de
ser um método sensível, podendo detectar até 1 pg de DNA numa amostra (Cremonesi
et al., 2005), é altamente específico (Schmitz et al., 1998), pelo fato de se utilizar
iniciadores exclusivos para cada gene de interesse.
Alguns iniciadores podem se ligar a regiões polimórficas do DNA em questão.
Isso acarreta na amplificação de regiões não específicas para o qual o iniciador foi
desenhado, dessa forma, resultando em amplicons de tamanhos inesperados (Bania et
al., 2005). Esse caso ocorreu para os iniciadores utilizados para amplificar a seqüência
seb. Por este fato, foi utilizada a cepa FRIS6, comprovadamente positiva para SEB
através do kit TECRA, para realizar os ensaios. Entretanto, a PCR não foi positiva em
nenhuma das condições testadas. Dessa forma, nenhum dos ensaios imunoquímicos
realizados foi comparado com os resultados da PCR para a SEB.
Todas as preparações apresentaram DNA de S. aureus, conforme averiguação
com os iniciadores para a região ribossômica 16S de S. aureus. Estes resultados
confirmam que as amostras negativas nas reações da PCR, foram negativas pela
ausência da seqüência das respectivas SEs, salvo para seb, caso em que o par de
iniciadores foi inadequado.
Para amplificação das seqüências de SEs foram selecionadas amostras que
foram positivas por Imunodifusão. Essas amostras foram utilizadas como controles
positivos nos ensaios da PCR, nos quais a temperatura foi a variável. Cada amostra
positiva para a reação na temperatura determinada foi, então, analisada em diferentes
concentrações de magnésio. Após determinação da temperatura e concentração ideais
de amplificação, todas as amostras foram analisadas nessas condições.
46
Dentre os métodos utilizados na comparação com a PCR, de modo geral, o que
apresentou menor sensibilidade foi o Western blot. O cálculo de sensibilidade descrito
por Jordan et al. (2006), relaciona real-positivos com falso-negativos. Isso significa que
a quantidade de falso-negativos por Western blot foi maior em relação aos outros
testes. Embora se admita que os falso-negativos possam ser causados pela falta de
sensibilidade do método, também o podem ser pela ausência da expressão da toxina.
Como se sabe, o fato de a cepa apresentar a seqüência para a toxina não significa que
ela secrete, o que depende das condições em que o microrganismo se encontra
(Sasaki et al., 2005). Mesmo assim, para padronizar o ensaio, todas as cepas foram
cultivadas sob a mesma condição, assim como as alíquotas utilizadas nas
eletroforeses, as concentrações e o tempo de incubação com os anticorpos. Além
disso, o ensaio de imunodetecção é capaz de detectar 100 pg/mL (Rasooly e Rasooly,
1998), sensibilidade suficiente para evitar a ingestão de alimento contaminado pela
enterotoxina, se detectável a tempo. Entretanto, o ensaio dura entre quatro e seis
horas, além de necessitar do kit para preparação do gel, do kit de transferência e de
alguém especializado para sua realização.
Apesar de apresentar menor sensibilidade, o Western blot foi o teste que
apresentou maior especificidade, seguida da aglutinação em látex. Isso se deve ao fato
de que as proteínas são separadas por tamanho (ou ponto isoelétrico) e, após a
revelação, é possível conhecer seu peso molecular para, então, caracterizá-la. Além do
mais, através deste método, é possível desnaturar a proteína, ou desfazer agregados,
possibilitando a melhor interação com o anticorpo, e reduzindo as reações cruzadas
que podem ocorrer pelas conformações ou pelas seqüências das proteínas (Rasooly e
Rasoly, 1998). Essa preparação prévia das amostras não ocorre nos ensaios de ELISA
e Imunodifusão, o que pode acarretar em reações cruzadas não detectadas, resultando
em aumento do background.
Quanto a sensibilidade, a imunodifusão foi um dos testes que apresentou melhor
resultado. A sensibilidade ocorreu não em relação a quantidade de material captado,
mas pela facilidade de interação e captação de moléculas por anticorpos específicos e
não específicos. Neste ensaio, a interação da toxina com o anticorpo pode ser facilitada
pela conformação, que nas SEs é conservada (Hurley et al., 1995) e acaba por resultar
em mais falso-positivos que negativos, dessa forma, diminuindo sua especificidade.
Além disso, existe o fato de a linha de precipitação formada não ser padronizada. O
que é positivo no teste para alguns manipuladores, pode não ser para outros, o que se
47
traduz em menor confiabilidade do teste. Dessa forma, os resultados da imunodifusão
disponibilizados foram visualizados por mais de um observador. Um outro problema
deste teste é a longa duração do procedimento, variando entre dezoito e setenta e
duas horas (Su e Wong, 1997).
Um dos métodos mais utilizados para rápida e sensível detecção de SEs é o
teste de ELISA (Freed et al., 1982), principalmente na forma de kits comerciais. Estes
testes são capazes de detectar toxinas dos tipos A-E. Um deles, o TECRA, é
usualmente utilizado nas indústrias de alimentos com aprovação do AOAC e do FDA
(Boerema et al., 2006). Estes testes são relativamente rápidos e detectam tão pouco
como 0,1 e 1 ng/mL de SEs (Su e Wong, 1997), com duração de aproximadamente
duas horas e apesar de ser um dos métodos clássicos de detecção, podem produzir
resultados falso-positivos por causa das reações cruzadas entre as toxinas (Schmitz et
al.,1998; Bavari et al., 1999).
Apesar de o ideal ser a utilização de kits comerciais, só foi possível comparar
com o ELISA convencional. Obviamente, o kit oferece maior segurança, pois todos os
elementos que o compõem estão devidamente padronizados. Para minimizar as
diferenças entre os ensaios foram utilizados os mesmos soros padrões utilizados nos
ensaios de Western blot, sempre na diluição de 1:1000. Os sobrenadantes utilizados
foram obtidos das culturas cultivadas durante aproximadamente dezesseis horas em
meio BHI. Apesar das precauções, os títulos encontrados foram baixos para o
sobrenadante das cepas, embora, nos casos positivos, maiores que o controle
negativo, e negativo para as proteínas padrões. Não é sabido se as proteínas padrões
utilizadas nas imunizações dos coelhos, utilizados para produção de anticorpos foram
purificadas, nem por qual método, ou se elas foram desnaturadas. Desta forma, se
esses anticorpos produzidos reconheciam a proteína, devido a sua conformação, é
provável que a realização de um ELISA sanduíche implicasse num resultado diferente
e até mais seguro. Entretanto, se os anticorpos foram produzidos contra a proteína
desnaturada, os resultados do Western blot podem ser considerados mais confiáveis,
levando-se em consideração as reações cruzadas. Estes fatos podem justificar o
resultado negativo das proteínas padrões, que não apresentaram resultado esperado
em testes de ELISA. É provável que, no Western blot, essas proteínas apresentem
sinal positivo, utilizando-se seus respectivos soros.
Nesta tese não foram realizados testes de ELISA sanduíche pelo fato de
possuirmos apenas um anticorpo (soro) padrão para cada toxina. Para realizar tal
48
ensaio são necessários dois anticorpos e ainda, é recomendável que, pelo menos um
seja monoclonal (Harlow e Lane, 1998b).
Para sensibilização das placas de ELISA foram utilizadas amostras fervidas e
não fervidas. A intenção da utilização das amostras fervidas era mimetizar uma
desnaturação sem adição de componentes que pudessem vir a interferir no resultado,
possibilitando melhor acesso dos anticorpos presentes nos soros padrões às SEs
presentes nas amostras de conveniência. Porém, o efeito pode ter sido exatamente o
contrário, já que poucas amostras fervidas apresentaram reatividade com os
anticorpos. Anderson et al. (1986), observaram que SEA presente em alimentos
processados por calor não reagiu bem com anticorpos usados em ELISA.
As reações cruzadas ocorrem por causa da homologia tanto na seqüência de
aminoácidos (tabela 11) quanto na sua estrutura tridimensional (Balaban e Rasooly,
2000). A discrepância nos resultados encontrados, tanto com relação ao percentual de
amostras positivas para cada anticorpo quanto com relação a própria comparação
entre os testes realizados sugere que essas seriam as causas da ocorrência de
reações cruzadas. Como exemplo, a existência de 68% de homologia entre SEB e SEC
e, ainda, a semelhança na estrutura tridimensional entre as SEs, podem justificar a
reação cruzada com o anticorpo anti-SEB padrão ocorrida para a cepa 188 no ensaio
de imunodifusão já que esta cepa é apenas sec+.
Tabela 11: Homologia (em porcentagem) das seqüências de aminoácidos das SEs
(Jarraud et al., 2001, modificada).
SEB SEC SED
SEA 33 30 50
SEB 68 35
SEC 31
O fato de, por exemplo, a cepa B77 ser sec+ e não ter se apresentado positiva
para SEC para nenhum dos outros ensaios pode ser explicado pela informação de que
49
a presença da seqüência sec não é indicativa, necessariamente, de expressão protéica
desta seqüência.
Ainda, algumas cepas apresentaram-se negativas pela PCR para as seqüências
sea, sec ou sed, mas testaram positivas nos outros ensaios para alguma dessas SEs.
Neste caso podem ter ocorrido duas coisas: 1) a cepa pode possuir a seqüência seb,
que não foi detectada pela PCR nas condições e com os iniciadores testados ou; 2) a
cepa não possuir nenhuma das 4 seqüências testadas mas possuir outras. Ainda, o
fato de serem positivas para os anticorpos testados se explica pelas reações cruzadas
entre as proteínas expressas e os soros padrões utilizados. Como exemplo, cita-se as
cepas B194 e B295. Assim sendo, devido às reações cruzadas era de se esperar que
nenhuma cepa fosse negativa em todos os ensaios imunoquímicos testados.
Tendo como método de referência a imunodifusão, foi observada sensibilidade
de 100% para o teste de aglutinação em látex. Para que o teste resulte em
sensibilidade absoluta é necessário que não haja amostras falso-negativas, ou seja,
todas as amostras real-positivas também foram positivas no ensaio de aglutinação em
látex. Tal fato demonstra que, além do teste ser conveniente, o anticorpo imobilizado
em látex é um bom reagente de captura, reconhecendo bem as moléculas de SEC.
A proteína SEC recombinante foi purificada na presença de 8 M de uréia.
Nessas condições, espera-se que a proteína esteja na sua forma desnaturada.
Associada a resistência enzimática e térmica das SEs, está o fato de que nem toda a
estrutura de uma proteína desnaturada é perdida (Shortle e Acherman, 2001). O soro
R18 pode ter sido produzido a partir da SE não completamente desenovelada na sua
conformação, mas provavelmente com alguns sítios mais expostos, talvez os mais
antigênicos. Tais fatos justificam a imunogenicidade da proteína e a boa reatividade do
soro R18, produzido a partir da toxina recombinante, com as proteínas nativas
presentes nas amostras de conveniência testadas.
Os testes de ELISA e Western blot apresentaram 58 e 69 de sensibilidade,
comparando com o teste de imunodifusão. Este resultado demonstra que o mesmo
anticorpo, que reconhece bem as moléculas de SEC no teste de aglutinação, não as
reconhece tão bem no ELISA e no Western blot, sugerindo que a forma com que a
proteína é disponibilizada no teste influencia na sua detecção. Por exemplo, em ELISA
as proteínas e seus contaminantes estão imobilizados num recipiente, o que pode
dificultar o acesso à proteína de interesse e aumentar a quantidade de amostras falso-
negativas, diminuindo a sensibilidade. O próprio teste padrão, a imunodifusão neste
50
caso, pode fazer com que sejam apresentadas amostras falso-negativas no Western
blot. Por não possuir alta confiabilidade, uma amostra que seja apenas SEC positiva
pode se apresentar real-SEB-SEC-positiva, pelo teste de imunodifusão, devido a uma
reação cruzada com anticorpo anti-SEB. Isso resulta em negatividade de SEB (falso-
negativo) no Western blot, diminuindo a sensibilidade do teste.
Ainda considerando o teste de imunodifusão como método de referência, temos
especificidade de 67, 81 e 79% para os testes de aglutinação em látex, o ELISA e o
Western blot, respectivamente. Segundo Jordan et al. (2006), a especificidade está
relacionada com a quantidade de amostras falso-positivas. Comparando os testes,
ELISA e Western blot apresentaram melhores resultados que o teste de aglutinação em
látex. Em primeiro lugar, a facilidade de reação do anticorpo anti-SEC com a própria
SEC e com outras SEs resulta em mais amostras falso-positivas. Essa interação
antígeno-anticorpo é facilitada nas moléculas em solução, conforme ocorre no teste de
aglutinação e o torna menos específico. Em segundo lugar, o teste de Western blot é o
que melhor diferencia os resultados positivos por reações cruzadas, o que se traduz
em menos amostras falso-positivas e maior especificidade. Em terceiro lugar, o
material em teste imobilizado no recipiente das placas para ELISA pode possuir
moléculas, que não a toxina, que reajam com o anticorpo. Estes resultados positivos
não podem ser confirmados em ELISA, conforme é possível em Western blot. De
qualquer forma, mesmo que não sejam reais essas amostras positivas são
consideradas na contagem e aumentam a especificidade do teste. Em testes de ELISA
também podem ocorrer reações cruzadas que, aumentam a quantidade de amostras
falso-positivas e também de amostras real-positivas.
Quaisquer fatos justificados pelas reações cruzadas e pela questão dos
contaminantes se aplicam a todos os testes. Entretanto, neste trabalho, estão sendo
ressaltadas as condições que favorecem os resultados observados.
Na prática, os anticorpos específicos não reconhecem as respectivas proteínas
nas mesmas condições físico-químicas porque, além da disponibilização das proteínas
nos diferentes testes e apesar da homologia entre as seqüências, nem todas as SECs,
por exemplo, são sintetizadas a partir da mesma seqüência de nucleotídeos em todas
as cepas. As cepas não são clones e por isso normalmente podem possuir variações
em um ou mais nucleotídeos e tal acontecimento pode acarretar em variações em
nenhum, um ou mais aminoácidos. Tais variações permitirão maior ou menor interação
51
entre os anticorpos (produzidos contra uma seqüência protéica específica) e as
moléculas, presentes na amostra problema, com as quais estes anticorpos interagem.
Em relação ao acoplamento de proteínas ao látex, observa-se que as
concentrações de IgG anti-SEC e SEC adsorvidas variam de acordo com as condições.
A presença de glicina durante o acoplamento permite que maiores quantidades de IgG
anti-SEC e de SEC recombinante se liguem ao látex. Entretanto, a presença de MES
parece melhorar a ligação da proteína ao látex/anticorpo e a conseqüente aglutinação.
E ainda, na presença de MES, e de 0,5 a 1% de látex, é possível visualizar aglutinação.
Quanto a enterotoxina acoplada, nenhuma das condições testadas foi eficiente para
que houvesse detecção de anticorpo em amostras de soros.
Conforme foi atentado para a imunodifusão, os testes de aglutinação também
são subjetivos (Lim et al., 1998). Por isso, além dos resultados serem relatados por
mais de um observador, os testes foram realizados num prazo determinado. Num
período maior que trinta minutos, nas lâminas contendo o material em teste, este
apresentava-se seco. E, aproximadamente 15 minutos após mistura das soluções de
látex com a proteína, o controle negativo apresentava-se decantado, o que pode ser
confundido com aglutinação. Desta forma, os materiais analisados após este período
foram descartados. Por este motivo, e também pela subjetividade e praticidade, os
resultados não foram apresentados na forma de uma, duas ou três cruzes (Attar et al.,
2001), indicando menor ou maior reatividade. As amostras foram consideradas
positivas quando se observou aglutinação da mistura látex/proteína (sobrenadante ou
solução controle) e não se observava aglutinação da mistura látex/controle negativo
(meio BHI ou PBS ou água) no período de aproximadamente 8 minutos.
Apesar de os testes imunológicos de comparação utilizados não serem
absolutamente sensíveis e específicos, a PCR, por sua vez, apresenta alto índice de
confiabilidade, e isso valida os resultados de sensibilidade e especificidade
encontrados para os testes pilotos de aglutinação em látex. Ainda, a forma com que os
dados dos testes foram analisados aumenta a confiabilidade das comparações. Talvez
o teste baseado na aglutinação pudesse apresentar um percentual de sensibilidade
ainda maior, quando se considera para o fato de que a presença do gene não é
necessariamente evidência da presença da respectiva toxina (Sasaki et al., 2005), o
que se traduz em falsos negativos. Contudo, tal vantagem diagnóstica do teste piloto
não deve ser considerada definitiva, pois apenas 18% das amostras foram analisadas.
Além disso, não foi realizado o teste duplo-cego, onde se analisam as amostras sem
52
conhecer qualquer informação prévia pelo operador. Esses testes não foram realizados
por limitação do cronograma e pelo fato de ser um teste piloto, não necessitando ser
feito para todas as amostras. Entretanto, antes da realização dos testes de aglutinação,
foram testadas várias amostras controles, em diferentes concentrações para, então, as
amostras de conveniência serem testadas e consideradas. Embora uma amostra
comprovadamente positiva (a cepa B48) e outra comprovadamente negativa (a cepa
B10) tenham sido escolhidas como controles internos do teste piloto de aglutinação, os
operadores não tinham conhecimento prévio da classe secretada pelas outras
amostras.
