Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng trong nấm...

8/18/2019 Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV …

http://slidepdf.com/reader/full/buoc-dau-xay-dung-phuong-phap-xac-dinh-ham-luong-triterpenoid 1/69

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--- ---

BÙI THỊ NGỌC HÂN

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNHHÀM LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG TRONG NẤM

LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV – VIS

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC Ngành CỬ NHÂN HÓA HỌC

Mã ngành: 52440112

2013

WW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMóng góp PDF bở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

--- ---


BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNHHÀM LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG TRONG NẤM

LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV – VIS

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC

Ngành CỬ NHÂN HÓA HỌC

Mã ngành: 52440112

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ths. NGUYỄN THỊ ÁNH HỒNG

2013





Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Khoa học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Bộ môn: Hóa học ------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Cán bộ hướng dẫn: Ths. Nguyễn Thị Ánh Hồng

Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid

tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV – Vis.

Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Ngọc Hân MSSV: 2102244

Lớp Hóa học – Khóa 36

Nội dung nhận xét:

Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:

Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: ...................................................................................................................................................................................................

Những vấn đề còn hạn chế: ..................................................................................

..............................................................................................................................

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Kết luận, đề nghị và điểm:

..............................................................................................................................

..............................................................................................................................

Cần Thơ, ngày ... tháng ... năm 2013

Cán bộ hướng dẫn








NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

Cán bộ phản biện:

Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoidtổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV – Vis.





..............................................................................................................................

..............................................................................................................................




..............................................................................................................................


..............................................................................................................................

..............................................................................................................................


..............................................................................................................................

..............................................................................................................................


Cán bộ phản biện










Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoidtổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV – Vis.





..............................................................................................................................

..............................................................................................................................




..............................................................................................................................


..............................................................................................................................

..............................................................................................................................


..............................................................................................................................

..............................................................................................................................












Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid

tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV – Vis.





..............................................................................................................................

..............................................................................................................................




..............................................................................................................................


..............................................................................................................................

..............................................................................................................................


..............................................................................................................................

..............................................................................................................................







Luận văn Đại học – Hóa học

Bùi Thị Ngọc Hân i 2102244

LỜI CAM ĐOAN

Tất cả dữ liệu và số liệu sử dụng trong nội dung bài luận văn được thamkhảo từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau và được ghi nhận từ những kết quả mà

tôi đã tiến hành khảo sát trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin cam đoancác số liệu, kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và chưa đượccông bố trong những công trình luận văn trước đây.

Bùi Thị Ngọc Hân






Bùi Thị Ngọc Hân ii 2102244

LỜI CÁM ƠN ------

Để đạt được kết quả như hôm nay, xin gửi lời cảm ơn chân thành đếntoàn thể quý thầy cô bộ môn Hóa –Khoa Khoa Học Tự Nhiên. Các Thầy Cô đãnhiệt tình truyền đạt những kiến thức chuyên ngành, cũng như những kinhnghiệm thực tế, đây là hành trang vô cùng quý báu không chỉ để hoàn thành đềtài tốt nghiệp mà còn hỗ trợ rất nhiều trên con đường sự nghiệp sau này.

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Ánh Hồng, cô đãhướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình làm đề tàivà đã chỉnh sửa bài viết rất cẩn thận.

Xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều

kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.

Cảm ơn Công ty cổ phần Dược Hậu Giang đã cung cấp mẫu để tôi thựchiện đề tài này.

Cảm ơn các thành viên của lớp Hóa học Khóa 36 đã chia sẻ và đồnghành trên những chặng đường vừa qua.

Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình luôn là chỗ dựa vữngchắc cả về vật chất lẫn tinh thần.

Chân thành cảm ơn







Bùi Thị Ngọc Hân iii 2102244

TÓM TẮT

Đề tài nhằm mục đích khảo sát hàm lượng triterpenoid tổng có trong mộtsố mẫu nấm Linh chi được cung cấp bởi Công ty cổ phần Dược Hậu Giang

bằng phương pháp UV–Vis với chất chuẩn là Oleanolic acid nồng độ 100 ppm. Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích bằng cách xây dựng các thínghiệm về xác định khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện

và giới hạn định lượng. Trên cơ sở đó xác định hàm lượng triterpenoid tổng sốtrong 10 mẫu nấm Linh chi đem đi phân tích. Kết quả nghiên cứu cho thấy

phương pháp đề ra là có thể được áp dụng vào định lượng triterpenoid tổngvới đường chuẩn của Oleanolic acid có hệ số tương quan R = 0,9999, độ đúngcủa phương pháp đạt 99,36%, độ lặp lại có RSD nhỏ hơn 2%, LOD và LOQlần lượt vào khoảng 0,3 và 0,9 ppm. Trong số 10 mẫu nấm Linh chi đem đi

phân tích thì mẫu số 2 chứa hàm lượng triterpenoid nhiều nhất (12361 mg/kgchiếm 1,236% trong số các thành phần có trong nấm Linh chi) và mẫu số 4chứa hàm lượng triterpenoid thấp nhất (6649 mg/kg chiếm 0,665%). Kết quảcủa đề tài làm cơ sở cho việc đánh giá chất lượng của các loại nấm Linh chi

đang bán trôi nổi trên thị trường hiện nay, đồng thời giúp ích cho việc lựachọn giống Linh chi tốt nhất để nuôi trồng ở qui mô công nghiệp trong nước tahiện nay.

Từ khóa: triterpenoid tổng, nấm Linh chi.






Bùi Thị Ngọc Hân iv 2102244

ABSTRACT

The theme aims to servey the total triterpenoid content in some Lingzhi

samples that provided by Hau Giang Pharmaceutical Corporation and some

other samples are bought floating at the Can Tho city by the method UV – Viswith standard substance is working Oleanolic acid concentration 100 ppm.

Proceed evaluation of analytical methods by constructing experiments is to

determine the linear range, accuracy, repeatibility, limit of detection and limit

of quantification. Base on that, were determined the total triterpenoid content

in ten Lingzhi samples. The research result show that the proposed method can

be applied to quantify the total triterpenoid content base on standard curve of

Oleanolic acid with correlation coefficient R = 0,9999, the accuracy of method

achieve 99,36%, the repeatibility has RSD less than 2%, LOD and LOQ are

about 0,3 and 0,9 ppm, respectively. Among the ten samples taken Lingzhi

analyzed, the no.2 contained most triterpenoid content (12361 mg/kg occupies

1.236% in the number of component in Lingzhi) and no.4 contained the lowest

concentration of triterpenoid (6649 mg/kg accounts for 0.665%). The result of

the study as a basis for evaluating the quality of Lingzhi are free to sold in the

current market, and help the cultivation of the best varieties Lingzhi at

industrical scale in our country today.

Keyword: the total triterpenoid, Lingzhi.






Bùi Thị Ngọc Hân v 2102244

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... i

LỜI CÁM ƠN .................................................................................................... ii

TÓM TẮT ......................................................................................................... iii

ABSTRACT ...................................................................................................... iv MỤC LỤC ......................................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vii

DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... iix

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

Chương 1 TỔNG QUAN ................................................................................... 3

1.1 Nấm Linh chi ....................................................................................... 3

1.1.1 Khái quát chung ......................................................................................... 3

1.1.1.1 Vị trí phân loại ..................................................................... 4

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái ............................................................... 4 1.1.1.3 Tình hình phân bố ................................................................ 5

1.1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi ........ 5

1.1.1.5 Bảo quản .............................................................................. 6

a. Bảo quản tươi ............................................................................. 6 b. Bảo quản khô ............................................................................. 7

1.1.1.6 Thành phần hóa học và đặc tính dược lý của nấm Linh chi 8 1.1.2 Khả năng chữa bệnh và một số ứng dụng lâm sàng của nấm Linh chi

……………………………………………………………………… 11

1.1.2.1 Khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi ............................. 11

1.1.2.2 Một số ứng dụng lâm sàng ................................................ 14 1.1.3 Giới thiệu sơ lược về hoạt chất có trong nấm Linh chi ....................... 15

1.1.3.1 Ganoderma polysaccharides (GLPs) ................................. 15

1.1.3.2 Ganoderma Adenosine ...................................................... 16

1.1.3.3 Alkaloid ............................................................................. 16

1.1.3.4 Hợp chất saponin ............................................................... 16

1.1.3.5 Germanium hữu cơ ............................................................ 17

1.2 Triterpenoid ..................................................................................... 18

1.3 Các nghiên cứu về định lượng triterpenoid tổng .............................. 21

Chương 2 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ PHƯƠNG PHÁP

ĐỊNH LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG ...................................................... 25 2.1 Phương pháp chiết triterpenoid trong dược liệu với sự hỗ trợ của

sóng siêu âm .................................................................................................... 25

2.2 Định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương phápUV - Vis ....................................................................................................... 26

2.3 Thẩm định phương pháp phân tích ................................................... 27

2.3.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định ..................................................... 27

2.3.2 Nội dung thẩm định ................................................................................ 27

2.3.2.1 Độ tuyến tính (Linearity) ................................................... 27

2.3.2.2 Độ đúng (Accuracy) .......................................................... 28






Bùi Thị Ngọc Hân vi 2102244

2.3.2.3 Độ lặp lại............................................................................ 29

2.3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of detection) ................. 29

2.3.2.5 Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification) ....... 30

Chương 3 THỰC NGHIỆM ............................................................................ 31

3.1 Phương tiện nghiên cứu ..................................................................... 31

3.1.1 Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................. 31

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị................................................................................... 31

3.1.3 Hóa chất .................................................................................................... 32

3.1.4 Thu mẫu .................................................................................................... 32

3.1.5 Qui trình chiết mẫu .................................................................................. 33

3.1.6 Qui trình chuẩn bị mẫu phân tích .......................................................... 34

3.1.7 Hoạch định thí nghiệm ............................................................................ 35

3.2 Kết quả thực nghiệm ......................................................................... 35

3.2.1 Các thí nghiệm ......................................................................................... 36

3.2.1.1 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn .... 36

a. Thí nghiệm về xác định khoảng tuyến tính ............................. 36

b. Xây dựng đường chuẩn ........................................................... 37

3.2.1.2 Xác định độ đúng của phương pháp .................................. 38

3.2.1.3 Xác định độ lặp lại của phương pháp ................................ 39

3.2.1.4 Giới hạn phát hiện (LOD) – Giới hạn định lượng (LOQ) . 39

3.2.2 Thực nghiệm trên mẫu ............................................................................ 40

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 43

4.1 Kết luận ............................................................................................. 43

4.2 Kiến nghị........................................................................................... 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 44

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 46






Bùi Thị Ngọc Hân vii 2102244

DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Dụng cụ-thiết bị thí nghiệm ......................................................... 31

Hình 3.2. Hình ảnh 10 mẫu nấm Linh chi ................................................... 32

Hình 3.3. Qui trình chiết triterpenoid tổng bằng sóng siêu âm ................... 34

Hình 3.4. Qui trình định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi ........ 34

Hình 3.5. Đồ thị khảo sát bước sóng hấp thụ của dung dịch chuẩn OA ..... 35

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ OA . 36

Hình 3.7. Đồ thị đường chuẩn Oleanolic acid ............................................. 38

Hình 3.8. Đồ thị so sánh hàm lượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu ......... 41






Bùi Thị Ngọc Hân viii 2102244

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi [9]

............... 9

Bảng 1.2. Lục bảo Nấm Linh chi và các tác dụng trị liệu [4] ........................... 11

Bảng 1.3. Các hoạt chất Triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh

chi (Lê Xuân Thám, 1996) ............................................................................... 20

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính .................................. 36

Bảng 3.2. Dãy dung dịch chuẩn làm việc của Oleanolic acid ......................... 37

Bảng 3.3. Độ hấp thụ của dãy chuẩn Oleanolic acid ...................................... 37

Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp ................................... 38

Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp ................................. 39

Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra (LOD) và (LOQ) ................................................. 39

Bảng 3.7. Hàm lượng Triterpenoid trong các mẫu nấm Linh chi ................... 41






Bùi Thị Ngọc Hân ix 2102244

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

UV – Vis: Ultraviolet –visible: Phổ tử ngoại–khả kiến

HPLC: High Performance Liquid Chromatography: Sắc ký lỏng hiệunăng cao

LOD: Limit of Detection: Giới hạn phát hiện LOQ: Limit of Quantification: Giới hạn định lượng Abs: Absorbance: Độ hấp thụ

OA: Oleanolic acid

ppm: part per million: một phần triệu

SD: Standard Deviation: Độ lệch chuẩnRSD: Relative Standard Deviation: Độ lệch chuẩn tương đối UAE: Ultrasonic –Assisted Extraction: chiết với sự hỗ trợ của sóng

siêu âm

MAE: Microwave –Assisted Extraction: chiết với sự hỗ trợ của visóng

AC băng: Acetic acid băng

GLPs: Ganoderma lucidum polysaccharides






Bùi Thị Ngọc Hân 1 2102244

MỞ ĐẦU

Ngày nay, xu hướng sử dụng các loại thảo dược thiên nhiên để trị bệnhđã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảodược đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới. Trong đó, nấm Linh chi làđối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia. Đặc biệt là các nước vùng Châu Á:

Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,… .

