BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO...

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG…………………….

Luận văn Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi nấm

SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang

1

Phần 1: MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo chúng ta đã biết thì Linh chi là một trong được thảo thiên nhiên được xếp vào

loại thượng dược. Cách đây hàng ngàn năm, nấm Linh chi đã được dùng để làm thuốc,

các sách dược thảo của nhiều triều đại ở Trung Quốc đều ghi nhận Linh chi được sử dụng

làm thuốc từ lâu đời. Giá trị dược liệu của Linh chi đã dược ghi chép trong các thư tịch cổ

của Trung Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Từ những kinh nghiệm lưu

truyền trong nhân gian, loài người đã biết sử dụng Linh chi theo nhiều cách khác nhau.

Đến nay khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi còn được các nhà khoa học trên

thế giới chứng minh được tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết

áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan siêu vi, suy nhược thần kinh… [3, 9]

Hiện nay Linh chi không còn khan hiếm như lúc trước do con người có thể áp

dụng kỹ thuật để nuôi trồng Linh chi trong môi trường nhân tạo và ngày càng phát triển

mạnh trên thế giới và đạt đến quy mô công nghiệp. Trong hai thập niên gần đây, các nhà

khoa học ở nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapore, Hongkong đã tăng cường

nghiên cứu sản xuất nấm Linh Chi và mở rộng hiệu quả sử dụng dược liệu này.

Tại thị trường Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở

trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Nhiều cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi

trồng, chế biến và thăm dò các hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi. Các thành phần

hóa học có trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: acid béo, steroid,

alcaloid, protein, polysaccharide… [19]. Trong đó thành phần có tác dụng dược lý quý

báu, đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [2].

Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa và nguồn nguyên liệu cellulose dồi dào, đã

tạo điều kiện cho nghề trồng nấm không ngừng phát triển. Hiện nay cả nước có 32/61 tỉnh

thành đã có cơ sở nuôi trồng nấm dược liệu (tháng 12/2001) [6].

Dựa vào tình hình ngày càng phát triển của ngành nấm ở Việt Nam và sự cho phép

của bộ môn công nghệ sinh học của Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí

Compa

ny C

onfid

entia

l


2

Minh chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi

nấm Ganoderma lucidum”.

1.2 MỤC ĐÍCH

Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối tơ nấm Linh chi.

1.3 YÊU CẦU

Ø Xác định ảnh hưởng các yếu tố dinh dưỡng đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm

Linh chi

Ø Xác định ảnh hưởng các yếu tố pH đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi

Ø Xác định đường cong tăng trưởng của sợi nấm Linh chi

Ø Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sợi nấm Linh chi theo quy trình thực nghiệm

Ø Phân tích thành phần hoạt chất có trong sợi nấm Linh chi

1.4 HẠN CHẾ ĐỀ TÀI

Chưa khảo sát hết các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh khối nấm

Linh chi.

Compa

ny C

onfid

entia

l


3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 NẤM LINH CHI [2, 5, 6, 12]

2.1.1 Khái quát chung

Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, người miền Bắc xưa còn

gọi là nấm lim. Trong thư tịch cổ nấm Linh chi còn được gọi với tên khác như Tiên thảo,

Nấm trường thọ, Vạn niên nhung…

Nấm Linh chi thường phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường

phát triển trên giá thể là gỗ mục hoặc các nguyên liệu có chất sơ.

Hình thái quả thể nấm Linh chi được mô tả như sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt

hoặc thận. Mặt trên mũ có vân đồng tâm và bóng loáng, màu vàng cam cho đến màu đỏ

đậm hoặc nâu đen. Mặt dưới phẳng, có nhiều lổ nhỏ li ti, là cơ quan sinh bào tử. Cuống

nấm đặc và cứng, sậm màu và bóng loáng.

Giá trị dược liệu của Linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung

Quốc, cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1994). Trong sách “Thần nông bản thảo“ cách

đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc

Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi“ thời nhà Minh với các khái quát công

dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu (Lý Thời Trân, 1590).

Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:

ü Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)

ü Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)

ü Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)

ü Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)

ü Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)

ü Tử chi (Linh chi tím)

Cho đến nay Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nước Trung Quốc, mà

mang tính toàn cầu. Hiện tại có khoảng 250 bài báo của các nhà khoa học liên quan đến

dược tính và lâm sàng của Linh chi đã được công bố.

Compa

ny C

onfid

entia

l


4

Cấu trúc độc đáo của Linh chi chính là thành phần khoáng vi lượng đủ loại, trong

đó một số khoáng tố như germanium, vanadium, crôm... Chúng đã được sử dụng là nhân

tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa, đông máu

nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế bào với hàm

lượng rất thấp

Ở các nước Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan…,

việc nghiên cứu phát triển và sử dụng Linh chi đang được công nghiệp hóa với quy mô

lớn về phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến và bào chế dược phẩm. Đồng thời nghiên

cứu được các hoạt chất có tác dụng dược lý và phương pháp điều trị lâm sàng.

Ở Việt Nam, trong các tài liệu lưu lại của Hải Thượng Lãn Ông, Lê Hữu Trác

(1720-1791) cũng thấy đề cập đến Linh chi. Sau đó, Lê Quý Đôn còn khẳng định, đây là

nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam. Trong quyển “Cây thuốc và vị thuốc Việt

Nam” (1991), giáo sư Đổ Tất Lợi còn mô tả chi tiết và trình bày về đặc tính trị liệu của

loài nấm này, đồng thời cho rằng đây là loại Siêu thượng dược.