Embora o teste piloto de aglutinação em látex tenha sido produzido apenas para
a SEC, verifica-se que é possível desenvolver este método de detecção rápido, seguro,
prático e fácil de usar, e estender as outras SEs. Além disso, comparando com os kits
disponíveis no mercado, a metodologia desenvolvida teria um custo muito reduzido:
enquanto um teste pelo kit comercial sairia por aproximadamente R$35,00 o teste de
aglutinação em látex teria um custo menor que R$10,00. Fica claro que o teste ainda
necessita ser avaliado para vários tipos de amostras alimentares, propositalmente
contaminadas com as SEs e aquelas disponíveis em estabelecimentos comerciais,
principalmente em alimentos mais suscetíveis a contaminação por S. aureus, uma vez
que as intoxicações mais prevalentes que causam diarréias infantis e gastroenterites
são as causadas pelas SEs estafilocócicas (Dinges et al., 2000). Além disso, o mundo
ainda vive o cenário de bioterrorismo (Mantis, 2005), no qual as SEs estão incluídas
como agentes categoria B de risco biológico, e um teste como esse, que seja rápido e
utilizável em larga escala, seria de grande valor.
53
6 – Conclusões
O teste piloto de aglutinação em látex mostrou-se um método sensível e
específico de detecção para SEC presente em amostras controles e de cepas de
Staphylococcus aureus enterotoxigênicas de conveniência.
Comparado com os testes de ELISA, imunodifusão e Western blot, o teste piloto
apresentou o melhor resultado de sensibilidade (83/100%) e especificidade (100/67%),
considerando como método de referência a PCR ou a imunodifusão.
Devido ao desempenho do teste piloto desenvolvido para detecção de SEC, ao
tempo reduzido para o ensaio e às altas sensibilidade e especificidade, é possível
propor a utilização do teste de aglutinação em látex como método de detecção de SEs
em amostras de alimentos e em fluidos biológicos.
O teste de aglutinação em látex é rápido, simples, fácil de usar e possui bom
desempenho, todavia, cabe ressaltar que é um método subjetivo, pelo fato de o
resultado ser dependente da observação visual.
A discrepância observada na sensibilidade, especificidade e na quantidade de
amostras positivas para a mesma proteína entre os diferentes métodos testados pode
ser justificado pelas possíveis reações cruzadas entre as toxinas, uma vez que as
enterotoxinas possuem altas homologias conformacionais e seqüenciais. A desconexão
também pode ser justificada pelas limitações dos métodos analisados.
54
Capítulo II
Terapia e Profilaxia Para Enterotoxinas Estafilocócicas
55
1 - Introdução
1.1 – Alvos terapêuticos ou profiláticos de neutralização
Para neutralizar os efeitos das toxinas existem pelo menos três importantes alvos:
1) a interação TCR-toxina-MHC classe II; 2) as moléculas de adesão, acessórias ou co-
estimulatórias envolvidas nas funções de ativação e efetoras das células T; e 3) as
citocinas secretadas pela ativação de células T e macrófagos. A inibição de todos ou um
dos três alvos tem sido descrito tanto in vitro como in vivo como meio viável de controlar
os efeitos biológicos dessas toxinas bacterianas (Stiles e Krakauer, 2005b).
Outras opções de controle alternativas aos antibióticos, à intervenção dos
mecanismos que regulam geneticamente a expressão dos fatores de virulência das
cepas de Staphylococcus aureus patogênicas (Medina-Acosta et al., 2003) e as que
envolvem as interações célula-célula (Stiles e Krakauer, 2005b) no hospedeiro são
aquelas que se utilizam de anticorpos que inibem a ação das toxinas (Kum e Chow,
2001) e aquelas que se utilizam das proteínas recombinantes, proteínas mutadas
(Mantis, 2005) e da seqüência de transcitose (Shupp et al., 2002) como antígenos
vacinais.
1.2 – Possíveis vacinas contra enterotoxinas
Vários grupos vêem desenvolvendo vacinas para SEs e TSST-1 (Stiles e Krakauer,
2005b). O potencial superantigênico das toxinas tem levado a investigação de seus
sítios antigênicos e sua utilização no desenvolvimento de profiláticos (Lowell et al.,
1996). A compreensão das interações moleculares entre SEB e TCR-MHCII tem
permitido o desenvolvimento de vacinas atenuadas com pequenas mutações em alguns
resíduos para inibição do seu potencial mitogênico. Tais vacinas têm sido testadas em
modelos animais (Tseng et al., 1995; Ulrich et al., 1998; Stiles et al., 2001; Gampfer et
al., 2002).
A proteção atribuída depende, além da própria formulação vacinal, da via de
inoculação, do adjuvante utilizado e ainda da espécie animal em questão. Lowell et al.
(1996), mostraram que camundongos imunizados, pela via intramuscular, com SEB
formalinizada na forma de proteossomas utilizando hidróxido de alumínio como
adjuvante, protegeu 60% dos animais desafiados com uma dose letal pela via
respiratória. Além disso, 80% dos animais imunizados inicialmente pela via
56
intramuscular seguida de administração intranasal (reforço) sobreviveram ao desafio
contra uma dose letal intramuscular, contendo galactosamina (Lowell et al., 1996).
Em mamíferos não primatas, três doses de SEB recombinante (produzida com três
mutações pontuais específicas para ligação ao MHC II e TCR), inoculadas pela via
intramuscular, e na presença de hidróxido de alumínio, protegeram 100% dos animais
contra um desafio utilizando dose letal de proteína veiculada em aerossol. Essa
proteína, quando utilizada como imunógeno, não induziu a elevação de temperatura,
clássica variável indicadora da síndrome do choque tóxico; porém, em animais não
protegidos, a temperatura variou de 1 a 2ºC (Boles et al., 2003a).
A imunização cruzada tem sido observada, o que significa que proteção em amplo
espectro seja possível. A vacinação de animais com uma toxina protege animais contra
várias outras SEs (ou TSST-1) ou a imunização de camundongos BALB/c com uma
mistura de SEs protege parcialmente os animais contra desafios utilizando uma ou
várias toxinas. Além disso, títulos maiores de anticorpos foram encontrados contra cada
SE quando os animais foram vacinados com a inoculação multivalente (Bavari et al.,
1999). A imunização de camundongos com SEC mutante, protegeu 62,5% dos animais
desafiados com S. aureus, em comparação com 0% do grupo controle (Hu et al.,
2005b).
O desenvolvimento de protocolos de imunização pelas formas ativas ou passivas
abre horizontes no sentido de proteger o público em amplas proporções, enquanto se
providencia uma planilha complementar de tratamento e proteção efetivos contra as
doenças causadas por essas toxinas (Hassani et al., 2004).
1.3 – Terapias contra enterotoxinas
1.3.1 – Baseadas em citocinas ou moléculas envolvidas na ativação de células T
Uma série de estratégias que inibe os superantígenos in vitro e in vivo está
descrita na literatura. A produção de óxido nítrico mediada por SEA e SEB está
intimamente ligada a síntese de citocinas pirogênicas IL-1, IL-2, IL-6, TNF, e INF-γ e a
inibição da enzima óxido nítrico sintetase, pela dexametasona ou anizomicina, reduziu a
produção dessas moléculas atenuando a resposta pirética (Won et al., 2000). A
produção de TNF-α no soro de animais administrados com SEB e lipopolissacarídeos
(LPS) foi reduzida em até 80% com a utilização do antiinflamatório pirfenidona,
57
demonstrando seu potencial terapêutico contra choque séptico e os efeitos biológicos
de SEB (Hale et al., 2002).
A proteína CD28 é um co-estimulador da união do receptor de reconhecimento
antigênico da superfície do linfócito T com o complexo antígeno-MHCII nas APCs.
Camundongos CD28-/- são resistentes ao choque tóxico, enquanto que camundongos
CD28+/- ou +/+ são suscetíveis. Esses resultados sugerem que inibição do co-
estimulador reduz efetivamente a proliferação de células T, pela inibição da produção de
TNF-α induzida por TSST-1 in vitro e previne a síndrome do choque tóxico in vivo (Saha
et al., 1996).
A tolerância em camundongos foi induzida pela aplicação nasal de SEA. O
fenômeno resultou na sobrevivência de 50-100% dos animais testados após o desafio
com SEA e 0% de sobrevivência dos animais desfiados com TSST-1. Neste caso, a
tolerância foi relacionada com o aumento dos níveis de IL-10 no soro, mas não com
depleção da reatividade de célula T induzida por SEA (Collins et al., 2002).
1.3.2 – Baseadas em interações com o antígeno/epítopo
A imunoprofilaxia passiva usando tanto anticorpos policlonais (Capparelli et al.,
2005) ou anticorpos monoclonais promove proteção imediata (embora por um curto
período) uma importante abordagem para pacientes que ou não querem esperar o efeito
da vacina ocorrer ou cujo sistema imune está muito comprometido para desenvolver
uma resposta imune contra a vacina (Projan et al., 2006). Os dados disponíveis na
literatura destacam a vantajosa utilização dessa terapia que pode ser aplicada para
reduzir ou eliminar a síndrome do choque tóxico, os efeitos de intoxicação, letalidade e
outras possíveis desordens associadas mediadas por superantígenos e SEs.
A transferência passiva em camundongos de IgY anti-SEB suprimiu a resposta de
citocinas e foi protetora (LeClaire et al., 2002). Macacos tratados com IgY anti-SEB
antes ou quatro horas após a exposição a uma dose letal de SEB, na forma de aerossol,
sobreviveram ao desafio (LeClaire et al., 2002). Também foi observado que este
anticorpo inibiu a atividade proliferativa da SE sobre células T obtidas de voluntários
humanos (LeClaire e Bavari, 2001).
O soro de camundongos imunizados com os mutantes de SEB, N23K e F44S,
protegeu de 80 a 87% de camundongos contra o desafio com 30 vezes a LD50 de SEB
nativa. Essa proteção ocorreu durante a administração do soro uma, duas ou quatro
58
horas após o desafio. Este soro também foi eficiente em bloquear a proliferação in vitro
de células T induzidas por SEB (Woody et al., 1997).
Como mencionado, a imunização com uma classe de enterotoxina resulta na
produção de anticorpos capazes de neutralizar outras. Ulrich et al. (1998), imunizaram
macacos com SEB e verificaram que os anticorpos policlonais produzidos protegeram
esses animais contra doses letais de SEA, SEB, SEC1 ou TSST-1, com um percentual
de sobrevivência de 100% para animais desafiados com SEB e SEC1.
Há também a possibilidade do anticorpo produzido contra uma das toxinas
estafilocócicas proteger contra a infecção por S. aureus. A utilização de dez miligramas
de anticorpo específico para TSST-1 reduziu a mortalidade de camundongos de 100%
para 80%, por 15 dias, após um desafio com 5 x 107 CFU de S. aureus 834 (Hu et al.,
2002).
Os anticorpos monoclonais também são interessantes imunoterápicos. Conforme
verificado por Bonventre et al. (1993), o anticorpo monoclonal Mab 8-5-7, específico
para TSST-1 nativa, protegeu coelhos não só contra os efeitos sistêmicos causados
pela TSST-1 nativa, mas também contra várias TSST-1 mutadas.
Em um outro tipo de experimento, onde foram analisados sítios funcionais da SEB,
foi observado que dois anticorpos monoclonais específicos para epítopos de SEB foram
capazes de bloquear, na toxina, um sítio de ligação ao MHCII ou um sítio de ligação
envolvido com o reconhecimento da cadeia Vβ do TCR (Hamad et al., 1994).
Inicialmente os anticorpos foram incubados com SEB. A neutralização de SEB pela
formação de complexo foi determinada investigando-se a produção de IL-2. A inibição
da produção de IL-2 indicou que as células T não responderam à ligação do complexo
SEB-MHCII porque os anticorpos monoclonais neutralizaram as moléculas de SEB. Em
seguida, SEB apresentada por APCs foi incubada com anticorpo monoclonal e um
reagente secundário fluorescente. A maior intensidade de fluorescência detectada foi
indicativa de que a região onde o anticorpo monoclonal se ligou seria responsável pela
ligação do complexo SEB-MHCII às células T.
1.3.3 – Baseadas em peptídeos
Os peptídeos têm atraído considerável atenção dos pesquisadores nos últimos
anos (Lomonossoff e Hamilton, 1999). Estes podem ser usados para identificar uma
seqüência específica responsável por algum efeito danoso na célula (Hamad et al.,
1994; Hu et al., 2001), para produção de vacinas, como sugerido por Shupp et al.
59
(2002), se estas seqüências forem conservadas nas moléculas, ou ainda como
antagonistas de moléculas alvo (Arad et al., 2000; Llewelyn e Cohen, 2001; Kaempfer
et al., 2002; Rajagopalan et al., 2004).
Hu et al. (2001), sintetizaram peptídeos de 10 aminoácidos não sobrepostos,
correspondentes a seqüência inteira de SEA. Anticorpos contra todos estes peptídeos
foram produzidos em coelhos. Ratos sadios, adultos, foram inoculados com misturas
de 6, 3, 2 ou 1 dos anticorpos produzidos contra cada peptídeo, junto com SEA (ED50).
Quanto menor fosse a quantidade de animais que apresentasse êmese, maior a
possibilidade do anticorpo produzido contra uma seqüência específica ser encontrado
nessa mistura. Consequentemente, este anticorpo, que pode ser utilizado como
terapêutico, teria sido produzido por uma seqüência responsável pela
enterotoxigenicidade da molécula analisada (Hu et al., 2001).
A região responsável pela passagem transepitelial das SEs (figura 20), o peptídeo
SEB152-161 KKKVTAQELD de transcitose, é um alvo interessante a ser explorado. Após a
conjugação do peptídeo ao carreador KLH, foram produzidos anticorpos anti-peptídeo
em camundongos. Soros destes animais foram utilizados num ensaio in vitro, em
células T-84, de inibição da transcitose de SEA, SEB, SEE e TSST-1, e o resultado foi
uma redução significante da transcitose das 4 toxinas (Shupp et al., 2002).
Figura 20: Esquema representativo da transcitose de SEs. A toxina próxima ao epitélio
intestinal é transcitada até os vasos sanguíneos utilizando o peptídeo de transcitose.
Essa transcitose é mediada, em parte, por um peptídeo específico e conservado nas
SEs, o peptídeo de transcitose (http://www.biodeliverysciences.com/
BDSI-images/transcytosis_small.jpg).
60
Pelo fato dos peptídeos serem fracos imunógenos, além da alternativa de ligá-los a
moléculas carreadoras (Abbas et al., 2000), uma estratégia encontrada para utilizar
peptídeos como vacina visa aumentar seu número de cópias na superfície de proteínas
carreadoras ou macromoléculas, como por exemplo, os vírus quiméricos, dentre eles,
os vírus de plantas (Lomonossoff e Johnson, 1995 e 1996).
O peptídeo de transcitose tem sido expresso na superfície de partículas virais
quiméricas de plantas com o objetivo de verificar tanto sua imunogenicidade para
anticorpos anti-peptídeo como para utilizá-lo como antagonista (Moura, 2004; Medina-
Acos
quatro horas sobreviveram a dose letal de
SEB
I das APCs, duas ou
uma
ibir in vitro a transcitose de
/peptídeo
foram
ta, dados não publicados).
Os peptídeos usados como antagonistas podem surtir efeitos antes e após a
exposição/desafio das SEs. Kaempfer et al. (2002), comprovaram que 30% dos
camundongos expostos num período de vinte e quatro horas e 20% dos camundongos
expostos num período superior a vinte e
quando o peptídeo de SEB148-161 VQTNKKVTAKELD foi administrado antes da
exposição. Além disso, 70, 60 e 50 % dos animais desafiados sobreviveram à
exposição letal de SEB, após administração do peptídeo V148QTNKKVTAKELD161, três,
cinco ou sete horas, respectivamente, após desafio.
Em outro trabalho foi comprovado que a administração de um peptídeo,
possivelmente inibidor competitivo pelo sítio de ligação ao MHC I
hora antes da administração individual de dose letal de diversas SEs protegeu
entre 83 a 100% de camundongos previamente sensibilizados com LPS e
galactosamina (Visvanathan et al., 2001)
O peptídeo de transcitose também foi utilizado para in
SEA, SEB, SEE e TSST-1 (Shupp et al., 2002). Diferentes proporções toxina
incubadas com 1µg/mL da toxina na presença de células T-84. A quantidade de
toxina capaz de atravessar as células epiteliais foi detectada por ELISA. Os resultados
indicaram que o peptídeo SEB152-161 foi capaz de inibir a transcitose de 73% de SEA,
aproximadamente 60% de SEB, 68% de SEE e 59% de TSST-1.
Com resultados tão promissores, não diferente da produção de anticorpos
específicos, a produção de peptídeos antagonistas das SEs e da TSST-1 permitiria
avaliar as vantagens terapêuticas desta estratégia na exposição sistêmica aos
superantígenos ingeridos ou inalados (Shupp et al., 2002).