Ở Trung Quốc, “Lục bảo Linh chi” đã được nghiên cứu rất nhiều và sửdụng như là thảo dược quý để trị bệnh và có tác dụng như là bổ dưỡng, điềuhòa huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ, tăng trí nhớ, điều hòa hoạt độngtim mạch, hô hấp, lợi tiểu, bổ thận, trị đau nhức khớp xương, gân cốt…. Các

tác dụng của nấm Linh chi đã được khẳng định và xếp vào hàng “thượng

dược”, trị được bách bệnh.

Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ởtrong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Các thành phần hóa học cótrong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: Acid béo, Steroid,Alkaloid, Protein, Polysaccharide,…. Trong đó thành phần có tác dụng dượchọc đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc về nhóm triterpenoid. Trong

đó, các nhà nghiên cứu đã nhận định rằng triterpenoid có các hoạt tính sinh

học đáng kể như là: chống oxi hóa, bảo vệ gan, chống dị ứng, chống khối u,làm giảm lượng cholesterol trong máu cũng như là ngăn chặn sự kết dính các

tiểu cầu,…. Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid thay đổi theo từng giống nấmLinh chi, môi trường nuôi trồng và giai đoạn bào tử của nấm Linh chi. Do đó,

cần phải có phương pháp tách chiết cũng như phương pháp định lượngtriterpnoid tổng trong nấm Linh chi một cách có hiệu quả, đơn giản, với độchính xác cao và phù hợp với từng cơ sở thí nghiệm. Trong đó phương phápUV –Vis là phương pháp được ứng dụng rộng rãi và đáp ứng được các yêu cầunêu trên.

Do vậy mà chúng tôi thực hiện đề tài “Bước đầu xây dựng phươ ng

pháp xác định hàm lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV– Vis ” nhằm đưa ra phương pháp đơn giản, hiệu quả và vớiđộ chính xác cao để xác định hàm lượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu nấmLinh chi được cung cấp bởi Công ty Dược Hậu Giang, từ đó có thể lựa chọn, đánh giá và so sánh được chất lượng của các loại nấm Linh chi được bán trôinổi trên thị trường hiện nay, tránh hiện tượng nhầm lẫn giữa nấm Linh chi thậtvà nấm Linh chi giả ảnh hưởng đến sức khỏe mọi người.







Mục tiêu đề tài

Trong khuôn khổ của một luận văn tốt nghiệp cùng với điều kiện trang

thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm, đề tài hướng tới các mục tiêu:

Chiết triterpenoid trong nấm Linh chi bằng ethanol 96%. Thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng triterpenoid tổng

trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV –Vis với Oleanolicacid (nồng độ 100 ppm) làm chất chuẩn

Áp dụng phương pháp đã được thẩm định vào phân tích hàmlượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu nấm Linh chi được cung

cấp bởi Công ty Dược Hậu Giang.







Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Nấm Linh chi

1.1.1 Khái quát chung

Nấm Linh chi, viết theo kiểu phiên âm Trung Hoa là Lingzhi, tên Nhật làReishi, ở Hàn Quốc gọi là Youngzhi, tên khoa học là Ganoderma Lucidum, ởViệt Nam nấm Linh chi còn có tên gọi là nấm Lim. Nấm Linh chi còn có

những tên khác như Tiên Thảo, nấm Trường Thọ, Vạn Niên Nhung. Gọi lànấm nhưng khác với một số nấm ăn thông thường, nấm Linh chi có nhiều hình

dáng khác nhau, chẳng hạn: hình thận, gạc nai. Màu sắc của nấm Linh chi

cũng phong phú: đỏ, vàng, tím, đen, xanh, trắng. Nấm Linh chi thường phân

bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗmục hoặc các nguyên liệu có chất xơ [1-2]

.

Trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây khoảng 2000 năm thời nhàChâu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân

ra thành “Lục Bảo Linh chi” (thời nhà Minh) với các khái quát công dụngdược lý khác nhau, ứng theo từng màu:

Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)

Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)

Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi) Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)

Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)

Tử chi (Linh chi tím)

Cho đến nay nấm Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nướcTrung Quốc, mà mang tính toàn cầu. Hiện tại có khoảng 250 bài báo của cácnhà khoa học liên quan đến dược tính và các ứng dụng lâm sàng của nấm Linhchi đã được công bố.

Cấu trúc độc đáo của nấm Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượngđủ loại, trong đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, chrom,….Chúng đã được sử dụng là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chốngung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫntruyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm lượng rất thấp.

Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan,…việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng nấm Linh chi đang được côngnghiệp hóa với qui mô lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào







chế dược phẩm. Đồng thời nghiên cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lývà phương pháp điều trị lâm sàng.

Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê HữuTrác (1720 –1791) cũng đề cập đến nấm Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn cònkhẳng định, đây là nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong

quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” (1991), giáo sư Đỗ Tất Lợi còn mô tảchi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của loài nấm này, đồng thời cho rằngđây là loại “siêu thượng dược”.

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Nấm Linh chi có vị trí phân loại rộng rãi hiện nay [3]:

Giới: Fungi

Ngành:Basidiomycota

Lớp: Basidiomycetes

Bộ: Polyporales

Họ: Ganodermataceae

Chi: Ganoderma

Loài: Ganoderma lucidum

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Nấm Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn

200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài. Nấm Linh

chi là một trong những loại nấm phá gỗ, nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa,

trên thân cây hoặc gốc cây [2]

.

Nấm Linh chi (quả thể) gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến

đối diện với mũ nấm) [4,5]. Cuống thường đơn có khi phân nhánh, thẳng ít khi

cong quẹo, hình trụ hoặc trụ dẹt, nở rộng về phía mũ nấm, thường đính vào mũ

ở bên đôi khi ở gần tâm. Lớp vỏ cuống láng bóng, màu nâu đỏ– nâu đen, phủsuốt đến một phần mặt trên mũ. Chất mô cuống chắc, dai; mặt cắt ngangcuống thường chia làm 2 vùng phân biệt rõ bằng một vòng ranh giới cứng như

gỗ, vùng trong thường xốp và đầy những lổ nhỏ li ti, khắp trong cùng mỗivùng có những vệt nâu đen cứng như gỗ.

Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có dạng thận, gần tròn, đôi khixòe hình quạt hoặc có hình dạng khác thường, dày ở gốc và mỏng dần về phía

mép, nơi đính cuống thường lõm xuống ít nhiều nhưng có khi gồ lên hay

phẳng. Mặt trên mũ nấm láng bóng khi không có bụi bào tử phủ lên, thườngmàu nâu đỏ nhưng đậm nhạt khác nhau, đôi khi màu nâu vàng, nâu đất, nâu







tím, đen ánh xanh. Các vân đồng tâm thường rõ nhưng có khi ít rõ vì rãnh giữacác vân rất cạn, đồng nhất. Mặt dưới mũ nấm màu vàng xám hơi nâu với cácvết trầy xước màu nâu đất hay vàng chanh với các vết xước mà trắng.

Bào tử nấm hình trứng hoặc hình trứng cụt đầu, có phần phụ không màu phát triển bao quanh lỗ nảy mầm có màu vàng rỉ sắt, bào tử có vỏ với cấu trúc2 lớp màng, màng ngoài nhẵn, không màu, màng trong màu nâu rỉ, phát triểnthành những gai nhọn vươn sát màng ngoài, nối liền hai lớp vỏ. Khi nấm đếntuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm

[5].

1.1.1.3 T ình hình phân bố

Nấm Linh chi có nguồn gốc từ thực vật Ganoderma lucidum. Nhóm nấm

Linh chi bao gồm các loài sống kí sinh trên cây gây mục ruỗng, trên cây chết

hoặc đã chặt hạ, trên rễ cây mục hoặc đất có mùn gỗ mục và thường là các loàicó hệ enzyme mạnh, phân hủy gỗ cây nên mục trắng gỗ, gây hại cây rừng, cây

công nghiệp, cây ăn quả.

Thời xưa người ta chỉ có thể tìm thấy trong rừng, trên những núi cao chứkhông cách gì gây giống được. Có sách nói nấm Linh chi được tìm thấy ở phíatây núi Thái Hàng, Trung Quốc, nó thường mọc ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng vàđộ ẩm cao. Những cây thường có nấm Linh chi là cây mận, dẻ (pasania) và

guereus serrata. Tuy nhiên trong hàng vạn cây già, chỉ có hai ba cây có nấm

Linh chi. Vì thế nấm này rất hiếm ở dạng thiên nhiên [6].

Chính vì thế trong lịch sử không biết bao nhiêu người đã tìm cách gâygiống và trồng loại nấm này nhưng đều thất bại. Mãi tới năm 1971, hai nhà

bác học người Nhật tên là Yukio và Zenzaburo Kasai, giáo sư của khoa nôngnghiệp, Đại học Kyoto mới thành công trong việc gây giống và người ta mới

sản xuất được vị thuốc này một cách qui mô. Từ đó nấm Linh chi được trồngvà sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới.

1.1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm L inh chi

Để nấm Linh chi có thể phát triển tốt thì phải đầy đủ các điều kiện [1]:

Dinh dưỡng

Nguồn cacbon: chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh bột, pectin, lignin, cenlulose, hemicenlulose, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và

tạo thành các chất cần thiết.

Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu

ure, muối amon, sulphate amon. Tuy nhiên, Nitơ không được quá nhiều làmcho sợi nấm mọc quá nhiều khó hình thành quả thể.







Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1. Giai đoạn hìnhthành quả thể, tỉ lệ là 30/1 hay 40/1.

Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K.

Nhiệt độ Giai đoạn nuôi sợi, nấm Linh chi sinh trưởng tốt nhất ở 20– 30°C.

Giai đoạn hình thành quả thể thì nhiệt độ thích hợp nhất là 22– 28°C.

Nhiệt độ không nên thay đổi quá lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triển

thành tán mà ở dạng sừng hươu, dạng đuôi ngựa.

Độ ẩm

Hàm lượng nước môi trường thường 65% là vừa, quá nhiều hoặc quá ít

sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm. Độ ẩm không khí giữ ở 85– 95%,nuôi cấy trong phòng cần giải quyết vấn đề về độ ẩm và thông thoáng gió.

Nấm Linh chi là loại háo khí vì vậy cần thông gió, giữ độ ẩm và nhiệt độthích hợp. Khi nuôi cấy nấm trong tầng lỏng cần phải lắc 100– 150 vòng/phút.

Lắc mạnh dễ làm sợi nấm đứt đoạn.

Ánh sáng

Giai đoạn nuôi sợi: không cần ánh sáng.