2.1.2 Vị trí phân loại [5, 7]

Nấm Linh chi có vị trí phân loại được thừa nhận rộng rãi hiện nay:

Ngành: Eumycota

Ngành phụ: Basidiomycotina

Lớp: Hymenomycetes

Lớp phụ: Hymenomycetidae

Bộ: Aphyllophorales

Họ: Ganodermataceae

Họ phụ: Ganodermoidae

Giống: Ganoderma

2.1.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành

một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn 200 loài được ghi nhận,

riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài. [3]

Compa

ny C

onfid

entia

l


5

Nấm Linh chi là một trong những loại nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc bộ

Đậu (Fabales). Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân cây hoặc gốc cây. Ở Việt

Nam Nấm Linh chi được gọi là nấm Lim và được phát hiện ở miền Bắc bởi Patouillard

N.T (1890 đến 1928).

Hình 2.1: Nấm Linh chi

Nấm Linh chi (quả thể) cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến

đối diện với mũ nấm). Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5-

3cm. Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ,

nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm.

Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có hình quạt. Trên mặt mũ có vân gạch

đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím

nhẵn bóng như láng vecni. Mũ nấm có đường kính 2 - 15cm, dày 0,8 - 1,2cm, phần đính

cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm. Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ

phiến có màu nâu sẫm.

Compa

ny C

onfid

entia

l


6

2.1.3.2 Chu trình sống của nấm Linh chi

Hình 2.2: Chu trình phát triển của nấm Linh chi [5]

2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐẶC TÍNH DƯỢC LÝ CỦA NẤM LINH CHI

(GANODERMA LUCIDUM)

Các phân tích của G-Bing Lin đã chứng minh các thành phần hóa được tổng

quát của nấm Linh chi như sau : [18]

Nước: 12 – 13%

Cellulose: 54 – 56%

Lignine: 13 – 14%

Lipid: 1.9 – 2.0%

Monosaccharide: 4.5 – 5.0%

Polysaccharide: 1.0 – 1.2% (chống hoạt động khối u, tăng

sức đề kháng và hệ miễn dịch cho cơ thể)

Sterol: 0.14 – 0.16%

Protein: 0.08 – 0.12%

Thành phần khác: K, Zn, Ca, Mn, Na, khoáng thiết yếu,

nhiều vitamin, amino acid, enzyme và

hợp chất alcaloid.

Quả thể

Sợi nấm song nhân

Sợi nấm đơn nhân Đảm và bào tử

đảm

Phối nhân trong đảm

Đảm

Compa

ny C

onfid

entia

l


7

Từ những năm 1980 đến nay, bằng các phương pháp hiện đại: phổ kế UV (tử

ngoại), IR (hồng ngoại), phổ kế khối lượng - sắc ký khí (GC – MS), phổ cộng hưởng từ

hạt nhân và đặc biệt là kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cùng phổ kế plasma (ICP), đã

xác định chính xác gần 100 hoạt chất và dẫn xuất trong nấm Linh chi. [2]

Bảng 2.1: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi (Ganoderma

lucidum) [19]

Thành phần hoạt

chất Nhóm chất Hoạt tính dược lý

Loại mô

nấm

ARN Nucleic acid Kích thích hệ miễn dịch

Chống virút Bào tử

**(Không xác

định) Alkaloid Bổ tim Quả thể

** Glycoprotein Ức chế khối u Quả thể

Adenosine Nucleotide Tăng sự lưu thông máu

Thư giản cơ, giảm đau Quả thể

Beta – D - glucans Polysaccharide

Chống khối u

Kích thích hệ miễn dịch

Giảm lượng đường huyết

Bổ tim

Quả thể

Ganoderic Acids Triterpenoid

Chống dị ứng

Bảo vệ gan

Ức chế tổng hợp

cholesterol

Quả thể

Ganodermadiol Triterpenoid Giảm huyết áp

Ức chế ACE Quả thể

Adenosine Nucleotide Tăng sự lưu thông máu

Thư giản cơ, Giảm đau Hệ sợi nấm

Compa

ny C

onfid

entia

l


8

Beta – D -glucans Polysaccharide

Chống khối u

Kích thích hệ miễn dịch

Tăng sản suất kháng thể

Hệ sợi nấm

Uridine, Uracil Nucleoside Phục hồi sự dẻo dai Hệ sợi nấm

Cyclooctasulpher Chống dị ứng Hệ sợi nấm

Ling Zhi – 8 Protein Chống dị ứng quang phổ

Điều hoà huyết áp Hệ sợi nấm

Ganodosterone Steroid Bảo vệ gan Hệ sợi nấm

Ganoderic Acids Triterpenoid Bảo vệ gan Hệ sợi nấm

Ganodermic Acid T

– O Triterpenoid

Ức chế tổng hợp

cholesterol Hệ sợi nấm

Oleic Acid Acid béo Chống dị ứng Hệ sợi nấm

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpene mới, bao gồm lucidumol

A và B, các ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đó kiểu Lanostane triterpene

có thành phần chính là lipophilic. Có khoảng 130 hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi

và bào tử nấm Linh chi. Thành phần và hàm lượng triterpene phụ thuộc vào nguồn giống,

yếu tố môi trường. Vai trò của triterpene có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn

bệnh HIV. [22]

Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng polysaccharide và

triterpene của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh viêm gan mãn tính. Ganopoly ức

chế quá trình dịch mã của ADN polymerase của virút gây bệnh HBV, ngăn chặn sự hoạt

động của virút. Ngoài ra polysaccharide và triterpene tác động hữu hiệu trong việc điều trị

bệnh đái đường loại 2 (type II diabetes mellitus) cho các bệnh nhân. [14]

Năm 1994, Lin Zhibin và Lei Lin Sheng đã xác định được trọng lượng phân tử của

Polysaccharide từ G.lucidum là khoảng 7.100 – 9.300. Những tổng kết về vai trò sinh

Compa

ny C

onfid

entia

l


9

dược học của nhóm polysaccharide ở các loài nấm Linh chi đã được giới thiệu tại Hội

thảo Bắc Kinh với các báo cáo của các tác giả Đài Loan, Trung Quốc, Hoa kỳ.