1.4 – Vírus vegetais quiméricos como sistemas de apresentação de epítopos
61
Para resolver alguns dos problemas associados com os métodos tradicionais de
produção de vacina, como a perda da estrutura das proteínas pela sua desativação, a
reversão do fenótipo patogênico de microrganismos atenuados ou, o alto custo dos
processos de obtenção de proteínas recombinantes, tem sido considerado interessante
ção de epítopos (Lomonossoff e Johnson,
1996)
s
quime
ala, na ordem 1-2g/Kg (Porta e Lomonossoff,
1996;
tais como ausência do risco de contaminação
com p
as são suscetíveis a mobilidade genética durante a
o desenvolvimento de sistemas de apresenta
nos quais seqüências peptídicas definidas correspondentes a sítios antigênicos
específicos de patógenos são engenheiradas em vírus não patogênicos (Porta e
Lomonossoff, 1996). Nesse sistema, a seqüência de interesse é incorporada ao genoma
do vírus, que será replicado e, consequentemente, levado a síntese protéica. Esta
ras são atraentes como novos potenciais vacinais, porque as partículas
modificadas podem ser facilmente purificadas e a apresentação de múltiplas cópias do
peptídeo na superfície da macromolécula pode aumentar significativamente sua
imunogenicidade (Usha et al., 1993; Lomonossoff e Johnson, 1995 e 1996).
1.4.1 – Características dos vírus de plantas
Alguns vírus, Vírus do Mosaico do Feijão-de-Corda (CPMV – cowpea mosaic
virus), Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), Vírus do Tomate (TBSV), Pox Vírus (PPV), o
Vírus X da Batata (PVX) e o Vírus do Mosaico da Alfafa (AlMV), têm sido estudados e
utilizados como sistemas de expressão de proteínas em plantas (Lomonossoff, 2001).
Os vírus se multiplicam extremamente bem em seus hospedeiros e as partículas
são facilmente purificadas em grande esc
Scholthof et al., 1996; Lomonossoff, 2001; Mechtchriakova et al., 2005; Cañizares
et al., 2005). Dentre as vantagens que tornam os vírus atrativos para tal propósito
temos: 1) o vírus é termoestável, com o ponto termal de inativação maior que 60ºC; 2) o
genoma viral é pequeno e, portanto, fácil de manipulação; 3) a infecção das plantas é
facilmente realizada e; 4) a seqüência inserida no vetor viral é amplificada durante a
replicação viral (Liu et al., 2005; Cañizares et al., 2005). Os sistemas de expressão em
plantas ainda apresentam as vantagens
atógenos animais, baixos custos de produção, e a possibilidade de produção em
larga escala. Também oferecem a opção da produção de vacinas comestíveis
(Cañizares et al., 2005; Rae et al., 2005).
Algumas desvantagens de se utilizar vírus incluem 1) restrições físicas
associadas ao tamanho da seqüência a ser inserida, para que o vírus mantenha sua
viabilidade; 2) as seqüências inserid
62
replica
Para produção de vacinas comestíveis se faz necessário avaliar in vivo a
a condições gastrointestinais e é distribuído sistemicamente em
camun
er utilizadas como plataformas para moléculas de interesse diagnóstico, como
aquela
1.4.2
vírus de planta, o CPMV, oferece uma ferramenta potencialmente
segura para a apresentação de epítopos/proteínas de patógenos para o
desenvolvimento de vacinas de baixo-custo (Chatterji et al., 2002).
O CPMV pertence ao grupo comovirus e infecta um grande número de
leguminosas. Sua estrutura é icosaédrica, composta por 60 cópias da proteína maior
(proteína L), de aproximadamente 37,4 kDa, e 60 cópias da proteína menor (proteína
S), de 21,3 kDa (figura 21); o genoma viral é RNA bipartido e simples fita. O RNA 1
(5889 nucleotídeos) codifica a maquinaria de replicação, independente das células
vegetais, e o RNA 2 (3481 nucleotídeos) codifica as proteínas de movimentação e as
ção viral e; 3) tais seqüências não são mantidas estáveis após múltiplas
passagens (Liu et al., 2005; Cañizares et al., 2005). Apesar das desvantagens, o uso de
vírus de plantas para produção de vacinas vem crescendo como uma alternativa atrativa
aos tradicionais sistemas de produção.
administração oral de partículas virais. Rae et al. (2005), verificaram que o CPMV é
resistente
dongos, via corrente sanguínea, tanto para se ligar ao endotélio ou entrar no
parênquima tecidual numa variedade de tecidos após inoculação oral (e intravenosa) ou
alimentação com folhas infectadas.
Além de poderem ser usadas como vacinas, as partículas quiméricas podem
ainda s
s usadas em imunoensaios (Spasford et al., 2006) ou aquelas utilizadas para
técnicas de capturas de imagens (Lewis et al., 2006).
– Vírus do mosaico do feijão-de-corda como sistema de apresentação de
peptídeos
CPMV foi o primeiro vírus de planta a ser desenvolvido como sistema de
apresentação de epítopos. Por isso, os conhecimentos envolvendo a estrutura e o
genoma do CPMV são bem definidos, o que contribui para a sua ampla utilização como
sistema apresentador de epítopos e de expressão de polipeptídeos (Lomonossoff,
2001).
Sendo um
proteínas estruturais (Porta et al., 1994).
63
Figura 21: Modelo tridimensional do vírus quimérico do mosaico do feijão-de-corda que
expõe
que foi
comprovado com experimentos contendo uma variedade de quimeras. As
características físicas e biológicas das partículas modificadas são similares àquelas
obtidas para o CPMV selvagem (Porta et al., 1994).
A proteína S do capsídeo tem se mostrado extensivamente útil na inserção de
peptídeos exógenos, porém outros locais também têm sido utilizados com sucesso
como a alça βE-αB da proteína L e o sítio βC’-βC’’ da proteína S (Chatterji et al., 2002;
Porta et al., 2003; Liu et al., 2005).
Alguns exemplos de partículas quiméricas geneticamente estáveis produzidas a
partir de CPMV e diferentes seqüências heterólogas são apresentados na tabela 12,
evidenciando a capacidade de CPMV como sistema apresentador de epítopos.
peptídeos heterólogos. Em verde a proteína L; em azul a proteína S e em
amarelo a seqüência heteróloga (esquema gentilmente cedido por George Lomonossoff,
John Innes Centre, Inglaterra).
Uma análise detalhada da estrutura tridimensional do CPMV revelou que a alça
mais exposta da superfície do vírus, o βB-βC, região entre a alanina 22 e a prolina 23,
na proteína S, tolera a inserção de aproximadamente 40 aminoácidos, o
64
Tabela 12: Exemplos de epítopos expressos como peptídeos de fusão da proteína S de
CPMV.
Epítopo Origem da Seqüência Referência
VP1 Vírus da febre aftosa Usha et al., 1993
VP1 Rinovirus humano - 14 Porta et al., 1994
Gp41 Virus da imunodeficiência
humana -1
Kennedy et al., 1986
VP2 Parvovirose canina Dalsgaard et al.,1997;
Langeveld et al., 2001;
Nicholas et al., 2003
D2 da FnBP Staphylococcus aureus Brennan et al., 1999a
Proteína F Pseudomonas aeruginosa Brennan et al., 1999b
GP63, LACK,
LDP23
Leshmania chagasi Mittmann, 2004
Peptídeo de
transcitose
Enterotoxina B de
Staphylococcus aureus
Moura, 2004
1.4.3 - Propriedades Imunogênicas
Em termos tecnológicos, a produção de partículas virais quiméricas (PVQs)
oferece uma alternativa competitiva às metodologias clássicas de produção de
imunoprofiláticos. PVQs podem ser administradas em animais experimentais para
avaliar a eficiência desta tecnologia em conferir proteção contra doenças clínicas
desenvolvida tanto em animais como em humanos. A imunogenicidade dessas
partículas tem sido demonstrada em animais de experimentação pela injeção de
partículas que conferem proteção contra doenças (Porta et al., 1994).
Uma variedade de partículas virais contendo insertos na alça βB-βC da proteína
S tem sido propagadas e as partículas purificadas têm sido analisadas
imunologicamente. Os epítopos candidatos são derivados de rinovirus humano (HRV),
virus da imunodeficiencia humana (HIV), vírus da febre aftosa (FMDV), parvovirus
65
canina, virus measles, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Plasmodium
falciparum e outros agentes não patogênicos como hormônios, antígenos de células
tumorais, proteínas estruturais e peptídeos (Lomonossoff e Hamilton, 1999).
A eficácia das partículas quiméricas como vacina experimental tem sido
comprovada para diferentes modelos de doenças (tabela 13).
Em alguns casos, a imunização de uma partícula específica acarreta na proteção de
uma partícula de outro grupo, como no caso de camundongos imunizados com CPMVs.
Os anticorpos anti-CPMV produzidos foram transferidos passivamente para outra
linhagem de camundongos e protegeram esses animais contra dose intracraniana letal
do vírus da rubéola (Oleszewska e Steward, 2003).
Confirmada sua eficácia, as PVQs mostram-se bastante úteis para o
desenvolvimento de vacinas (Figura 22).
Figura 22: Esquema representativo da produção de vacinas pela tecnologia de
partículas virais quiméricas (modificado de esquema gentilmente cedido por George
Lomonossoff, John Innes Centre, Inglaterra).
66
Tabela 13: Peptídeos imunogênicos expressos utilizando o sistema viral de
apresentação de epítopos de plantas (Cañizares et al., 2005, modificado).
Peptídeo Propriedades Imunológicas Referência Gp-41 de HIV-1 Camundongos imunizados pela via
intraperitoneal ou nasal produziram altos
níveis de IgG e IgA contra HIV-1
Marusic et al., 2001
MHV Camundongos imunizados via parenteral
ou intranasal foram protegidos contra MHV
Koo et al., 1999
VP2* Injeção parenteral protegeu martas contra
desafio com Vírus da Enterite Martas;
A forma inativada da quimera inoculada
protegeu cães contra o desafio com
parvovirus canino.
Dalsgaard et
al.,1997; Langeveld
et al., 2001
D2 da FnBP* Aplicação parenteral protegeu ratos contra
endocardites.
Rennermalm et al.,
2001
Proteína F * Injeção parenteral protegeu camundongos
contra desafio com Pseudomonas
aeruginosa
Brennan, 1999b
Peptídeos da
proteína G e F do
vírus da raiva
Camundongos imunizados e desafiados
com a partícula NF1-g24 cederam a
infecção em 10-20 dias.
Voluntários imunizados com a partícula
Av/A4-g14 apresentaram aumento
significante nos níveis de anticorpos contra
o vírus da raiva.
Yusibov et al., 2002
Gp63 Camungondos imunizados pela via oral e
nasal foram parcialmente protegidos contra
desafio com Leishmania major
Mittmann, 2004
67
*Produzidos em partículas CPMV. Nos últimos anos houve um significante progresso no uso de vetores virais de
plantas para produção de imunógenos. Particularmente encorajador é o fato de que
peptídeos apresentados neste modelo podem conferir imunidade protetora contra várias
doenças. Na maioria dos casos, a imunidade é estimulada pela vacinação parenteral,
mas há casos em que a imunização via mucosa é possível. Isso aumenta a perspectiva
de que é possível conferir imunidade protetora pela simples alimentação com planta
infectada com a construção viral apropriada (Cañizares et al., 2005).
Assim como no caso dos peptídeos sintéticos, os peptídeos expostos na superfície
de partículas virais podem ser utilizados como antagonistas de moléculas alvo, com as
vantagens de sua produção ser mais barata e descomplicada que a produção de
peptídeos sintéticos e, ainda, poder competir pelo mesmo receptor que os fatores de
virulência.
Considerando as características tóxicas e superantigênicas das SEs como alvos
de possível eliminação, a seqüência K152KKVTAQELD161 de transcitose de SEB
(Shupp et al., 2002) foi expressa na superfície do vírus do mosaico do feijão-de-corda
por Moura, 2004, e o seu potencial terapêutico foi avaliado no presente trabalho.
1.5 – Justificativa
Não existe nenhuma vacina ou tratamento disponibilizados para o combate aos
sintomas causados por intoxicação ou superantigenicidade dessas toxinas. Desta
forma, também há a necessidade de desenvolver estratégias capazes de bloquear tais
efeitos que podem levar a morte. Com a finalidade de inibir efeitos visíveis causados
pela SEC recombinante ou pela SEC nativa, visamos avaliar duas estratégias: uma
baseada na interação antígeno-anticorpo (terapia passiva) e outra baseada na utilização
de partículas virais quiméricas expressando o peptídeo K152KKVTAQELD161 de
transcitose, presente nas SEs.
Em princípio, a terapia passiva poderia tratar indivíduos já expostos a aerossóis ou
intoxicados pela ingestão de alimentos contaminados. Esse tipo de proteção é imediata
e evita a necessidade de submeter o paciente, que já apresenta o sintoma ou que
apresenta imunossupressão, à imunização com a toxina e à espera da reação do
sistema imunológico.
O conhecimento e a utilização do peptídeo de transcitose representam um passo
importante quando se pensa em estratégias profiláticas/terapêuticas para as doenças
68
causadas pelas SEs e TSST-1. Esta seqüência de 10 aminoácidos é altamente
conservada nas SEs e na TSST-1. O desenvolvimento de uma vacina ou a produção de
anticorpos específicos através deste peptídeo evitaria o contato com regiões específicas
das proteínas responsáveis por causarem intoxicação e superantigenicidade. E ainda
permitiria inibir os efeitos tóxicos de várias SEs. Neste trabalho também propomos a
produção de anticorpo policlonal contra o peptídeo de transcitose e a avaliação destes
produtos na inibição dos efeitos tóxicos causados pelas SEs.
Acoplada a utilização de peptídeos está a implementação de partículas virais de
plantas como eficientes plataformas de apresentação de antígenos. Dentre as
vantagens apresentadas por esse sistema estão: 1) a facilidade de propagação das
partículas virais no hospedeiro e 2) as altas concentrações de partículas obtidas, 3) a
facilidade de purificação das partículas, 4) a dispensa da refrigeração, como ocorre nas
vacinas tradicionais, 5) os baixos custos e 6) facilidade de manutenção da planta para
propagação do vírus e, 7) o fato da técnica não requerer condições estéreis de cultura.
Ainda há a característica imunogênica/protetora dessas partículas.
Além das vantagens apresentadas pela utilização de partículas virais, é bem
possível que a produção dessas partículas quiméricas expressando 60 vezes o
peptídeo K152KKVTAQELD161 de transcitose permita sua utilização com uma função
diferenciada, a de antagonistas das SEs.
69
2 – Objetivos
2.1 – Avaliar in vivo o potencial terapêutico de anticorpos anti-SEC recombinante e anti-
peptídeo de transcitose K152KKVTAQELD161 em enterotoxinas.
2.2 – Avaliar in vivo o potencial terapêutico de partículas virais quiméricas do vírus do
mosaico do feijão-de-corda expressando o peptídeo de transcitose
K152KKVTAQELD161.
70
3 – Materiais e métodos
3.1 – Materiais biológicos
3.1.1 – Animais
Uma ninhada de três gatos machos sadios de 30 dias (~500 g/animal) foi obtida
através de um criador local.
Coelhos machos albinos sadios de 1-3 kg foram comprados de criador/fornecedor
local.
Os animais foram mantidos em ambiente de temperatura e iluminação
controladas, alimentados com ração e água ad libitum. Os coelhos foram agrupados
dois a dois e os gatos em três, em gaiolas 20 x 20 x 90 cm higienizadas diariamente.
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os cuidados
exigidos pelo Comitê de Ética do LSA, CCTA, UENF, observando-se os Princípios
Éticos na Experimentação Animal, estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e a Lei número 3900 (2002), que institui o Código
Estadual de Proteção aos Animais.
3.1.2 – Partículas virais
As construções pCP1 (contendo o cDNA do RNA 1 do CPMV) e pCP2/PT14
(contendo o cDNA do RNA 2 do CPMV acrescentado do inserto para o peptídeo
K152KKVTAQELD161 de transcitose, responsável pela transcitose) foram utilizados para
infectar folhas primárias de Vigna unguiculata de 10 dias de idade. Dez microgramas
da construção pCP1 foram linearizados com a enzima Mlu I e dez microgramas da
construção pCP2 foram linearizados com Eco RI e, então, utilizadas para infecção, por
meio de abrasão manual com pó de carborundum. Após manutenção das plantas
infectadas a 25ºC, 65% de umidade, durante aproximadamente 20 dias, as primeiras
lesões cloróticas, indicativas de infecção/produção de partículas virais quiméricas,
apareceram. Depois de confirmada a produção de partículas por RT-PCR, PCR, SDS-
PAGE e Western blot, tais partículas, denominadas CPMV-PT14, foram purificadas,
dosadas, por espectrofotometria e utilizadas nos experimentos de neutralização de
SEC. As partículas CPMV selvagem foram produzidas de forma semelhante, porém,
utilizando o plasmídio pCP2, que não possui a seqüência codificadora do peptídeo de
transcitose (Moura, 2004). Ambas as partículas CPMV-PT14 ou CPMV selvagem foram
71
gentilmente doadas pela Bióloga colaboradora Renata Moura (Hospital Geral de
Guarus, Campos dos Goytacazes - RJ).
3.1.3 – Soros
3.1.3.1 – Produção de soro anti-CPMV (R20)
Antes da realização do ensaio foi coletado 1 mL de sangue (soro pré-imune).
Esquema de imunização: nos dias 0, 15º e 30º o coelho recebeu 200 µg de CPMV
selvagem, pela via subcutânea, emulsionada em adjuvante completo de Freund
(relação 1:1) na primeira imunização e emulsionada em adjuvante incompleto (relação
1:1) a partir da segunda imunização. No 45º dia foi feita coleta de sangue via punção
cardíaca. O sangue obtido foi incubado por uma hora a 37ºC para coagulação e, em
seguida, o soro foi separado e acondicionado congelado até realização do teste de
ELISA.