Giai đoạn hình thành quả thể cần ánh sáng tán xạ và cường độ ánh sáng phải cân đối từ mọi phía.

Trị số pH

pH của môi trường nuôi nấm Linh chi là 3 –7,5, thích hợp nhất là 5– 6.

Trong môi trường lỏng là 4,5–5. Trong vật liệu trồng nấm điều chỉnh pH từ

5,8 –6 là vừa.

1.1.1.5 Bảo quản

Có 2 dạng bảo quản nấm Linh chi: bảo quản ở dạng tươi và dạng khô [7].

a. Bảo quản tươi

Nấm Linh chi sau khi đã được thu hoạch, rửa bề mặt nấm bằng nướcsạch không cho mùn cưa bám lại thân nấm. Để đưa đến tay người tiêu thụ, cầnmột thời gian bảo quản thích hợp để giữ được độ dinh dưỡng và sự thơm ngon

của nấm trước khi tung ra thị trường tiêu thụ.

Vớ i nấm tươi, chỉ giữ được thời gian ngắn, bằng cách làm chậm sự phát

triển, giảm cường độ hô hấp, chống thoát nước và bảo quản ở nhiệt độ thấp.







Thời gian bảo quản có thể kéo dài và trọng lượng không giảm, nếu nấmđược bảo quản lạnh ở nhiệt độ 0– 12°C. Ngoài ra người ta cũng thử bảo quảnnấm bằng chiếu xạ hoặc bằng các loại hóa chất khác nhau, kể cả chất chốngoxi hóa…. Nhưng thường ít hiệu quả và nhất là không kinh tế.

Ưu điểm:

Giữ được màu sắc, mùi vị, sự thơm ngon, độ dinh dưỡng tối ưu nhất của

nấm trước khi đưa ra thị trường.

Không mất nhiều công sức, nhiều thời gian cho việc bảo quản, nên tiết

kiệm được chi phí bảo quản sau thu hoạch.

Nhược điểm:

Thời gian lưu giữ, bảo quản rất ngắn, muốn duy trì sản phẩm có tuổi thọ sửdụng tươi được cao hơn phải dùng hóa chất bảo quản, điều đó không tốt chosức khỏe người tiêu dùng và đôi lúc có sự biến đổi về chất và lượng của nấm .

Dễ bị sinh vật, côn trùng và các vi sinh vật xâm nhập và gây hại.

b. Bảo quản khô

Cũng giống như một số loại nấm khác, có thể bảo quản nấm Linh chi khô

trong thời hạn từ 6 tháng trở lên trong điều kiện khô ráo ở nơi thoáng mát.

Có 2 phương pháp để làm khô nấm Linh chi đó là phương pháp “phơinắng” và phương pháp “sấy khô” (dùng hơi nóng) để bảo quản.

Phương pháp phơi nắng

Là phương pháp làm khô nấm để bảo quản sử dụng nguồn năng lượng từtự nhiên là năng lượng mặt trời.

Ưu điểm:

Tiết kiệm chi phí và công sức

Giảm tải cho máy sấy

Bảo quản nấm lâu hơn, từ đó kéo dài thời gian sử dụng nấm

Là giai đoạn làm khô nấm hiệu quả trước khi đưa vào máy làmkhô nấm hoàn toàn.

Nhược điểm:

Nấm Linh chi phơi nắng không tốt bằng sấy cả về màu sắc vàmùi vị

Nấm phơi nắng dễ bị nhiễm mốc

Phụ thuộc vào thời tiết, nắng phơi nấm phải là nắng gắt, nên phơi không đủ nắng hay đôi lúc có những cơn mưa bất chợt dễ







làm cho nấm bị ẩm mốc, sẽ làm cho nấm trở nên độc hại hoặclàm giảm tính năng và tuổi thọ sử dụng của nấm.

Phương pháp sấy khô bằng máy

Là phương pháp làm khô nấm để bảo quản sử dụng hơi nóng từ máy sấy nấm. Để cho khỏi mục nát, cần phải sấy khô nhưng phương pháp sấy, tàng trữvà bảo quản phải được thi hành đúng cách. Phương pháp mới nhất là sấy nấm

Linh chi bằng lò sấy. Để sấy nấm người ta dùng tủ nhiều ngăn và cung cấpkhông khí nóng để làm khô. Nấm được làm mất nước từ từ, kéo dài 4 giờ.

Nấm sấy giữ được mùi vị và màu sắc tốt hơn phơi nắng. Thường cứ khoảng 3kg nấm tươi được 1 kg nấm khô.

Để bảo quản nấm, người ta thường dùng túi nilon 2 lớp, sau đó dùng tay

vuốt ngược từ đáy túi lên miệng túi để không khí ra hết, cho nấm vào rồi buộckín từng lớp một. Dùng bao tải để đựng và bảo quản nơi khô ráo. Thời gian bảo quản có thể từ 12– 18 tháng.

Ưu điểm:

Giữ được màu sắc và mùi vị tốt hơn phương pháp phơi nắng

Tiết kiệm thời gian và hiệu quả cao

Bảo quản được lâu nhất trong các phương pháp đồng thời tránhđược những rủi ro từ phương pháp phơi nắng.

Nhược điểm: Tốn kém chi phí vì phải mua máy sấy.

Chính những ưu điểm mà nó mang lại, phương pháp sấy khô bằng máyngày càng được sử dụng rộng rãi, phổ biến trong các cơ sở trồng và sản xuất

các loại nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng.

Lưu ý: Cần bảo quản nấm Linh chi ở nơi khô thoáng, không ẩm mốc tránhtrường hợp nấm hút ẩm trở lại.

1.1.1.6 Thành phần hóa học và đặc tính dược lý của nấm L inh chi

Viện nghiên cứu tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc nghiên cứu thành phầnhóa học của nấm Linh chi mọc hoang dại thấy

[4, 2]:

Nước 12– 13%

Hợp chất phenol 0,08– 0,1%

Lignin 13 – 14%

Hợp chất có N 1,6– 2,1%

Tro 0,022%

Xelluloza 54 – 56%

Chất béo 1,9– 2%







Chất khử 4– 5%

Hợp chất steroid 0,14– 0,16%

Ergosterol (C28H44O).

Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên tìm thấy acid amin, protein,

saponin, steroid.

Học viện Y học Bắc Kinh phát hiện đường khử và đường kép acid amin,

dầu béo.

Theo những công trình nghiên cứu mới nhất của Viện nghiên cứu nấm

Linh chi hoang dại của toàn Trung Quốc trong hỗn hợp 6 loại nấm Linh chi có

hàm lượng Germanium cao hơn lượng Germanium có trong nhân sâm từ 5 đến

8 lần. Germanium giúp khí huyết lưu thông, các tế bào hấp thu oxi tốt hơn.

Lượng polysaccharide cao có trong nấm Linh chi tăng cường sự miễn dịch củacơ thể, làm mạnh gan, cô lập và diệt tế bào ung thư. Acid ganoderic có tácdụng chống dị ứng và chống viêm.

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiên đại: phổ kếUV (tử ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng– sắc ký khí (GC–MS), phổ

cộng hưởng từ hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC)cùng phổ kế Plasma (ICP), đã xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫnxuất trong nấm Linh chi.

Bảng 1.1. Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi [8]

Thành phầnhoạt chất

Nhóm chất Hoạt tính dược lý

Cyclooct asulsus Ức chế giải phóng Histamine

Adenosine NucleotideỨc chế kết dính tiểu cầu, thưgiãn cơ, giảm đau

Dẫn xuất ProteineChống dị ứng phổ rộng, điềuhòa miễn dịch

Ling Zhi - 8 Alkaloid Trợ tim

Ganodosterone Steroid Giải độc gan

Lanosporeric acid A Steroid Ức chế sinh tổng hợp

Lanosterol Steroid Choesterol

Ganoderans A, B, C Polysaccharide Hạ đường huyết







D – Glucans PolysaccharideChống ung thư, tăng tính miễndịch

D – 6 PolusaccharideTăng tổng hợp protein, tăngchuyển hóa acid nucleic

Ganoderic acid R, S Triterpenoid Ức chế giải phóng Histamine

Ganoderic acid B, D, F,

H, K, YTriterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE

Ganoderic acids TriterpenoidỨc chế sinh tổng hợpcholesterol

Ganodermadiol Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế ACE

Ganodemic Acid T – O Triterpenoid Ứng chế tổng hợp Cholesterol

Ganodemic Acid Mf Triterpenoid Ứng chế tổng hợp Cholesterol

Lucidone A Triterpenoid Bảo vệ gan

Lucidenol Triterpenoid Bảo vệ gan

Ganosporelacton A Triterpenoid Chống khối u

Ganosporelacton B Triterpenoid Chống khối u

Oleic acid dẫn xuất Acid béo Ức chế giải phóng Histamine

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpenoid mới, bao gồmLucidumol A và B, các Ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đókiểu Lanostane triterpenoid có thành phần chính là lipophilic. Có khoảng 130hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi và bào tử nấm Linh chi. Triterpenoid

có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV, thành phần và hàmlượng triterpenoid phụ thuộc vào nguồn giống và yếu tố môi trường[2]

.

Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và triterpenoid của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh

viêm gan mãn tính, bệnh đái tháo đường loại 2 (type II diabetes mellitus) [9]

.He, Y.et al (1992) đã khảo cứu các BN3B –gồm 4 polysaccharide đồng

nhất có hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là Glucan

(chỉ chứa Glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kếtglucoside.

Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyếtcủa nhiều polysaccharide. Các heteroglycan có hoạt tính chống ung thư, cácganoderan B có tác dụng làm tăng mức insulin trong huyết tương, giảm sinh

tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sởtrị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường.







Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương phápdung hợp Protoplast giữa chủng G.lucium với G.applanatum, thậm chí với cảnấm Hương (Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u củacác phức hợp polysaccharide–protein lên đáng kể.

Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợpIL – 2 (Interleukine –2) và hoạt tính AND polymerase ở chuột già bởi

polysaccharide, càng tăng khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của nấm Linh chi.

Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứngtỏ hiệu lực chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỉ lệ ¾ ở các loàiG.lucium và G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993).

Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine,

triterpenoids và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chếgiải phóng Histamine, ức chế Angiotensine Conversino enzyme (ACE), ức chếsinh tổng hợp Cholesterol và hạ huyết áp.

1.1.2 Khả năng chữa bệnh và một số ứng dụng lâm sàng của nấm Linh chi

1.1.2.1 Khả năng chữa bệnh của nấm L inh chi

Nấm Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm

trước ở Trung Quốc đã khẳng định nấm Linh chi là nhân tố quan trọng chonhiều phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu nội mạch,

giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào. Giá trịdược liệu của Nấm Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị Nấm học thếgiới thành lập Viện nghiên cứu nấm Linh chi Quốc tế tại New York [10-12]

.

Bảng 1.2. Lục bảo Linh chi và các tác dụng trị liệu [4]

Tên gọi Màu

sắc Đặc tính dược lý

Thanh chi(Long chi)

Xanh Vị chua, tính bình, không độc, chữa trị sáng mắt, bổ gankhí, an thần, tăng trí nhớ.

Hồng chi (Xích chi) Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim,

bổ trung, trị tức ngực.

Hoàng chi (Kim chi) Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần.

Bạch chi (Ngọc chi) Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, anthần, chữa ho nghịch hơi.

Hắc chi (Huyền chi) Đen Vị ngọt, tính bình, không độc, trị bí tiểu, ích thận khí.

Tử chi Tím Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị đau nhức xương khớp.







Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụngcụ thể của nấm Linh chi được tập hợp vào những mặt tác dụng lớn như sau

[13]:

Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn). Bảo can (bảo vệ gan).

Cường tâm (thêm sức cho tim).

Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá). Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp). Giải độc (giải toả trạng thái nhiễm độc).

Giải cảm (giải tỏa trạng thái bị cảm). Trường sinh (sống lâu, tăng tuổi thọ).

