by with molecular markers Contents of OryzaOryza sativa sativa L.) › doc › 01003579 ›...
Transcript of by with molecular markers Contents of OryzaOryza sativa sativa L.) › doc › 01003579 ›...
เอกสารประกอบการสอนวิชา 01554691 1
Breeding by Design with molecular markersBreeding by Design with molecular markers
Case study of rice (Case study of rice (OryzaOryza sativa sativa L.)L.)
ธาน ี ศรวีงศชยั ([email protected])
ภาควชิาพชืไรนา คณะเกษตร มหาวทิยาลัยเกษตรศาตร
Source: www.irri.org
Contents
• ความมัน่คงทางอาหารกบัการปรบัปรุงพนัธุขาว• การหาตาํแหนงยนี (gene mapping) QTL analysis Bulk segregant analysis
• การใชเครื่องหมายดเีอน็ชวยปรบัปรงพนัธ• การใชเครองหมายดเอนชวยปรบปรุงพนธ ุ(marker assised selection; MAS) พืน้ฐานของการปรบัปรุงพนัธุพชื MAS MAB MAP
•บทสรปุ
ลาน
(คน)
World population
http://en.wikipedia.org
600
800
1000
1200
Thailand
Viet Nam
China
Kg/Rai
IR8H3 H3
H3
H2
0
200
400
1961
1963
1965
1967
1969
1971
1973
1975
1977
1979
1981
1983
1985
1987
1989
1991
1993
1995
1997
1999
2001
2003
2005
2007
2009
Year
RD1 CNT1SPR1
http://faostat.fao.org
ผลกระทบจากการพฒันาเทคโนโลยีการผลติขาวผลกระทบจากการพฒันาเทคโนโลยีการผลติขาว
300275250225200
Area (million Ha)
Area saved
1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000
175150125100
7550250
Year
Actual area planted
www.irri.org
วิธีการปรับปรงุพันธุขาว
พันธุพ้ืนเมือง
V1 V2 V3
V4 V5 V6
พันธุตางประเทศV11 V12 V13
V14 V15 V16
ผสมพันธุ
X
V1 V18
กลายพันธุV1
พืชพันธุใหม 6
V7
V8
V9
V17 V18 V19
พันธวุิศวกรรมV1
เอกสารประกอบการสอนวิชา 01554691 2
F1 AaAA aaP
AA 25% Aa 50% aa 25%F2
AA 12 5% aa 12 5%
การเปลี่ยนแปลงภายหลงัการผสมตัวเอง
7
AA 25%AA 12.5%
Aa 25%AA 37.5%
aa 25%
aa 37.5%
aa 12.5%
F3
Aa 12.5%
AA 6.25%
AA 43.75% aa 43.75%
aa 6.25%
F4
การเปลี่ยนแปลงภายหลงัการผสมตัวเอง
m % Homozygosity (เชน AA + aa) เมื่อมียีน 1 คู1 F2 502 F3 75
3 F 87 53 F4 87.54 F5 93.755 F6 96.8756 F7 98.43757 F8 99.218758 F9 99.609389 F10 99.80469
m = จาํนวนครัง้ทีผ่สมตวัเอง
n = จาํนวนคูหรอืตาํแหนงของยนี
8
No. Heterozygous
loci of F1
Different gamete in
F1
Possible F2 genotype
Possible F2 combination
Kinds of F2 phenotype
Dominance Additive
1 2 3 4 2 3
2 4 9 16 4 9
ตารางความสมัพนัธระหวางจาํนวน heterozygous loci และ genotype
3 8 27 64 8 27
4 16 81 256 16 81
10 1,024 95,049 1,084,576 ‐ ‐
21 2,097,152 10,460,353,203 4,398,046,511,104 ‐ ‐
nn 22nn 33nn 44nn 22nn 2n+12n+1
9
Random markers
Specific location markers
การหาตาํแหนงยีน
Target geneQTL location
Marker A
Marker B
Linked marker
Functional marker
Marker A
Marker B
การหาตาํแหนงยีน (gene mapping)
• การพัฒนาเคร่ืองหมายดีเอ็นเอ (DNA markers) ที่สัมพันธกับลักษณะที่สนใจจะชวยใหแนวทางในการปรับปรุงพันธุพืชมีประสิทธิภาพมากยิ่งข้ึน
