Borna Disease in a Dog with Borna Disease in a Dog with Lethal Meningoencephalitis Lethal Meningoencephalitis

Received 4 February 1998/Returned for modification 9 April 1998/Accepted 20 April 1998 Received 4 February 1998/Returned for modification 9 April 1998/Accepted 20 April 1998

班級 :生科四甲學生 :陳致融

指導老師 :張猷忠

IntroductionIntroduction

Borna 疾病是熱血動物感染神經學的綜合症狀，導致腦部組織損壞而致命。歐洲最初辨認在綿羊和馬有被辨認出來，它被發現發生在大範圍熱血動物包括鳥、牛、兔子、貓和大主教。從那以後被發現有此病毒的動物地區有以色列、荷蘭、波蘭、俄國、瑞典、英國和美國 。

Borna Borna 疾病發病的特徵疾病發病的特徵• Borna 疾病通常在動物的伏期通常非常快，

最初會使動物打哈欠、昏睡、厭食、四肢無力、絞痛和肌肉收縮，後期會影響到中央神經系統錯亂、腦膜炎和腦脊髓炎。 ( 在人類主要會感染邊緣系統 ) 。 Borna 病毒漸漸受到關注，但是還有一個未解決的問題「 BDV 是不是會用動物傳染給人」，要是 BDV 是否可藉由寵物傳染給人類，此問題就會受到重視。

Fig 1

用 Cresyl echt violet染，顯示淋巴的腦膜炎下的血管內皮細胞脹大，軟膜內細胞也有腫脹。 ( 放大 110倍 )

病理切片

• Fig 1• 用 Cresyl echt violet

染下視邱，顯示淋巴球性圍管現象。 ( 放大110 倍 )

• 右下角是用四溴螢光素染下視丘，箭號指出的地方是在核酸內 Joest-Degen 內含體裡面的神經元。 ( 放大 510 倍 )

• 從奧地利的福拉爾貝格 (Vorarlberg) 找一隻兩歲的母哈士奇狗，而這隻狗的臨床病史有厭食及昏睡。作者用電解質、葡萄糖、維他命、胺基酸、非固醇類的消炎劑、和抗生素 等等…經過兩天的治療失敗後。這隻狗逐漸變成了嚴重的神精質，一天後將這隻狗安樂死，因為其臨床症狀被懷疑是得到了狂犬病或是犬溫熱。經神經病理學檢察顯示是一種嚴重的非化膿性腦膜腦炎，其具有淋巴球的腦膜炎的特性。

探針的標記 探針的標記 • 先將核苷酸序列 (T7 、 SP6)clone 到含噬菌體轉錄啟動子的載體 (pGEM 3z ) 中，然後在 RNA聚合酶的作用下，以 DNA 為範本，以含有標記的 NTP 為原料，對啟動子下游的序列進行轉錄，而啟動子本身並不被轉錄。體外轉錄常用噬菌體 (T7 、 SP6)轉錄啟動子，噬菌體的 RNA聚合酶對 SP6啟動子序列具有高度的親和性，從而啟動下游的轉錄，在 4種 dNTP 和相應的噬菌體 RNA聚合酶存在的條件下，即轉錄成 RNA 。如反應物中含有標記的 dNTP ，部分的 RNA 就被標記。

in situ hybridizationin situ hybridization((原位雜原位雜交交 ))

• 利用石蠟把中腦細胞包埋，再用 digoxigenin labelle RNA進行 ISH 。生物體外的方法是由 BDV ORF1(open reading frame 1) RNA ，而這個 RNA 有 digoxigenin labelle ，在拿 RNA當 probe去中腦的細胞進行混交就可以偵測到 RNA

實驗方法實驗方法1. 用 0.1 N HCl for 10 min室溫2. 在 0.1% (wt/vol) pepsin(胃蛋白脢 ) in 0.1

% HCl at 37°C for 20 min 3. hybridization with partially hydrolyzed

(水解 ) probe at 50°C overnight4. 用 13 SSC for 15 min 室溫 (2次 ) 和 0.

