BRASSINOSTEROIDYRostlinné hormony

Barbora Slavíková

• Co jsou to brassinosteroidy (BRs)

• Výskyt a význam brassinosteroidů

• Syntéza nových analogů

• Testování

Brassinosteroidy - Brassinolid• přírodní rostlinné hormony (auxiny, gibereliny, cytokininy, kys.

abscisová, ethylén)

• výskyt v přírodě v rostlinách ve velmi malém množství

• Brassinolid (Bl)- objeven v pylových zrnech řepky(Brassica napus) v roce 1979

• (22R,23R,24S)-2,3,22,23-tetrahydroxy-24-methyl-7oxa-7a-homo-5-cholestan-6-on

O

HO

HOH

O

OH

OH

Význam brassinosteroidů• Účinky podporující růst rostlin (růst a dělení buněk, indukují

kvetení, zrání plodů, klíčení semen, mají vliv na fotosyntezu…)

• Protistresové účinky (zvyšují odolnost rostlin vůči abiotickým a biotickým stresům-sucho, chlad, pesticidy, sůl, nemoci, škůdci…)

BRs působí prostřednictvímpřenosu signálu přes receptor lokalizovaný na buněčné membráně.

huseníček (Arabidopsis thaliana)identifikován první gen pro receptory rostlinných BRs

Proč syntetizovat analoga brassinolidu

• Syntéza epibrassinolidu – obdobná účinnost (5 mg cca 90 $)

• Studium vztahu mezi strukturou a aktivitou • Hledání strukturně podobných účinných sloučenin,

metabolicky stabilnějších a levnějších• Počítačové modelování – jak zacílit syntézu

Řešení

• Izolace Bl neefektivní (40 kg pylu 10 mg)

• Syntéza Bl složitá, neefektivní (‹1 %)• Metabolická nestabilita

O

HO

HOH

O

OH

OH

Syntéza epibrassinolidu

HO HOHO TosO

TosO

OHOO

Li tosylchlorid

+

CH3COOKJonesovoLiBr

ethylamin

O

HO

HOO

HO

HO

HO

HO O

HO

HO O

+

OsO4

èinidlo

+Bayer-

Villiger+

ergosterol

OH

HO

OH

HO

O O

H H

H

H H H H

O

OH

HO

HO

Počítačové modelování

Program MOEQSAR-Quantitative Structure-Activity Relationships

QSAR- analýza- odhad vlastností a osudu org. sloučenin v prostředí, účinku sloučenin na živé organismy…

Porovnání struktur

O

O

HO

HO

H

AO

O

HO

HHO

B

A

B

GRID mapy

Cíl práce

Syntéza brassinosteroidů se zvýšenou metabolickou stabilitou

-zablokování poloh metabolické deaktivace (A-kruh, postranní řetězec…) zavedením fluoru do molekuly

O

HO

HOH

O

OH

OH

A B

C D

Syntéza analogů brassinosteroidů

AcO

O

AcO

R

1. R = OH2. R = OAc

AcO

OAc

BrOH

AcO

OAc

OAcO

OAc

FOH

AcO

OAc

FO

HO

OAc

FO

OAc

FO

HO HO

OH

FO

3

456

7 89

1. NaBH4

2. Ac2O

BrOH

1.KOH, MeOH2.Ac2O

HF pyridinJones r.

K2CO3, MeOH

1. MesCl2.NaNO2

HCl, MeOH

Syntéza analogů brassinosteroidů

F

OAc

FO

OAc

FO

HO F

OH

FO

5 6 7

OAc

FO

OAc

FO

HO HO

R

FO

1 2 3. R = OAc4. R = OH

HO

1.MesCl2. kolidin

OsO4

DAST HCl, MeOH

Syntéza analogů brassinosteroidůCH2OH

O O

CHO

O O

O O O

Dess-Martinreagent MePPh3Br

n-BuLi

p-TsOH

COOMe

O O

LiAlH4

2 3 4

56

Rf+

Hoveyda-Grubbs2nd gen. cat.