He, Y. et al (1992) đã khảo cứu các BN3B - gồm 4 polycaccharide đồng nhất có

hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là glucan (chỉ chứa glucose) và

BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết glycoside.

Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết của nhiều

polysaccharide. Đó là các heteroglycan có cả hoạt tính chống ung thư. Các ganoderan B

có tác dụng làm tăng mức insuline trong huyết tương, giảm sinh tổng hợp glycogen và

giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sở trị liệu trên các bệnh nhân đái

tháo đường.

Các phức hợp polysaccharide – protein có hoạt tính chống khối u và tăng tính miễn

dịch. Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp

Protoplast giữa chủng G.lucidum với G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương

(Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức

polysaccharide – protein lên đáng kể.

Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2

(Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng

soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi.

Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực

chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và

G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993). [2]

Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine,

triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng

histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp

Cholesterol và hạ huyết áp. [2, 3, 19]

2.3 KHẢ NĂNG CHỮA BỆNH CỦA NẤM LINH CHI

Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc

và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của Linh chi. Chúng đã được khẳng định

là nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, dị ứng, lão hóa, xơ vữa,

Compa

ny C

onfid

entia

l


10

đông máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc của nhân tế

bào.

Tài liệu cổ nhất nói tương đối cụ thể về khả năng trị liệu của nấm Linh chi cũng

của Lý Thời Trân (1595). Theo tác giả trong 6 loại Linh chi thì mỗi loại có đặc tính riêng.

Bảng 2.2: Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590)

Tên gọi Màu sắc Đặc tính dược lý

Thanh chi Xanh Vị chua, tính bình, không độc chủ trị sáng mắt,

bồ gan khí an thần, tăng trí nhớ.

Hồng chi Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ,

dưỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực.

Hoàng chi Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí.

Bạch chi Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông

mũi, an thần, chữa ho nghịch.

Hắc chi Đen Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu

Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của

nấm Linh chi như sau: [1, 7, 8]

- Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn)

- Bảo can (bảo vệ gan)

- Cường tâm (thêm sức cho tim)

- Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá)

- Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp)

- Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm)

- Trường sinh (tăng tuổi thọ)

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy

Linh chi có tác dụng với một số bệnh:

Đối với các bệnh tim mạch: Nấm Linh chi có tác dụng điều hoà, ổn định huyết áp.

Khi dùng cho người huyết áp cao, nấm Linh chi không làm tăng mà làm giảm bớt, dùng

Compa

ny C

onfid

entia

l


11

nhiều thì huyết áp ổn định. Đối với những người suy nhược cơ thể, huyết áp thấp thì nấm

Linh chi có tác dụng nâng huyết áp lên gần mức dễ chịu nhờ cải thiện, chuyển hoá dinh

dưỡng. Đối với bệnh nhiễm mỡ, xơ mạch, dùng nấm Linh Chi có tác dụng giảm

cholesterol toàn phần, làm tăng nhóm lipoprotein tỷ trọng cao trong máu, làm giảm hệ số

sinh bệnh. Nấm Linh chi làm giảm xu thế kết bờ của tiểu cầu, giảm nồng độ mỡ trong

máu, giảm co tắc mạch, giải tỏa cơn đau thắt tim. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò

của các nguyên tố khoáng vết hiếm. Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng

cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận

chuyển oxy vào mô. Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là

một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung

thư. [2, 3]

Đối với các bệnh về hô hấp: nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là với những

ca điều trị viêm phế quản dị ứng, hen phế quản tới 80% có tác dụng giảm và làm nhẹ bệnh

theo hướng khỏi hẳn.[7, 8]

Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải

phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có

thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở

Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh

nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn. Các nhà khoa học ở

Đại học Haifa, Israel khẳng định nấm Linh chi - một loài nấm dại thường dùng trong

Đông Y ở Trung Quốc (và Việt Nam) - có thể chữa ung thư tuyến tiền liệt. Ung thư tiền

liệt tuyến là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất ở đàn ông, với hơn 543.000

người được chẩn đoán mỗi năm trên toàn thế giới.

Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong

nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm

kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virút được xác

định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm

HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này

(Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị

Compa

ny C

onfid

entia

l


12

tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân

trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng

minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau: (Masao Hattori, 2001)

ü Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1

ü Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease

HIV – 1

ü Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A

(mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma).

Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH)

ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột. [2, 22]

Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và

triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985).

Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố

khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có

thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh

chi Việt Nam nói riêng. [2]

Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do trong

cơ chế chống não hóa, chống ung thư. Bảo vệ và chống ảnh hưởng của các tia chiếu xạ.

Linh chi cũng có tác dụng giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc, kể cả các kim loại

năng như: Chì, Germanium.