• การใชเคร่ืองหมายดีเอ็นเอ ชวยในการปรับปรงพันธการใชเครองหมายดเอนเอ ชวยในการปรบปรุงพนธุ (Marker assisted selection, MAS) เปนหน่ึงในวิธีการใชประโยชนจากเคร่ืองหมายดีเอ็นเอ
• MAS เปนการใช DNA markers ที่สัมพันธ (tightly-linked หรือ functional detection) กับตําแหนงของยีนที่ตองการเพื่อชวยคัดเลือกตนพืชที่มีลักษณะที่ตองการ
1. QTL analysis
1. Development of mapping population
การหาตาํแหนงยีน (gene mapping)
2. Trait evaluation (P = G + E + GxE)
3. Genotyping (G)
4. Phenotype & Genotype combination (QTL analysis)
• Linkage map construction
• QTL analysis
เอกสารประกอบการสอนวิชา 01554691 3
1. Development of mapping population
1. QTL analysis
การหาตาํแหนงยีน (gene mapping)
ชนิดของประชากรผสมระหวางพอแมท่ีมีพันธุกรรมแบบ heterozygous • F1 ผสมระหวางพอแมท่ีมีพันธุกรรมแบบ homozygous • F2• Backcross• Double haploid• Recombinant Inbred line
F2
F1
Parent 1 Parent 2
x
aaAA
(Aa)
F2(AA : Aa : aa)
1 2 1
RIL/ DH
F1
Parent 1 Parent 2
x
aaAA
(Aa)
F2(AA : Aa : aa)
1 2 1
1. Development of mapping population
Backcross
F1
Parent 1 Parent 2
x
BC1F1
x KDML105
%Similarity : 100%Similarity : 0
x KDML105
aaAA
(Aa) (aa)
(Aa : aa)1 : 1
GenotypeAA : Aa : aa(1 : 2 : 1)
x1 : 2 : 1
F3
GenotypeAA : aa
x1 : 2 : 1
F3x
F4
F5
F6
x
x
KDML105
BC4F1 x KDML105
BC2F1
x KDML105
BC3F1 x KDML105
(Aa : aa)1 : 1
(aa)
(aa)
(aa)
(aa)
GenotypeAa : aa
Phenotype evaluation on Mapping population
Submergence Drought
Yield components
2. Trait evaluation
Disease resistance
Insect resistance
Yield components
Cooking quality
3. Genotyping
Source: Collard et.al., 2005
1-87
48 76 47 75 25 74 24 52 23 51 1 50 TH
16
28 BF
27
2-305
BF
27 48 76 47 75 25 74 24 52 23 51 1 50 TH
16
28 BF
27
Agarose gel
3. Genotyping
311
249
Pyms267-268
TH16
B1-2
Polyacrylamide gel P1
P2
Mapping population
Mapping population
y
TH16
B1-2
P1
P2
Scoring (Convert band to computer data)3. Genotyping
เอกสารประกอบการสอนวิชา 01554691 4
4.1. Linkage map construction
Source: Collard et.al., 2005
4.1. Linkage map construction
Linkage Map
2. Simple interval mapping analysis
1. Single - maker analysis
4.2. QTL analysis
3. Simplified composite interval mapping analysis
M1
M2
M3
QTL1M1
M2
M3
QTL1M4
M5M6
QTL2
QTL for Submergence tolerance
4.2. QTL analysis
1.2 Bulk segregant
1. QTL analysis
การหาตาํแหนงยีน (gene mapping)
analysis
Source: Collard et.al., 2005
1.2 Bulk segregant analysis
Source: Collard et.al., 2005
เอกสารประกอบการสอนวิชา 01554691 5
1.2 Bulk segregant analysis
Source: Collard et.al., 2005
ประโยชนของ Gene mapping
• การปรบัปรุงพนัธุ • ใชเครื่องหมายดเีอ็นเอชวยคดัเลือกตนทีม่ีพนัธกุรรมทีต่องการ (marker assisted selection; MAS)selection; MAS)
