Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): 146-152 (2017)http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.2.146 ISSN 1225-7117 / eISSN 2288-8268

질 내 유산균의 Candida albicans에 대한 항진균 효과 연구

정여정1, 강창호1,2, 신유진1, 소재성1*

Characterization and Antifungal Activity against Candida albicans of

Vaginal Lactobacillus spp. Isolated from Korean Women

Yeojung Jung1, Chang-Ho Kang1,2, YuJin Shin1, and Jae-Seong So1*

Received: 9 December 2016 / Revised: 15 May 2017 / Accepted: 20 June 2017

© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: Vulvovaginal candidiasis (VVC) is one of the uro-

genital infections occurring in women worldwide. Candida

albicans is generally observed among various types of micro-

organisms causing VVC. Antibiotic therapy is typical, and the

use of Lactobacilli probiotics is to be recognized as a promis-

ing alternative. The aim of this study was to select vaginal lac-

tobacilli with probiotic properties against C. albicans. In a

previous study, we isolated 38 lactobacilli from vagina of

Korean women and 20 isolates were shown to inhibit C. albi-

cans. We further selected 10 isolates which were able to inhi-

bit C. albicans less than 105 CFU/mL. Among these selected

strains, Lactobacillus salivarius MG242 (identified by 16s

rRNA sequencing) was finally selected based on its strong

anti-candidal activity, acid/bile salt resistance and adhesion

property. Indirect adhesion activity of MG242 measured by

auto-aggregation assay showed more than 60% auto-aggrega-

tion after 5 h standing. Taken these results together, the selec-

ted strain MG242 may have potential for application in vagi-

na health related products.

Keywords: Candida albicans, Antifungal activity, Probiotics,

Lactobacillus spp.

1. INTRODUCTION

캔디다성 질염은 진균성 질염으로 75% 이상의 여성이 일생

에 한번 이상 겪는 질환이며, Candida 진균이 질 내에 과다 증

식하면서 질 내의 유익한 미생물총의 균형을 깨트려 발생하

게 되는 질병이다 [1]. 캔디다성 질염의 가장 흔한 원인균은

Candida albicans으로 전체 발병율의 85~90%에 해당된다

[2]. 치료제로는 polyene 계열의 amphotericin B와 azole 계열

의 fluconazole과 ketoconazole 등의 항생제를 복용 또는 질 내

주입하는 방법이 사용되고 있다 [3]. 그러나 동물세포와 진균

세포는 같은 진핵 세포이므로 이 양자는 대사기능 및 유사한

점이 많다 [4]. 이에 동물 세포에 독성을 보이지 않으며, 진핵

세포에 효과적으로 항생 작용을 일으키는 항진균제를 찾기

는 어렵다. 이러한 부작용 때문에 다양한 치료방법의 개발이

요구되고 있으며, 그 중 하나로 인체에 유익한 작용을 나타내

는 프로바이오틱스 (probiotics)를 사용하는 방법이 대두되고

있다 [5].

프로바이오틱스는 적정량을 섭취하였을 때 인체에 유용한

효과가 있는 살아있는 미생물을 의미하며 (FAO/WHO), 섭취

한 균이 사람의 소화기관을 통과하여 장내에 도달하여야 함

으로 사람 장관의 위산과 담즙산에 대한 내성을 보유해야 한

다 [6]. 프로바이오틱스는 숙주에게 유해한 성분을 생성하지

않고 안전성이 확보된 GRAS (generally regarded as safe) 미

생물로 분류되어 있으며, 현재 프로바이오틱스로 사용되고

있는 미생물로는 Lactobacillus spp. [7], Bifidobacterium spp.