2.4 MỘT SỐ ỨNG DỤNG LÂM SÀN

Trị suy nhược thần kinh: Bệnh viện Hoa Sơn thuộc Viện Y học số 1 Thượng Hải

báo cáo: Dùng cả 2 loại Linh chi nhân tạo và Linh chi hoang dại chế thành viên ( mỗi viên

tương đương 1g thuốc sống), mỗi lần uống 3 viên, ngày 3 lần, một liệu trình từ 10 ngày

đến 2 tháng. Trị 225 ca, tỷ lệ kết quả 83,5 - 86,3%, nhận xét thuốc có tác dụng an thần,

điều tiết thần kinh thực vật và tăng cường thể lực ( theo báo Tân y học, số phụ chuyên đề

về bệnh hệ thống thần kinh 1976,3:140).

Compa

ny C

onfid

entia

l


13

Trị chứng cholesterol máu cao: Báo cáo của Sở nghiên cứu kháng khuẩn tố công

nghiệp Tứ Xuyên, dùng liên tục từ 1 đến 3 tháng cho 120 ca thuốc có tác dụng hạ

cholesterol huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ kết quả 86% ( theo báo cáo đăng trên báo thông tin

Trung thảo dược 1973,1:31).

Trị viêm phế quản mạn tính: Tổ nghiên cứu Linh chi tỉnh Quảng Đông báo cáo

dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có

tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông

1979,1:1).

Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi

hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động,

viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan

được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242).

Trị chứng giảm bạch cầu: dùng polysaccarit chế thành viên (mỗi viên có 250mg

thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kết quả 72,57% ( Báo cáo của

Lưu Chí Phương đăng trên tạp chí Trung hoa huyết dịch bệnh 1985,7:428).

Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế

thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ

43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kết quả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả

78,88% ( Thông tin nghiên cứu Y học 1984,12:22).

Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét

bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch

truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương.

Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê

huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh. Thuốc

còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực.

Dùng giải độc các loại khuẩn: phối hợp với cam thảo, gừng, táo.

Ngoài ra sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam của Đỗ Tất Lợi có ghi:

Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày

Compa

ny C

onfid

entia

l


14

giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh chi về nấu canh, nấu súp

làm món ăn cao cấp.

2.5 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ HOẠT CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI

2.5.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) [15, 16]

Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi nhưng

polysaccharid gồm 2 loại chính:

GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0) M= 23.000 Da

GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0) M= 25.000 Da

GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galactan, còn GL-B có thành phần

chính là Glu, nên gọi là Glucan.

b (1-3) -D-glucan, khi phức hợp với một protein, có tác dụng chống ung thư rõ rệt

(Kishida & al., 1988).

. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3

chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon,

lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào

(CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan

trong nước nóng.

Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi

cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa

trị.

Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận

sáng chế (patent) ở Nhật. Năm 1976, Cty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm

trích từ Linh Chi có tác dụng kháng carcinogen. Năm 1982, Cty Teikoko Chemical

Industry sản xuất sản phẩm từ Linh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm.

Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al. (1977), sản xuất từ Linh chi chất

mucopolysaccharid dùng chống ung thư.

2.5.2 Ganoderic Acid

Compa

ny C

onfid

entia

l


15

Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm

lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử

ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng

G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [18, 19]

Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có

bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các

triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một

số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là

có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước

ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [10, 11]

Bảng 2.3: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi

(Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996)

Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải

phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan. Hiện nay, đã tìm

thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic. Trong đó ganodosteron được xem là chất kích

thích hoạt động của gan và bảo vệ gan.

2.5.3 Ganoderma Adenosine [18, 19]

Hoạt chất Hoạt tính

Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin

Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp

Ganodermaldiol Hạ huyết áp

Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol

Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol

Compa

ny C

onfid

entia

l


16

Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid.

Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh.

Chức năng của adenosine:

ü Giảm độ nhớt máu

ü Ức chế kết dính tiểu cầu

ü Ngăn chặn hình thành cục nghẽn

ü Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin

ü Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lượng máu cung cấp cho não

ü Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể

2.5.4 Alcaloid [10, 11]

Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản

ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng.

Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung

môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong

nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen.

Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích

alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống.

Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược

và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của

alcaloid.

ü Tác dụng lên hệ thần kinh

ü Tác dụng lên huyết áp

ü Tác dụng trị ung thư

2.5.5 Hợp chất Saponin [21, 23]

Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon

và phần không đường gọi là aglycon.

- Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu

tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:

Compa

ny C

onfid

entia

l


17

ü Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc

gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan.

Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean.

ü Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân

thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan.

- Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan,

spiroalan, solanidan.

Hợp chất Saponin có nhiều công dụng trong y học như:

ü Trị long đờm, chữa ho

ü Là chất phụ gia trong một số vắc xin

ü Tác dụng thông tiểu

ü Tác dụng kháng viêm, chống khối u

2.5.6 Germanium hữu cơ [18, 19]

Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm

1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của

oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến

1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa.

Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc

giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ

sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế

bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà

và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển.

Chức năng của Germanium:

ü Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư

ü Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ

ü Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ

Compa

ny C

onfid

entia

l


18

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

THÍ NGHIỆM

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM

Đề tài được thực hiện từ 27/09/2008 đến 1/1/2009 tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh

thực phẩm, Khoa Sinh học Ứng dụng - Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ

Chí Minh

3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm khoa

sinh học ứng dụng, Trường Cao Đẳng Kinh Tế - Công Nghệ Tp.HCM.

3.3 VẬT LIÊU THÍ NGHIỆM

3.3.1 Thiết bị

Cân phân tích

Kính hiển vi

Máy chụp ảnh kỹ thuật số

Tủ cấy vô trùng

Nồi hấp thanh trùng

Tủ sấy

3.3.2 Hóa chất

Các hóa chất bao gồm: MgSO4, KH2PO4, Glucose, Agar.

