Brucelosis cisterna

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Brucelosis Bovina Brucelosis Bovina Cecilia Cisterna Cecilia Cisterna Instituto de Patobiología, Laboratorio de Brucelosis, INTA Castelar [email protected] Maestría Salud Animal UBA Diciembre 2008

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Brucelosis BovinaBrucelosis Bovina

Cecilia CisternaCecilia CisternaInstituto de Patobiología, Laboratorio

de Brucelosis, INTA [email protected]

Maestría Salud Animal UBA Diciembre 2008

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Brucelosis BovinaBrucelosis Bovina

Enfermedad bacteriana, de curso agudo con Enfermedad bacteriana, de curso agudo con evolución a la cronicidad, con afección de evolución a la cronicidad, con afección de múltiples órganosmúltiples órganosAgente etiológico: Agente etiológico: Brucella abortusBrucella abortus, biotipos (1 , biotipos (1 al 9) de los cuales se describieron en la al 9) de los cuales se describieron en la Argentina el 1 y 2.Argentina el 1 y 2.Es una de las zoonosis de mayor difusión en el Es una de las zoonosis de mayor difusión en el mundo en seres humanos y animales mundo en seres humanos y animales domesticadosdomesticadosGran repercusión mundial, por afectar la salud Gran repercusión mundial, por afectar la salud pública y la economía ganadera generando pública y la economía ganadera generando pérdidas económicas de importanciapérdidas económicas de importancia

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Vía de entradaVía de entrada

La vía natural de infección es la La vía natural de infección es la ingestión de ingestión de Brucella abortusBrucella abortus que que ha sido eliminada por vacas ha sido eliminada por vacas infectadasinfectadas

La fuente de transmisión son los La fuente de transmisión son los animales que excretan el animales que excretan el microorganismo (parto/aborto).microorganismo (parto/aborto).

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Sucesos que ocurren luego de su Sucesos que ocurren luego de su entrada al organismoentrada al organismo

Fagocitosis por los PMN y macrófagos Fagocitosis por los PMN y macrófagos (inmunidad innata). (inmunidad innata).

Si no son eliminadas llegan por vía linfática a los Si no son eliminadas llegan por vía linfática a los ganglios regionales pudiendo desde allí invadir ganglios regionales pudiendo desde allí invadir el torrente sanguíneo, donde son fagocitadas el torrente sanguíneo, donde son fagocitadas por los PMN y macrófagos circulantes.por los PMN y macrófagos circulantes.

y transportadas, a los diversos órganos donde y transportadas, a los diversos órganos donde pueden sobrevivir y multiplicarse dentro de las pueden sobrevivir y multiplicarse dentro de las vacuolas de los fagocitos circulantes y tisulares.vacuolas de los fagocitos circulantes y tisulares.

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Factores de patogenicidad del agenteFactores de patogenicidad del agente

Enzimas antioxidantes. Enzimas antioxidantes. Superóxido dismutasa (SOD) cataliza la Superóxido dismutasa (SOD) cataliza la dismutación de superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Protege a dismutación de superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Protege a la célula de las reacciones dañinas del superóxido.la célula de las reacciones dañinas del superóxido.

Producción de GMP (guanosina 5´monofosfato) y adenina, que inhiben la Producción de GMP (guanosina 5´monofosfato) y adenina, que inhiben la fusión fagosoma-lisosoma, la desgranulación, la activación del sistema fusión fagosoma-lisosoma, la desgranulación, la activación del sistema mieloperoxidasa-haluro y la producción del TNF-α.mieloperoxidasa-haluro y la producción del TNF-α.

En células fagocíticas no profesionales, En células fagocíticas no profesionales, BrucellaBrucella interacciona con interacciona con endosomas tempranos, se desvía de los compartimentos endocíticos endosomas tempranos, se desvía de los compartimentos endocíticos tardíos y explota transitoriamente la vía autofágica de la célula huésped tardíos y explota transitoriamente la vía autofágica de la célula huésped para posteriormente alojarse en el retículo endoplásmico donde comienza para posteriormente alojarse en el retículo endoplásmico donde comienza la etapa de replicación exponencial.la etapa de replicación exponencial.