3.1.3.2 – Produção de soro anti-peptídeo de transcitose
3.1.3.2.1 – Obtenção de peptídeos sintéticos correspondentes à seqüência de
transcitose
Foram utilizados 2 peptídeos para produção de anticorpos anti-peptídeo de
transcitose (tabela 14), sintetizados por encomenda pela companhia Genemed
Synthesis Inc, São Francisco, EUA, a partir da seqüência de transcitose de SEB
descrita por Shupp et al., 2002.
72
Tabela 14: Informações sobre as seqüências dos peptídeos de transcitose utilizados
para a produção de anticorpos.
Peptídeo Diferencial Referência
MAP-KKKVTAQELD Possui oito seqüências do
peptídeo de transcitose
K152KKVTAQELD161 acoplados
num suporte de lisina carreador de
MAP (multiple antigen peptide).
Shupp et al., 2002;
Tam e Zavala,
1989; Tam e
Spetzler, 1997
C-KKKVTAQELD O resíduo de cisteína adicionado
tem o propósito de acoplamento
apenas.
Shupp et al., 2002;
Genemed
Synthesis Inc, São
Francisco, EUA
3.1.3.2.2 – Imunização de coelhos com os peptídeos MAP-KKKVTAQELD e C-
KKKVTAQELD
Peptídeo MAP-KKKVTAQELD
Protocolo 1
Antes de iniciar o experimento, 1 mL de soro do coelho foi coletado (soro pré-
imune). Esquema de imunização: nos dias 0, 15º e 30º o coelho recebeu 1 mg do
peptídeo MAP-KKKVTAQELD, pela via subcutânea, emulsionado em adjuvante
completo de Freund (relação 1:1) na primeira imunização e emulsionado em adjuvante
incompleto (relação 1:1) a partir da segunda imunização. No 45º dia foi feita coleta de
sangue via punção cardíaca. O sangue obtido foi incubado por uma hora a 37ºC para
coagulação e, em seguida, o soro foi separado e acondicionado congelado até
realização do teste de ELISA.
Protocolo 2
Antes de iniciar o experimento, 10 mL de soro de cada animal foi coletado (soro
pré-imune). Neste caso, dois coelhos foram imunizados conforme o protocolo descrito a
seguir. Estas imunizações foram realizadas pelo colaborador veterinário Ricardo José
Bottecchia e os animais foram mantidos e tratados segundo as normas da EMBRAPA,
local onde foram mantidos os animais. Esquema de imunização: nos dias 0, 7º, 15º e
73
21º um coelho recebeu 500 µg do peptídeo MAP-KKKVTAQELD, no ponto BaiHui
(Lignon e Bottecchia, 2000), num volume de 1 mL de solução salina. O outro animal
recebeu 500 µg do peptídeo MAP-KKKVTAQELD, pela via intraperitoneal, emulsionado
em adjuvante completo de Freund (relação 1:1) na primeira inoculação e emulsionado
em adjuvante incompleto (relação 1:1) a partir da segunda inoculação. No 28º dia o
sangue de cada animal foi coletado via punção cardíaca. O sangue obtido foi incubado
por uma hora a 37ºC para coagulação e, em seguida, o soro foi separado e
acondicionado congelado até realização do teste de ELISA.
O mesmo protocolo de imunização foi realizado para dois coelhos, porém
utilizando 1 mg de peptídeo.
Peptídeo C-KKKVTAQELD
A imunização com esse peptídeo foi realizada por encomenda pela Genemed
Synthesis Inc., São Francisco, EUA. Além da imunização ter sido em 2 coelhos, não há
mais informações sobre o protocolo utilizado.
3.1.3.3 - Ensaio de ELISA
O ELISA dos soros dos animais imunizados no item 3.1.3 foi realizado contra
CPMV, para animais imunizados com CPMV selvagem, ou contra os peptídeos MAP-
KKKVTAQELD ou C-KKKVTAQELD, contra a SEC recombinante e contra a partícula
viral CPMV-PT14, para os animais imunizados com os peptídeos (tabela 15). O
protocolo ELISA foi realizado conforme o item 3.2.1, capítulo I.
Foram utilizados 2 µg/mL de SEC recombinante e 5 µg/mL de cada peptídeo ou
de CPMV selvagem ou CPMV-PT14 para sensibilização das placas. O soro controle foi
o R18 (anti-SEC recombinante, 1:15000). O soro de coelhos imunizados no item
3.1.3.1 e 3.1.3.2, capítulo II, foram testados a partir da diluição 1:100 até 1:25600.
74
Tabela 15: Ensaio de ELISA com as combinações dos diferentes peptídeos, SEC
recombinante e partícula viral CPMV-PT14 com os soros dos animais imunizados.
Reagente contra o qual os soros foram testados Soro do animal
inoculado com o
peptídeo MAP-
KKKVTAQELD
C-
KKKVTAQELD
SEC
recombinante
Partícula CPMV-
PT14
MAP-KKKVTAQELD X
C-KKKVTAQELD X X X
3.1.3.4 – Avaliação do anticorpo anti-peptídeo de transcitose por imunoprecipitação de
partículas virais
A um tubo de ensaio foram adicionados 50 µL de solução contendo 5 µg de
partículas virais e 50 µL de soro (contra a partícula ou pré-imune ou contra o peptídeo
C-KKKVTAQELD). Essa mistura foi incubada por duas horas a 37ºC, sob agitação.
Então, foram acrescentados 50 µL de uma suspensão 50% (v/v) de proteína G
sepharose (Sigma-Aldrich). O tubo foi novamente incubado a 37ºC por uma hora, sob
agitação. Após o período de incubação, o material foi transferido para tubos de
microcentrífuga e centrifugado a 3000 x g por cinco minutos. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado foi lavado 3 vezes com PBS 1X (Harlow e Lane, 1998c). O
material foi suspenso em 50 µL de tampão de amostra completo.
Uma alíquota de 20 µL de cada amostra foi fracionada em SDS-PAGE, gel de
separação 15% e então transferida para membrana de nitrocelulose, conforme
explicitado no item 3.2.2, capítulo I. Após bloqueio, a membrana foi incubada com o
soro R20 (1:5000) por duas duas horas e após lavagem foi incubada por mais duas
horas com proteína A peroxidase (1:5000).
3.2 – Ensaio de neutralização do efeito pirético da SEC nativa com IgG anti-SEC
recombinante em gatos
Antes da realização do ensaio, foram coletados de cada gato, 500 µL de sangue,
que foram incubados por uma hora a 37ºC para coagulação. Em seguida, o soro foi
separado e testado para verificação da presença de anticorpos contra SEC. Tendo sido
75
negativos por ELISA (item 3.2.1, capítulo I) para anticorpos IgG anti-SEC, os animais
foram utilizados no experimento.
Protocolo terapêutico: 2 mg de IgG anti-SEC recombinante (item 3.1.3.1, capítulo
I) foram incubados com 100 µg de SEC nativa purificada (item 3.1.1, capítulo I) por
uma hora, 37º. O volume final foi de 1 mL, em PBS. A mistura foi inoculada pela via
intraperitoneal. A temperatura retal foi medida antes da inoculação; a cada hora por
três horas consecutivas, após inoculação. Foram observadas variação de temperatura
e a ocorrência de vômito, diarréia, letargia e sonolência (Martin e Marcus, 1964; Clark e
Page, 1968; Boles et al., 2003b; Ilbäck et al., 2003).
Protocolo não terapêutico: 2 mg de IgG pré-imune (item 3.1.3.1, capítulo I) foram
incubados com 100 µg de SEC nativa purificada por uma hora, 37º. O volume final de 1
mL, em PBS, foi administrado vinte e quatro horas após aplicação do protocolo
terapêutico, pela via intraperitoneal. A temperatura retal foi medida antes da inoculação
e a cada hora por três horas, após inoculação. Também foram observadas variação de
temperatura e a ocorrência de vômito, diarréia, letargia e sonolência.
O monitoramento da temperatura retal se fez com o uso do termômetro durante
três minutos. Foi considerada resposta pirética aquela em que a temperatura variou em
1,2ºC ou mais, em relação ao tempo 0 (Marcus e Martin, 1964).
3.3 – Ensaio de neutralização do efeito diarréico da SEC recombinante com IgG anti-
SEC recombinante em coelhos
Antes da realização do ensaio, foram coletados de cada coelho, 500 µL de
sangue, que foram incubados por uma hora a 37ºC para coagulação. Em seguida, o
soro foi separado e testado para verificação da presença de anticorpos contra SEC.
Tendo sido negativos por ELISA (item 3.2.1, capítulo I) para anticorpos IgG anti-SEC,
os animais foram utilizados no experimento.
Protocolo terapêutico: 2 mg de IgG anti-SEC recombinante foram incubados com
60 µg de SEC recombinante (item 3.1.2, capítulo I) por uma hora, 37º. O volume final
foi de 1 mL, em PBS. A mistura foi inoculada subsequentemente no ponto BaiHui. A
temperatura retal foi medida antes da inoculação e 2 vezes durante vinte e quatro
horas após inoculação. Foram observadas variação de temperatura e a ocorrência de
taquipinéia, constipação, fezes mucosas, diarréia, letargia e sonolência (Shlievert et al.,
2000; Lignon e Bottecchia, 2000; Hu et al., 2003).
76
Protocolo não terapêutico: 2 mg de IgG pré-imune foram incubados com 60 µg de
SEC recombinante por uma hora, 37º. O volume final foi de 1 mL, em PBS. A mistura
foi inoculada vinte e quatro horas após aplicação do protocolo terapêutico, no ponto
BaiHui. A temperatura retal foi medida antes da inoculação e 2 vezes durante vinte e
quatro horas após inoculação. Também foram observados efeitos como variação de
temperatura e ocorrência de taquipinéia, constipação, fezes mucosas, diarréia, letargia
e sonolência.
O monitoramento da temperatura retal se fez com o uso do termômetro durante
três minutos. Foi considerada resposta pirética aquela em que a temperatura variou em
1ºC ou mais, em relação ao tempo 0 (Boles et al., 2003a).
3.4 – Ensaio de neutralização do efeito diarréico de SEC recombinante com a partícula
viral quimérica CPMV-PT14
Antes da realização do ensaio, foram coletados de cada coelho, 500 µL de
sangue, que foram incubados por uma hora a 37ºC para coagulação. Em seguida, o
soro foi separado e testado para verificação da presença de anticorpos anti-SEC e anti-
CPMV. Tendo sido negativos por ELISA (item 3.2.1, capítulo I) para anticorpos IgG
anti-SEC e IgG anti-CPMV, os animais foram utilizados no experimento.
Protocolo terapêutico: 30 µg de SEC recombinante e 200 µg do vírus CPMV-PT14
(que equivalem a uma relação molecular proteína/peptídeo de aproximadamente 1:1)
foram misturados (volume final de 500 µL, em PBS) e administrados, pela via oral. Os
animais foram observados diariamente, durante sete dias, para verificação da
ocorrência de fezes com muco, pastosa ou diarréica (Arad et al., 2000; Shupp et al.,
2002; Kaempfer et al., 2002). Dois dias após inoculação, amostras de fezes foram
coletadas para detecção de partícula viral.
Protocolo não terapêutico: Sete dias após administração do protocolo terapêutico,
30 µg de SEC recombinante e 200 µg de CPMV selvagem misturados (num volume de
500 µL em PBS) foram administrados pela via oral. Os animais foram novamente
observados, durante sete dias, para verificação da ocorrência de fezes com muco,
pastosa ou diarréica.
3.4.1 – Detecção de partícula viral das fezes de coelhos
77
Amostras de fezes dos coelhos (três gibalas por 2 animais) foram coletadas dois
dias após administração do protocolo terapêutico e maceradas em 1-2 mL de tampão
fostafo (van Kammen, 1967). Após centrifugação, 12000 x g por dez minutos, o
sobrenadante foi utilizado para sensibilização das placas de poliestireno de 96 poços
para testes de ELISA.
3.4.2 – Detecção de partículas virais em soro de coelhos
Vinte e quatro horas antes do experimento foram coletados aproximadamente 500
µL de sangue de 4 coelhos, de aproximadamente 1 Kg. Dois coelhos foram
administrados com 200 µg de partícula selvagem em 500 µL de PBS, pela via oral.
Outros dois coelhos foram administrados com 200 µg de CPMV-PT14 em 500 µL de
PBS, pela via oral. Após administração das partículas, 300 a 1000 µL de sangue dos
coelhos foram coletados (da orelha com agulha 27G) a cada duas horas durante oito
horas. O sangue foi incubado por uma hora a 37ºC e posteriormente centrifugado para
obtenção do soro. Amostras diluídas dos soros foram analisadas por
espectrofotometria de varredura (Specord M500, Zeiss Germany), comprimentos de
onda variando entre 220 nm e 400 nm. Picos (denominados pico-identidade, daqui em
diante) nos comprimentos de onda 260 e 290 nm indicam a presença de partículas
virais (van Kammen, 1967). O soro coletado quatro horas após inoculação com CPMV-
PT14 foi também utilizado para infectar plantas de feijão-de-corda (Vigna unguiculata)
por abrasão manual e para imunodetecção.
3.4.3 – Verificação do potencial diarréico da SEC recombinante pela via oral
Dois coelhos foram administrados pela via oral com 30 µg de SEC recombinante
(com um lote comprovado causador de diarréia após administração pela via
subcutânea). Os animais foram observados durante três dias para verificação de
diarréia.
3.5 – Verificação do potencial diarréico da SEC nativa obtida do sobrenadante da cepa
B48
A cepa bubalina B48 de S. aureus, produtora de enterotoxina C e TSST-1, testada
por imunodifusão e Western blot, foi cultivada por dezoito horas a 37ºC, em meio BHI.
A dosagem aproximada de SEC no sobrenadante foi realizada por meio de SDS-PAGE
78
e imunodetecção, comparando visualmente as intensidades das bandas de uma curva
de diluição de SEC recombinante e da banda de igual peso molecular na raia
correspondente ao sobrenadante da cepa B48.
Três coelhos de aproximadamente 1Kg receberam, pela via subcutânea, 150 µL
de sobrenadante da cepa B48 contendo aproximadamente 8 µg de SEC nativa. Os
animais foram observados durante três dias para verificação de diarréia.
3.5.1 – Ensaio de neutralização do efeito diarréico de SEC nativa com a partícula viral
quimérica CPMV-PT14
Antes da realização do ensaio, foram coletados de cada coelho, 500 µL de
sangue, que foram incubados por uma hora a 37ºC para coagulação. Em seguida, o
soro foi separado e testado para verificação da presença de anticorpos contra SEC e
anti-CPMV. Tendo sido negativos por ELISA (item 3.2.1, capítulo I) para anticorpos IgG
anti-SEC e IgG anti-CPMV, os animais foram utilizados no experimento.
Protocolo terapêutico: 3 coelhos receberam, pela via subcutânea, 150 µL de
sobrenadante da cepa B48 cultivada em meio BHI misturado com 200 µg de CPMV-
PT14 (volume final de 500 µL). Os animais foram observados diariamente, durante sete
dias, para verificação de fezes com muco, pastosas ou líquidas.
Protocolo não terapêutico: 3 coelhos foram administrados, pela via subcutânea,
com uma mistura contendo 150 µL do mesmo lote de sobrenadante da cepa B48 e 200
µg de CPMV selvagem. Os animais foram observados diariamente, durante sete dias,
para verificação de fezes com muco, pastosas e diarréicas.
79
4 - Resultados
4.1 – Avaliação da resposta humoral de animais
4.1.1 – Após imunização com CPMV selvagem
Os soros pré-imune e imune (R20) foram testados contra CPMV. Houve
resposta humoral após administração da partícula no coelho e apenas o soro imune
apresentou sinal, com endpoint 1:12800 contra a partícula viral.
4.1.2 – Após imunização com peptídeos
Peptídeo MAP-KKKVTAQELD
O soro obtido na coleta do dia 45 (protocolo 1 de imunização) e seu pré-imune
foram testados por ELISA contra o peptídeo MAP-KKKVTAQELD. Não houve resposta
humoral para o coelho imunizado pela via subcutânea com 1 mg do peptídeo. O valor
da DO492nm para o título na menor diluição utilizada (1:100) foi igual ao valor obtido para
o controle negativo.
Os soros obtidos na coleta do dia 28 (protocolo 2 de imunização) e seus pré-
imunes foram testados por ELISA. Não houve resposta humoral contra o peptídeo
MAP-KKKVTAQELD para os coelhos imunizados no ponto BaiHui ou fora do ponto,
com 500 µg ou 1 mg de peptídeo. O valor da DO492nm para o título na menor diluição
utilizada (1:100) foi igual ao valor obtido para o controle negativo.
Peptídeo C-KKKVTAQELD
Os soros pré-imunes ou imunes, obtidos pela companhia Genemed Synthesis
Inc, São Francisco, EUA, foram testados contra o peptídeo C-KKKVTAQELD, SEC
recombinante e CPMV-PT14. Apenas o soro imune apresentou sinal, com endpoint
maior que 1:100000 contra o peptídeo C-KKKVTAQELD, 1:3200 contra SEC
recombinante e 1:50 contra CPMV-PT14.
O título dos soros anti-peptídeo de transcitose MAP-KKKVTAQELD negativo
para SEC recombinante e do soro anti-peptídeo C-KKKVTAQELD de 1:3200 para SEC
recombinante, foi considerado insuficiente para execução do, então planejado, desenho
experimental in vivo de neutralização dos efeitos diarréico e pirético de SEC
recombinante com soro anti-peptídeo de transcitose.
