Cap.07-Ciclo ácido citrico

7/16/2019 Cap.07-Ciclo ácido citrico

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VALTER T. MOTTA

BIOQUÍMICA BÁSICA

Ciclo do ÁcidoCítrico

Capítulo

7



191

7Ciclo do Ácido Cítrico

Objetivos

1. Descrever a obtenção de acetil−CoA pela descarboxilação oxidativa dopiruvato nas mitocôndrias.

2. Reconhecer que o ciclo do ácido cítrico é a via de oxidação do grupo acetila da

acetil−CoA com formação de três NADH e de um FADH2 além da formação deum ATP (ou GTP) por fosfori lação ao nível do substrato.

3. Identificar a reação catalisada pela citrato−sintase como a primeira reação dociclo do ácido cítrico e reconhecer as substâncias participantes.

4. Identificar as substâncias participantes das reações do ciclo do ácido cítrico

catalisadas por: isocitrato−desidrogenase, complexo do α−cetoglutarato,

succinil−CoA−sintetase (succinato−tiocinase), succinato desidrogenase e

malato−desidrogenase.

5. Explicar a reação catalisada succinil−CoA−sintetase (succinato tiocinase) na

formação de ATP ao nível do substrato.

6. Calcular o número de compostos de “alta energia” (ATP) sintetizados pela

oxidação de um mol acetil−CoA no ciclo do ácido cítrico.

7. Descrever os mecanismos de regulação do ciclo do ácido cítrico.

8. Descrever a entrada e saída de intermediários do ciclo do ácido cítrico.

O ciclo do ácido cítrico (também chamado de ciclo de Krebs ouciclo dos ácidos tricarboxílicos) é o estágio final da oxidação doscombustíveis metabólicos. Os átomos de carbono entram no ciclo na

forma de grupos acetila derivados dos carboidratos, ácidos graxos eaminoácidos. O grupo acetila ligado a coenzima A (acetil-CoA) éoxidado em oito reações mitocondriais para formar duas moléculas deCO2 com a conservação da energia livre liberada em três moléculasde NADH, uma de FADH2 e um composto de “alta energia” (GTP ouATP). O NADH e o FADH2 são oxidados e os elétrons são conduzidos

pela cadeia mitocondrial transportadora de elétrons com a liberaçãode energia conservada na forma de ATP sintetizado a partir de ADP ePi por meio de processo denominado fosforilação oxidat iva (ver

Capítulo 8). A reação líquida para o ciclo do ácido cítrico é:



192 • MOTTA • Bioquímica

Quadro 7.1 Descoberta do ciclo do ácido cítrico

A operação do ciclo do ácido cí tr ico foi deduzidapor Hans Krebs em 1937 a partir de observaçõessobre a velocidade de consumo de oxigênio durantea oxidação do piruvato por suspensões de músculospeitorais de pombos. Esses músculos ativos no vôo,exibem uma velocidade de respiração muito alta esão apropriados para as investigações metabólicas.O consumo de oxigênio foi monitorado com o auxíliode um manômetro, um aparelho que permite amedida das alterações no volume de um sistemafechado a pressão e temperatura constantes.

Estudos anteriores, principalmente os realizados

por Albert Szent −Györgyi (1935), mostraram que osuccinato, o fumarato, o malato e o oxaloacetato

estimulavam o consumo de oxigênio por essesmúsculos. Krebs mostrou que o piruvato tambémaumentava o consumo de oxigênio.

Além disso, ele também observou que aoxidação do piruvato podia ser grandementeestimulada pelo oxaloacetato, cis-aconitato, isocitrato

e α-cetoglutarato. Os efeitos dessas substânciaseram completamente suprimidos pela adição demalonato, um inibidor competitivo da

succinato−desidrogenase. A adição do malonato

também acumulava citrato, α−cetoglutarato esuccinato. Pelo fato da adição do piruvato eoxaloacetato à suspensão ter resultado no acúmulode citrato, Krebs concluiu que a via operava como umciclo. Somente em 1951 foi demonstrado que aacetil-CoA é o intermediário que condensa com ooxaloacetato para formar citrato.

Krebs publicou sua descoberta no periódicoEnzimologia já que a revista Nature recusou o artigooriginal.

Acetil−CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + P i + 2 H2O →

2 CO 2 + 3 NADH + FADH2 + CoASH + GTP + 3 H +

Além do papel na geração de energia, o ciclo do ácido cítricotambém é fonte de unidades monoméricas para a biossíntese decarboidratos, lipídeos e aminoácidos não-essenciais.