3.3.3 Môi trường sử dụng

3.3.3.1 Môi trường dinh dưỡng

Môi trường PGA (Potato glucose agar)

Khoai tây: 200 (g)

Glucose: 20 (g)

Agar: 20 (g)

Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)

Các môi trường đều được khử trùng ở 1210C trong 15 phút.

Compa

ny C

onfid

entia

l


19

3.3.3.2 Môi trường nhân giống

Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn với

cám bắp.

3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Ganoderma lucidum

3.4.1.1 Hình thái quả thể

3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm [9]

ü Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính

ü Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại

trên ngọn lửa đèn cồn

ü Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút

ü Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95%

ü Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu

ü Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100

3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi [13, 17]

ü Lấy quả thể nấm Linh chi trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ

giấy trắng để thu bào tử

ü Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính

ü Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua

ngọn lửa đèn cồn đến khô

ü Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100

3.4.2 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các môi trường lỏng

Cách tiến hành: Các môi trường đều được pha với nồng độ khác nhau. và được

hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy giống. Sau 9 ngày ta thu sinh khối và sấy

ở nhiệt độ 500C và tiến hành cân trọng lượng khô.

Tổng số chai cấy: 52 chai

Compa

ny C

onfid

entia

l


20

3.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi

trường lỏng

Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa

20ml môi trường

Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy

1 PG + 1 g/l MgSO4

2 PG + 2 g/l MgSO4

3 PG + 3 g/l MgSO4

4 PG + 4 g/l MgSO4

3.4.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong

môi trường lỏng


20ml môi trường


1 PG + 0,5 g/l KH2PO4

2 PG + 1g /l KH2PO4

3 PG + 1,5 g/l KH2PO4

4 PG + 2 g/l KH2PO4

3.4.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong

môi trường lỏng


20ml môi trường


1 P + 10 g/l Glucose



Compa

ny C

onfid

entia

l


21



3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên môi trường nuôi cấy

pH ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng. Ở

các giá trị pH khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm khác nhau. Do đó, trong thí

nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng và

phát triển của sợi nấm Linh chi để tìm được giá trị pH thích hợp cho sự phát triển của sợi

nấm.

Cách tiến hành: pha môi trường lỏng PG (potato glucose) với nồng độ pH khác

nhau và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Môi trường được hấp

khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy

gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối sau 9 ngày. Sinh khối

được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô.

Thí nghiệm được thực hiện với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 2 chai. Vậy tổng

số chai cấy là 14 chai

3.4.4 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum

Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG

Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi

trường 20 ml. Hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định

vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các

ngày 3, 6, 9, 12, 15, 21. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân

trọng lượng khô.

Trong quá trình thí nghiệm, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 chai.

Tổng số chai cấy là 10 chai.

3.5. PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

3.5.1. Mục đích

Tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc chọn lựa thành phần tối ưu

của nhiều phần tử trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Phương pháp quy hoạch thực

Compa

ny C

onfid

entia

l


22

nghiệm nhiều yếu tố cho phép thay đổi đồng thời nhiều yếu tố và xác định được tương tác

giữa các yếu tố, nhờ đó giảm bớt số thí nghiệm.

3.5.2. Phương pháp xử lý số liệu

Phương trình hồi quy được xây dựng từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong

phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến mật độ tế bào. Ảnh

hưởng của các yếu tố được đánh giá dựa trên xác xuất tin cậy hay mức ý nghĩa p của

chúng.

Ảnh hưởng được coi là rất lớn khi p ≤ 0,0001, ảnh hưởng là đáng kể khi 0,0001 <

p ≤ 0,05 và không đáng kể khi p > 0,05.

Chỉ có những hệ số biểu diễn ảnh hưởng rất lớn và đáng kể mới được giữ lại trong

phương trình hồi qui cuối cùng. Khi ảnh hưởng của các yếu tố hay ảnh hưởng tương hổ

giữa các yếu tố là đáng kể thì hệ số biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố đó luôn được giữ

lại trong phương trình.

Phương trình hồi quy

Yi = b0 +b1 1x + b2 2x + b3 3x + b12 1 2x x + b13 1 3x x + b23 2 3x x + b123 1 2 3x x x

Trong đó

ü Yi: Sinh khối nấm thu được (g/20ml)

ü ix (i= 1 – k): là các yếu tố ảnh hưởng, mỗi yếu tố có hai mức là hai giới hạn

biên của nó.

ü bo, bi, bj, bij: là các hệ số trong phương trình hồi quy

Để đơn giản trong tính toán, chuyển từ hệ trục tự nhiên sang hệ trục không thứ

nguyên (hệ mã hoá). Xét yếu tố được kí hiệu là Zi

Zio = ( Zi max + Zi

min)/2

Với: + Zimax: mức cao

+ Zimin: mức thấp

+ Zio: mức cơ sở

ü Điểm có tọa độ (Z1o, Z2

o, Z3o,…Zk

o) gọi là tâm của phương án

Compa

ny C

onfid

entia

l


23

ü Việc mã hoá được thực hiện dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu

làm gốc tọa độ.

ü Phương pháp xử lý số liệu từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong phương

trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng tăng sinh khối.