13 SSC for 20 min 50°C (2次 )5. 用鹼性的磷酸脢結合 antidigoxigenin( 抗

地高辛 )去 hybrid 特定的標準 IHC

免疫組織化學（免疫組織化學（ ImmunochistocheImmunochistochemistry,IHCmistry,IHC ） ）

利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 ( 螢光素、酶、金屬離子、同位素 ) 顯色來確定組織細胞內抗原 (多肽和蛋白質 ) ，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。

標記抗體與抗原結合方式主要有兩種：標記抗體與抗原結合方式主要有兩種：

• ①直接法：用標記抗體與抗體中的相應抗原直接結合，操作方法簡便，特異性高，但敏感性較差，此法可用於檢定未知抗原；

• ②間接法：先用未標記的具有特異性的第一抗體與樣品中的相應抗原結合，然後再以標記的第二抗體與特異性的第一抗體結合；第二抗體是用第一抗體作為抗原注入另一動物體內誘導產生的抗體，然後再結合以標記物。

免疫化學染色法免疫化學染色法 (IHC)(IHC) 與原位雜與原位雜交 交 (ISH)(ISH) 來作比較來作比較

• 免疫化學染色法 (IHC)與原位雜交 (ISH) 來作比較， (IHC) 的操作時間比較短，約 4-6小時即可完成，而 ISH必須隔夜。在設備上 (ISH)需使用螢光顯微鏡，而 (IHC)只需一般光學顯微鏡即可。在分子生物學上， (ISH)測的是腫瘤細胞的 DNA ，而 (IHC)測的是細胞膜表面的蛋白質。 (ISH) 用傳統的分子生物學方法抽取腫瘤組織的 DNA 或RNA 作南方或北方點墨法的時候，很難避免受到鄰近腫瘤組織的間質組織之干擾，會稀釋腫瘤組織所特有的 DNA表現，而 ISH 可以避免這個問題。

RT-PCR RT-PCR

• RT-PCR 的全名是 Reverse Transcriptase PCR （反轉錄酶 PCR），其技術原理簡單的來說是將一段待測的 RNA序列經反轉錄酶的作用轉錄成 cDNA ，再利用 PCR技術將基因片段以幾何級數倍增的方式增加到數十萬倍，所形成的 PCR 基因產物經一種叫 Ethidium bromide( 溴化乙錠 ) 的化學物質作用，利用其會與 DNA嵌合，經 UV照射時會發出肉眼可見的螢光，即在電泳膠片上會呈現具有特定分子量的 PCR 基因片段的產 (212bp) 。

利用抗生素蛋白和維生素 H 在神經原顯現出專一性標記

Astrocytes (星形細胞 )

Neurites(Neurites( 神經軸突神經軸突 ))

利用抗生素蛋白和維生素 H 在神經原顯現出專一性標記

利用抗生素蛋白和維生素 H 在神經原顯現出專一性標記

white matter(白質 )

利用抗生素蛋白和維生素 H 在神經原顯現出專一性標記

單株抗體 (BO18) 辨認特別的 BDV (p38/40)

利用利用 ISHISH 以以 RNA probeRNA probe 表示可以偵測到有感染的表示可以偵測到有感染的RNA, RNA, 顯示在神經細胞的細胞質有表現。顯示在神經細胞的細胞質有表現。

(( 放大放大 570570 倍倍 ))

利用利用 ISHISH 以以 RNA probeRNA probe 表示沒有偵測到有感表示沒有偵測到有感染的染的 RNARNA 在牛皰疹病毒沒有顯示在牛皰疹病毒沒有顯示

AF054275(AF054275( 狗的狗的 BDVBDV ，， 212bp) 212bp)

• CCCAGCCTTGTGTTTCTATGTTTGCTAATCCCAGGACTGCACGCTGCATTTGTTCACGGAGGGGTGCCTCGTGAATCTTACCTGTCGACGCCTGTTACGCGTGGGGAACAGACTGTCGTTAAGACTGCGAAGTTTTACGGGGAAAAGACAACACAGCGTGATCTCACCGAGCTGGAGATCTCTTCTATATTCAGCCATTGTTGCTCATTAC

AF054276(AF054276( 馬的馬的 BDVBDV ，， 212bp)212bp)

• CCCAGCCTTGTGTTTCTATGTTTGCTAATCCCAGGACTGCACGCTGCATTTGTTCACGGAGGGGTGCCGCGTGAATCTTACCTGTCGACGCCTGTTACGCGTGGGGAACAGACTGTCGTTAAGACTGCGAAGTTTTACGGGGAAAAGACAACACAACGTGATCTCACCGAGCTGGAGATCTCTTCTATATTCAGCCATTGTTGCTCATTAC

結論• BDV 會破壞腦而引起腦膜炎和腦脊髓炎。• 利用 immunohistochemistry(免疫組織化

學法 ) 、 RT-PCR 以及 in situ hybridization(原位雜交 ) 可證實狗的腦組織中含有 BDV的抗原及 BDV 特有的 RNA 。