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi,

người ta thấy nấm Linh chi có tác dụng rất tốt với một số bệnh [1-2]

:

Đối với các bệnh tim mạch: Hàng loạt các hoạt chất của nấm Linh chi được chứng tỏ có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cholesterol, kìm hãm quátrình kết tụ tiểu cầu. Các nghiên cứu này được củng cố để có kết quả trị liệucho các bệnh nhân cao huyết áp, nhiễm mỡ xơ mạch, bệnh mạch vành tim,.. ..

Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm.Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô.

Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm nấm Linh chi được xem như là một

chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệuung thư. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh chi có tác dụnggiảm cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỉ trọng cao trong máu,

làm giảm hệ số sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu,giảm nồng độ mỡ trong máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim.

Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất làvới những ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụnggiảm và làm nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.

Khả năng miễn dịch: nấm Linh chi chứa một lượng lớn Germanium hữucơ, polysaccharides và triterpenoids. Những thành phần này đã được chứngminh là tốt hơn cho hệ miễn dịch và cải thiện hệ miễn dịch của chúng ta.

C hữa bệnh gan: Ở Trung Quốc, nấm Linh chi thường được kê vào đơnthuốc cho những bệnh nhân bị viêm gan mãn tính. Trong điều trị lâu dài từ 2đến15 tuần thì tỉ lệ chữa hiệu quả là từ 70,7–98 %. Ở Nhật, phần chiết nấm

Linh chi đã được báo cáo là có hiệu quả đối với những bệnh nhân suy gan.

Hiệu quả chống ung thư: Trong một nghiên cứu cho thấy nấm Linh chicó thể ngăn chặn sự bám dính và sự di căn của những tế bào ung thư tuyến vú







và tuyến tiền liệt. Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải phẫuvới trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dàycó thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm.

Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long

não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt–khối u tiêu biến hoàn toàn.

Khả năng kháng HIV: để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợpchất trong nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thểtrong thử nghiệm kháng virus HIV– 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sựnhân lên của virus được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt

các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV–1. Kết quả cho thấy có sự ứcchế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này (Gau J.P, 1990; Kim,

1996). Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh

chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001).

Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV– 1.

Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1.

Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth– A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma).

Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane Triterpenoid với

nhóm hydroxol (-OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV– 1,Meth –A và LLC ở chuột.

Khả năng antioxidant: nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các

saponine và triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quảnhất (Wang C.H, 1985).

Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu

Selenium –một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxidant rất mạnh– vào nấm Linh

chi. Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ,trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và nấm Linh chi Việt Nam nói riêng.

Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốctự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ. Chúnglàm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơthể. Ngoài ra nấm Linh chi còn có tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khíchữa trị đau nhức khớp xương, gân cốt,….







1.1.2.2 Một số ứng dụng lâm sàng

Một số các kết quả lâm sàng từ việc sử dụng nấm Linh chi [1-2]:

Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa Sơn thuộc Viện Y học số 1

Thượng Hải báo cáo: Dùng cả 2 loại nấm Linh chi nhân tạo và nấm Linh chi hoang dại chế thành viên (mỗi viên tương đương 1 g thuốc sống), mỗi lầnuống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày đến 2 tháng. Trị 225 ca, tỷ lệ

đạt được 83,5 –86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần, điều tiết thần kinh

thực vật và tăng cường thể lực (theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề về bệnhhệ thống thần kinh 1976,3:1440).

Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng

khuẩn tố công nghiệp Tứ Xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca

thuốc có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỉ lệ kết quả 86% (theo báocáo đăng trên báo thông tin Trung thảo dược 1973,1:31).

Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu nấm Linh chi tỉnh Quảng

Đông báo cáo dùng siro nấm Linh chi và đường nấm Linh chi, tr ị 1.110 ca cókết quả và có nhận xét là thuốc có tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn (theo

tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông 1979,1:1).

Trị viêm gan mãn tính: Dùng polysaccharide chiết xuất từ nấm Linh chi hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn

hoạt động, viêm gan mạn kéo dài và xơ gan.

Trị chứng giảm bạch cầu: Dùng polysaccharide chế thành viên (mỗiviên có 250 mg thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kếtquả 72,57% (Báo cáo của Lưu Chí Phương đăng trên tạp chí Trung Hoa Huyếtdịch bệnh 1985,7:428).

Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: Dùng

nấm Linh chi chế thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ

lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ 43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kếtquả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả 78,88% (thông tin nghiên cứu Y học1984,12:22).

Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét bao tử, rối loạn tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bộitử, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương.

T rị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch máu não: thường phối

hợp với Kê huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty

tử, Hoàng tinh. Thuốc còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực.







Dùng giải độc các loại khuẩn: Phối hợp với cam thảo, gừng, táo.

Ngoài ra, sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi

có ghi: Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kì mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ,dùng lâu ngày giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh

chi về nấu canh, nấu súp làm món ăn cao cấp.

1.1.3

Giới thiệu sơ lược về hoạt chất có trong nấm Linh chi

1.1.3.1 Ganoderma polysacchar ides (GLPs)

Polysaccharide là một trong những thành phần hữu hiệu nhất chứa trong

Nấm Linh chi, rất được các nhà y dược học coi trọng. Thành phần polysaccharide ở nấm Linh chi (Ganoderma lucidum polysaccharide) nay đã

được phân ly thành hơn 200 loại, trong đó phần lớn là chất thuộc loại kết cấu,tồn tại ở thành tế bào, và một số ít là chất tồn trữ, tồn tại ở trong tế bào.

Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh

chi. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn

ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trênkhung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000 – 1.000.000, đa số chúng tồntại phía trong vách tế bào. Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan

trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng [2,14]

.

Hoạt tính dược lý của polysaccharide ở nấm Linh chi có liên quan đếnkết cấu lập thể, cấu hình lập thể dạng xoắn ốc bị phá hủy thì hoạt tính của

polysaccharide giảm đi nhiều. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trườngdịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị.

Vai trò dược học của polysaccharide:

Kích thích hệ miễn dịch cơ thể

Gia tăng khả năng dung nạp oxygen

Giảm gốc tự do hydroxyl Ức chế khối u phát triển

Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ

Tăng chức năng gan

Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường

Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein.







1.1.3.2 Ganoderma Adenosine

Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc

nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều cóhoạt tính dược liệu mạnh

[6].

Chức năng của adenosine:

Giảm độ nhớt máu

Ức chế kết dính tiểu cầu

Ngăn chặn hình thành cục nghẽn

Tăng lượng lipoprotein 2– 3 phosphoricglycerin

Tăng khả năng vận chuyển oxy và làm tăng lưu lượng máu cung

cấp cho não

Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể.

1.1.3.3 Alkaloid

Alk aloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng,có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đadạng. Tuy nhiên cũng có một số alkaloid không có nhân dị vòng với nitơ vàmột số alkaloid không có phản ứng kiềm. Một số alkacoid còn có thể có phảnứng acid yếu do có nhóm chức acid trong phân tử

[1-2].

Đa số alk aloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn. Một vài alkaloid ởdạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng và có màu.

Các alk aloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường

tan trong dung môi hữu cơ: chloroform, ether diethyl, alcol bậc thấp. Các muốicủa alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môihữu cơ như: chloroform, ether, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của cácalk aloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alkaloid ra khỏi nguyên

liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống.

Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong

ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alkaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alkaloid.

Tác dụng lên hệ thần kinh

Tác dụng lên huyết áp

Tác dụng trị ung thư.

1.1.3.4 Hợp chất saponin

Saponin là một nhóm chất trao đổi thứ cấp quan trọng trong thế giới thựcvật. Tên gọi saponin bắt nguồn từ từ Sapo trong tiếng Latinh, có nghĩa là xà







phòng. Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụnglàm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt. Saponin thường ởdạng vô định hình, có vị đắng

[1-2].

Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200°C trở lên và có

thể trên 300°C. Saponin bị tủa bởi chì acetate, hydroxide barium, sulfateamonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. Saponin là một loạiglycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần khôngđường gọi là aglycon.

Về phương diện hóa học, saponins được xác định gồm những cấu trúckhác nhau: triterpenoids, glycosylated steroids và steroidal alkaloids.

Saponin tri terpenoid : Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30

cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm: Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này

có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean,ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tựnhiên đều thuộc nhóm olean.

Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan,

cucurbitan.

Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spiroalan, spirostan, furostan,

aminofurostan, solanidan.

Vai trò dược học.

Trị long đờm, chữa ho.

Là chất phụ gia trong một số vắc xin.

Tác dụng thông tiểu.

Tác dụng kháng viêm, chống khối u.

1.1.3.5 Germanium hữu cơ

Germanium là nguyên tố hiếm, do nhà hóa học người Đức khám phávào năm 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thếchức năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoànmáu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế làm tăng mức độ trao đổi chất và ngănchặn quá trình lão hóa

[3].

Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường

trong cơ thể và bảo vệ sức khỏe. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo







trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hòa và kiểm soát quá trình này,từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển.

Chức năng của Germanium:

Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện

ung thư.

Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ

Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ.

1.2 Triterpenoid

Triterpenoid được phân bố rộng rãi trong giới thực vật, động vật. Chúng

tồn tại dưới dạng tự do như các ester hoặc dạng glucosid.

Triterpenoid được phân lập lần đầu tiên vào năm 1982 bởi Kubota et al.,sau đó hơn 130 loại triterpenoid được phân lập từ quả thể, bào tử và sợi nấmLinh chi.

Triterpenoid có tác dụng sinh học trong giảm nguy cơ ung thư, làm giảm

cholesterol, giúp máu lưu thông tốt, làm giảm huyết áp, nếu dùng lâu dài nóđược coi là kháng sinh tự nhiên, chống oxi hóa.

Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Cáctriterpenoid có bộ khung chính từ 27–30 nguyên tử carbon (C18H48) rất thường

gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phầnđường), cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; ether -O-;

Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trongether dầu hỏa, hexan, etherethyl, chloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khichúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid.

Có thể chia triterpenoid thành 3 nhóm dựa vào cấu trúc: không vòng, 4

vòng và 5 vòng. Nhiều triterpenoid chuyển hóa từ nhóm nọ sang nhóm kia. Sựchuyển hóa bao gồm việc thay đổi nhóm – COOH thành nhóm – CH3 tương

ứng thành nhóm – CH2OH [15].

Tr iterpenoid không vòng: Squalen (cấu hình trans hexane), Ambrein.

Squalen







Squalen được phát hiện lần đầu từ gan cá mập Squalus, ngoài ra còn

được tìm thấy trong một số loại nấm, dầu olive.

Tr iterpenoid 4 vòng: thuộc loại squalenoxid (mọi vòng 6C đều ở cấuhình trans với nhau): Lanosterol, Protosterol, Agnosterol, Cycloaudinol.

Thuật ngữ saponin chỉ một nhóm glycosid có đặc tính chung là khi hòa

tan vào nước sẽ có tác dụng giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều

bọt. Dưới tác dụng của các enzyme thực vật hoặc vi khuẩn, hoặc acid loãng,saponin thủy phân tạo thành genin và phần đường gồm 1 hoặc nhiều phân tử

oza. Genin do saponin thủy phân gọi là sappogenin.

Có thể chia làm 2 nhóm lớn là sapogenin triterpen và sapogenin steroid.

Về phần đường, các oza phổ biến là D– Glucoza, D – Lactoza, L – Arabinoza,

L – Ramnoza, acid galacturonic, acid D –Glucuronic….Đại đa số các oza gắnqua nhóm – OH ở C3 của sapogenin, một số khác gắn ở C16 hoặc qua COOH(ở vị trí C28).

Nhóm sapogenin triterpen 4 vòng chiếm số lượng không nhiều trong tựnhiên, nhưng điều là những sapogenin quan trọng. Đáng chú ý nhất là các chất

Panaxozid trọng họ Nhân Sâm Panax gingseng C.A. Meyer, các Cururbitacin

trong họ bầu bí (Cururbitaceae).