Nesse contexto será examinado como o piruvato, derivado daglicose e outros açúcares através da via glicolítica, é oxidado à

acetil−CoA e CO2 para entrar no ciclo do ácido cítrico (Figura 7.1).O piruvato atravessa a membrana externa da mitocôndria via

canais aquosos de proteínas transmembranas chamados porinas (ver

Seção 9.4). A piruvato−translocase, uma proteína da membranamitocondrial interna, transporta especificamente o piruvato do espaçointermembrana para a matriz mitocondrial em simporte com o H + (ver Seção 9.4.B).

Ciclo doácido cítrico

2CO2GTP

8e

Acetil-CoA

CO2

2e

Piruvato

Figura 7.1Associação da glicólise e o ciclo do ácido cítrico. O piruvato produzido

na glicólise é convertido em acetil−CoA, o combustível do ciclo do ácidocítrico. Os elétrons removidos são transportados pelo NADH e FADH2 para a

cadeia mitocondrial transportadora de elétrons no interior das mitocôndrias



7 Ciclo do ácido cítrico • 193

que fornece en ergia para a síntese de ATP.

7.1 Oxidação do piruvato a acetil−CoA e CO2

Sob condições aeróbicas, o piruvato presente na matrizmitocondrial é convertido em CO2 e um fragmento de dois carbonos,a acetil−CoA em reação de descarboxilação oxidativa. A reação écatalisada pelo complexo da piruvato−desidrogenase constituído por três enzimas distintas: a piruvato−desidrogenase (E1) , adiidrolipoil −transacetilase (E2) e a diidrolipoi−desidrogenase (E3)associadas de modo não-covalente e cinco diferentes coenzimas. Ocomplexo está localizado exclusivamente na mitocôndria das célulaseucarióticas. Devido a grande energia livre padrão negativa dessareação sob condições fisiológicas, o processo é irreversível o que

impede a reação inversa de formação do piruvato a partir doacetil−CoA.

A operação do complexo da piruvato desidrogenase requer cincocoenzimas cujos papéis funcionais são descritos a seguir.

1. Descarboxilação oxidativa do piruvato. A reação requer o co-fator pirofosfato de tiamina (TPP) ligado à enzima piruvato−desidrogenase (E1). O TPP ataca o carbono da carbonilado piruvato e libera o CO 2 deixando o grupo hidroxietil ligado aoTPP para formar o hidroxietil−TPP (HETTP).

2. Transferência do grupo hidroxietil do HETTP para adiidrolipoil −transacetilase (E2). O aceptor do hidroxietil é o

H O C CH3

CO2H+

N

O C C CH3

C S

+

CH3

NC S

+

CH3

C

O O

+

C O

CH3

O OH

N

C S

+

CH3

Piruvato

Hidroxietil-TPP

Citosol Matriz mitocondrial

NAD NADH,H

Complexo piruvatodesidrogenase

COO

C O

CH3H

Piruvatotranslocase

+ + +

HS-CoA CO2

S-CoA

C O

CH3

Piruvato Acetil-CoA

Piruvato




grupo prostético lipoamida . A reação de transferência regenera oTPP da E1 e oxida o grupo hidroetil a um grupo acetila.

3. Transferência do grupo acetila para a coenzima A, em reaçãocatalisada pela diidrolipoil −transacetilase .

4. Regeneração do complexo da piruvato−desidrogenase original. Ogrupo diidrolipoato da E2 é reduzido pela flavina adeninadinuclotídeo (FAD) em presença de diidrolipoil −desidrogenase

com a regeneração do lipoato.

CoA SH

C

O CH3

S

HS

Coenzima A

Acetil CoA

CoA S C CH3

O

+

HS

HS

N

H O C CH3

S

S

C S+

CH3

H+

N

H O C CH3

HS

S

C S+

CH3

N

HS

S

C S+

CH3

C

O CH3

S

S CH2

CH2

CH2

CH CH CH CH C NH (CH ) CH2 2 2 2 2 4

O NH

C O

Lipoamina

Ácido lipóico Lis

Lipoamina

H+




5. A FADH2 é reoxidada pela transferência dos elétrons para o NAD+ para formar NADH. O NADH transfere os elétrons para acadeia mitocondrial transportadora de elétrons que está acopladaà síntese de 2,5 moléculas de ATP por meio da fosforilaçãooxidativa. A reação total de conversão de piruvato a acetil−CoA éaltamente exergônica ∆G°′ = −33,5 kJ·mol−1. Como para cadamolécula de glicose, 2 piruvato são formados pela glicólise, sãosintetizadas 5 moléculas de ATP.

A representação esquemática da operação do complexo da piruvato−desidrogenase está resumida na Figura 7.2.