80
4.1.3 - Imunoprecipitação de partículas virais
Os baixos títulos do anticorpo anti-peptídeo de transcitose contra SEC e a
negatividade do mesmo anticorpo contra a partícula CPMV-PT14 sugerem que os
anticorpos presentes nestes soros reconhecem peptídeos na sua estrutura
tridimensional. Para avaliar essa possibilidade foi realizado o ensaio de
imunoprecipitação. Este teste visa a precipitação do complexo
partícula/anticorpo/proteína A Sepharose formado. Quando este complexo é submetido
a separação em SDS PAGE, as ligações formadas entre essas moléculas são desfeitas
e então é possível detectar as proteínas do capsídeo viral que ligarem ao anticorpo
anti-peptídeo.
Somente o anticorpo anti-CPMV se ligou a partícula CPMV-PT14, assim como a
CPMV selvagem (figura 23). Sendo assim, é possível concluir que o anticorpo anti-
peptídeo K152KKVTAQELD161de transcitose (Genemed Synthesis Inc, São Francisco,
EUA) não reconhece a partícula CPMV-PT14.
Figura 23: Membrana de nitrocelulose revelada com R20. Raias: M) marcador
Kaleidoskope (Bio-Rad); 1) CPMV selvagem (lote 1) + soro R20; 2) CPMV selvagem
(lote 1) + soro R18 (anti-SEC recombinante); 3) CPMV selvagem (lote 2) + R20; 4)
CPMV selvagem (lote 2) + R18; 5) CPMV-PT14 + R20; 6) CPMV-PT14 + pré-imune do
coelho imunizado com o peptídeo C-KKKVTAQELD (Genemed Synthesis); 7) CPMV-
PT14 + soro do coelho imunizado com o peptídeo C-KKKVTAQELD (Genemed
Synthesis).
81
4.2 – Neutralização do efeito pirético de SEC recombinante com IgG anti-SEC em
gatos
Após administração tanto do protocolo terapêutico quanto do protocolo não
terapêutico não foram observados eventos de vômitos ou diarréia nos gatos. Letargia e
sonolência também não foram visíveis.
Com relação à temperatura, ambos os protocolos testados induziram resposta
pirética. Para os gatos 1 e 2, no T3 com o protocolo terapêutico e, para o gato 3, no T3
com os protocolos terapêutico e não terapêutico (figura 24, A e B).
Figura 24: Variação de temperatura nos gatos submetidos aos protocolos A)
terapêutico e B) não terapêutico. T0 = temperatura antes da inoculação; T1-T3 =
de SEC recombinante por IgG anti-SEC em
ra a SEC recombinante para neutralizar este efeito
diarréico.
temperatura após 1, 2 e 3 horas, respectivamente.
4.3 – Neutralização do efeito diarréico
coelhos
Em experimentos preliminares verificou-se que 30 µg de SEC recombinante,
quando inoculados no ponto BaiHui, foram suficientes para causar diarréia em coelhos.
Foi utilizado um anticorpo cont
82
Vinte e quatro horas após administração do protocolo terapêutico, os coelhos
não foram acometidos com diarréia ou mesmo fezes contendo muco. Em contrapartida,
vinte horas após administração do protocolo não terapêutico, fezes contendo muco até
iarréia severa foram observadas, após um período de constipação.
Sonolência e taquipinéia não foram observadas em nenhuma das duas
condições testadas, porém letargia foi observada no caso dos animais submetidos ao
protocolo não terapêutico.
Os animais submetidos ao protocolo não terapêutico apresentaram falta de
apetite nas dezoito horas após inoculação, enquanto que após a administração do
protocolo terapêutico a alimentação foi habitual. O critério de avaliação foi a diferença
na quantidade de alimento consumido por cada grupo de dois animais no mesmo
período, nos dois tratamentos.
A temperatura dos coelhos também foi verificada (figura 25, A e B). Somente no
caso do protocolo não terapêutico ocorreu resposta pirética. O aumento da temperatura
ocorreu para os coelhos 2, 3 e 4 (protocolo não terapêutico) no tempo de 2 horas.
d
Figura 25: Variação de temperatura nos coelhos submetidos aos protocolos A)
terapêutico e B) não terapêutico. Apenas o protocolo não terapêutico induziu resposta
irética. p
83
84
para o protocolo não terapêutico foi
ou anticorpos anti-
sagem da SEC e consequentemente seus
foi verificado se a partícula viral administrada oralmente seria
detectada no soro ou ficaria retida nesse sítio.
4.4.2 – Investigação de partícula viral em soro de coelhos
Amostras de CPMV selvagem e CPMV-PT14, utilizadas como controles nesta
etapa, apresentaram um pico-identidade no comprimento de onda de 260 nm (Figura
26A). A análise do espectro de varredura dos soros dos animais administrados com
CPMV-PT14 também apresentou um pico-identidade no comprimento de onda de 260
nm, no tempo de coleta de quatro horas (Figura 26D e 3E). Entretanto, para os animais
administrados com CPMV selvagem não foi observado, em nenhum espectro, o pico-
identidade correspondentes à partícula viral (Figura 26B e 3C).
4.4 – Neutralização do efeito diarréico de SEC recombinante com partícula CPMV-
PT14, via oral
Nem para o protocolo terapêutico ou
observada ocorrência de diarréia, ao contrário, os animais apresentaram bem-estar e
fezes habituais.
Com o intuito de investigar a suspeita ocorrência de anticorpos anti-CPMV e
anti-SEC nos animais submetidos aos protocolos terapêutico e não terapêutico, isto é,
a exposição prévia à partícula viral, os respectivos soros pré-imunes foram testados por
ELISA. Nenhum dos soros foi positivo para anticorpos anti-CPMV
SEC.
4.4.1 – Investigação de partícula viral em fezes de coelhos
Não foi detectada partícula viral nas fezes, conforme monitorado por ELISA com
anticorpo anti-CPMV, o que sugeria que a partícula estivesse sendo absorvida pelo
epitélio intestinal do animal.
Além disso, não foi observado o quadro de intoxicação esperado após
administração de SEC recombinante em coelhos (no protocolo não terapêutico), o que
sugere que as partículas CPMV selvagem poderiam ser capazes de competir/bloquear
o sítio de transcitose, impedindo a pas
efeitos. Sendo assim,
Figura 26: Espectro de varredura. Partículas virais CPMV e CPMV-PT14 purificadas apresentando um pico-identidade em 260 nm
(A); soros de coelhos inoculados com CPMV selvagem (B e C), que não apresentaram o pico-identidade; e soros de coelhos
inoculados com CPMV-PT14 (D e E), onde é possível verificar um pico em 260 nm.
85
86
Figura 26: continuação.
Quando testados por imunodetecção, os soros dos coelhos administrados com
partículas virais não apresentaram reação positiva para as proteínas L e S do vírus
com o anticorpo anti-CPMV (figura 27).
Figura 27: Membrana de nitrocelulose incubada e revelada com o anti-CPMV. Raias: 1
e 2) controles positivos: ~ 6 µg de CPMV selvagem e CPMV-PT14 purificados,
respectivamente; 3) mistura do soro pré-imune dos coelhos 1 e 3; soro do coelho 1
após administração de partículas CPMV selvagem nos tempos: 4) 2 horas; 5) 4 horas;
6) 6 horas; soro do coelho 3 após administração de partículas CPMV-PT14 nos
tempos: 7) 2 horas; 8) 4 horas e 9) 6 horas.
As plantas de feijão-de-corda inoculadas com soro do coelho 3 (administrado
com CPMV-PT14) apresentaram leves sintomas de infecção. Para verificar a infecção
por CPMV, extratos foliares dessas plantas foram utilizados para inoculação em novas
plantas. Essas plantas apresentaram lesões cloróticas ou e formação de mosaico foliar
(figura 28), indicativa de infecção viral. Esses resultados corroboram os dados
observados por espectrofotometria.
87
Figura 28: Imagens de folhas de feijão-de-corda: A e B) não inoculadas e C e D)
infectadas com partículas presentes no extrato bruto das plantas diretamente
inoculadas com o soro de coelho 3, coletado 4 horas após administração de CPMV-
PT14.
Resumindo, embora CPMV selvagem ou CPMV-PT14 não tenham sido
, CPMV-PT14 foi
dete
sido detectada partícula viral no soro de um
coelho por espectrofotometria e ainda, o soro do animal administrado com CPMV-PT14
detectadas por imunodetecção em membrana de nitrocelulose
ctada no soro, por espectrofotometria. Além disso, partículas presentes nas plantas
inoculadas com o soro do coelho 3 foram capazes de infectar novas plantas. Esses
resultados sugerem que a partícula é eficientemente transcitada através do epitélio
intestinal quando administrada pela via oral.
4.4.3 – Verificação do potencial diarréico da SEC recombinante após administração
oral
Visto que a administração de SEC na presença de CPMV selvagem, via oral, não
resultou em quadro diarréico, além de ter
88
ter infectado feijão-de-corda, suspeitou-se de que a SEC recombinante utilizada no
ensaio não estivesse sendo tóxica. Sendo assim, foi necessário verificar a toxicidade
da concentração de SEC recombinante utilizada no ensaio. Foi observado que 30 µg
de SEC inoculados pela via oral não foram suficientes para causar diarréia nos
coelhos.
4.5 – Neutralização de SEC nativa com partícula viral CPMV-PT14
Este experimento teve como objetivo verificar se a partícula viral inoculada pela
binante e do sobrenadante da cepa B48, em membrana de nitrocelulose revelada
om soro anti-SEC recombinante, diluído 1:8000. Por comparação visual, foi
cons
via subcutânea juntamente com as SEs nativas presentes no sobrenadante da cultura
B48 é capaz de neutralizar/diminuir o efeito tóxico causado pela SEC. Para isso, foi
necessário quantificar, previamente, SEC presente no sobrenadante.
A figura 29 mostra o perfil eletroforético de diferentes concentrações de SEC
recom
c
iderado que o volume aplicado no gel do sobrenadante em questão possuía
aproximadamente 400 ng de SEC nativa.
Figura 29: Dosagem de SEC nativa secretada in vivo por S. aureus cepa B48.
Membrana de nitrocelulose incubada e revelada com soro anti-SEC recombinante.
Raias: M) marcador Kaleidoskope (Bio-Rad); 1-5) 4,5; 2,25; 0,9; 0,45; 0,09 �g de SEC
recombinante, respectivamente, 6) sobrenadante da cepa estafilocócica B48, 7) meio
BHI.
Previamente à execução dos protocolos terapêutico e não terapêutico foi
observado que 150 µL de sobrenadante da cepa B48 (contendo 8 µg de SEC nativa)
89
foram suficientes para causar diarréia nos animais vinte e quatro horas após
oculação. A normalização das fezes ocorreu em três dias.
O
in
s animais submetidos ao protocolo terapêutico não foram acometidos pelo
quadro de diarréia, durante os sete dias de observação. Ao contrário, episódios de
diarréia foram observados nos animais administração com protocolo não terapêutico, a
partir do segundo dia, durante 4 dias. Nos dois grupos, foi visto de uma a três fezes
amolecidas, mas não diarréica.
90
5 – Discussão
Além de causarem intoxicações alimentares, as SEs são proteínas classificadas
como superantígenos e por isso induzem a ativação do sistema imunológico de forma
não específica (Dinges et al., 2000; Phillips, 2002), levando indivíduos acometidos ao
al., 2000), gatos (Martin e Marcus, 1964),
ntínua de um
quadro de choque tóxico. O quadro clínico de choque tóxico se caracteriza por febre
acima de 38,9ºC, descamação da pele, hipotensão, e alterações dos sistemas
gastrointestinal, muscular, mucoso, renal, hepático, hematológico e nervoso central
(Monday e Bohach, 1999).
A ativação do sistema imune por SEs envolve a ligação não específica do
superantígeno às moléculas de MHC II nas APCs e os TCRs das células T. As
interações entre essas moléculas resultam na ativação de até 25% dos linfócitos T
(Kappler et al., 1994) e conseqüente excesso na produção de citocinas
proinflamatórias. Algumas dessas citocinas são responsáveis pela elevação da
temperatura não apenas em humanos, mas também em animais, fato que leva os
pesquisadores a utilizá-los como modelos de estudo (Martin e Marcus, 1964, Scheuber
et al., 1983, Huang et al., 1997, Wright et al., 2000, Kum e Chow, 2001, Boles et al.,
2003b).
Vários modelos animais têm sido utilizados nos ensaios biológicos que envolvem
SEs: camundongos (Kum e Chow, 2001), cobaias (Scheuber et al., 1983), coelhos
(Huang et al., 1997), furão (Wright et
macacos (Boles et al., 2003b). No presente trabalho foram utilizados dois modelos de
experimentação, gatos e coelhos. Vale ressaltar que os animais foram devidamente
cuidados conforme os princípios éticos estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA) e a Lei número 390 (2002), que institui o Código
Estadual de Proteção aos Animais e sob o conhecimento e supervisão co
veterinário. Ainda, o desenho experimental permitiu utilizar um número reduzido de
animais, devido às dificuldades em se trabalhar com animais maiores, que necessitam
de uma estrutura mais elaborada. Isso tornou o experimento menos dispendioso. O
desenho dos protocolos de experimentação também considerou gatos e coelhos como
animais de estimação e assim sensibilizam o experimentador.
Os gatos foram utilizados para verificação da resposta pirética após
administração intraperitoneal de SEC nativa, na presença ou ausência de anti-SEC
recombinante. Nestes animais, febre é melhor indicativo de intoxicação do que a
91
êmese (Clark e Page, 1968) e um aumento de 1,2ºC na temperatura já é definida como
resposta pirética (Martin e Marcus, 1964). Embora os gatos sejam mais sensíveis em
relação a temperatura, não são em relação a enterotoxina do tipo C. Para causar
êmese nesses animais é necessário que a concentração de SEC seja 50 vezes maior
to de realizar o protocolo terapêutico. Dessas análises, não é possível concluir
). Entretanto, contrária a situação em humanos, gatos e cães, a
diarréi
hrt, 2004). A diarréia em coelhos é definida como o aumento
que a de SEA ou SEB (Su e Wong, 1997).
Em ambos os protocolos de experimentação utilizados neste trabalho, com o
objetivo de verificar o potencial antipirético de anti-SEC recombinante, houve resposta
pirética. Analisando-se a variação de T3 a T0, verifica-se que diferença de temperatura
foi mais significativa após administração do protocolo terapêutico. Também é possível
verificar que, ao realizar o protocolo não terapêutico, a temperatura inicial dos animais
se encontrava maior do que aquela observada no momento de realizar o protocolo
terapêutico. Isso sugere que, ao realizar protocolo não terapêutico, os animais ainda
estavam sob o efeito pirético do teste terapêutico. Sendo assim, se o intervalo utilizado
para realização dos dois ensaios tivesse sido maior, provavelmente a temperatura
inicial no momento de realizar o protocolo não terapêutico teria sido menor e talvez
essa variação de temperatura tivesse um resultado maior ou igual àquela observada no
momen
sobre o potencial antipirético do anticorpo anti-SEC recombinante, em gatos. Edwin et
al. (1986), realizaram um experimento semelhante utilizando SEA, no mesmo intervalo
de tempo, entretanto, a atividade biológica analisada foi êmese, aproximadamente
trinta minutos após inoculação da toxina.
O quadro febril observado após administração do protocolo terapêutico pode ser
justificado pelo fato de o anticorpo utilizado, produzido contra a SEC recombinante, não
estar interagindo com a SEC na forma nativa. Dessa forma, o anticorpo não neutralizou
o efeito da toxina. A falha do protocolo terapêutico ocorreu mesmo confirmada a
reatividade do anticorpo conta SEC nativa em imunodeteção (Uhl, 2004).
Os coelhos foram utilizados para verificação do efeito diarréico e pirético, após
administração dos protocolos terapêutico e não terapêutico. Estes animais são
extremamente sensíveis à família das SEs e os efeitos cardiovasculares e
imunológicos são similares àqueles observados em choque séptico em humanos
(Ilbäck et al., 2003
a em coelhos é causada pelo decréscimo da motilidade intestinal, o que resulta
em constipação (Brown, 2001), e pode ser causada por vários fatores, incluindo
ingestão de toxinas (Steino
92
da quantidade de água nos gibalas fecais com ou sem o aumento na freqüência ou
volume dos movimentos do intestino e é sinal de uma condição muito séria e
frequentemente fatal (Brown, 2001), porém, não deve ser confundida com as fezes
noturnas (cecotropos), produzidas e ingeridas por esses animais (Steinohrt, 2004).
Em coelhos, após administração do protocolo terapêutico, não foram observados
nenhum dos sintomas sugestivos de intoxicação. Em contraste, menos de vinte e
quatro horas após a administração do protocolo não terapêutico, utilizando anticorpo
pré-imune, foram observados os quadros de falta de apetite, letargia, desconforto
contra doenças (Casadevall,
2002).
Page, 1968; Huang et al. 1997; Boles et al., 2003a; Ilbäck et al., 2003;). No presente
trabalho, medições retais da forma mais simples foram realizadas por vários motivos: 1)
a primeira intenção dos experimentos foi verificar se os protocolos terapêutico e não
terapêutico causariam ou não diarréia, a variação de temperatura seria uma informação
adicional; 2) evitar maior sofrimento dos animais e; 3) impossibilidade de realização das
cirurgias no centro de pesquisa. Assim, além da variação intrínseca para cada
indivíduo, variações importantes poderiam ter ocorrido, as quais as medições não
contínuas e com menor rigor não tenham detectado, o que resultaria numa diferença
mais significativa.