[8], Enterococcus spp. [9] 등이 있다. 건강한 여성의 질 내에

는 많은 종류의 유산균이 있고 이러한 유산균주는 건강한 질

내 환경을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 유산균주는 젖산

을 생성하여 질 내 산도를 낮추고 hydrogen peroxide, bacteri-

1인하대학교 생물공학과1Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212,KoreaTel: +82-32-860-7516, Fax: +82-32-872-4046e-mail: sjaeseon@inha.ac.kr

2(주)메디오젠 2MEDIOGEN, Co., Ltd., Seoul 04157, Korea

Research Paper

질 내 유산균의 Candida albicans에 대한 항진균 효과 연구 147

ocins 등 다양한 항생물질을 생성하여 질염 원인균의 증식과

감염을 예방하며, Borges [10]의 연구에 따르면 유산균주는

질 내 상피 세포에 부착부위를 선점하여 질 건강 유지에 기여

한다고 알려져 있다. 기존의 유산균을 이용한 질 내 환경개선

방안은 탐폰, 질정의 형태로 유산균을 질 내로 직접 주입하는

방법을 이용하고 있으나, 사용시 거부감과 불편함에 대한 문

제가 지속적으로 제기되고 있다. 이에 대체 방안으로 요거트,

아이스크림, 유산균 캡슐과 같이 식품으로 섭취하여 질 내 환

경개선을 도와주는 다양한 형태의 프로바이오틱스 연구가

진행되고 있다 [11].

이에 본 연구에서는 건강한 한국 여성의 질에서 분리한 유

산균주를 대상으로 C. albicans에 대한 항진균 효과를 확인하

고, 프로바이오틱스로서의 특성을 확인하는데 목적이 있다.

이에 캔디다성 질염의 주요 원인균인 C. albicans에 대한 항

진균 활성이 우수한 유산균주를 선별하여 산성과 담즙염에

대한 내성 및 장내 세포의 부착성을 간접적으로 확인할 수 있

는 auto-aggregation 특성을 확인하였다.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Candida albicans에 대한 항진균효과

본 연구에서는 선행 연구를 통해 [12] Gardnerella vaginalis에

대한 항균 효과를 보인 한국 여성의 질에서 분리한 유산균주

38여종의 Candida albicans SC5314 (C. albicans) [13]에 대한

항진균 활성을 확인하기 위해 Martinez의 연구 [14]를 변형하

여 실험하였다. 유산균주는 MRS (Lab M, UK) 액체 배지에

24시간 정치배양하고 배양액을 새로운 MRS 배지에 1% 접종

하여, 18시간 동안 배양한 배양액을 1.5% MRS 고체 배지 위

에 5 µL씩 spot하여 37oC에서 8시간 배양하였다. 배양한 MRS

고체 배지에 C. albicans (105~106 CFU/mL)를 접종한 YM (0.3%

malt extract, 0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 1% glucose,

0.7% agar) 배지 5 mL를 붓고 37oC에서 18시간 배양한 후, 저

해환을 확인하였다.

C. albican에 대해 저해환을 보인 유산균주의 정량적인 항

진균 효과를 확인하기 위해, 유산균주와 C. albicans를 혼합

배지 (MRS 액체 배지와 YM 액체 배지를 1:1 (v/v)로 혼합)에

균의 농도가 최종적으로 105 CFU/mL 되도록 각각 접종하였

다. 37oC에서 20시간 정치배양 후, erythromycin (0.3 µL/mL)

를 도포한 YM 고체 배지에 도말하여 C. albicans의 생균수를

확인하였다.

2.2. 산과 담즙염에 대한 내성

C. albicans에 대한 항진균 효과가 우수한 유산균주를 선별한

후, 선별된 유산균주의 위산 및 담즙염에 대한 내성을 확인하

기 위해 Guo의 방법 [15]으로 실험을 진행하였다. 선별된 유

산균주를 MRS 배지에 18시간 계대배양하였다. 배양액은 원

심분리 (4,000×g, 4oC, 5분)한 후, phosphate-buffer saline (PBS,

pH 7)에 2번 세척하고, OD600=1.0 (108~109 CFU/mL)으로 조

정하여 각각 산성과 담즙염에 대한 내성 실험에 사용하였다.