Phương trình hồi quy

Y = b0 +b1 1x + b2 2x + b3 3x + b1b2 1 2x x + b1b3 1 3x x + b2b3 2 3x x + b1b2b3 1 2 3x x x

Với

+ Y: sinh khối (g/20ml)

+ b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b123 : các hệ số trong phương trình hồi quy

+ 1x : nồng độ MgSO4 (g/l)

+ 2x : nồng độ KH2PO4 (g/l)

+ 3x : nồng độ Glucose (g/l)

Bảng 3.1: Các yếu tố thí nghiệm

Các yếu tố (g/l) Các mức

1x 2x 3x

Mức cơ sở

Khoảng biến thiên

Mức trên

Mức dưới

Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm

Số TN 1x 2x 3x y1 y2 y3 Ytb

1 + + +

2 - + +

3 + - +

4 - - +

5 + + -

6 - + -

Compa

ny C

onfid

entia

l


24

7 + - -

8 - - -

3.6 XÁC ĐỊNH DƯỢC CHẤT CÓ TRONG NÂM LINH CHI

3.6.1 Phương pháp định tính alcaloid [11]

3.6.1.1 Chuẩn bị dịch thử

Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng

nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau:

- Phần 1: Bột nấm Linh chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1%

H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả

2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.

Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không

có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2.

- Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp

gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có

tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi

dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan.

Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.

3.6.1.2 Thuốc thử định tính alcaloid

- Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI

trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml.

Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có

alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa

tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử.

- Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml

HNO3 30% (D=1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp

2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại,

lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu

để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần.

Compa

ny C

onfid

entia

l


25

Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu

có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.

3.6.2 Phương pháp xác định hợp chất saponin [11]

Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch

lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính.

3.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt

Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những

phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin.

Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml

nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml,

dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1

phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả:

Bọt bền trong 15 phút: +

Bọt bền trong 30 phút: ++

Bọt bền trong 60 phút: +++

3.6.1.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel

Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách

thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm.

Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1)

Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13)

Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên,

quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.

ü Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ

xác định là có saponin triterpenoid.

ü Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác

định là có saponin steroid. Compa

ny C

onfid

entia

l


26

3.6.3 Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard)

Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 10 –

20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt

kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether.

Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml

anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống

nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống

nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung

dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu

xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid

3.6.4 Định tính acid hữu cơ

Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít

tinh thể natri Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận

là có acid hữu cơ.

3.7 ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE (GLPs) [15, 16]

Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở

100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các

polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để

chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs.

Compa

ny C

onfid

entia

l


27

Hình 3.1: Qui trình chiết suất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và ctv, 2001)

Thu nhận cả 3 dịch chiết và đem đi lọc. Lấy phần cặn (dịch lơ lửng sau khi lọc)

đem đi sấy khô và cân trọng lượng. Từ đó đánh giá hàm lượng polysaccharide thô có

trong quả thể nấm Linh chi.

Sinh khối nấm Linh Chi

Nghiền

Hổn hợp chiết rút lần 1

Bã chiết lần 1

Hỗn hợp chiết rút lần 2

Bã chiết lần 2

Dịch chiết lần 3



-Ngâm nước 70oC trong 3 giờ

-Ngâm trong nước 70oC trong 3 giờ

-Ngâm trong cồn 80% ở 70oC trong 2 giờ

Compa

ny C

onfid

entia

l


28

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1 QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẨU CỦA NẤM LINH CHI (GANODRMA

LUCIDUM)

4.1.1 Hình thái quả thể nấm Linh chi

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm, Khoa

sinh học ứng dụng trước đó, có hình dạng như sau :

Hình 4.1: Hình thái nấm Linh chi

Nhận xét: Quả thể của nấm Linh chi thu hái được có cuống ngắn, đính bên, cuống

nấm to (đường kính 2- 3 cm), lớp vỏ cuống láng, đỏ nâu. Mũ nấm hình quạt, đôi khi có

hình dị dạng, mặt mũ nấm láng, đỏ nâu, có vân gợn đồng tâm. Khi còn non, tai nấm có

màu vàng chanh – vàng cam cho đến đỏ tươi, càng về già thì màu càng sẫm lại. Kích

thước từ 3 – 12 cm, dày từ 1 – 3,5 cm. Phần đính cuống gồ lên hoặc lõm xuống. Mặt dưới

thể quả thường màu trắng kem – hơi vàng, có nhiều lỗ nhỏ. Đây là lớp bào tầng sinh sản

của nấm, chính những lỗ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành. Mật độ

lỗ khoảng 3 – 5 ống/mm2, miệng lỗ gần tròn. Khi chúng tôi bổ đôi quả thể ra thì thấy đây

là những ống thẳng, chiều dày từ 0,3 – 1,5 cm. Khi bào tử đảm chín thì nó được phóng

thích dọc theo ống này và thoát ra ngoài qua miệng lỗ ống. Còn phần thịt nấm ở trên thì

có màu vàng nâu đến nâu đỏ. Phân cách giữa phần trên và phần dưới (tầng sinh sản) là

khá rõ ràng vì phần trên thì các lớp tia sợi hướng lên, còn phần dưới thì là ống thẳng

hướng xuống.

Compa

ny C

onfid

entia

l


29

4.1.2 Hệ sợi nấm Ganoderma lucidum

Hình 4.2: Hình thái sợi nấm Linh chi (vật kính dầu x100)

4.1.3 Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum

Bào tử đảm có dạng hình trứng, chúng ta có thể thấy rõ trên cả 2 hình đều có đầu

chóp tròn - nhọn, phồng căng. Bào tử nấm Linh chi có cấu trúc vỏ kép, có kiến tạo lỗ

thủng (porus, lacunae) và có kích thước bào tử khoảng 8 – 11 x 6 – 8 µm

Hình 4.3: Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum

4.2 SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA

LUCIDUM)

4.2.1 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Ganodrma lucidum trên các môi trường lỏng

4.2.1.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối sợi nấm

Linh chi trong môi trường lỏng

Mg2+ là khoáng chất cần thiết cho sự hoạt động một số loại enzym, giúp quá trình

sinh tổng hợp các chất tham gia xây dựng tế bào được xảy ra nhanh hơn. Trong thí

nghiệm này chúng tôi sử dụng MgSO4 ở các hàm lượng khác nhau. Từ đó, chúng tôi có

thể xác định được hàm lượng MgSO4 cần thiết để quá trình tạo sinh khối xảy ra nhanh

nhất.