Tr iterpenoid 5 vòng: được chia làm 3 nhóm dựa trên quan hệ đã được

xác định với một trong 3 chất tiêu chuẩn là myrin, myrin và Lupeol.

Nhóm amyrin: amyrin, acid Ursolic, acid Asiatic, acid

Xentoic, acid Quinovic. Nhóm này có rất ít trong tự nhiên.

amyrin Acid Asiatic

hóm amyrin: myrin, acid Oleanolic, acid Albigenic,acid

Cincholic, Erythrodiol, Soya sapogenol A, B, C,…. Nhóm này chiếm đa sốtrong sapogenin triterpen, phổ biến nhất là saponin của acid Oleanolic.







Acid Oleanolic Acid Albigenic

Nhóm Lupeol: Lupeol, Betulin, Taraxasterol, Thuberogenin…. Nhóm

dẫn xuất này cũng ít gặp.

Acid Butelinic Lupeol

Triterpenoid 5 vòng có tính acid tồn tại phổ biến hơn trong thực vật.

Bảng 1.3. Các hoạt chất Triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh

chi (Lê Xuân Thám, 1996)

Hoạt chất Hoạt tính

Ganoderic acid R, S Ức chế giải phóng histamine

Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp

Ganodermadiol Hạ huyết áp

Ganoderic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganoderic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganoderic acid Ức chế tổng hợp cholesterol

Chú ý: Nhóm hoạt chất dược lý triterpenoid là sử dụng từng triterpenoidtinh khiết riêng rẽ thì hoạt lực thấp hơn khi dùng các phân đoạn tách chưa tinhchế. Có nghĩa là khi sử dụng tổ hợp các đồng phân của chúng sẽ có hiệu quảhơn. Nên việc sử dụng nấm Linh chi thường dùng toàn bộ dịch chiết từ nấm.







1.3 Các nghiên cứu về định lượng triterpenoid tổng

Triterpenoid là một nhóm chất rất đa dạng, chúng được phân bố rộng rãi

trong nhiều loài động, thực vật khác nhau. Chúng có nhiều tác dụng dược họcđáng quý mà khoa học đã chứng minh được, vì thế đã có rất nhiều các công

trình nghiên cứu định lượng cũng như nhận biết các hoạt chất thuộc nhóm

triterpenoid trên thế giới đã được thực hiện bằng nhiều phương pháp bởi nhiềunhà khoa học khác nhau.

Trong đó, để xác định hàm lượng triterpenoid tổng thì phương pháp đượcsử dụng phổ biến nhất đó là phương pháp so màu, trong nhiều công trình củanhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này thì có một số điểm khác

biệt giữa các qui trình như là: khác nhau về bước sóng hấp thụ, khác nhau vềchất chuẩn, chất hiện màu, thời gian cũng như là dung môi chiết mẫu.

1. Theo Xiang và các cộng sự (2001) đã sử dụng phương pháp so màu đểđịnh lượng triterpenoid tổng số trong lá Ceriops Decandra với chất chuẩn làOleanolic acid (nồng độ gốc là 604 g/L). Đường chuẩn được xây dựng với cácống nghiệm 10 mL chứa lần lượt 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 và 0,6 mL dung dịchchuẩn gốc, thêm vào 0,2 mL hỗn hợp 5% vanillin– acetic acid (w/v) và 1,2 mL

acid perchlor ic, ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong khoảng 15 phút, sau đó làmlạnh trong chậu nước đá khoảng 2 phút. Cuối cùng thêm ethyl acetate vào đểtổng thể tích đạt được 5 mL, để nguội ở nhiệt độ phòng. Mẫu trắng được

chuẩn bị là dung dịch acetic acid. Độ hấp thụ được quét trên máy UV– Vis

trong vùng bước sóng 200–700 nm. Độ hấp thụ A của chất chuẩn sẽ được xác

định ở bước sóng 550 nm trong curve dày 1 cm. Hàm lượng triterpenoid tổngsẽ được xác định dựa vào đường chuẩn. Cũng theo Xiang và các cộng sự đãkhảo sát thì khoảng thời gian cho phản ứng lên màu tốt là 15– 25 phút

[16].

Trong nghiên cứu có bước khảo sát thời gian cho phản ứng lên màu tốiưu và khảo sát vùng bước sóng hấp thụ cực đại giúp cho việc xác định chínhxác hàm lượng chất cần phân tích. Tuy nhiên, trong phương pháp cuối cùng lạithêm vào ethyl acetate thay vì thêm vào dung dịch đệm acetic acid, cũngkhông có bước cho bay hơi hết dung môi trong dung dịch chuẩn gốc và trongdịch chiết mẫu điều này có thể làm ảnh hưởng đến nền mẫu trong quá trình

định lượng (vì đường nền có thể bị nhiễu bởi các dung môi).

2. Theo X. Bai và các cộng sự (2007), định lượng triterpenoid tổng trong

thân của cây Actinidia deliciosa dựa trên phản ứng màu với vanillin và ursolic

acid là chất chuẩn. Lấy một lượng dịch chiết, thêm vào đó 0,3 mL hỗn hợp 5%

vanillin –acetice acid và 1 mL acid perchloric, cho phản ứng trong vòng 15 phút ở 60°C, sau đó làm lạnh trong chậu nước đá. Độ hấp thụ của mẫu sẽ đo ở







bước sóng 520 nm. Hàm lượng triterpenoid tổng sẽ được xác định dựa theo

đương chuẩn của ursolic acid đã xây dựng (Cursolic acid (g)).

Với các điều kiện được sử dụng trong nghiên cứu này thì: đường chuẩn

được xây dựng trong khoảng 0– 16,5 g, độ lệch chuẩn bé hơn 4%, hiệu suất

thu hồi (độ đúng) đạt từ 93– 115%, hệ số tương quan R 2 = 0,9937[17]

.

Đường chuẩn của ursolic acid trong phương pháp được xây dựng bằng

cách cân khối lượng (Cursolic acid (g)) dễ gây sai số, không chính xác, không

cho bay hơi dung môi trong dịch chiết làm ảnh hưởng tới tín hiệu đường nền.

3. Theo Jie – Ping Fan và Chao –Hong He (2006), trong “Simultaneous

quantification of three major bioactive triterpene acids in the leaves of

Diospyros kaki by high- performance liquid chromatography method” cũng đã

sử dụng phương pháp so màu để xác định hàm lượng triterpenoid tổng . Lấymột lượng dịch chiết phù hợp thu được sau khi chiết mẫu hòa tan trong 25 mLethanol, lấy 0,2 mL dịch chiết sau đó làm bay hơi hết dung môi trong bể điều

nhiệt, thêm vào 0,3 mL hỗn hợp 5% vanillin– acetic acid và 1 mL acid

perchloric, mẫu được gia nhiệt trong vòng 45 phút ở 60°C sau đó làm lạnhtrong chậu nước đá. Độ hấp thụ của mẫu được đo ở 548 nm sau khi thêm vào5 mL acetic acid băng. Ursolic acid được sử dụng làm chất chuẩn.

Sau khi tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm được sử dụng trong qui

trình: đường chuẩn được xây dựng nằm trong khoảng 0– 0,0126 mg/mL.Phương trình hồi qui được tính toán như sau: y = 0,0167x – 0,0015 (trong đó ylà nồng độ của ursolic acid (mg/mL) và x là độ hấp thụ của mẫu) với hệ sốtương quan R 2=0,9995. Độ lệch nhỏ hơn 4%. Hiệu suất thu hồi củatriterpenoid tổng được thực hiện bằng cách thêm vào một lượng chất chuẩn đạt94 – 112%

[18].

Thời gian cho phản ứng lên màu là quá dài 45 phút thay vì 15 – 25 phút

như đã khảo sát bởi Xiang et. al (2001) điều này làm cho cường độ màu của

dung dịch có thể không tối ưu, khoảng xây dựng đường chuẩn nhỏ 0– 0,0126mg/mL. Ưu điểm của phương pháp là đã cho bay hơi hết dung môi không gâyảnh hưởng đến tín hiệu nền.

4. Theo Jiewen Zhao (4 – 2011) đã mô tả qui trình định lượng triter penoid

tổng bằng phươ ng pháp UV –Vis với vanillin–perchloric acid làm chất hiệnmàu trong “The extraction of high value chemicals from heather (Callunavulgaris) and bracken (Pteridium aquilinum)” cụ thể: 10 mg Oleanolic acid

được hòa tan trong 50 mL methanol, sau đó chuẩn bị một dãy chuẩn làm việc

với tám ống nghiệm lần lượt chứa 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, va 0,7 mL







dung dịch chuẩn và cho bay hơi hết dung môi trong bể điều nhiệt. Thêm vàoống nghiệm 0,3 mL hỗn hợp 5% vanillin– acetic acid và 1 mL acid perchloric,

đem ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong vòng 25 phút. Sau đó làm lạnh trongchậu nước đá và thêm vào 10 mL acetic acid băng. Độ hấp thụ của dung dịch

được đo ở bước sóng 550 nm và tạo ra đường chuẩn.

Tiến hành đo trên mẫu: 10 mg của dịch chiết CO2 siêu tới hạn (hoặc dịchchiết hexan) hòa tan trong 1 mL dichloromethane trong ống nghiệm. Cho dungmôi bay hơi trong bể điều nhiệt. Tương tự cũng cho 0,3 mL hỗn hợp 5%vanillin –acetic acid và 1 mL acid perchloric trước khi đem ủ ở 70°C trong 25

phút. Dung dịch được làm lạnh trong bể nước đá và sau đó thêm vào ống

nghiệm 10 mL acetic acid băng. Độ hấp thụ của dịch chiết cũng được đo ở 550nm và hàm lượng triterpenoid tổng trong mẫu được xác định dựa theo đường

chuẩn Oleanolic acid đã xây dựng [19].

Quá trình chiết mẫu của phương pháp là chiết với CO2 siêu tới hạn điềunày không thể áp dụng trong làm việc ở phòng thí nghiệm, do đó kết quả thựcnghiệm của đề tài làm ra không thể so sánh được. Phương pháp trong nghiên

cứu này đã được cải tiến nhiều so với các nghiên cứu trước.

5. Trong “In vitro inhibitory effects of Pithecellobium dulce (Roxb.)Benth. seeds on intestinal α-glucosidase and pancreatic α-amylase” củaDnyaneshwar Madhukar Nagmoti, Archana Ramesh Juvekar (28 – 4 – 2013)

cũng đã xác định được hàm lượng triterpenoid tổng bằng cách: 250 L dịch

chiết được trộn với 0,25 mL hỗn hợp 5% vanillin– acetic acid và 0,5 mL acid

perchloric. Hỗn hợp được ủ trong trong 10 phút, làm lạnh trong bể nước đá 15 phút và sau đó thêm vào 2,5 mL acetic acid băng. Sau 6 phút, độ hấp thụ đượcđọc ở 538 nm. Oleanolic acid làm chất chuẩn và hàm lượng triterpenoid tổng

được xác định thông qua đường chuẩn của Oleanolic acid (OAE, mg/g dịchchiết) [20]

.

Thời gian cho phản ứng lên màu là không tối ưu, trong khi đó thời gianlàm lạnh lại dài hơn.

Theo mục tiêu của đề tài thì phương pháp được sử dụng để định lượngtriterpenoid tổng phải là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, với độ chính xáccao và phù hợp với từng cơ sở thí nghiệm. Trong điều kiện trang thiết bị hiệncó của phòng thí nghiệm có thể định lượng triterpenoid tổng bằng 2 phương

pháp: phương pháp HPLC và phương pháp UV–Vis. Trong đó, phương phápHPLC là phương pháp thực hiện với độ chính xác cao, độ nhạy tốt, có thể

phân tích nhiều hợp chất, tuy nhiên, phương pháp này lại ít chọn lọc nên khóloại bỏ hết ảnh hưởng của nền mẫu, phải lựa chọn dung môi và phải khảo sát







các thông số chạy máy. Đối với phương pháp UV–Vis là một phương phápđược sử dụng phổ biến, dễ thực hiện và mang lại hiệu quả cao.