O

Rf

8a, Rf = n-C6F13

8b, Rf = n-C3F7

8c, Rf = i-C3F7

10a, Rf = n-C6F13

10b, Rf = n-C3F7

10c, Rf = i-C3F7

OsO4 (15 mol%)

O

Rf

HO

HO

OH

HO

9a, Rf = n-C6F13, 19%O

Rf

HO

HOor

11a, Rf = n-C6F13

11b, Rf = n-C3F7

11c, Rf = i-C3F7

O

HO

OH

RfHO

HOO

1. CF3COOOH

7a, Rf = n-C6F13

7b, Rf = n-C3F7

7c, Rf = i-C3F7

2. HPLC

COOH

1HO

NMO

H H

H H H

Testování účinnosti látek• Brassinolidní aktivita

– Test na druhém internodu fazole– Test na stéblu rýže

– Polní testy

• Protinádorové aktivity

• Test vazby na GABAA receptor

Test na druhém internodu fazole

Test na druhém internodu fazole

Test na stéblu rýže

Čína: použití do tabáku, cukrové třtiny, řepky, čaje a k ošetření ovocných stromů.Rusko: ošetření brambor, rajčat, okurky, pepře a ječmeneU nás testy na pšenici, sóje, lupině, řepce, chmelu, hrachu, kukuřici…

Polní testyBRs zvyšují výnos kulturních plodin zvláště v nepříznivých podmínkách, jsou přirozené pro rostliny, chrání životní prostředí

(2 x 10-11 mol.l-1, cca 20 mg na ha)Sledování: hmotnost sušiny, délka stébla, délka klasu, počet odnoží, množství a složení semen, hořčiny, cukernatost, obsah chlorofylu,

Protinádorová aktivita

Calcein (acetoxymethoxy) AM-• indikátor životnosti buněk (díky vysokému záchytu v

živých buňkách a silné fluorescenci)• rozpustný v DMSO

• buněčné linie (leukémie, karcinom prsu…)

Výsledky testování látek na druhém internodu fazole

HO

OH

FO

F

OH

FO

HO

OH

FO

HO

4a, Rf = n-C6F13

4b, Rf = n-C3F7

4c, Rf = i-C3F7O

HO

OH

Rf

HO

HO

OH

1

2

3

Testovaná látkaRozdíl délky růstu v mm

(koncentrace 10-10 mol . L-1)

24-epiBR 54

1 43,4±0,9

2 19,5±4,9

3 18,42,3

4a 3,1±5,7

4b 11±1,1

4c 0,9±3,7

Výsledky testování látek na druhém internodu fazole

Conc. Mol.L-1 1

Kontrola Rozdíl v mm

1,00E-07 21,928571 20,5 1,428571

1,00E-10 63,928571 20,5 43,42857

1,00E-12 34,785714 20,5 14,28571

Výsledky testování látek na protinádorovou aktivitu (IC50)

HO

OH

FO

F

OH

FO

HO

OH

FO

HO

4a, Rf = n-C6F13

4b, Rf = n-C3F7

4c, Rf = i-C3F7

O

HO

OH

Rf

HO

HO

OH

1

2

3

Testovaná látka CEMa (M) MCF 7b (M)

28-homocastasteron 13±2,8 >50

1 >50 >50

2 >50 >50

3 >50 >50

4a >50 >50

4b 35,3±1,6 48,2±0,6

4c >50 >50

a T-lymphoblastic leukemia cell line CEM

bBreast carcinome cell lines MCF-7

Výsledky testování látek ve vazbě na GABAA receptor

4a, Rf = n-C6F13

4b, Rf = n-C3F7

4c, Rf = i-C3F7

O

HO

OH

Rf

HO

HO

OH

HO

allopregnanolone

O

H

Testovaná látka[35S]-TBPS (%)

100nMImax(%) IC50 (nM)

allopregnanolone 56,2±6,0 79 80

4a 47,2±15,1 57,9 900

4b 95,1±14,8    

4c 56.6±14.6 59,4 100

koncentrace od 1 nM do 10 μM()

LiteraturaSlavíková B. et al. J. Med. Chem., 2008, 51 (13), pp 3979–3984

Eignerová B. et al. J. Med. Chem., 2009, 52 (18), pp 5753–5757

Šíša M. et al. Steroids 72 ( 2007 ) 740–750

Poděkovánímedicinální steroidy, ÚOCHB Praha

laboratoř růst. regulátorů, PřF ÚP a ÚEB AV ČR, Olomouc , Dr. Oklešťková

Universitat Ramon Llull, Barcelona

Psychiatrické Centrum, Praha- Dr.Krištofíková

Děkuji za pozornost