En el caso de la internalización en fagocitos profesionales, que poseen una En el caso de la internalización en fagocitos profesionales, que poseen una vía endocítica mucho más activa, el retraso de la fusión con lisosomas no vía endocítica mucho más activa, el retraso de la fusión con lisosomas no sería suficiente para evitar la fusión con compartimentos tardíos por lo que sería suficiente para evitar la fusión con compartimentos tardíos por lo que se forma el fagolisosoma y se forma el fagolisosoma y BrucellaBrucella es capaz de sobrevivir en él. es capaz de sobrevivir en él.

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Electron micrograph of a portion of a macrophage infected with Brucella abortus.Bacteria are dispersed throughout the cytoplasm in membrane bound vacuoles. In the lower right, a section of the macrophage nucleus is seen.

Tráfico intracelular de Tráfico intracelular de BrucellaBrucella en HELA en HELA

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Massive proliferation of Massive proliferation of BrucellaBrucella in a in a

bovine macrophagebovine macrophage

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Mecanismos de defensa y Mecanismos de Mecanismos de defensa y Mecanismos de evasión del agente a las defensas del organismoevasión del agente a las defensas del organismo

Los mecanismos activados para inhibir la multiplicación Los mecanismos activados para inhibir la multiplicación de de BrucellaBrucella o destruirla incluyen la estimulación del o destruirla incluyen la estimulación del estallido respiratorio y la producción de radicales libres estallido respiratorio y la producción de radicales libres del oxígeno en los PMN.del oxígeno en los PMN.

Brucella abortusBrucella abortus puede ser destruida por el puede ser destruida por el complemento en ausencia de Ac específicos, o por complemento en ausencia de Ac específicos, o por suero obtenido en etapas tempranas de la infección. Se suero obtenido en etapas tempranas de la infección. Se determinó que las vías de activación del complemento determinó que las vías de activación del complemento involucradas en la lisis de involucradas en la lisis de Brucella Brucella fueron la vía clásica y fueron la vía clásica y la de las lectinas, esta última mediada por la proteína la de las lectinas, esta última mediada por la proteína fijadora de manosa (MBP).fijadora de manosa (MBP).

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Mecanismos de la inmunidad Mecanismos de la inmunidad adaptativaadaptativa

La respuesta adaptativa contra La respuesta adaptativa contra BrucellaBrucella involucra tres mecanismos principales, que involucra tres mecanismos principales, que actúan en diferentes etapas de la infección:actúan en diferentes etapas de la infección:

La generación de una respuesta humoral con La generación de una respuesta humoral con producción de Ac.producción de Ac.

La activación de la función bactericida de los La activación de la función bactericida de los macrófagos por acción del IFN-γ producido macrófagos por acción del IFN-γ producido por células T CD4+ y CD8+ ypor células T CD4+ y CD8+ y

La lisis de células infectadas por LT CD8+.La lisis de células infectadas por LT CD8+.

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EliminaciónEliminación

El síntoma mas importante en brucelosis bovina es el aborto tardío.

El aborto o el parto de un ternero viable l aborto o el parto de un ternero viable contamina las pasturas y el agua de bebida y contamina las pasturas y el agua de bebida y esta es la fuente de infección para el ganado y esta es la fuente de infección para el ganado y el hombre. el hombre. La cantidad de brucelas eliminadas La cantidad de brucelas eliminadas es variable y puede alcanzar hasta es variable y puede alcanzar hasta 1x101x101414/gramo de placenta. P/gramo de placenta. Puede comenzar una semana antes del parto/aborto hasta 45-60 días posteriores al mismo.

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Modelo de tráfico dentro de Modelo de tráfico dentro de MacrófagosMacrófagos

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Patogénesis Brucelosis

Animal no preñado

LibresGanglios regionalesBrucella Mucosa oral

En fagocitos

BrucellaDestruidas por PMN y MO

Órganos SRE

(Bazo, Hígado, Médula ósea)

Adaptado Samartino Luis

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Patogénesis BrucelosisAnimal preñado

Vía hematógena Útero

Trofoblastos eritrofagocíticos del placentoma (Hierro)

Infección contigua

Trofoblastos de la membrana corioalantoideaUlceración y ruptura de la membrana

Vía hematógena Feto y placentoma

El endometrio no es afectado por brucella Adaptado Samartino Luis

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Signos clínicosSignos clínicos

Aborto tardío.Aborto tardío.