A forma de monitoramento de temperatura deve ser reavaliada, principalmente
em gatos, e realizada em menores intervalos de tempo, o que garante análises mais
acuradas dos resultados.
abdominal e mudança na consistência das fezes (fezes mucosas ou diarréia severa).
Ainda, duas horas após aplicação do protocolo não terapêutico, houve resposta
pirética. Estes resultados sugerem que, em coelhos, a terapia utilizando anti-SEC
recombinante é eficaz. Os resultados sugerem que o anticorpo anti-SEC recombinante
oferece proteção como agente profilático ou terápico contra doses diarréicas de SEC,
em coelhos. Essas análises podem ser expandidas para outros modelos, como
primatas, para validação, uma vez que a administração passiva de anticorpos
apresenta como uma das vantagens a imunidade imediata
A maioria dos ensaios em que se monitora a variação de temperatura como
resposta pirética, as medições de temperatura são realizadas pela implantação
cirúrgica de um termômetro no espaço retro-peritoneal do animal. O aparelho
permanece nos animais por um período de seis horas até três semanas e os dados são
transferidos para um banco de dados para análise (Martin e Marcus, 1964; Clark e
93
Outras vantagens da aplicação de anticorpos como defesa incluem a
possibilidade de administração oral para alguns agentes gastrintestinais, sua
administração requerer apenas uma inoculação, sua preparação ser gerada de forma
mais rápida do que novos agentes biológicos possam ser desenvolvidos, sua produção
oder incluir técnicas avançadas de expressão (hibridomas, sistemas bacterianos,
fagos), seu desenvolvimento reduzir a atratividade da produção de armas biológicas e
os anti oderem ser h tilizados em conjunto a outros terápicos
(Casadevall, 2002).
Contudo, algumas desvantagens dessa abordagem são o alto custo, a
necessidade do diagnóstico específico antes do uso e a possibilidade de se tornar
obsolet sa da variaç s agentes bio asadevall, 2002).
Foi pensando neste problema que o peptídeo de transcitose, região altamente
conserv esponsável pela epitelial das S p et al., 2002), foi
testado imunógeno. O p scitose é altamente conservado, inclusive
nas diferentes SEs e na TSST-1 (tabela 16). Assim, os anticorpos produzidos contra
essa se poderiam ser tes in vivo.
Nenhum dos animais imunizados com o peptídeo MAP-KKKVTAQELD produziu
IgG anti-peptídeo. Nem a via, nem a concentração, nem o carreador utilizados fizeram
com qu sta fosse ob a que nem as s do peptídeo ou
da imu oram eficientes para estabelecer uma
spos imunogênica. Este resultado, embora, em princípo, desanimador, torna a
seqüê
p
corpos p umanizados e u
o por cau ão antigênica do lógicos (C
ada r passagem trans Es (Shup
como eptídeo de tran
qüência utilizados em tes
e a respo tida. Isso signific condiçõe
nização ou a própria seqüência peptídica f
re ta
ncia de transcitose alvo terapêutico importante, devido a baixa imunogenicidade.
94
Tabela 16: Homologia entre as seqüências responsáveis pela transcitose de
enterotoxinas estafilocócicas, toxina da síndrome do choque tóxico e enterotoxinas
estreptocócicas. Os aminoácidos destacados em vermelho são aqueles diferentes dos
apresentados para a seqüência de transcitose de SEB.
Toxina Seqüência GenBank #
SEB KKKVTAQELD P01552
SEA KKNVTVQELD P13163
SEC-1 KKSVTAQELD P01553
SEC-2 KKSVTAQELD P34071
SEC-3 KKSVTAQELD P23313
SED KKNVTVQELD P20723
SEE KKEVTVQELD P12993
SEG KNMVTIQELD O85382
TSST-1 KKQLAISTLD P06886
SPE* A KKMVTAQELD P08095
SPE* C KDIVTFQEID P13380
SPE* H KPKVTAQEVD Q9X5C8
SPE* G KKQFTLQEFD Q9X5C7
*SPE: streptococcal pyrogenic enterotoxin
O carreador MAP utilizado não é imunogênico (Tam, 1988), mesmo quando
expondo oito vezes o peptídeo K152KKVTAQELD161. Tal carreador apenas funciona
como adjuvante, para peptídeos que já sejam antigênicos (Chai et al., 1992), caso
contrário da seqüência de transcitose. Desta forma, a antigenicidade do peptídeo em
questão não é obtida quando acoplado a MAP, quando coelhos são imunizados por via
subcut
de SEA utilizando anticorpo anti-peptídeo,
que po
ânea ou intraperitoneal com 0,5 ou 1 mg de peptídeo.
O soro de coelhos imunizados com o peptídeo C-KKKVTAQELD, produzido pela
Genemed Synthesis Inc, São Francisco, EUA, foi o que apresentou bom título
(1:100000). Este foi testado contra SEC recombinante, porém, a resposta obtida com
título de 1:3200, não compensava realização dos ensaios in vivo. Hu et al. (2001),
realizaram experimentos de neutralização
ssuía título acima de 1:20000 para a proteína. Devido aos baixos títulos de anti-
95
peptídeo de transcitose contra SEC recombinante não foi possível avaliar seu potencial
terapêutico em ensaios in vivo.
Em nenhum dos dois protocolos testados utilizando SEC recombinante e CPMV-
PT14, foi observado o quadro clínico de diarréia esperado. Inicialmente, acreditava-se
que o CPMV-PT14 ficaria retido no sítio de transcitose, impedindo a transferência da
toxina para a corrente sanguínea. Entretanto, após o monitoramento da detecção de
partícu
élio animal para a
corren
animal.
las virais no soro foi possível verificar que a partícula é transcitada para a
corrente sanguínea quatro horas após sua administração oral. Pelo fato de CPMV
selvagem não ter sido detectada no soro até oito horas após administração oral,
inferindo-se que a passagem de CPMV-PT14 foi favorecida pela presença do peptídeo
de transcitose apresentado na sua superfície da partícula viral. A detecção de partícula
CPMV-PT14 no soro através de espectrofotometria e a infecção de plantas por extrato
de folhas de feijão-de-corda inoculadas com o soro de animal administrado com CPMV-
PT14 são resultados que indicam que o vírus foi transcitado do epit
te sanguínea.
Este resultado possibilita a utilização de CPMV-PT14, ou outra partícula
expressando um peptídeo de sinalização específico, associado a fármacos com o
objetivo de dirigir tais moléculas a sítios específicos no organismo
Os soros que testaram positivos para CPMV-PT14 por espectrofotometria
também testaram positivo no bioensaio de infecção de feijão-de-corda. Após
inoculação do soro do animal administrado com CPMV-PT14, as folhas apresentaram
um leve sintoma de infecção, que foi intensificado após inoculação de extrato foliar
desta planta em novas folhas. O leve sintoma observado pode ser justificado pela baixa
concentração de partícula no soro e está associado ao resultado obtido para a
imunodetecção. A baixa concentração de partícula viral ou a falta de sensibilidade do
método inviabilizaram a detecção por Western blot.
O não aparecimento de CPMV selvagem no soro dos animais não significa que
estas moléculas não estejam sendo transferidas para outros tecidos. Neste trabalho só
foi analisado o sangue, porém, Rae et al., (2005), detectaram RNA de CPMV selvagem
distribuído no baço, nos rins, no fígado, nos pulmões, no cérebro, na medula óssea, no
estômago, no duodeno, no jejuno e no íleo, por meio de RT-PCR, num período de três
dias após inoculação oral ou intravenosa.
A quantidade de SEC recombinante necessária para causar diarréia em coelhos
pela via subcutânea é insuficiente para causar diarréia pela via oral. Schlievert et al.,
96
(2000), observaram que diferentes concentrações de superantígenos, que foram letais
para os animais quando inoculados pela via intravenosa, não mataram os animais
quando inoculados pela via oral. Dessa forma, verifica-se que a via oral e a
concentração de SEC utilizadas na administração do protocolo terapêutico utilizando
partícula viral não foram satisfatórias para concluir sobre o potencial terapêutico do
CPMV-PT14.
Depois de confirmar que a rota e a quantidade de enterotoxina inoculadas não
foram suficientes para causar os sintomas de intoxicação e, ainda, que CPMV-PT14
não fica retida no sítio de transcitose, foi possível realizar o experimento de
neutralização pela administração de SEC nativa por outra via. A SEC nativa, presente
no sobrenadante da cepa estafilocócica B48, causou diarréia quando administrada pela
via su
te) e impedindo a passagem de SEC, o
que su
ia à temperatura, e suporta as
de ter sido devido a uma clivagem proteolítica que
ocorre entre os dois últimos resíduos da seqüência inserida. Não é sempre que ocorre,
mas esta clivagem pode ter resultado na liberação do epítopo de transcitose da
superfície do vírus (MClain et al., 1995; Lin et al., 1996), impedindo a detecção deste
bcutânea. O tratamento com CPMV-PT14 preveniu o quadro diarréico induzido
por SEC nativa, indicando que a partícula funcionou como terapêutico pela inibição da
toxicidade, provavelmente antes do contato com o epitélio intestinal.
A inferência é que as partículas tenham competido com as SEs pelo mesmo sítio
de transcitose e, ainda, que elas tenham alcançado esse sítio de forma mais rápida que
as SEs, ocupando-o (porém, temporariamen
gere que a partícula possa estar agindo como antagonista.
O fato das SEs serem resistentes a inativação pelas enzimas gastrintestinais e
ao calor indica que a vida média das SEs seja longa (Balaban e Rasooly, 2000). O
período de permanência no lúmen intestinal pode ser igual ou maior do que a da
partícula viral, que também apresenta resistênc
condições gastrintestinais (Cañizares et al., 2005; Rae et al., 2005). Por estes motivos,
associados à não ocorrência de diarréia, após administração de CPMV-PT14, sugere-
se que as partículas possuam alta afinidade pelo receptor ou ainda que a reposição do
receptor não seja rápida o suficiente para permitir a transcitose do superantígeno.
Tendo visto que o anticorpo anti-peptídeo de transcitose não reagiu com CPMV-
PT14, pelos testes de ELISA, e acreditando que essa reação poderia ocorrer pela
conformação tridimensional, testamos a interação dessas moléculas por
imunoprecipitação. Mesmo por este método, não ocorreu reconhecimento de CPMV-
PT14 pelo anticorpo. O ocorrido po
97
pelo anticorpo anti-peptídeo de transcitose. Isso significa que, o anticorpo analisado
ode não ter interagido com o peptídeo pelo fato deste ter se perdido da partícula após
a apenas pela
região
cção de plantas com o imunocomplexo
itelial da seqüência em questão. Se houvesse dificuldade de
o no bloqueio da
partícu
SEC n
001; Kaempfer et al.,
realizado também de forma rápida.
p
adição do tampão desnaturante e não pelo fato deste não interagir com a molécula.
Desta forma, mesmo que tenha havido interação, as interações iriam se desfazer,
dificultando ou mesmo impedindo a detecção da partícula (posteriormente através de
Western blot), que estaria formando complexo através de uma ligação não-covalente
com uma sequência curta de aminoácidos, provavelmente ancorad
amino-terminal, que na presença de desnaturante, se desestrutura liberando tal
fragmento. Com tais problemas, suponho que outros métodos de detecção poderiam
ter sido utilizados como o ELISA sanduíche, infe
ou ainda microscopia eletrônica.
Embora a seqüência de transcitose esteja expressa na superfície da partícula
viral, o acesso do anticorpo ao peptídeo pode ter sido dificultado pela estrutura
complexa da partícula. Entretanto, essa possibilidade pode ser descartada, quando se
pensa no receptor ep
acesso do anticorpo à partícula, provavelmente também haveria dificuldade no
reconhecimento da seqüência pelo receptor.
O desejo e a insistência em verificar o reconhecimento da partícula pelo
anticorpo anti-peptídeo de transcitose está no fato de que sua utilizaçã
la CPMV-PT14 concomitante à repetição do experimento de neutralização de
ativa por CPMV-PT14 validaria a possibilidade de utilização de partícula viral
como terapêutico para doenças causadas por SEs.
Vários trabalhos demonstram a atividade antagônica de peptídeos contra
superantígenos (Arad et al., 2000 e 2001; Visvanathan et al., 2
2002), entretanto, não é de conhecimento deste grupo que partículas virais
expressando peptídeos tenham sido testadas e tenham funcionado com essa função.
Aliada a eficácia dos peptídeos como antagonistas está a facilidade de obtenção e
baixo custo de produção de partículas expressando peptídeos. Esses fatores permitem
sua preciosa avaliação no tratamento rápido e em larga escala de doenças causadas
por superantígenos, assim como, para outras doenças, desde que o diagnóstico seja
98
6 – Conclusões
O protocolo terapêutico contra SEC recombinante baseado em IgG anti-SEC foi
ficaz em coelhos, prevenindo a diarréia e o efeito pirético, resultados que foram
bservados nos animais submetidos ao protocolo não terapêutico. Este fato possibilita
a utilização do anticorpo na vacinação passiva contra doenças causadas por
enterotoxinas, após expansão do protocolo a outros modelos animais.
Os resultados obtidos após a administração do mesmo protocolo terapêutico não
foi conclusivo em gatos, uma vez que o efe o pirético foi observado na presença de
IgG pré-imune e na presença de IgG anti-SEC.
O peptídeo K152KKVTAQELD161 foi imunogênico em coelhos quando alterado
com o resíduo de cisteína na região amino-te minal. Esses anticorpos reconheceram a
SEC recombinante, porém com baixos títulos, e não reconhecem as partículas virais
quiméricas. Tais fatos impossibilitaram a avaliação de IgG anti-peptídeo de transcitose
como imunoterápico.
Partículas virais qu ptídeo de transcitose
foram transcitadas para a corrente sanguínea, quando administradas pela via oral em
coelhos. Soros desses animais apresentaram pico-identidade a 260 nm,
correspondente a partícula viral, duas horas após sua administração.
As partículas virais detectadas em soro foram infecciosas em plantas repórteres.
Vírus presentes no soro de animal administrado com partícula viral quimérica
foram capazes de infectar plantas de feijão-de-corda e foram detectados na corrente
sanguínea. Esses resultados abrem a possibilidade de utilização de CPMV-PT14
acoplado a fármacos para direcionamento a tecidos específicos.
CPMV-PT14 funcionou como terapêutico no tratamento de diarréia causada pela
SEC nativa. A administração intraperitoneal concomitante da partícula com a toxina
inibiu a diarréia em coelhos, indicando que a partícula funciona como antagonista. Os
dados sugerem a possibilidade de utilização de CPMV acoplado a peptídeos
específicos contra doenças como antagonistas que, em superfície de partículas virais,
possuem baixo custo de produção, não são tóxicas e ainda são eficazes.
e
o
it
r
iméricas expressando na superfície o pe
99
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o
115
116
Anexos
Quadro 1: Resultados da detecção de SEA pelos testes de ELISA, Western blot (WB) e Imunodifusão (ID) nos sobrenadantes, fervidos ou não
durante três minutos, de cepas estafil cam que as amostras são positivas e
ne i te. FP amostras ti ela téc e ELIS ISA écn LISA,
FP tras f iva de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB, FP-ID: amostras falso-positivas pela
D, FN-ID: am stras falso-n tivas pela té nica de ID.
ecção da seqüência sea u de SEA utilizando soro anti-
ocócicas, comparados à técnica padrão ouro (PCR). Os sinais + e - indi
gativas, respect
-WB: amos
vamen -ELISA: falso-posi vas p nica d A, FN-EL : amostras falso-negativas pela t ica de E
also-posit s pela técnica
técnica de I o ega c
Det o SEA padrão
Sobrenadante das cepas (Padrão
ELI(fervidos/não
FP-ELISA FN-ELISA WB FN-WB ID FP-ID FN-ID PCR
ouro)
SA
fervido)
FP-WB
B35 - - - - - - - + + - -/
B315 + - - + - - + - - -/ +
B78 - - - - - - + + - -/ -
B47 - - - - - - - - - -/ -
B34 - - - - - - - - - - -/
B352 - - - - - - - - - - -/
B77 - - - - - - - - - - -/
B243 - - - - - - - - - -/ -
B260 - - - - - - - - - - -/
B361 - - - - - - - - - - -/
B327 - - - - - - - + + - -/
B194 - - + - - - - - - - +/
B112 - - - - - - - - - - -/
B196 - - - - - - - - - - -/
117
Continuação do quadro 1 Detecção da seqüência sea ou de SEA utilizando soro anti-SEA padrão
Sobrenadante das cepas
PCR (Padrão ouro)
ELISA (fervidos/não fervido)
FP-ELISA FN-ELISA
WB FP-WB FN-WB ID FP-ID FN-ID
B326 - -/- - - - - - - - -
B10 - -/- - - - - - - - -
B193-2 - -/- - - - - - - - -
B295 + - - - - - - - - +/-
B102 - -/- - - - - - - - -
B44 - -/- - - - - - - - -
B48 - /- + - + + - - - - +
B6 -/- - + - - + + - - +
B5 - -/- - - - - - + + -
B117 - -/- - - - - - - - -
B188 -/- - - - - - - - - -
B118 + -/- - + - - + + - -
B221 - -/- - - - - - - - -
B193-1 - -/- - - - - - - - -
B195 - /- - - - - - - - - -
B316 - -/- - - - - - + + -
B184 - -/- - - - - - + + -
B85 - -/- - - - - - + + -
LSA88 - -/- - - - - - - - -
118
Quadro 2: Resultados da detecção de SEC pelos testes de ELISA, Western blot (WB) e Imunodifusão (ID) nos sobrenadantes, fervidos ou não
durante três minutos, de cepas est dicam que as amostras são positivas e
ecti te. F : amo o a de E -EL stras falso-ne ELISA,
ostras f i ica de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB, FP-ID: amostras falso-positivas pela
a de ID, FN-ID: a ostras falso-negativas pela técnica
tecção da seqüência se ou de SEC utilizando soro anti-
afilocócicas, comparados à técnica padrão ouro (PCR). Os sinais + e - in
negativas, resp vamen P-ELISA stras falso-p sitivas pela técnic LISA, FN ISA: amo gativas pela técnica de
FP-WB: am also-posit vas pela técn
técnic m de ID.