•รวมยอดยนี/ QTLs (Pyramiding genes/ QTLs)
• การตรวจหายีน• Gene expression• Gene cloning• Function of gene
การใชเครือ่งหมายดเีอน็เอชวยปรบัปรงุพันธุพชื
การใชเคร่ืองหมายดีเอ็นชวยปรับปรุงพันธุ
พื้นฐานของการปรับปรุงพันธุพืช
(Marker Assisted Selection; MAS)
MAS
MAB
MAP
• Mass selection
• Introduction
วธิกีารพืน้ฐานในการปรบัปรุงพนัธุขาวConventional Breeding Methods
Non crossing• Mutation
• Genetic engineering• Pure line selection
• Pedigree selection
• Bulk method
• Single seed decent
• Backcross method
Crossing
28
วิธีการปรับปรงุพันธุพืชผสมตัวเอง
พันธุพ้ืนเมือง
V1 V2 V3
V4 V5 V6
พันธุตางประเทศV11 V12 V13
V14 V15 V16
ผสมพันธุ
X
V1 V18
กลายพันธุV1
พืชพันธุใหม 29
V7
V8
V9
V17 V18 V19
พันธวุิศวกรรมV1
F2
P2
F1
P1 x
large populations consisting of thousands of plants
PHENOTYPIC SELECTION
DonorRecipient
CONVENTIONAL PLANT BREEDINGCONVENTIONAL PLANT BREEDING
Field trialsGlasshouse trialsSalinity screening in phytotron Bacterial blight screening Phosphorus deficiency plot
Source: www.irri.org
เอกสารประกอบการสอนวิชา 01554691 6
F2
P2
F1
P1 x
large populations consisting of thousands of plants
ResistantSusceptible
MARKERMARKER‐‐ASSISTED ASSISTED SELECTIONSELECTION
MARKER-ASSISTED SELECTION (MAS)
Method whereby phenotypic selection is based on DNA markers
Source: www.irri.org
ขอดีของ MAS
Marker-assisted selection ชวยเพิม่ประสทิธภิาพการปรบัปรงุพนัธุพชืเมื่อเปรยีบเทยีบกบัวิธปีกต ิ(Conventional breeding) ทีค่ดัเลือกจากลกัษณะการแสดงออก ดวยเหตผุลดังนี้
• เปนวิธทีี่งายเปนวธทงาย• การคดัเลือกทาํในระยะตนกลา• เปนการคดัเลือกแบบรายตน
ประหยดัเวลาและแรงงาน ในลกัษณะทีป่ระเมนิยาก หรอืใชเวลานาน เชน การคดัเลือกทีต่องทาํในเวลาทีเ่ฉพาะของป หรือเฉพาะสถานที ่หรอืวิธกีารประเมนิยุงยาก
Source: www.irri.org
การคดัเลือกดวย DNA markers มคีวามนาเชื่อถือมากกวาการทดสอบในแปลงทีม่อีิทธิพลจากสภาพแวดลอม ประหยดัคาใชจายมากกวาการประเมนิบางลกัษณะทีม่ีคาใชจายสูง เชน ปรมิาณน้ํามนั ลดจํานวนสายพนัธทดสอบลดลง หรือคดัทิ้งตนที่ไม
ขอดีของ MAS (ตอ)
ลดจานวนสายพนธทุดสอบลดลง หรอคดทงตนทไมตองการในระยะแรกไดทนัที การคดัเลอืกแบบไมทําลายตน คดัเลือกแบบ ‘fast-tracked’ เพือ่หาตนทีม่ ีgenotypes ทีต่องการ หรือใช ‘background’ markers ชวยเพิม่พนัธกุรรมของ recurrent parents ใน marker-assisted backcrossing
การใช MAS ในการปรบัปรงุพันธุพชื
1 Marker assisted backcrossing (MAB)
Foreground selection
1 2 3 4
Recombinant selection
1 2 3 4
Background selection1 2 3 4
Target locus
TARGET LOCUS SELECTION
FOREGROUND SELECTIONSource: www.irri.org
RECOMBINANT SELECTION BACKGROUND SELECTION
Conventional backcrossingx P2P1
DonorElite cultivarDesirable trait
e.g. disease resistance
• High yielding
• Susceptible for 1 trait
• Called recurrent parent (RP)