Retención de placenta.Retención de placenta.

Ocasionalmente orquitis y Ocasionalmente orquitis y epididimitis unilateral con epididimitis unilateral con tumefacción aguda y dolorosatumefacción aguda y dolorosa..

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Lesiones MacroscópicasLesiones Macroscópicas

En la placenta se observa: placentitis En la placenta se observa: placentitis necrótica que involucra los cotiledones y necrótica que involucra los cotiledones y el tejido intercotiledonario, especialmente el tejido intercotiledonario, especialmente en proximidad de los cotiledones. El tejido en proximidad de los cotiledones. El tejido intercotiledonario (cuando la placentitis es intercotiledonario (cuando la placentitis es severa) puede presentar edema y un severa) puede presentar edema y un exudado espeso amarillento.exudado espeso amarillento.

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Placenta: lesión macroscópicaPlacenta: lesión macroscópica

Necrosis en placentomas - placenta de bovino

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Lesiones MicroscópicasLesiones Microscópicas

Necrosis y ulceración del epitelio coriónico en la Necrosis y ulceración del epitelio coriónico en la membrana corioalantoidea, que se encuentra membrana corioalantoidea, que se encuentra cubierto por un exudado compuesto por cubierto por un exudado compuesto por trofoblastos descamados (que contienen trofoblastos descamados (que contienen bacterias), detritus celulares, bacterias libres, bacterias), detritus celulares, bacterias libres, macrófagos y neutrófilos. macrófagos y neutrófilos. Lesiones en los placentomas, donde se pueden Lesiones en los placentomas, donde se pueden observar bacterias en el tejido conectivo de las observar bacterias en el tejido conectivo de las vellosidades coriónicas, las cuales pueden estar vellosidades coriónicas, las cuales pueden estar rodeadas por epitelio trofoblástico intacto o por rodeadas por epitelio trofoblástico intacto o por neutrófilos y detritus celulares.neutrófilos y detritus celulares.

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Lesión microscópica en placentaLesión microscópica en placenta

Chorioallantoic membrane. Focal necrotizing panarteritis in the wall of an arterial vessel and the severe inflammation in surrounding connective tissue. Hyalinous thrombus is

present within the lumen. HE x 200.

Chorioallantoic membran. Stained brucella antigen in trophoblasts (arrow), phagocytes and interstitium.

PATHOLOGICAL AND IMMUNOPEROXIDASE STUDIES OF THE PLACENTAL LESIONS OF BOVINE BRUCELLOSIS O. Yazicioglu, R. Haziroglu

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Lesiones en FetoLesiones en Feto

No son patognomónicasNo son patognomónicas

Edema subcutáneo difuso rojizo y peritonitis Edema subcutáneo difuso rojizo y peritonitis fibrinosa difusa, bronconeumonía supurativa, fibrinosa difusa, bronconeumonía supurativa, peri hepatitis fibrinosa, hepatitis peri vascular peri hepatitis fibrinosa, hepatitis peri vascular mononuclear y múltiples focos de necrosis en mononuclear y múltiples focos de necrosis en hígado, riñón y ganglios linfáticos. En varios hígado, riñón y ganglios linfáticos. En varios órganos fetales se observan lesiones órganos fetales se observan lesiones granulomatosas y necrosis focal, así como granulomatosas y necrosis focal, así como leptomeningitis granulomatosa. leptomeningitis granulomatosa.

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Fetos abortadosFetos abortados

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Lesiones en MachosLesiones en Machos

La lesión macroscópica es una orquitis y La lesión macroscópica es una orquitis y epididimitis fibrinopurulenta.epididimitis fibrinopurulenta.Microscópicamente, se observa una lesión Microscópicamente, se observa una lesión inflamatoria con presencia de focos de inflamatoria con presencia de focos de necrosis, pequeños granulomas, atrofia de necrosis, pequeños granulomas, atrofia de epitelio seminal y esclerosis, y gran epitelio seminal y esclerosis, y gran cantidad de polimorfonucleares, cantidad de polimorfonucleares, macrófagos e hiperplasia del tejido macrófagos e hiperplasia del tejido reticular. reticular.