산성에 대한 내성을 확인하기 위하여 유산균주 현탁액 1 mL

를 9 mL PBS (pH 3)에 첨가 후 진탕한 뒤 37oC에서 3시간 배

양한 후 생균수를 확인하였다. 담즙염 내성은 0.3% oxgall

(Difco, MI, USA)을 포함한 MRS 배지에 유산균 현탁액을 1%

접종하고 37oC에 24시간 배양한 후 생균수를 확인하였다.

2.3. Auto-aggregation

선별된 유산균주의 장내 세포 내 부착능력을 간접적으로 확

인하기 위하여 Kassa의 연구 [16]를 변형하여 auto-aggregation

실험을 진행하였다. 선별된 유산균주를 MRS 배지에 18시간

계대배양한 후, 원심분리 (4,000×g, 4oC, 5분)한다. PBS를 사

용하여 2번 세척하였고, OD600=1.0 (108~109 CFU/mL)으로 조

정하여 유산균주 현탁액 4 mL을 10초간 진탕한 뒤 5시간 동

안 방치하면서 auto-aggregation을 확인하였다. 실험 시작 직

후 (A0)와 1, 3, 5시간 후 (A), 각각 0.1 mL의 상등액을 취해

0.9 mL PBS와 혼합한 뒤 600nm에서 흡광도를 측정 (A0, A)

하고, 다음 계산식에 따라 autoaggregation을 계산하였다.

2.4. 계통수 분석

최종 선별된 유산균주는 universal primers (785F와 908R)을

이용하여 16S ribosomal RNA gene sequencing을 통해 동정

하였다. 염기서열은 PHYDIT program version 3.1을 통해 분

석하였고, 계통수 (phylogenetic tree)는 MEGA 5.0 프로그램

을 통해 neighbor-joining methods법으로 작성하였다.

2.5. Jar fermenter를 이용한 배양

전용배지 (Glucose 2.0%, Peptone 2.0%, Yeast extract 0.5%,

Whey 1.0%, Tween 80 0.1%, Na-acetate 0.25%, Ammonium

sulfate 0.1%, Sodium citrate 0.1%, K2HPO4 0.2%, KH2PO4 0.1%,

MnSO4 0.005%, MgSO4 0.01%)를 이용하여 7 L jar fermenter

(KBT, KoBioTech. Co., Ltd., Korea)에서 배양을 진행하면서

배양액의 생균수와 흡광도를 측정하였다. 배양 조건으로

working volume은 4 L, 교반 속도는 250 rpm, 배지 성분들을

혼합한 후 121oC에서 20분간 멸균하였고, 암모니아수를 이용

해 pH를 5.5로 조정하였다. 종균은 MRS에 접종하여 15시간

배양하였고, 전용배지 100 mL에 2% 접종하여 8시간 배양하

였다. 이 후 전용배지 4 L에 2% 접종하였고 3, 5, 7, 9, 11, 13,

15시간의 생균수와 흡광도를 측정하였다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Candida albicans에 대한 항진균 효과

항생제의 대표적인 부작용으로는 유익한 미생물총의 균형

파괴, 항균 물질의 체내 잔류, 내성 균의 출현 등이 보고되었

Auto-aggregation %( )A0 A–( )

A0------------------------- 100×=

148 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): 146-152 (2017)

다. 이에 국내외적으로 항생제의 사용이 규제되고 있으며, 항

생제의 대체 물질이 요구되고 있다 [5]. 유산균주는 젖산, hy-

drogen peroxide, bacteriocins 등 다양한 항생물질을 생성하여

이를 통해 질염 원인균의 증식과 감염을 예방하는 것으로 알

려져 있다 [7]. 선행연구 [12]에서 국내 여성의 질에서 분리한

유산균주의 세균성 질염의 주요 원인균인 G. vaginalis에 대한

항균실험 결과가 우수한 유산균주 38균주를 1차 선별하였다.