Ưu điểm: dễ làm, đơn giản, độ chính xác cao, có thể phân tích đượcnhiều mẫu cùng một lúc.

Nhược điểm: nền mẫu phức tạp cần có bước hiệu chỉnh qui trình.







Chương 2 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ PHƯƠNGPHÁP ĐỊNH LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG

2.1 Phương pháp chiết triterpenoid trong dược liệu với sự hỗ trợ của

sóng siêu âmCó rất nhiều kỹ thuật chiết tách hoạt chất trong dược liệu được thực hiện

vào từng thời điểm khác nhau. Theo k ỹ thuật chiết truyền thống thì có các phương pháp chiết như là: chiết ngấm kiệt, chiết lôi cuốn hơi nước, chiết vớisự hỗ trợ của nhiệt độ, chiết soxhlet. Tuy nhiên, các phương pháp này thường

cho hiệu suất chiết thấp, thường sử dụng một lượng lớn dung môi để chiết,thời gian chiết kéo dài không thật sự thuận lợi về mặt hiệu quả kinh tế.

Để có thể khắc phục các nhược điểm trên, ngày nay, người ta đã phát

triển các phương pháp chiết khác mang lại hiệu quả kinh tế hơn, rút ngắn thờigian chiết và hiệu suất chiết cao như: phương pháp chiết với sự hỗ trợ củasóng siêu âm (UAE), chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (MAE), chiết bằng CO 2

siêu tới hạn, chiết dưới áp suất cao,…. Trong đó, chiết băng CO2 siêu tới hạnvà chiết dưới áp suất cao là 2 kỹ thuật chiết hiện đại nhất, mang lại hiệu quả

chiết cao nhất. Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm hiện tại thì chỉ có

thể áp dụng phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm là phù hợp nhất.

Theo Schinor EC và các đồng nghiệp (2004) đã sử dụng phương pháp

chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm để chiết steroid và triterpenoid trong thân,lá và hoa của Chresta exsucca, C. scapigera và C. sphaerocephala và đồngthời cũng sử dụng phương pháp chiết cổ điển để so sánh

[21]. Theo Soponrat

Rattanasombat, Chayanoot Sangwichien (2011) đã chiết triterpenoid trongGymnema inodorum Decne bằng cách sử dụng 2 phương pháp chiết: chiết soxhlet và chiết có sự hỗ trợ của sóng siêu âm

[22]. Cũng theo như Hua Yao và

các đồng nghiệp (tháng 2–2013) đã chiết triterpenoid từ rễ của cây Euphorbia

pekinensis với sự hỗ trợ của sóng siêu âm [23]. Đã đồng thời cho thấy, phương

pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm mang lại hiệu suất chiết cao hơn sovới các phương pháp chiết thông thường, tiết kiệm được thời gian và dung môicho quá trình chiết.

Nguyên tắc: khi sóng siêu âm truyền trong dịch chiết lỏng, theo trình tự

và với tốc độ rung cao làm cho dung môi tại các hốc nhỏ dược liệu sẽ có hiệntượng sủi bọt. Khi những bọt bong bóng này vỡ ở những nơi gần thành tế bào,thì sóng xung kích sẽ làm vỡ thành tế bào và giải phóng các thành phần hoạtchất vào dung môi.







Cách tiến hành: cân một lượng nguyên liệu cần thiết, cho vào một dụngcụ chứa có sẵn một lượng dung môi phù hợp (thường là methanol hoặcethanol), cho vào bể chiết, chiết ở nhiệt độ 60°C trong khoảng thời gian từ 30– 45 phút, lọc lấy cắn (có thể ly tâm), hòa tan cắn trong một lượng dung môi

thích hợp, định mức. Thu được dịch chiết có một nồng độ Cm.

Một số điều cần lưu ý trong quá trình chiết: nhiệt độ trong bình chiết phải phù hợp đảm bảo hoạt chất được chiết ra không bị biến tính ở nhiệt độchiết, đảm bảo rằng số lần chiết và thời gian chiết đủ để chiết kiệt hoạt chấttrong dược liệu và lượng dung môi chiết phải vừa đủ để có thể ngấm hết mẫu.

2.2 Định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương

pháp UV – Vis

Nguyên tắc: phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại–khả kiến là phương pháp dựa trên việc đo độ hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiêncứu ở bước sóng xác định trong vùng tử ngoại khả kiến, rồi so sánh với độ hấp

thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định, từ đó tínhtoán được hàm lượng chất nghiên cứu dựa theo đường chuẩn của chất chuẩn.

Theo các công trình nghiên cứu về định lượng triterpenoid tổng thì có thểrút ra các kết luận chung: hỗn hợ p vanillin – acetic acid băng và acid perchloric

thường được dùng làm chất lên màu trong phản ứng tạo phức, bước sóng hấp

thụ cực đại nằm trong khoảng 520–550 nm, để chính xác hơn trong đề tài sẽtiến hành khảo sát lại bước sóng hấp thụ cực đại trong vùng 190– 1100 nm,

thời gian cho phản ứng lên màu tối ưu là 15– 25 phút (theo Xiang et.al (2001)),

một điểm cần lưu ý là phải cho bay hơi hết dung môi trong dịch chiết mẫu vàdung dịch chuẩn vì dung môi làm ảnh hưởng đến nền mẫu khi phân tích, chấtchuẩn có thể sử dụng là oleanolic acid hoặc là ursolic acid.

Cách tiến hành: Lấy một lượng dịch chiết mẫu (sau khi thực hiện quátrình chiết mẫu) có nồng độ Cx, cho bay hơi hết dung môi, thêm vào hỗn hợp

5% vanillin – acetic acid băng và acid perchloric để thực hiện phản ứng lênmàu, ủ hỗn hợp một thời gian để bền màu, định mức bằng acetic acid băng,

sau đó đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng thích hợp trên máy UV – Vis,

dựa vào phương tr ình đường chuẩn của chất chuẩn xác định nồng độ của mẫu,

từ đó suy ra hàm lượng triterpenoid tổng có trong mẫu ban đầu.

Một số điều cần lưu ý trong quá trình định lượng:

Cần phải loại bỏ các yếu tố làm ảnh hưởng đến nền mẫu: dung môi,

tạp chất.

Thời gian cho phản ứng lên màu phải là tối ưu.







Xác định được bước sóng tối ưu để độ hấp thụ đạt cực đại.

Phải thẩm định phương pháp trước khi đo mẫu.

2.3

Thẩm định phương pháp phân tích

2.3.1

Tầm quan trọng của việc thẩm định

Thẩm định phương pháp phân tích là một quá trình tiến hành thiết lập

bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minhrằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Nói cách khác, việcthẩm định một phương pháp phân tích yêu cầu chúng ta phải chứng minh mộtcách khoa học rằng khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ vàchấp nhận được.

2.3.2

Nội dung thẩm định Cơ sở để thẩm định một quy trình phân tích dựa vào các cơ sở sau

[25]:

Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

Độ đúng (accuracy)

Độ lặp lại

Giới hạn phát hiện (limit of detection)

Giới hạn định lượng (limit of quantitation).

2.3.2.1 Độ tuyến tính (Linearity) Độ tuyến tính diễn tả sự tương quan giữa nồng độ chất khảo sát trong các

dung dịch đo của mẫu thử với kết quả phân tích của phương pháp. Sự tươngquan tuân theo phương trình bậc 1: y = f(C) = ax + b.

Độ tuyến tính thể hiện qua hệ số tương quan tuyến tính (R).

R càng gần bằng 1 thì phương pháp thử có độ tuyến tính càng cao.

Cách xác định:

Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước cácgiá trị đo được y. Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa làtrong khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn của y theo x theo mộtđường thẳng (đoạn thẳng) theo phương trình sau: y = ax + b.

Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệsố tương quan:

1 1

2 2 2 2

1(X ).(y )i

x y nXY R

nX nY







X, Y là các giá trị trung bình

R phải nằm trong giá trị -1,+1.

Nếu R = 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt. R > 0: có tương quan đồng biến.

R < 0: có tương quan nghịch biến. R < 0,5: coi như không có tương quan tuyến tính. R > 0,5: có phụ thuộc tuyến tính.

Sau khi đã xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thểxây dựng được phương trình hồi quy của khoảng này tức là đi tìm được hệ sốa và b của phương trình trên:

2

2

(X ) i i

i i

i i

X Y Y

na

X X

n

b = y – ax

Như vậy sau khi đã xây dựng được phương trình đường chuẩn, khi biếtđược x thì suy ra y.

Yêu cầu: Tùy theo hoạch định mà chọn giá trị R. Nói chung R > 0,999

2.3.2.2 Độ đúng (Accuracy)

Độ đúng là độ sát gần của giá trị tìm thấy với gái trị thực khi áp dụng

quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất trong cùngđiều kiện xác định.

Đại lượng đặc trưng cho độ đúng: BIAS, tỉ lệ phục hồi.

BIAS: là hiệu giữa hàm lượng thêm vào và hàm lượng tìm lại được bằngqui trình.

Độ đúng biểu thị bằng tỉ lệ phần trăm (%) phục hồi của giá trị thêm vào

mẫu thử bằng phương pháp xây dựng.

Cách thực hiện:

Xác định hàm lượng của chất cần thử trong mẫu đem thử bằng phương pháp dự kiến.

Cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử có hàm lượng

bằng 80%, 100%, 120% so với hàm lượng chất đó có trong mẫu thử, rồi tiếnhành bằng phương pháp đề xuất.







Cách tính độ đúng

Hàm lượng tìm lại:

Hàm lượng chuẩn thêm vào là: x

Tỉ lệ phục hồi (Đ) = %100

x

Yêu cầu: %98 ĐTB %102

2.3.2.3 Độ lặp lại

Độ lặp lại (hay độ chính xác) là mức độ gần sát giữa các kết quả thử

riêng lẻ với giá trị trung bình x thu được khi áp dụng phương pháp đề xuấtcho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định.

Độ lặp lại bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.

Độ lặp lại thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệchchuẩn tương đối (RSD) của một loạt các lần thử nghiệm.

Cách thực hiện

Với cùng một mẫu được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất n lần (n = 6–10 hay nhiều hơn). Sau đó áp dụng công thức tính

SD và RSD của phương pháp.

Yêu cầu: RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do

mỗi phòng thí nghiệm đưa ra. Thông thường ta chọn RSD 2% .

2

1

(x )

1

n

i

i

X

SDn

X: Giá trị trung bình

100%SD

RSD X

i x

X n

2.3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of detection)

Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất thử trong một mẫu thử

còn có thể phát hiện bằng phương pháp đề xuất, nó là một thông số của phương pháp thử giới hạn.

Giới hạn phát hiện thường được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phầnngàn, phần tỷ của chất thử có trong mẫu. Việc xác định giới hạn phát hiện

không cần thiết phải tiến hành định lượng chính xác mà chỉ cần xác định chấtthử có nồng độ thấp hơn hay cao hơn một giới hạn nào đó.







Cách xác định:

Giới hạn phát hiện được xác định dựa vào phương trình hồi qui tuyến

tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F–phân phối Fischervà trắc nghiệm t –phân phối Student).

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection = LOD) được tính theo côngthức:

2.3.2.5 Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification)

Giới hạn định lượng là một thông số của phương pháp phân tích địnhlượng các hợp chất có trong một khung mẫu với lượng thấp nhất như nhữngtạp chất trong nguyên liệu làm thuốc và sản phẩm phân hủy có trong chế

phẩm.

Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trongmột mẫu thí nghiệm còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác cóthể chấp nhận được.

Giới hạn định lượng có thể được biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phần

ngàn, phần tỷ có chất cần phân tích có trong mẫu.