Compa

ny C

onfid

entia

l


30


20ml môi trường

Bảng 4.1: ảnh hưởng của MgSO4 lên môi trường

Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy Khối lượng (g/20ml)

NT1 PG + 1 g/l MgSO4 0,178

NT2 PG + 2 g/l MgSO4 0,346

NT3 PG + 3 g/l MgSO4 0,466

NT4 PG + 4 g/l MgSO4 0,379

00.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

0.450.5

NT1 NT2 NT3 NT4

Nghiệm thức

khối

lượn

g si

nh k

hối (

g/20

ml)

Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối

Nhận xét:

Dựa vào biểu đồ 4.1, chúng tôi nhận thấy khi sử dụng MgSO4 ở mức 1g/l thì sinh

khối phát triển chậm nhất và khi tăng dần hàm lượng MgSO4 lên 3g/l thì lượng sinh khối

thu được cao nhất 0,466 g/20ml và khi tăng hàm lượng MgSO4 lên 4g/l thì lượng sinh

khối giảm đáng kể chỉ còn 0,379 g/20ml

Điều này có thể khi tăng Mg2+ vượt quá mức chịu đựng của tế bào, sẽ ức chế sự

hoạt một số enzyme cần thiết trong quá trình tổng hợp tế bào cũng như sẽ giảm các phản

ứng tổng hợp trong tế bào sợi nấm.

Compa

ny C

onfid

entia

l


31

Kết luận: Chúng tôi chọn hàm lượng MgSO4 là 3 g/l làm giá trị thực nghiệm cho

bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.

4.2.1.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi

trường lỏng

KH2PO4 là nguồn cung cấp kali và photphat cho nấm. Nguồn kali đóng vai trò làm

đồng yếu tố (cofactor), cung cấp cho các loại enzym hoạt động. Đồng thời, Kali đóng vai

trò cân bằng khuynh độ (gradient) bên trong và ngoài tế bào. Nguồn phosphate tham gia

tổng hợp ATP, acid nucleic, phospholipid màng. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát hàm

lượng KH2PO4 thích hợp cho môi trường nuôi cấy tơ nấm Linh chi


20ml môi trường

Bảng 4.2: ảnh hưởng của KH2PO4 đến tốc độ tăng trưởng


NT1 PG + 0,5g/l KH2PO4 0,322

NT2 PG + 1g/l KH2PO4 0,475

NT3 PG + 1,5g/l KH2PO4 0,449

NT4 PG + 2g/l KH2PO4 0,364

00.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

0.450.5

NT1 NT2 NT3 NT4

Nghiệm thức

khối

lượ

ng s

inh

khối

(g/2

0ml)

Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối

Compa

ny C

onfid

entia

l


32

Nhận xét:

Dựa và biểu đồ 4.2, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng KH2PO4 lên dần thì

lượng sinh khối tăng. Mặt khác, khi hàm lượng KH2PO4 sử dụng vượt quá mức chịu đựng

của tế bào nấm Linh chi thì lượng sinh khối thu được giảm. Lượng sinh khối thu được cao

nhất là 0,475 g/20ml khi hàm lượng KH2PO4 là 2 g/l. Khi lượng KH2PO4 là 1 g/l thì

lượng sinh khối thu được thấp nhất 0,322 g/20ml

Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng KH2PO4 là 1 g/l làm giá

trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.

4.2.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong môi

trường lỏng

Nguồn cacbon dùng để tổng hợp nên các chất: hydratcacbon, amino acid, acid

nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát triển của nấm. Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm

nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi

chất. Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu cacbon cũng khác nhau. Trong thí

nghiệm này, chúng tôi khảo sát hàm lượng Glucose ảnh hưởng tới tốc độ tạo sinh khối sợi

nấm Linh chi trên môi trường lỏng ở các mức thay đổi khác nhau.


20ml môi trường

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của Glucose đến tốc độ tăng trưởng


NT1 P + 10 g/l Glucose 0,389





Compa

ny C

onfid

entia

l


33

00.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

0.450.5

NT1 NT2 NT3 NT4 NT5

Nghiệm thức

Khối

lượn

g si

nh k

hối (

g/20

ml)

Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối

Nhận xét:

Dựa vào biểu đồ 4.3, chúng tôi nhận thấy khi tăng hàm lượng Glucose tăng lên dần

thì sinh khối sở nấm tăng. Khi hàm lượng Glucose càng tăng thì lượng sinh khối thu được

càng giảm. Hàm lượng Glucose đạt mức 20g/l thì lượng sinh khối thu được là cao nhất

0,435 g/20ml.

Kết luận: Trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn hàm lượng glucose là 20 g/l làm giá

trị thực nghiệm cho bước thí nghiệm qui hoạch tiếp theo.

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA pH LÊN MÔI TRƯỜNG CẤY

Hầu hết môi trường nuôi cấy đều có pH tối thích cho quá trình phát triển của từng

giống. Sự tăng hoặc giảm pH (chính là sự tăng hoặc giảm H+) trong môi trường nuôi cấy

sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của hệ sợi tơ nấm Linh chi.