이 중 20 균주가 C. albicans에 대해 저해환을 보였으며 (Table

1, Fig. 1), 저해환을 보인 유산균주 중 C. albicans와 동량을

접종하였을 때 20시간 후 C. albicans의 생균수를 105 CFU/

mL 미만으로 저해시키는 유산균주 10종 (KLB58, KLB213,

KLB214, KLB215, KLB221, KLB233, KLB234, KLB236, MG

242, KLB306)을 2차 선별하였다 (Fig. 2). Martinez의 연구 [14]

에 따르면 Lactobacillus rhamnosus GR-1와 C. albicans를 함

께 배양하였을 때, 24시간 후 C. albicans는 약 106 CFU/mL 이

상의 생균수를 보였고, 이는 대조군인 단일 배양한 C. albic-

ans의 생균수와 비슷한 값을 보였다. L. reuteri RC-14와 C.

albicans를 함께 배양하였을 때, 24시간 후 C. albicans는 약

105 CFU/mL 이상의 생균수를 보였다.

Table 1. Screening of selected strains for antifungal activity

against C. albicans

StrainsInhibition ofC. albicans

StrainsInhibition ofC. albicans

KLB13 + KLB235 −

KLB14 + KLB236 +

KLB46 − KLB238 −

KLB58 + KLB240 −

KLB99 − KLB241 −

KLB101-2 − MG242 +

KLB103-1 − KLB243 −

KLB103-2 − KLB245 −

KLB213 + KLB247 −

KLB214 + KLB248 −

KLB215 + KLB251 −

KLB218 + KLB265 −

KLB219 + KLB267 −

KLB220 + KLB270 +

KLB221 + KLB272 +

KLB228 + KLB285 −

KLB229 + KLB288 +

KLB233 + KLB296 −

KLB234 + KLB306 +

+ = visible clear zone, − = no visible clear zone.

Fig. 1. Antifungal activity against Candida albicans by MG242and KLB296.

Fig. 2. Screening of anti-candidal activity of selected strains co-cultured with C. albicans (cell to cell) at 20 h.

질 내 유산균의 Candida albicans에 대한 항진균 효과 연구 149

3.2. 산과 담즙염에 대한 내성

프로바이오틱스로 사용되는 유산균주는 생균제로서 효능을

발휘하기 위해서는 위와 장 환경인 강산성과 담즙염에 대한

안정성을 갖추어야 한다 [6]. 따라서 본 연구에서는 C. albic-

ans에 대해 높은 항진균 효과를 보인 10균주의 산성 및 담즙

염에 대한 내성을 확인하였다 (Fig. 3). 일반적으로 위장의 pH

는 3.0을 유지하며 음식물이 위 내에서 3시간 머무르는 것으

로 알려져 있다 [15]. pH 3 환경에 대한 내성실험에서 10균주

모두 104 CFU/mL이상의 생균수를 보였으며 KLB236 균주는

105 CFU/mL로 가장 높은 생균수를 유지하였다. 담즙염에 대

한 내성을 확인하기 위해 0.3% oxgall를 함유한 MRS 액체배

지에 균을 접종하여 실험을 수행하였다. 모든 균주는 107

CFU/mL 이상의 높은 생균수를 보였으며, 특히 MG242는 108

CFU/mL의 매우 높은 생균력을 보임을 알 수 있었다. Lin의

연구 결과 [17]에서 0.3% 담즙염 환경에서 유산균주의 생균

수가 104 CFU/mL 이하로 나타난 것에 비해 본 연구에서 선별

된 10균주들은 담즙염에 대해 우수한 내성을 보이는 것을 확

인할 수 있다.