P1 x F1
P1 x BC1
P1 x BC2
Visually select BC1 progeny that resemble RP
Discard ~50% BC1
Repeat process until BC6
P1 x BC3
P1 x BC4
P1 x BC5
P1 x BC6
BC6F2
Recurrent parent genome recovered
Additional backcrosses may be required due to linkage drag
Source: www.irri.org
P1 x F1
P1 x P2
CONVENTIONAL BACKCROSSING
BC1
VISUAL SELECTION OF BC1 PLANTS THAT MOST CLOSELY RESEMBLE RECURRENT PARENT
MARKER‐ASSISTED BACKCROSSING
P1 x F1
P1 x P2
BC1USE ‘BACKGROUND’ MARKERS TO SELECT PLANTS THAT HAVE MOST RP MARKERS AND SMALLEST % OF DONOR GENOME
BC2BC2
Source: www.irri.org
เอกสารประกอบการสอนวิชา 01554691 7
2 Marker assisted pyramiding (MAP)การรวมยอด (pyramiding) คือการรวมหลายยนีหรือ QTL เปาหมายใหอยูในตนเดยีวกัน ซึ่งสามารถทําไดในการปรบัปรงุพนัธุปกตเิชนกนั แตจะยุงอยากและใชเวลานาน โดยเฉพาะการประเมนิทีม่กีารทําลายตนพชืในประกร F
การใช MAS ในการปรบัปรงุพันธุพชื (ตอ)
โดยเฉพาะการประเมนทมการทาลายตนพชในประกร F2• DNA markers จะมปีระสทิธภิาพเนื่องจากเปนการ
ประเมนิที่ไมทาํลายตน การคดัเลือกยีนหรอื QTL เปาหมายสามารถทําไดจากการสะกดัดเีอน็เอ โดยไมจําเปนตองประเมนิ phenotype
• การรวมยอดมกันยิมทําในลกัษณะความตานทานตอโรคเพื่อพฒันาความตานทานแบบยั่งยนื (durable disease resistance)
F1Gene A + B
P1Gene A
x P1Gene B
Genotypes
P1: AAbb P2: aaBB
F1: AaBb
• Process of combining several genes, usually from 2 different parents, together into a single genotype
x
Breeding plan
F2
MAS
Select F2 plants that have Gene A and Gene B
F2AB Ab aB ab
AB AABB AABb AaBB AaBb
Ab AABb AAbb AaBb Aabb
aB AaBB AaBb aaBB aaBb
ab AaBb Aabb aaBb aabb
Source: www.irri.org
F2
P2
F1
P1 x
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
R S R R S R R S R R R R S R R R R R S R
S R S R R R R S R S R R R R R S S R R R
Line number
Phenotype Race 1
Phenotype Race 2
Resistant to Race 1
Susceptible to Race 2
Susceptible to Race 1
Resistant to Race 2
P1 P2 F1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
P1 P2 F1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
R1
R2
S
S
MARKER 1
MARKER 2
Figure Marker assisted pyramiding of two disease resistance genes. Note that homozygotes can be selected from the F2 population.
Source: www.irri.org
Rice MAS in Thailand
sub1
ขาวหอมชลสทิธิ์(IR57514/KDML105
frg
waxy
Bph3
Pi‐IR64saltT
Xa21
xa5
ขาวธญัสรินิ(RD6*6/JHN)
Pi‐JHN
Pi‐JHN
Pi‐IR64
Xa21
ความทาทายในการนาํไปใช
• ลดคาใชจาย– คุมทุน, วิธีการที่งาย และมีนวัตกรรม
ใหมๆ• การพัฒนาวิธีการและเทคนิคการจําแนกหา
marker ที่สัมพันธกับยีนเปาหมาย– Functional
marker, eQTL, CSSL, gene cloning • การพัฒนาและปรับปรุงประสิทธิภาพของ
MAS • การบูรณาการระหวาง molecular
genetics และ plant breeding เขาดวยกัน• การจัดการขอมูลที่มีประสิทธิภาพ