Xác định: Giới hạn định lượng được xác định dựa vào phương trình hồiqui tuyến tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F–phân phối

Fischer và trắc nghiệm t–phân phối Student).

Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation = LOQ) được tính theo công

thức:

LOD = 3,3 * SD/độ dốc

LOQ = 10 * SD / độ dốc







Chương 3 THỰC NGHIỆM

3.1

Phương tiện nghiên cứu

3.1.1

Địa điểm và thời gian tiến hành

Đề tài thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 9–2013 đến tháng 12–

2013. Tại phòng thí nghiệm Hóa đại cương A3, Khoa Khoa học tự nhiên,trường Đại học Cần Thơ.

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị

Micropipet loại 100 và 1000 L

Pipet 5 mL và 10 mL

Dụng cụ thủy tinh: erlen 250 mL, becher 100 mL, bình định mức,….

Máy UV – Vis 6800 Cân điện tử

Dụng cụ thủy tinh Bể siêu âm

Hình 3.1. Dụng cụ - thiết bị thí nghiệm







3.1.3 Hóa chất

Perchloric acid (HClO4) đậm đặc 70– 72%

Acetic acid băng (CH3COOH) (Trung Quốc)

Methanol (Trung Quốc)

Ethanol 96% (Trung Quốc)

Nước cất

Vanillin (Pháp): Pha hỗn hợp vanillin – acetic acid băng 5%. Cân chínhxác 2,5 g vanillin dạng bột (màu trắng), thêm vào một lượng nhỏ acetic acid

băng, khuấy đều cho đến khi vanillin tan hoàn toàn. Chuyển sang bình địnhmức 50 mL, định mức tới vạch bằng acetic acid băng. Dung dịch tiếp tục được

lắc cho đến khi phân bố tốt. Hỗn hợp được bảo quản ở điều kiện thoáng mát,trong bóng tối.

Chuẩn Oleanolic acid 10 mg (Merk): Pha dung dịch chuẩn có nồng độgốc 100 ppm. Từ ống chuẩn 10 mg chuyển qua bình định mức 100 mL, cẩnthận tráng ống chuẩn nhiều lần với methanl, định mức tới vạch bằng methanol.Bảo quản ở nhiệt độ từ 2– 8°C, tránh ánh sáng. Lưu ý methanol dễ bay hơi, quathời gian methanol bay hơi sẽ làm cho nồng độ của chất chuẩn tăng lên gây saisố, cần phải bịt kín khi bảo quản.

3.1.4

Thu mẫu

Sau đây là 10 mẫu nấm Linh chi được cung cấp bởi Công ty Dược HậuGiang và một số mẫu mua trên địa bàn Thành phố Cần Thơ.

Hình 3.2. Hình ảnh 10 mẫu nấm Linh chi







Ngày nhận mẫu: 08/08/2013

Địa điểm nhận mẫu: Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang. Địa chỉ: 288

Bis, Nguyễn Văn Cừ, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ.

Mẫu đem về được chứa trong túi nilon, sau đó cắt nhỏ mẫu sao cho kíchthước gần bằng nhau với đường kính khoảng 1 mm. Khi cắt nhỏ từng mẫuxong, trộn đều mẫu, chia mẫu làm thành 4 phần bằng nhau một cách ngẫu

nhiên theo hình chữ thập, sau đó lấy hai phần mẫu đối diện nhau, trộn lại, tiếptục chia thành 4 phần bằng nhau, lấy hai phần đối diện trộn lại, tiếp tục làmnhư thế cho đến khi lấy được một lượng mẫu đủ để đem đi phân tích. Mẫuđược bảo nơi khô thoáng, tránh ẩm mốc.

Trước khi đem đi phân tích mẫu được xay nhuyễn thành bột để dễ dàng

chiết hoạt chất. Cần lưu ý bột mẫu dễ dàng hút ẩm trở lại nên cần bảo quảncẩn thận bằng túi nilon hai lớp.

Trong 10 mẫu được cung cấp bởi Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang có 2

mẫu đã được định danh và 8 mẫu còn lại được Công ty mua trôi nổi trên thịtrường thành phố Cần Thơ:

Mẫu 6: Ganoderma lucidum VINA (VINA: Việt Nam)

Mẫu 10: Ganoderma lucidum TG (TG: Tiền Giang)

3.1.5

Qui trình chiết mẫu Qui trình cụ thể: Cân chính xác 1 g bột mẫu (đã được sấy khô đến khối

lượng không đổi) cho vào cốc đã chứa sẵn 30 mL ethanol 96%. Đặt cốc vào

bình chiết siêu âm, chiết trong vòng 30 phút, lặp lại quá trình chiết nhiều lầncho đến khi chiết kiệt mẫu (đến khi dịch chiết cuối không còn màu). Cho bay

hơi dung môi trong bể điều nhiệt ở 60– 65°C đến cắn. Dùng pipet hút chínhxác 10 mL methanol để hòa tan cắn trở lại, sau đó cho vào bình định mức 50

mL và định mức tới vạch bằng methanol. Bảo quản trong tủ lạnh, để sau này

định lượng.

Sơ đồ tổng quát của qui trình chiết triterpenoid tổng bằng phương phápchiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm:







Hình 3.3. Qui trình chiết triterpenoid tổng bằng sóng siêu âm

3.1.6 Qui trình chuẩn bị mẫu phân tích

Hút một lượng chính xác 250 L dịch chiết mẫu chuyển sang bình định

mức 10 mL, cho bay hơi hết methanol trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ từ 60– 70°C. Sau đó thêm tiếp 0,3 mL thuốc thử hiện màu vanillin – acetic acid băng5% và 1 mL HClO4 . Đem ủ trong bể điều nhiệt ở 70°C trong 25 phút, sau đó

làm lạnh trong chậu nước đá khoảng 2 phút. Cuối cùng định mức tới vạch bằng acetic acid băng, đem đi đo ở bước sóng đã khảo sát.

Sơ đồ tổng quát:

Hình 3.4. Qui trình định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi

Mẫu chuẩn và mẫu trắng chuẩn bị tương tự như hình 3.4 nhưng không cómẫu thử thay vào đó là chất chuẩn (đối với mẫu chuẩn).







3.1.7 Hoạch định thí nghiệm

Thẩm định các phương pháp phân tích. Tiến hành các thí nghiệm sau:

Thí nghiệm về xác định khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn

Thí nghiệm về xác định độ đúng

Thí nghiệm về xác định độ lặp lại

Thí nghiệm về xác định giới hạn phát hiện

Thí nghiệm về xác định giới hạn định lượng

Áp dụng phương pháp đã đề ra đưa vào phân tích triterpenoid tổng trong

10 mẫu nấm Linh chi ở phòng thí nghiệm.

3.2 Kết quả thực nghiệm

Khảo sát bước sóng hấp thụ của dung dịch chuẩn Oleanolic acid.

Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn như đã xây dựng ở mục 3.1.6. Tiến hànhquét phổ mẫu chuẩn với bước sóng từ 190– 1100 nm trên máy UV – Vis 6800

JENWAY. Kết quả được trình bày như sau:

Hình 3.5. Đồ thị khảo sát bước sóng hấp thụ của dung dịch chuẩn OA

Từ kết quả khảo sát bước sóng hấp thụ của dung dịch chuẩn OA–đồ thịHình 3.5 –cho thấy trong khoảng bước sóng 450–650 nm độ hấp thụ của hợp

chất phức màu có sự thay đổi rõ rệt và đạt cực đại ở bước sóng 544 nm. Kếtquả này khá phù hợp theo nghiên cứu của Jie – Pang Fan va Chao – Hong He

(2006) với kết quả khảo sát bước sóng là 548 nm và Jiewen Zhao (4–2011) với bước sóng là 550 nm. Do đó, sử dụng bước sóng 544 nm đã khảo sát để địnhlượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu nấm Linh chi.







3.2.1 Các thí nghiệm

3.2.1.1 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

a. Thí nghiệm về xác định khoảng tuyến tính

Để xác định khoảng tuyến tính ta tiến hành pha một dãy dung dịch chuẩnOleanolic acid ở các nồng độ khác nhau (tăng dần) từ dung dịch chuẩnOleanolic acid có nồng độ 100 ppm theo qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.6.

Sau đó khảo sát sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ. Kết quả đo đượctrình bày ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1.

Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

STT Nồng độ (ppm) Độ hấp thụ

1 1 0,108

2 2 0,2113 5 0,50954 9 0,922

5 13 1,2792

6 17 1,669

7 21 2,052

8 25 2,384

9 30 2,676

10 35 2,879

11 40 3,033

12 50 3,2613 60 3,44

14 70 3,52

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ OA







Kết quả cho thấy, nồng độ từ 1–25 ppm nồng độ hoạt chất có 1 tươngquan chặt chẽ với độ hấp thu, R

2 = 0,9997. Từ đó chúng tôi tiến hành xây

dựng đường chuẩn trong khoảng nồng độ này.

b. Xây dựng đường chuẩn Dựa vào khoảng tuyến tính đã xác định, ta tiến hành xây dựng đường

chuẩn trong khoảng nồng độ từ 0 – 14 ppm. Từ dung dịch chuẩn ban đầu cónồng độ 100 ppm theo qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.6, ta tiến hành pha dãychuẩn theo Bảng 3.2:

Bảng 3.2. Dãy dung dịch chuẩn làm việc của Oleanolic acid

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nồng độ OA tương ứng

(ppm) 0 1 2 4 6 8 10 12 14

Thể tích bình định mức 10 ml

Chuẩn OA 100 ppm (mL) 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

Vanillin –acetic acid băng

5% (mL)0,3

HClO4 (mL) 1

Định mức tới vạch bằng acetic acid băng

Đo độ hấp thụ của dãy chuẩn ở bước sóng 544 nm trên máy UV– Vis thu

được kết quả như Bảng 3.3:

Bảng 3.3. Độ hấp thụ của dãy chuẩn Oleanolic acid

STT Nồng độ (ppm hoặc mg/L) Độ hấp thụ (ABS)

1 0 0

2 1 0,105

3 2 0,215

4 4 0,418

5 6 0,613

6 8 0,818

7 10 0,998

8 12 1,194

9 14 1,378







Hình 3.7.

Đồ thị đường chuẩn Oleanolic acid

Từ đồ thị trên, đường chuẩn có hệ số tương quan tuyến tính R 2 = 0,9997,

R = 0.9999, có thể kết luận rằng độ hấp thụ tăng tuyến tính với nồng độ củachất chuẩn từ 0 – 14 ppm. Đường chuẩn này được sử dụng cho các thí nghiệm

tiếp theo.

3.2.1.2 Xác định độ đúng của phương pháp

Để xác định độ đúng của phương pháp, chúng tôi tiến hành bằng cách

thêm vào mẫu dung dịch chuẩn Oleanolic acid 2 ppm và 4 ppm, mỗi lần lặp lại5 lần. Mẫu được xử lý theo qui trình đã xây dựng ở mục 3.2.1. Kết quả được

trình bày ở Bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp

Mẫu Nồng độ mẫu thêm chuẩn 2 ppm Nồng độ mẫu thêm chuẩn 4 ppm

1 1,992 3,968

2 1,984 3,973

3 1,995 3,978

4 1,987 3,9655 1,993 3,957

TB 1,9902 3,9682

Độ đúng (%) 99,51 99,205

Nhận xét:

Độ đúng trung bình: ĐTB = %36.992

%205.99%51.99

ĐTB = 99,36%, nằm trong giới hạn cho phép của tỉ lệ phục hồi lý thuyết

(98% – 102%). Như vậy, độ đúng của phương pháp đạt yêu cầu.