3.3. Auto-aggregation

프로바이오틱스로 사용되는 유산균주는 체내에서 지속적으

로 작용하기 위해 체내에서 부착할 수 있는 세포부착능이 요

구된다. Latha의 연구 [18]에 의하면 auto-aggregation 능력은

장내 상피세포에 대한 부착능과 직접적으로 연관이 있다고

보고되었으며, auto-aggregation 능력이 50% 이상일 때 biofilm

을 형성하여 병원균의 증식과 확산을 막는다고 알려져 있다.

이에 C. albicans에 높은 항진균 능력을 보이는 10균주를 auto-

aggregation 실험을 진행하였다 (Fig. 4). 선별된 균주들은 평

균 49.94%의 auto-aggregation 능력을 보였고, 이 중 KLB213

과 MG242 균주가 각각 60.47, 60.10%로 높은 auto-aggrega-

tion 능력을 나타내었다. Kos의 연구 [19]를 따르면, L. acido-

philus M92의 in vitro상의 auto-aggregation 능력이 약 60%으

Fig. 3. Survivablity of selected strains in acid (A) and bile salt (B).

150 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): 146-152 (2017)

로 본 연구의 결과와 비슷한 값을 보였다.

3.4. 계통수 분석

산과 담즙염에 대한 내성과 auto-aggregation 결과가 가장 우

수한 MG242 균주를 최종적으로 선별하였다. MG242의16S

rRNA gene sequencing결과, L. salivarius로 동정되었으며 (Fig.

5), L. salivarius MG242는 National Center of Biotechnology

Information으로부터 accession number KX014907을 부여받았

다. L. salivarius는 식품의약품안전처 건강기능식품의 기준

및 규격 [20]에 등재되어 안전성이 확인된 균주이므로 프로

바이오틱스로 사용이 가능하다.

3.5. Jar fermenter를 이용한 배양

전용배지를 사용하여 jar fermenter로 배양한 균주는 배양 7시

간 후 1010 CFU/mL이상의 생균수를 유지하였다. 기존의 MRS

배지를 사용한 배양 실험에서 109 CFU/mL의 생균수를 보인

것과 비교하여 식용이 가능하며 저렴한 배지조성에서도 높

은 생균수를 유지하는 것을 확인하였다 (Fig. 6). 식품의약품

안전처 건강기능식품의 기준 및 규격에 의하면, 프로바이오

틱스는 생균을 108 CFU/g 이상 함유하여야 한다고 제시하고

있으며 [20], L. salivarius MG242의 상용화에 있어서 경제적

인 배지를 이용하여 대량 생산을 가능하게 할 수 있을 것으로

판단된다.

4. CONCLUSION

본 연구에서는 선행 연구인 한국 여성의 질에서 분리한 유산

균주를 통해 세균성 질염의 주요 원인균인 Gardnerella vagi-

nalis에 대해 항균효과가 있는 유산균주 중 캔디다성 질염의

Fig. 4. The auto-aggregation ability of selected strains at 1, 3, 5 h.

Fig. 5. Neighbor-joining tree based on bacterial 16S rRNA gene sequence. Isolated strain was compared with sequences available from theGenBank database.

질 내 유산균의 Candida albicans에 대한 항진균 효과 연구 151

주요 원인균인 Candida albicans에 대한 항진균 효과를 확인

하였다. 항진균 효과가 우수한 10균주는 모두 C. albicans의

생장을 105 CFU/mL 미만으로 억제하는 것을 확인하였으며,

추가적인 특성 확인을 위해 내산성 및 내담즙염, auto-aggre-

gation 실험을 결과를 종합하여 최종적으로 MG242 균주를

선별하였다. 16S rRNA sequencing 결과 MG242는 Lactobac-

illus salivarius로 동정되었으며, L. salivarius는 건강기능식품

의 기준 및 규격에 등재되어 안정성이 입증되어 있다. 이에 L.

salivarius MG242를 프로바이오틱스로의 대량 생산 가능성

을 확인하였고, 향후 질 건강을 위한 프로바이오틱스의 주요

한 소재자원으로 활용될 수 있을 것이라 기대된다.

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