A atividade do complexo da piruvato−desidrogenase é regulada por mecanismos alostéricos e covalentes . O complexo é ativado einibido alostericamente pelos efetores mostrados no Quadro 7.1.

Quadro 7.1 – Principais efetores alostéricos do complexo da piruvato−desidrogenase.

Efetores positivos (ativadores) Efetores negativos (inibidor es)

Coenz ima A ATP

NAD + NADH

AMP Acetil−CoA

Ca 2+ Ácidos graxos de cadeia longa

HS

HSFAD FADH2

S

S

FADH2 FAD

NAD+ NADH + H+




Figura 7.2Operação do complexo da piruvato-desidrogenase. TTP = pirofosfato de tiamina. O lipoato tem dois

grupos tiós (−SH) que formam uma ligação dissulfeto (−S−S−) por oxidação.

Os mecanismos de regulação alostérica do complexo sãocomplementados por modificações covalentes de proteínas. Ocomplexo é inibido por fosforilação pela ação de proteína-cinase(altos teores de piruvato, CoASH e NAD+ inibem a cinase) e ativado

por desfosforilação pela ação de fosfatases quando os níveis de [ATP]mitocondrial declinam.

A seguir a fórmula d coenzima A (CoA):

TPP

Hidroxietil-TPP

Lipoamida

FAD

S

S

CO2

NADH + H+

NAD+

Piruvato

CH C C3

O O

O

1 2

CH C TPP3

OH

HS

SCH C3

O

S

S

HS

HS

Acetil-diidrolipoamida

FAD

SH

SH

3

4

5

CoA

S CoACH C3

O

Acetil-CoA

Piruvato

desidrogenaseDiidrolipoil

transacetilase

Diidrolipoildesidrogenase




A. Destinos metabólicos do acetil-CoA

Os principais destinos metabólicos do acetil−CoA produzido namitocôndria incluem: (1) completa oxidação do grupo acetila no ciclodo ácido cítrico para a geração de energia; (2) conversão do excessode acetil−CoA em corpos cetônicos (acetoacetato, β−hidroxibutirato eacetona) no fígado; (3) transferência de unidades acetila para ocitosol com a subseqüente biossíntese de moléculas complexas comoos esteróis e ácidos graxos de cadeia longa.

S C CH

CH2

CH

NH

C O

CH

CH

NH

2

2

C O

HO C H

H C C CH

CH O P O P O2

Resíduo de-mercaptoetilamida

N N

N

NH2

H

O

O

H H H

OH

2CH

N

2

3 O O

O O

Adenosina-3-fosfato

Resíduo deácido pantotênico

O P O

O

3

O

3

Grupo acetil

Acetil-coenzima A (acetil-CoA)

´

α




Figura 7.3

Destinos do acetil-CoA

7.2 Reações do ciclo do ácido cítrico

A oxidação de acetil−CoA é realizada pelo ciclo do ácido cítricoem oito reações sucessivas onde entra o grupo acetila (dois carbonos)e saem duas moléculas de CO2. (Figura 7.4).

Acetil-CoA

Piruvato Aminoácidos Ácidos graxos

Ciclo do ácidocítrico

Corpos cetônicos Esteróis-ácidosgraxos




Figura 7.4Reações do ciclo do ácido cítrico. O ciclo oxida duas unidades de carbono com a produção de duas moléculas deCO2, uma molécula d e GTP, três moléculas de NADH e uma molécula de FADH2.

1. Condensação da acetil-CoA com o oxaloacetato. A etapa

inicial do ciclo do ácido cítrico é a condensação do acetil−CoA com o

HO C COO

CH

COO

CH2

2

COO

Citrato

Acetil-CoA

CoASH

H O2

CH C S CoA

O

3

1. Citrato-

sintase

CH

C O

COO

COO

2

Oxaloacetato

NADH

NAD+

8. Malato-

desidrogenase

HO C COO

CH

COO

HO C H

2

COO

Isocitrato

2. Aconitase

Ciclo do

ácido cítrico

CH

COO

HO C H

2

COO

L-Malato

7. Fumarase

H O2

HCCH

COO

COO

Fumarato

FAD

FADH2

6. Succinato-

desidrogenase

Succinil-CoA

CoASH

5. Succinil-CoA-sintetase

Succionato

CH2

COO

CH2

COO

GTP

GDP + Pi

CoASHCO2

NADH

NAD+

4. -Cetoglutarato-desidrogenase

CH

C O

2

COO

CH2

COO

CH

C O

2

COO

CH2

S Coa

-Cetoglutarato

NAD+

NADH

CO2

3. Isocitrato-desidrogenase

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