De c SEC padrão
Sobrenadante das cepas
PCR (Padrão ouro)
ELIS(fervidos/
FP-ELISA FN-ELISA WB ID FN-ID A
não fervido)
FP-WB FN-WB FP-ID
B35 - -/- - - - - - - - -
B315 - -/- - - - - - - - -
B78 - -/+ + - - - - - - -
B47 + +/- - - - - + + - -
B34 - -/- - - - - - - - -
B352 - -/- - - - - - - - -
B77 + -/- - + - - + - - +
B243 - -/- - - - - - - - -
B260 - -/- - - - - - - - -
B361 - -/- - - - - - - - -
B327 - +/- + - - - - - - -
B194 - -/- - - - - - + + -
B112 - -/- - - - - - - - -
B196 - -/- - - - - - - - -
119
Continuação do quadro 2 Detecção da seqüência sec ou de SEC utilizando soro anti-SEC padrão
Sobrenadante das cepas
PCR (Padrão ouro)
ELISA (fervidos/ não fervido)
FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB ID FP-ID FN-ID
B326 - -/- - - - - - - - -
B10 - -/- - - - - - - - -
B193-2 - - - - - - - -/+ + -
B295 - -/- - - - - - - - -
B102 - -/+ + - - - - + + -
B44 + -/- - + - - + + - -
B48 + -/- - + + - - + - -
B6 + -/- - + - - + + - -
B5 + -/+ - - - - + + - -
B117 - -/- - - - - - + + -
B188 + -/- - + + - - + - -
B118 + -/- - + - - + - - +
B221 - +/- + - - - - + + -
B193-1 + -/- - + - - + + - -
B195 + -/- - + - - + + - -
B316 + +/- - - - - + - - +
B184 + -/- - + - - + + - -
B85 - +/+ + - - - - + + -
LSA88 + -/- - + - - + + - -
120
Quadro 3: Resultados da detecção de SED pelos testes de ELISA, Western blot (WB) e Imunodifusão (ID) nos sobrenadantes, fervidos ou não
durante três minutos, de cepas est ndicam que as amostras são positivas e
ecti te. F : amo p a ca de E -EL ostras falso-ne ELISA,
ostras f i ni de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB, FP-ID: amostras falso-positivas pela
a de ID, FN-ID: a ostras falso-negativas pela técnica
ecção da seqüência ou de SED utilizando soro anti-
afilocócicas, comparados à técnica padrão ouro (PCR). Os sinais + e - i
negativas, resp vamen P-ELISA stras falso- ositivas pel técni LISA, FN ISA: am gativas pela técnica de
FP-WB: am also-posit vas pela téc ca
técnic m de ID.
Det sed SED padrão
Sobrenadante das cepas
PC(Padrão ouro)
ELIS(fervidos/
FN- ISA WB ID FN-ID R A
não fervido)
FP-ELISA EL FP-WB FN-WB FP-ID
B35 - -/- - - - - - - - -
B315 - +/- + - - - - - - -
B78 - -/- - - - - - - - -
B47 - -/- - - - - - - - -
B34 - +/- + - - - - + + -
B352 - +/- + - - - - + + -
B77 - -/- - - + + - + + -
B243 - +/- + - + + - + + -
B260 - -/- - - - - - + + -
B361 - +/- + - - - - + + -
B327 + +/+ - - - - + - - +
B194 - +/- + - - - - - - -
B112 - -/- - - - - - + + -
B196 - -/- - - - - - + + -
121
Continuação do quadro 3 Detecção da seqüência sed ou de SED utilizando soro anti-SED padrão
Sobrenadante das cepas
PCR (Padrão ouro)
ELISA (fervidos/ não fervido)
FP-ELISA
FN-ELISA WB FP-WB FN-WB ID FP-ID FN-ID
B326 - -/- - - - - - + + -
B10 - +/- + - - - - + + -
B193-2 - -/- - - - - - + + -
B295 - +/- + - - - - + + -
B102 + --/ - + - - + + - -
B44 - - - - - - -/ - - - -
B48 - - + - - - - - - +/ -
B6 + - + - +/ - - - - + -
B5 - - + - - - - - - +/ -
B117 - - + - - - - - - +/ -
B188 - - + - - - - - - +/ -
B118 - - + - - - - - - +/ -
B221 - + + - - +/ - - + + -
B193-1 - - + - - +/ - - + + -
B195 - - - + + - + + -/- -
B316 - + - - +/- - - + + -
B184 - - + - - - - - - +/ -
B85 + - - +/ - - - - - + -
LSA88 + +/- - - + - + + - -
122
Quadro 4: Resultados da detecção de SEC pelos testes de ELISA, Western blot (WB), Imunodifusão (ID) e Aglutinação em Látex (AL) nos
sobrenadantes, fervidos ou não d CR). Os sinais + e - indicam
s ositiv gativas pectiv nte. F SA: f tivas pela técnica de ELISA, FN-ELISA: a fa
ela té E : sitivas pela técnica de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB, FP-
ostras falso-po ivas pela t ica de ID N-ID: amostras falso-negativas pela técnica de I
tecção da eqüênci sec ou d SE o soro R18 (anti-SEC rec binante
urante três minutos, de cepas estafilocócicas, comparados à técnica padrão ouro (P
que as amostra são p as e ne
LISA, FP-
, res
amos
ame
tras falso-po
P-ELI amostras also-posi mostras lso-
negativas p cnica de WB
ID: am sit écn , F D. De s a e C utilizand om )
Sobrenadante das cepas
PC(Padrão ouro)
ELIS(fervidos/
FP-ELISA
FN-ELISA
WB FP-WB FN-WB FP-ID FN-ID R A
não fervido)
ID AL FP-AL FN-AL
B35 - -/- - - - - - - - - NT NT NT
B315 - -/- - - + + - - - - NT NT NT
B78 NT - -/- - - - - - + + - NT NT
B47 + -/+ - - - - + - - + NT NT NT
B34 - -/- - - + + - - - - NT NT NT
B352 - -/- - - - - - + + - NT NT NT
B77 + -/- - + - - + - - + - - +
B243 - -/+ + - - - - - - - NT NT NT
B260 - -/- - - - - - - - - NT NT NT
B361 - -/- - - - - - - - - NT NT NT
B327 NT - -/+ + - - - - + + - NT NT
B194 - +/+ + - - - - + + - NT NT NT
B112 - -/- - - - - - + + - NT NT NT
B196 - -/- - - - - - - - - NT NT NT
123
Continuação do quadro 4 Detecção da seqüência sec ou de SEC utilizando soro R18 (anti-SEC recombinante)
Sobrenadante das cepas
PCR (Padrão ouro)
ELISA (fervidos/ não fervido)
FP-ELISA
FN-ELISA
WB FP-WB FN-WB ID FP-ID FN-ID AL FP-AL FN-AL
B326 - -/- - - - - - + + - NT NT NT
B10 - -/- - - - - - - - - - - -
B193-2 - -/- - - - NT NT - - - - - NT
B295 - -/- - - - - + - NT NT NT - +
B102 -/- - - - - - - - NT NT NT - -
B44 -/- + - - + - - + NT NT NT + -
B48 -/- - + + - - + - - + - + -
B6 -/- + - - + - - + NT NT NT + -
B5 +/- - + - - - - + NT NT NT + -
B117 +/- - - - - + - NT NT NT - + +
B188 -/- + + - - - + + - - + - -
B118 -/- + - - + - - + NT NT NT + -
B221 -/- - - - - - + - NT NT NT - +
B193-1 -/- + - - + - - + NT NT NT + -
B195 -/- + - - + - - + + - - + -
B316 +/- - - - + - - + NT NT NT + -
B184 -/- + + - - - - + NT NT NT + -
B85 - +/- + - + + - - - - NT NT NT
LSA88 + -/- - + - - + + - - + - -
124
Quadro 5: : Resultados da detecção de SEA pel nadantes, fervidos ou não durante três minutos,
lo cas, comparad dr unodif Os si + e - indicam que as amostras são positivas e
respectivamente. FP-EL tras falso-positivas pela técnica de ELISA, FN-ELISA: amostras falso-negativas pela técnica de
FP-WB: amostras f so-positivas pela cnica de WB amostras falso-negativas pela técnica de WB.
Detecção da SEA utilizando soro anti-SEA padrão
os testes de ELISA e Western blot (WB) nos sobre
de cepas estafi cóci os à técnica pa ão ouro (Im usão – ID). nais
negativas, ISA: amos
ELISA, al té , FN-WB:
Sobrdas c
enadante epas
ID ELISA vido/ não-fervido)
FP-ELISA FN-ELISA WB (fer FP-WB FN-WB
B35 + -/- - + - - +B315 + -/- - + - - +B78 + -/- - + - - +B47 - -/- - - - - -B34 - -/- - - - - -B352 - -/- - - - - -B77 - -/- - - - - -B243 - -/- - - - - -B260 - -/- - - - - -B361 - -/- - - - - -B327 + -/- - + - - +B194 - +/- + - - - -B112 - -/- - - - - -B196 - -/- - - - - - B326 - -/- - - - - - B10 - -/- - - - - -
125
Continuação do quadro 5 Detecção da SEA utilizando soro anti-SEA padrão
Sobrenadante ID ELISA (fervido/ FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB das cepas não-fervido) B193-2 - -/- - - - - - B295 - +/- + - - - - B102 - -/- - - - - - B44 - -/- - - - - - B48 - - + + - +/- + B6 + - + - -/- - + B5 + -/- - + - - +B117 - -/- - - - - -B188 - -/- - - - - -B118 + -/- - + - - +B221 - -/- - - - - -B193-1 - -/- - - - - -B195 - -/- - - - - -B316 + -/- - + - - +B184 + -/- - + - - +B85 + -/- - + - - +LSA88 - -/- - - - - -
126
ResuQuadro 6: lta da detecção B) nos sobrenadantes, fervidos ou não durant os, de
stafilocócicas, co rados à técnic drão ouro (Imunodifusão – ID). O nais + e - indica que as amostra ão positi
tivamente. FP-ELI : amostras fals sitivas pela técn a de s egativas pela técnica de ELISA, FP-WB:
ras falso-positivas pela técnica B: amostras falso-negativas pel écnica de WB.
Detecção da SEB utilizando soro anti-SEB padrão
dos de SEB pelos testes de ELISA e Western blot (W e três minut
cepas e mpa a pa s si m s s vas e negativas,
respec SA o-po ic ELISA, FN-ELISA: amo tras falso-n
amost de WB, FN-W a t
Sobrenadante cepas
ID ELISA do/ não-fervido)
FP-ELISA FN-ELISA WB das
(fervi FP-WB FN-WB
B35 - +/- + - - - -B315 - +/- + - - - -B78 - +/- + - - - -B47 - +/- + - - - -B34 - +/- + - - - -B352 - +/+ + - - - -B77 - +/- + - - - -B243 - +/- + - + + -B260 - -/- - - - - -B361 - +/- + - - - -B327 + +/- - - - - +B194 + +/- - - - - + B112 + -/- - + - - + B196 + -/- - + - - + B326 + -/+ - - - - + B10 + +/- - - + - -
127
Continuação do quadro 6 Detecção da SEB utilizando soro anti-SEB padrão
Sobrenadante das cepas
ID ELISA (fervido/ não-fervido)
FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB
B193-2 + -/- - + - - + B295 + +/- - - + - - B102 - - - - +/+ + - B44 - - -/- - - - - B48 - +/+ + - - - -B6 - +/- + - - - -B5 - +/- + - - - -B117 + -/- - + - - +B188 + +/- - - - - +B118 + +/- - - - - + B221 + +/- - - - - + B193-1 + +/- - - - - +B195 + +/- - - - - +B316 + +/- - - - - +B184 + +/- - - - - +B85 + +/- - - - - +LSA88 - +/- + - + + -
128
Quadro 7: Resultados da detecção de SEC pelos testes de ELISA e Western blot (WB) nos sobrenadantes, fervidos ou não durante três minutos, de
cepas estafilocócicas, comparados à técnica pa am que as amostras são positivas e negativas,
e. ELISA: amostr p a de tras falso-n WB:
lso-positivas pela técnica B: amostras falso-negativas pel écnica de WB.
Detecção da S utilizando soro ti-SEC padrão
drão ouro (Imunodifusão – ID). Os sinais + e - indic
respectivament FP- as falso-positivas ela técnic ELISA, FN-ELISA: amos egativas pela técnica de ELISA, FP-
amostras fa de WB, FN-W a t
EC anSobredas cepas
nadante ID ELISA vido/ não-fervido)
FP-ELISA FN-ELISA WB (fer FP-WB FN-WB
B35 - -/- - - - - -
B315 - -/- - - - - -
B78 - -/+ + - - - -
B47 + +/- - - - - +
B34 - -/- - - - - -
B352 - -/- - - - - -
B77 - -/- - - - - -
B243 - -/- - - - - -
B260 - -/- - - - - -
B361 - -/- - - - - -
B327 - +/- + - - - -
B194 + -/- - + - - +
B112 - -/- - - - - -
B196 - -/- - - - - -
B326 - -/- - - - - -
B10 - -/- - - - - -
129
Continuação do quadro 7 Detecção da SEC utilizando soro anti-SEC padrão
Sobrenadante das cepas
ID ELISA (fervido/ não-fervido)
FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB
B193-2 - -/+ + - - - -
B295 - -/- - - - - -
B102 + - + -/+ - - -
B44 + -/- - + - - +
B48 + -/- - + + - -
B6 + -/- - + - - +
B5 + -/+ - - - - +
B117 + -/- - + - - +
B188 + -/- - + + - -
B118 - -/- - - - - -
B221 + +/- - - - - +
B193-1 + -/- - + - - +
B195 + -/- - + - - +
B316 - +/- + - - - -
B184 + -/- - + - - +
B85 + +/+ - - - - +
LSA88 + -/- - + - - +
130
Quadro 8: Resultados da detecção de SED pelos testes de ELISA e Western blot (WB) nos sobrenadantes, fervidos ou não durante três minutos, de
cepas estafilocócicas, comparados à técnica pa am que as amostras são positivas e negativas,
e. ELISA: amostr p a de tras falso-n WB:
lso-positivas pela técnica B: amostras falso-negativas pel écnica de WB.
Detecção da S utilizando soro ti-SED padrão
drão ouro (Imunodifusão – ID). Os sinais + e - indic
respectivament FP- as falso-positivas ela técnic ELISA, FN-ELISA: amos egativas pela técnica de ELISA, FP-
amostras fa de WB, FN-W a t
ED anSobredas cepas
nadante ID ELISA vido/ não-fervido)
FP-ELISA FN-ELISA WB (fer FP-WB FN-WB
B35 - -/- - - - - -
B315 - +/- + - - - -
B78 - -/- - - - - -
B47 - -/- - - - - -
B34 + +/- - - - - +
B352 + +/- - - - - +
B77 + -/- - + + - -
B243 + +/- - - + - -
B260 + -/- - + - - +
B361 + +/- - - - - +
B327 - +/+ + - - - +
B194 - +/- + - - - -
B112 + -/- - + - - +
B196 + -/- - + - - +
B326 + -/- - + - - +
B10 + +/- + - - - +
131
Continuação do quadro 8 Detecção da SED utilizando soro anti-SED padrão
Sobrenadante das cepas
ID ELISA (fervido/ não-fervido)
FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB
B193-2 + -/- - + - - +
B295 + + - + /- + - -
B102 + -/- - + - - +
B44 - -/- - - - - -
B48 +/- + - - - - -
B6 +/- + + - - - -
B5 +/- + - - - - -
B117 +/- + - - - - -
B188 +/- + - - - - -
B118 +/- + - - - - -
B221 +/+ + + - - - -
B193-1 +/- + + - - - -
B195 + -/- + - - - +
B316 +/- + + - - - -
B184 +/- + - - - - -
B85 +/- - - + - - +
LSA88 +/- + + - - - -
132
133
detecção de SEC pelos testes de ELISA, Western blot (WB) e Aglutinação em látex (AL) nos sobrenadantes, fervidos ou
não durante três minutos, de cepas estafilocó ID). Os sinais + e - indicam que as amostras
ativas, vamente A: al sitivas de
LISA, FP-WB: amostras falso-positivas pela técnica de WB, FN-WB: amostras falso-negativas pela técnica de WB.