3.2.1.3 Xác định độ lặp lại của phương pháp

Để xác định độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi chuẩn bị song song 10

dung dịch chuẩn Oleanolic acid 2 ppm theo qui trình đã xây dựng ở 3.1.6, kếtquả được trình bày trong Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp

Mẫu Nồng độ (ppm) 1 1,882

2 1,869

3 1,878

4 1,888

5 1,856

6 1,886

7 1,891

8 1,8759 1,863

10 1,883

X SD 1,8771 0,0114

Tính toán độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

0,0114100 100 0, 607% 2%

1,8771

SD RSD

X

Với kết quả RSD tính toán được là 0,607% nhỏ hơn 2%, một mức lệch

phù hợp với lý thuyết đã đưa ra để thẩm định phương pháp trước khi phương pháp được áp dụng để định lượng hoạt chất.

3.2.1.4 Giới hạn phát hiện (LOD) – Giới hạn định lượng (LOQ)

Để xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp,chúng tôi tiến hành thêm dung dịch chuẩn Oleanolic acid 2 ppm vào 10 mẫuthử và tiến hành xử lý theo qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.6. Kết quả đượ ctrình bày trong Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra (LOD) và (LOQ)

Mẫu Nồng độ (ppm)

1 1,876

2 1,745

3 1,827

4 1,6367

5 1,7755

6 1,867

7 1,945







8 1,765

9 1,6959

10 1,816

X SD 1,7949 0,091

LOD = 3,3*SD 0,3003

X R

LOD

6,575

LOQ = 10*SD 0,91

Qua kết quả tính toán, giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ở mức

0,3003 ppm. Vớ i R = 6,575 (4 < R <10), nồng độ thử là phù hợp và LOD tính

được ở trên là đáng tin cậy. Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp là0,91 ppm.

Qua các kết quả phân tích ở trên, có thể thấy rằng phương pháp phân tíchTriterpenoid trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV–Vis là phương pháp

phân tích có độ ổn định, có độ lặp lại tốt đồng thời có độ chính xác cao, hoàntoàn phù hợp để xác định hàm lượng Triterpenoid trong nấm Linh chi.

3.2.2 Thực nghiệm trên mẫu

Áp dụng phương pháp đã xây dựng ở 3.1.6, tiến hành xác định hàmlượng triterpenoid trong một số mẫu nấm Linh chi như sau:

Công thức tính toán hàm lượng Triterpenoid trong mẫu nấm Linh chi ban

đầu:

.V .do bdmmau

C k C

m

Trong đó: Cmau: Tổng hàm lượng triterpenoid trong mẫu (mg/kg)

Cdo: Nồng độ triterpenoid đo được trên máy (ppm) V bdm: Thể tích bình định mức (mL) k: Hệ số pha loãng

m: Khối lượng mẫu (g)

Kết quả đo và tính toán hàm lượng triterpenoid trong các mẫu nấm Linh

chi trên bảng được trình bày trong Bảng 3.7:







Bảng 3.7. Hàm lượng Triterpenoid trong các mẫu nấm Linh chi

Mẫu

Khối lượngmẫu (g)

Nồng độ mẫuthử đo đượctrên máy (ppm)

Hàm lượngtriterpenoid trong

mẫu (mg/kg)

Phần trămtriterpenoid

trong mẫu (%)

M1 1,0156 4,0766 8051,24 0,80511,0093 4,0748

M21,0006 6,1855

12361,19 1,2361,0011 6,1862

M31,0054 3,8691

7698,14 0,76981,0048 3,8683

M41,0037 3,3411

6649,67 0,66491,0069 3,3438

M51,0024 5,6331

11232,62 1,1231,0039 5,6349

M6 1,0075 5,3065 10505,85 1,0511,0140 5,3122

M71,0001 4,8762

9745,28 0,97451,0013 4,8759

M81,0086 5,337

10589,55 1,0591,0072 5,3362

M91,0022 4,2933

8564,19 0,85641,0028 4,2923

M101,0024 4,3085

8588,42 0,85881,0047 4,3104

Có thể tổng quát hơn về hàm lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chiqua đồ thị sau:

Hình 3.8.

Đồ thị so sánh hàm lượng triterpenoid tổng trong 10 mẫu







Theo kết quả thu được trong đồ thị hình 3.8, ta có thể thấy hàm lượngtriterpenoid trong 10 mẫu nấm Linh chi không chênh lệch nhau quá nhiều,trong đó mẫu số 2 (M2) có hàm lượng triterpenoid cao nhất (12361 mg/kg )

chiếm 1,236% trong số các thành phần có trong nấm Linh chi, 2 mẫu chứa

hàm lượng triterpenoid thấp nhất là mẫu số 3 (M3)và số 4 (M4) (lần lượt,7698 mg/kg và 6649 mg/kg) chiếm 0,7698% và 0,6649% trong nấm Linh chi.

Trong 2 mẫu đã được định danh bởi Công ty cổ phần Dược Hậu Giangthì mẫu số 6 (M6) chứa hàm lượng triterpenoid tổng 10505 mg/kg và mẫu số10 (M10) có hàm lượng triterpenoid tổng trong mẫu 8588 mg/kg. nằm trongkhoảng dao động trung bình của các mẫu.

Do không có tiêu chuẩn nào đưa ra qui định về hàm lượng triterpenoidtổng có trong nấm Linh chi cụ thể là bao nhiêu, nên đề tài chỉ giới hạn trongviệc định lượng triterpenoid tổng có trong mẫu rồi so sánh hàm lượngtriterpenoid giữa các mẫu với nhau, có thể trong quá trình làm có thể khôngchính xác tuyệt đối 100% nhưng cũng có thể dựa vào đây để đánh giá đượcchất lượng của các mẫu nấm Linh chi đem đi phân tích, so sánh và lựa chọn

giống đem đi nuôi trồng.







Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1

Kết luận

Sau khoảng thời gian thực hiện luận văn, chúng tôi đã được một số kết

quả như sau:

Kết quả thẩm định phương pháp đã xây dựng:

Độ tuyến tính của phương pháp R = 0,9999

Độ đúng của phương pháp đạt 99,36%

Độ lặp lại của phương pháp với RSD = 0,607% < 2%

Giới hạn phát hiện của phương pháp LOD = 0,273 ppm

Giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 0,91 ppm.

Áp dụng phương pháp phân tích đã xây dựng để xác định hàm lượngtriterpenoid trong nấm Linh chi. Kết quả đạt được như sau: hàm lượngtriterpenoid trong mẫu 2 là cao nhất 12361 mg/kg chiếm 1,2361% trong số cácthành phần có trong nấm Linh chi, ở mẫu số 4 hàm lượng triterpenoid là thấpnhất 6649 mg/kg chiếm 0,6649%.

4.2 Kiến nghị

Tiến hành định danh toàn bộ 10 mẫu nấm Linh chi trước khi đem đi phântích thành phần các hoạt chất.

Qua các kết quả nghiên cứu về thành phần hoạt chất có trong các mẫu

nấm Linh chi, xác định được mẫu nào có chứa hàm lượng hoạt chất có tácdụng dược học quý báu nhiều nhất sẽ được lựa chọn để phục vụ cho mục đích

nuôi trồng ở qui mô công nghiệp ở nước ta.

Áp dụng phương pháp này như là một tiêu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp

theo.







TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Như Quỳnh, 2006. Tìm hiểu về một loại nấm Linh chi thu hái tạiThủ Đức – Tp. Hồ Chí Minh. Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Nông

lâm Tp. Hồ Chí Minh.

2. Nguyễn Vũ Duy Khanh, 2013. Đề tài Xây dựng quy trình sản xuất sinhkhối sợi nấm Ganoderma lucidum. Luận văn tốt nghiệp, trường cao đẳngKinh tế - Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh.

3. Mr. Leow Soon Seng. Mushroom of Immortality – Ganoderma lucidum.

4. GS. TS. Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà

xuất bản Y học.

5. Trương Thị Đẹp, Liêu Hồ Mỹ Trang, Nguyễn Thị Thu Ngân, Nguyễn ThịThu Hằng, nghiên cứu Y học Phân biệt đặc điểm hình thái – cấu trúc của

một số nhóm nấm “Nấm Linh chi” trên thị trường thành phố Hồ Chí Minh,

Y học thành phố Hồ Chí Minh – tập 15 – phụ bản số 1 – 2011.

6. http://www.namlinhchihanoi.com.

7. Lê Công Doanh, 2011. Kỹ thuật bảo quản và chế biến nấm Linh chi . Luận

văn tốt nghiệp trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ thành phố Hồ ChíMinh.

8. Medline, 1993; Kino và CTV 1989.

9. Shufeng Zhou. A clinical Study of a Ganoderma luidum extract in patients

with type II diabetes mellitus. Division of Pharmacology and Clinical

Pharmacology , Faculty of Medicine and Health Science, Auckland

University, Auckland, New Zealand.

10. Công Diễn, 2005. Nấm Linh chi phòng và trị bệnh. Nhà xuất bản Mũi CàMau.

11. DS. Trần Xuân Thuyết. Bài viết: Thực hư về nấm Linh chi.(www_vietlinh_com_vn nong nghiep & nong thon -agriculture & rural rau

an toan, rau sach - safe vegestable). Tạp chí Sức khoẻ và đời sống (số 224,225).

12. Magazine Khoa học Công nghệ Việt Nam (số ngày 20/09/2013). Bài viết:

Những công dụng chữa bệnh từ nấm Linh chi.



http://www.namlinhchihanoi.com/







13. Đoàn Sáng, 2003. Nấm Linh chi nguyên chất và bệnh thời na y. Nhà xuất bản Y học.

14. Carmen W. Huie, Xin Di. Chromatographic and electrophoretic methods

for Linhzhi pharmacologically active components , Journal ofChromatography B, 812 (2004) 241-257.

15. Tôn Nữ Liên Hương, 2011. Giáo trình Hợp chất thiên nhiên.

16. Reddy Prasad et al (2011). Kinetic study of Microwave Assisted extraction

of Hypoglycemic active compounds from Ceriops Decandra sp. Leaves

using ethanol: Comparison with the Soxhlet extraction. Journal of Applied

Sciences 11 (13): 2364 – 2369.

17.

X. Bai et al (2006). Optimization of Microwave – assisted extraction of

Antipatotoxic Triterpenoids from Actinidia deliciosa root and its

comparison with conventional extraction methods. Food Technol

Biotechnol 45 (2) 174 – 180.

18. Jie – Ping Fan and Chao – Hong He (2006). Simultaneous quantification

of three major bioactive triterpene acids in the leaves of Diospyros kaki by

high – performance liquid chromatography method. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis 41: 950 – 956.

19. Jiewen Zhao, April 2011. The extraction of high value chemicals from

heather (Calluna vulgaris) and bracken (Pteridium aquilinum). The

University of York Chemistry.

20. D.M. Nagmoti and A.R.Juvekar (8 – 2013). In vivo inhibitory effects of

Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth. Seed on intestinal - glucosidase

and pancreatic amylase. J Biochem Tech 4 (3): 616 – 621.

21. Schinor EC et al (2004). Comparison of classsical and ultrasound – assisted extraction of steroids and triterpenoids from three Chresta spp.

Ultrason Sonocem 11 (6): 425 – 421.

22. Peixu Zhang et al (2008). Ultrasonic – assisted Nebulization extraction

coupled with SPE and HPLC for the determination of triterpenoids in root

of Euphorbia pekinensis Rupr. Chromatographia 76 (15 – 16): 967 – 974.

23.

LOU Ying et al (2009). An ultrasonic extration method of triterpenoidsfrom Ganoderma lucidum mycelium. Food Research and Development 06.







24. Nguyễn Thị Diệp Chi (2008). Giáo trình kiểm nghiệm thực phẩm và dược phẩm. Đại học Cần Thơ.

PHỤ LỤC

Phụ lục số 1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính.







Phụ lục số 2: Kết quả xây dựng đường chuẩn

Phụ lục số 2: Kết quả xây dựng đường chuẩn.







Phụ lục số 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp.







Phụ lục số 4: Kết quả khảo sát LOD và LOQ của phương pháp.







Phụ lục số 5: Kết quả xác định hàm lường triterpenoid tổng trong mẫu.



Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng trong nấm...

Documents

Transcript of Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid tổng trong nấm...