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Diagnóstico Serológico de laBrucelosis

Tamiz o Screening: BPA

Clásicas: Wright

Complementarias: 2-ME, FC

Vigilancia Epidemiológica: Ring Test (Anillo en leche), ELISA indirecta.

Nuevas técnicas: ELISA, Polarización fluorescente.

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Modelo de investigación planteadoModelo de investigación planteado

Brucella abortusBrucella abortus puede infectar placentas en cualquier puede infectar placentas en cualquier estadío de la gestación.estadío de la gestación.Gran capacidad de replicarse sólo en las placentas de Gran capacidad de replicarse sólo en las placentas de segundo y tercer trimestre.segundo y tercer trimestre.Factores endocelulares en trofoblastos podrían Factores endocelulares en trofoblastos podrían favorecer la multiplicación de favorecer la multiplicación de Brucella abortusBrucella abortus en las en las placentas que superen la mitad de la preñez???. placentas que superen la mitad de la preñez???. PropuestaPropuesta: Identificar diferencias en la expresión de : Identificar diferencias en la expresión de proteínas en los tejidos placentarios bovinos según su proteínas en los tejidos placentarios bovinos según su estadío, así como también la mutación dirigida a los estadío, así como también la mutación dirigida a los sitios activos de dichas proteínas para comparar la sitios activos de dichas proteínas para comparar la multiplicación de multiplicación de Brucella abortusBrucella abortus en trofoblastos en trofoblastos mutados versus trofoblastos normales.mutados versus trofoblastos normales.

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Materiales y métodosMateriales y métodos

Explantes de membrana corioalantoidea Explantes de membrana corioalantoidea (CAMs) bovinas procedentes del primer y (CAMs) bovinas procedentes del primer y tercer estadío de gestación.tercer estadío de gestación.

RNA purificado de CAMs en cultivo.RNA purificado de CAMs en cultivo.

cDNA a partir del RNA purificado cDNA a partir del RNA purificado (marcados con fluorescencia de distinto (marcados con fluorescencia de distinto color)color)

Kit de microarrays para el genoma bovino.Kit de microarrays para el genoma bovino.

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Etapas:Etapas:1.1. Cultivo de Cultivo de Explantes de membrana corioalantoidea (CAMs) Explantes de membrana corioalantoidea (CAMs)

bovinas procedentes del primer y tercer estadío de gestación.bovinas procedentes del primer y tercer estadío de gestación.

2.2. Obtención de RNA de esas células.Obtención de RNA de esas células.

3.3. Síntesis el cDNA mediante la enzima transcriptasa inversa el Síntesis el cDNA mediante la enzima transcriptasa inversa el cual se marcará con fluorescencia de distinto color para cada cual se marcará con fluorescencia de distinto color para cada estadío.estadío.

4.4. Ensayo microarrays: Se comparará la expresión génica en los Ensayo microarrays: Se comparará la expresión génica en los trofoblastos de diferente estadío para determinar cuál o cuales trofoblastos de diferente estadío para determinar cuál o cuales son las proteínas que cambian su patrón de expresión.son las proteínas que cambian su patrón de expresión.

5.5. De esta forma se pueden observar genes que se activan o se De esta forma se pueden observar genes que se activan o se reprimen en esas condiciones.reprimen en esas condiciones.

6.6. Mutaciones dirigidas hacia los sitios activos de cada una de Mutaciones dirigidas hacia los sitios activos de cada una de estas proteínas a fin de evaluar su efecto in Vitro en la infección estas proteínas a fin de evaluar su efecto in Vitro en la infección experimental de experimental de Brucella abortusBrucella abortus..

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Ensayo microarraysEnsayo microarrays

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Recreo!!!Recreo!!!

GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!GRACIAS POR SU ATENCIÓN!!