Detecção de SEC utilizando soro anti-SEC recombinante
cicas, comparados à técnica padrão ouro (Imunodifusão –
são positivas e neg respecti . FP-ELIS amostras f so-po pela técnica ELISA, FN-ELISA: amostras falso-negativas pela
técnica de E
Sobrenadante pas
ID ELISA (fervid
FP-ELISA FN-ELISA WB FP-WB FN-WB ALdas ce o/
não-fervido)
FP-AL FN-AL
B35 - - -/- - - - - NT NT NT
B315 + - N NT - -/- - - + T NT
B78 + + -/- - + - - NT NT NT
B47 - - -/+ + - - - NT NT NT
B34 + - -/- - - + + NT NT NT
B352 - N NT + -/- - + - - T NT
B77 - - -/- - - - - - - -
B243 - - -/+ + - - - NT NT NT
B260 - - -/- - - - - NT NT NT
B361 - N NT - -/- - - - - T NT
B327 - + -/+ - - - - NT NT NT
B194 +/+ - + - - - - NT NT NT
B112 - + -/- - + - - NT NT NT
B196 - N NT - -/- - - - - T NT
Quadro 9: Resultados da
B326 + -/- - + - - - NT NT NT
B10 - -/- - - - - - - - -
134
o do quadro 9 de liz EC iDetecção SEC uti ando soro anti-S recomb nante
Sobrenadante das cepas o/
rvi
F A P- FN FN-AL ID ELISA(fervidnão-fe
do)
FP-ELISA N-ELIS WB F WB -WB AL FP-AL
B193-2 - -/- NT - - - - - NT NT
B295 + -/- - NT - + - - NT NT
B102 - -/- - NT - - - - NT NT
B44 -/- - NT - - - - - NT NT
B48 -/- - - + - + + - + -
B6 /- - NT - - - - - - NT NT
B5 /- - NT - + + - + + NT NT
B117 + /- + NT + - - - - NT NT
B188 - /- + - - - - - + + +
B118 - /- - - NT - - - - NT NT
B221 + /- + - + NT - - - NT NT
B193-1 - /- - - - - - - NT NT NT
B195 - /- - - - - - - - + +
B316 - /- - - NT + + - - NT NT
B184 - /- + - NT - - - + NT NT
B85 - /- + NT + + - + - NT NT
LSA88 + /- + - + - - - +--
Continuaçã
Princípios éticos na experimentação animal
A evolução contínua das áreas de conhecimento humano, com especial
qual se preconizam posturas éticas
:
roporciona.
ar das manobras experimentais e da dor que
possam causar.
rtigo IV - É relevante considerar a importância dos estudos realizados através de
experimentação animal quanto a sua contribuição para a saúde humana em animal,
o desenvolvimento do conhecimento e o bem da sociedade.
Artigo V - Utilizar apenas animais em bom estado de saúde.
Artigo VI - Considerar a possibilidade de desenvolvimento de métodos alternativos,
como modelos matemáticos, simulações computadorizadas, sistemas biológicos in
vitro, utilizando-se o menor número possível de espécimes animais, se caracterizada
como única alternativa plausível.
ênfase àquelas de biologia, medicinas humana e veterinária, e a obtenção de
recursos de origem animal para atender necessidades humanas básicas, como
nutrição, trabalho e vestuário, repercutem no desenvolvimento de ações de
experimentação animal, razão pela
concernentes aos diferentes momentos de desenvolvimento de estudos com animais
de experimentação.
Postula-se
Artigo I - É primordial manter posturas de respeito ao animal, como ser vivo e pela
contribuição científica que ele p
Artigo II - Ter consciência de que a sensibilidade do animal é similar à humana no
que se refere a dor, memória, angústia, instinto de sobrevivência, apenas lhe sendo
impostas limitações para se salvaguard
Artigo III - É de responsabilidade moral do experimentador a escolha de métodos e
ações de experimentação animal.
A
135
Artigo VII - Utilizar anima m desconforto, angústia
e dor, considerando que determinariam os mesmos quadros em seres humanos,
Artigo VIII - Desenvolver procediment animais, assegurando-lhes sedação,
analgesia ou anestesia quando se confignar o desencadeamento de dor ou angústia,
rejeitando, sob qualquer argumento ou tiva, o uso de agentes químicos e/ou
físicos paralizantes e não anes
rtigo X - Dispor de alojamentos que propiciem condições adequadas de saúde e
as necessidades das espécies animais mantidas para
sistência de profissional qualificado para orientar e
ades de transportes, acomodação, alimentação e atendimento de
volvidos nos procedimentos com animais de experimentação,
is através de métodos que previna
salvo se demonstrados, cientificamente, resultados contrários.
os com
justifica
tésicos.
Artigo IX - Se os procedimentos experimentais determinarem dor ou angústia nos
animais, após o uso da pesquisa desenvolvida, aplicar método indolor para sacrifício
imediato.
A
conforto, conforme
experimentação ou docência.
Artigo XI - Oferecer as
desenvolver ativid
animais destinados a fins biomédicos.
Artigo XII - Desenvolver trabalhos de capacitação específica de pesquisadores e
funcionários en
salientando aspectos de trato e uso humanitário com animais de laboratório.
136
Lei nº 3900, 19 de julho de 2002.
Institui o Código Estadual de Proteção aos Animais, no Âmbito do Estado do Rio de
Janeiro.
Título I
Capítulo I
Seção I
Das disposições gerais
ão aos Animais”, estabelecendo normas
ara a proteção dos animais no Estado do Rio de Janeiro, visando a compatibilizar o
rt. 2º - É vedado:
imais, sujeitando-os a qualquer tipo de
experiência capaz de causar sofrimento ou dano, bem como as que criem condições
inaceitáveis de existência;
II – V E T A D O.
orbitantes ou que ultrapassem sua força;
e de animais para menores desacompanhados por
enenos ou outros métodos não preconizados pela
Organização Mundial da Saúde – OMS, nos programas de profilaxia da raiva.
Art. 3º - Consideram-se espé stado do Rio de Janeiro as
que são originárias deste Estado e que viva
estão em migração, incluindo-se as espéc e animais marinhos da costa
uminense.
desenvolvimento, bem como os seus ninhos, ovos e abrigos são considerados bens
Art. 1º - Institui o “Código Estadual de Proteç
p
desenvolvimento sócio-econômico com a preservação ambiental.
A
I – ofender ou agredir fisicamente os an
III – obrigar animais a trabalhos ex
IV – não dar morte rápida e indolor a todo animal cujo extermínio seja necessário
para consumo;
V – exercer a venda ambulant
responsável legal;
VI – enclausurar animais com outros que o molestem ou aterrorizem;
VII – sacrificar animais com v
cies da fauna nativa do E
m de forma selvagem, inclusive as que
ies de peixes
fl
Art. 4º - Os animais silvestres de qualquer espécie, em qualquer fase de seu
137
d
respeitando os limite
e interesse comum do Estado do Rio de Janeiro, exercendo-se este direito
s que a legislação estabelece.
Fauna exótica
rt. 6º - Nenhuma espécie poderá ser introduzida no Estado do Rio de Janeiro sem
prévia autorização do órgão competen
rt. 7º - Todo vendedor de animais pertencentes à fauna exótica deverá possuir
arágrafo único – V E T A D O.
Da pesca
Art. 9º - Toda alteração no regime dos cursos de água, devido a obras, implicará
medidas de pro tidade estadual
ompetente.
Seção II
Art. 5º - V E T A D O.
A
te.
A
certificado de origem e licença de importação fornecida pela autoridade responsável.
P
Seção III
Art. 8º - São de domínio público todos os animais e vegetação que se encontram nas
águas dominiais.
teção que serão orientadas e fiscalizadas por en
c
Capítulo II
Dos animais domésticos
Seção I
Dos animais de carga
tos agrícolas e
industriais, somente pelas espécies bovinas, eqüinas ou muares.
Art. 10 – Será permitida a tração animal de veículos ou instrumen
138
Art. 11 – É vedado:
I – atrelar animais de diferentes espécies no mesmo veículo;
l trabalhar por mais de 6 (seis) horas seguidas sem lhe dar água e
Seção II
Do transporte de animais
Art. 12 – Todo veículo de transporte de animais deverá estar em condições de
ferecer proteção e conforto adequado.
– transportar sem a documentação exigida por lei;
al fraco, doente, ferido ou em adiantado estado de gestação,
II – utilizar animal cego, enfermo, extenuado ou desferrado em serviço, bem como
castigá-lo;
III – fazer viajar animal a pé por mais de 10 (dez) quilômetros sem lhe dar descanso;
IV – fazer o anima
alimento.
o
Art. 13 – É vedado:
I – transportar em via terrestre por mais de 12 (doze) horas seguidas sem o devido
descanso;
II
III – transportar anim
exceto para atendimento de urgência.
Capítulo III
Dos sistemas intensivos de economia agropecuária
Art. 14 – Consideram-se sistemas inte economia agropecuária os métodos
cuja característica seja a criação de confinamento, usando para tal fim
um alto grau de tecnologia que permita economia de espaço e trabalho e o rápido
ganho de peso.
rt. 15 – Será passível de punição toda a empresa que utilizar o sistema intensivo
nsivos de
animais em
A
de economia agropecuária que não cumprir os seguintes requisitos:
139
I – os animais deverão receber água e alimento, atendendo-se, também, suas
necessidades psicológicas, de acordo com a evolução da ciência, observadas as
xigências peculiares de cada espécie;
irculação de
r e temperatura.
Capítulo IV
e
II – os animais devem ter liberdade de movimento de acordo com as suas
características morfológicas e biológicas;
III – as instalações devem atender a condições ambientais de higiene, c
a
Parágrafo único – Não será permitida em nenhuma hipótese a engorda de aves,
suínos e outros animais por processos mecânicos, químicos e outros métodos que
sejam considerados cruéis.
Do abate de Animais
Art. 16 – Todo frigorífico, matadouro e abatedouro no Estado do Rio de Janeiro tem
a obrigatoriedade do uso de métodos científicos e modernos de insensibilização,
aplicados antes da sangria, por instrumentos de percussão mecânica,
processamento químico, elétrico ou decorrentes do desenvolvimento tecnológico.
Art. 17 – É vedado:
I – emprego de marreta, picada no bulbo (choupa), facada no coração, bem como
mutilação ou qualquer método considerado cruel para o abate;
II – abater fêmeas em período de gestação e de nascituros até a idade de três
meses de vida, exceto em caso de doença, a fim de evitar o sofrimento do animal.
Título II
Capítulo I
Dos Animais de Laboratório
Da vivissecção
Art. 18 – Considera-se vivissecção os experimentos realizados com animais vivos
em centro de pesquisas.
140
Art. 19 – Os centros de pesquisas deverão ser devidamente registrados no órgão
competente e supervisionados por profissionais de nível superior, nas áreas afins.
Art. 20 – O diretor do centro de pesquisa, antes de proceder qualquer experimento
com animal vivo, deverá relatar ao órgão competente a natureza do experimento, a
quantidade, a espécie de animal e o nível de dor que o mesmo sofrerá.
Art. 21 – É proibida a prática de vivissecção sem uso de anestésico, bem como a
sua realização em estabelecimentos escolares de ensino fundamental e médico.
§ 1º - Os relaxantes musculares parciais ou totais não serão considerados
anestésicos.
§ 2º - V E T A D O.
Art. 22 – Com relação ao experimento de vivissecção é proibido:
I – realizar experiências cujos resultados já são conhecidos anteriormente ou
aqueles destinados à demonstração didática que já tenham sido filmadas ou
ilustradas;
II – V E T A D O.
III – realizar experiências com fins comerciais, de propaganda armamentista e outros
que não sejam de cunho científico humanitário;
IV – utilizar animal já submetido a outro experimento ou realizar experiência
prolongada com o mesmo animal.
Art. 23 – V E T A D O.
Art. 24 – Nos locais onde está autorizada a vivissecção, deverá constituir-se uma
comissão de ética, composta por, no mínimo, 03 (três) membros, sendo:
I – um (01) representante da entidade autorizada;
II – um (01) veterinário ou responsável;
III – um (01) representante da sociedade protetora de animais.
Art. 25 – Compete à comissão de ética fiscalizar:
I – a habilitação e a capacidade do pessoal encarregado de prestar assistência aos
animais;
141
II – verificar se estão sendo adotados os procedimentos para prevenir dor e o
sofrimento do animal, tais como aplicação de anestésico ou analgésico;
III – denunciar ao órgão competente qualquer desobediência a esta Lei.
Art. 26 – Todos os centros de pesquisas deverão possuir os recursos humanos e
materiais necessários a fim de zelar pela saúde e bem estar dos animais.
Art. 27 – Somente os animais criados nos centros de pesquisas poderão ser
empregados em experimentos.
Art. 28 – As penalidades e multas referentes às infrações definidas nesta lei serão
estabelecidas pelo Poder Executivo, em espécie.
Art. 29 – V E T A D O.
Art. 30 – Esta Lei entra em vigor na data de sua publicação, revogadas as
disposições em contrário.
142
Lista de Soluções
Soluções utilizadas para Extração/Visualização de DNA
TELT: 50 mM Tris pH 8,0/62,5mM EDTA pH 9,0/2,5M LiCl /4% (v/v) Triton X-100
Tampão TE RNAse: 10 mM Tris-HCl pH 8.0/1 mM EDTA/20 µg RNAse /mL
Tampão de PCR 10X: 500mM KCl/100mM Tris
Tampão de amostra 6X para DNA: 0,25% azul de bromofenol/0,25% xileno
cianol/30% glicerol
Gel agarose: 1,2g agarose/100 mL de TAE 1X
TAE 1X: Tris 4,84 g/Acido acético glacial 1,142 g/EDTA 0,93 g
Soluções utilizadas para SDS-PAGE e Transferência
Tampão de amostra 2X para proteína: Tris base pH 6.8/2,3% SDS/0,1% azul de
bromofenol/10% glicerol/Para cada 1 mL, adicionar 50 µL de β-mercaptoetanol.
Gel separador de acrilamida 15% (15 mL): 3,5 mL H2O/4 mL Tampão Lower
7,5 mL Acrilamida 30%/0,03 mL APS 20%/0,02 mL TEMED
Gel concentrador de acrilamida 6% (15 mL): 7 mL H2O/4 mL Tampão Upper
4 mL Acrilamida 30%/0,03 mL APS 20%/0,02 mL TEMED
Tampão Lower: 1,5 M Tris-HCl, pH 8.8/0,4% SDS
Tampão Upper: 0,5 M Tris-HCl, pH 8.8/0,4% SDS
Acrilamida 30%: 29,2 g Acrilamida/0,8 g Bisacrilamida/100 mL H2O
Corante Azul de Coomassie: 0,4% (w/v) Azul brilhante de Coomassie R-250/15%
(v/v) metanol/7,5% (v/v) ácido acético
Solução Descorante de ácido acético: Metanol 450 mL/Ácido acético glacial 90 mL
Tampão fosfato 0,5 M pH 7,4: 200 mL de 1 M NaHPO4/59,2 mL de 1M
Na2HPO4/volume final de 400 mL
Tampão TST-20 10X: 100 mM Tris/15 mM NaCl/0,5% Tween 20/pH 7,4
Solução de revelação (Western blot): 40 mM Tris-HCl, pH 7.4/10 mM imidazol/30 v
H2O2/1 mg/mL DAB
143
Soluções utilizadas em ELISA
Tampão carbonato/bicarbonato: 0,032 g de CaCO3/0,058 g de NaHCO3/20mL de
H2O/pH 9,6
Solução de lavagem: PBS 1X/Tween-20 0,05%
Solução de revelação: 6,5 mL de 0,1M de ácido cítrico/7,0 mL de 0,2M de
Na2HPO4/ 5 µL de H2O2 3 V/ 10 mg de OPD/11,5 mL de H2O.
Soluções utilizadas em imunodifusão
Agar Noble 1,2%: 1,2 g Agar Noble/100 mL NaCl 1,5M/0,1 µL mertiolate
Solução salina: 150 mM NaCl/50 mM CaCl2/50 mM MgCl2
Corante Azul de Coomassie: 0,4% (m/v) Azul brilhante de Coomassie R-250/15%
(v/v) metanol/7,5% (v/v) ácido acético
Solução Descorante de ácido acético: Metanol 450 mL/Ácido acético glacial 90 mL
Outras soluções
GBS: 50 mM glicina, 0,1 M NaCl, pH8,0
PBS: 0,2 g KCl/8 g NaCl/1,44 g Na2HPO4/0,24 g KH2PO4/pH 7,4
144
145
Glossário
Amostras falso-negativas: amostras que foram negativas nos testes avaliados e
discordam do resultado positivo do teste padrão.
Amostras falso-positivas: amostras que foram positivas nos testes avaliados e
discordam do resultado negativo do teste padrão.
Amostras real-negativas: amostras que foram consideradas negativas nos testes
avaliados e concordam com os resultados negativos do teste padrão de detecção.
Amostras real-positivas: amostras que foram consideradas positivas nos testes
avaliados e concordam com os resultados positivos do teste padrão de detecção.
Bubalino: de búfalos
Dor abdominal: situação evidenciada pelo comportamento de coices (em coelhos).
Êmese: vômito
Enantema: erupção na superfície das cavidades
Endpoint: a maior diluição do anticorpo cujo valor da DO B492nm B é imediatamente
maior que duas vezes o valor do controle negativo
Exantema: erupções cutâneas
Letargia: prostração.
Ponto BaiHui: ponto subcutâneo localizado entre a última vértebra lombar e a
primeira vértebra sacral.
Sonolência: inércia.
Taquipinéia: respiração acelerada.