Chúng tôi tiến hành cấy giống trong chai thuỷ tinh 100ml, chứa một lượng môi

trường là 20ml. Trước khi hấp thanh trùng, ta chỉnh pH môi trường trong các mẫu về các

giá trị : pH =3,5 ; pH =4; pH =4,5; pH =5; pH =5,5; pH =6,8; pH =7. Sau đó tiến hành cấy

giống bằng cách gắp một hạt lúa cho vào chai.

Compa

ny C

onfid

entia

l


34

Bảng 4.4: Ảnh hưởng pH lên tốc độ tạo sinh khối của Linh Chi

pH

Khối lượng

(g/20ml)

3,5 4 4,5 5 5,5 6,8 7

TN 1 0,193 0,225 0,348 0,333 0,344 0,346 0,278

TN 2 0,111 0,241 0,290 0,366 0,386 0,336 0,270

Trung bình 0,152 0,233 0,319 0,349 0,365 0,341 0,274

Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của pH lên sự tăng sinh khối của

Ganoderma lucidum

Nhận xét

Dựa vào biểu đồ trên chúng tôi nhận thấy sinh khối tơ nấm Linh chi có khả năng

tăng trưởng tốt trong khoảng pH = 4,5 đến pH = 7,0. Khi nuôi cấy trong mô trường có pH

= 3,5 thì khối lượng sinh khối thấp nhất 0,152 g/20ml. Sinh khối nấm tăng dần theo giá trị

của pH, nhưng khi tăng giá trị pH 6,8 thì sinh khối giảm 0,341 g/20ml và giảm dần cho

đến pH = 7,0 trong cùng một điều kiện nuôi cấy.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

3,5 4 4,5 5 5,5 6,8 7

pH

Khối

lượn

g si

nh k

hối (

g/20

ml)

Compa

ny C

onfid

entia

l


35

Kết luận

Như vậy chúng tôi chọn được giá trị pH = 5,5 là giá trị pH tối thích cho sự phát

triển của tơ nấm với lượng sinh khối cao nhất đạt 0,365 g/20ml.

4.4 ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM LINH CHI

Quá trình sinh trưởng của tơ nấm phải trải qua 4 giai đoạn: giai đoạn thích nghi,

giai đoạn phát triển, giai đoạn cân bằng và giai đoạn già cỗi. Trong thí nghiệm này, chúng

tôi tiến hành nuôi cấy sinh khối trong trong những chai nhỏ 100ml, chứa 20ml môi trường

PG + MgSO4 + KH2PO4. Điều chỉnh về pH 5,5 rồi sau đó đem đi hấp thanh trùng. Mỗi

lần cấy gắp 1 hạt lúa cho vào chai. Khoảng thời gian lấy mẫu là cách nhau 3 ngày. Mẫu

được sấy khô ở 500C - 600C sau đó đi cân và ghi nhận số liệu.

Bảng 4.5: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi thay đổi theo thời gian khi nuôi cấy

trong môi trường lỏng

Thời gian

(ngày)

TN

3

NGÀY

6

NGÀY

9

NGÀY

12

NGÀY

15

NGÀY

18

NGÀY

21

NGÀY

LẦN 1 0,114 0,251 0,451 0,699 0,773 0,781 0,790

LẦN 2 0,144 0,265 0,461 0,685 0,787 0,819 0,820

TB 0.129 0.258 0.456 0.692 0.78 0.8 0.805

Compa

ny C

onfid

entia

l


36

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

3 6 9 12 15 18 21

Ngày

Khố

i lượ

ng s

inh

khối

(g/2

0ml)

Đồ thị 4.1: Đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum

Nhận xét

Đường cong sinh trưởng là một yếu tố quan trọng trong quá trình nuôi cấy sinh

khối sợi nấm Linh chi. Dựa vào đồ thị ta biết chính xác được khoảng thời gian nào sinh

khối phát triển mạnh nhất, lúc nào sinh khối ổn định và lúc sinh khối bắt đầu già đi.

Từ đường cong sinh trưởng chúng tôi nhận thấy:

• Trong 6 ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối tăng lên rất ít

• Đến ngày thứ 12, sinh khối phát triển nhưng không nhanh, tơ nấm dần dần chuyển

sang màu vàng

• Từ ngày 12 đến ngày 15, sinh khối phát triển vượt bậc

• Từ ngày 15 trở đi sinh khối tăng rất chậm, tơ nấm từ vàng nhạt chuyển sang màu

vàng đậm

15 ngày

Hình 4.4: Sinh khối sợi nấm

Compa

ny C

onfid

entia

l


37

4.5 TỐI ƯA HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LỎNG NUÔI CẤY HỆ SỢI

GANODERMA LUCIDUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Chúng tôi xác định điền kiện tối ưu để thu được sinh khối cực đại, chúng tôi tiến

hành tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp qui hoạch

thực nghiệm và tiến hành như sau:

Xét k=3 nhân tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm (Glucose, KH2PO4, MgSO4)

và mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Hàm mục tiêu Y là sinh khối Ganoderma lucidum

Bảng 4.6 : Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng

Các yếu tố (g/l) Các mức

1x 2x 3x

Mức cơ sở 3,0 1,0 20

Khoảng biến thiên 0,5 0,2 2

Mức trên 3,5 1,2 22

Mức dưới 2,5 0,8 18

Trong đó

x1 : Hàm lượng MgSO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l)

x2 : Hàm lượng KH2PO4 bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l)

x3 : Hàm lượng glucose bổ sung vào môi trường khoai tây ( g/l)

y1 : Khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 1 (g/20ml)

y2 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 2 (g/20ml)

y3 : khối lượng sinh khối Ganoderma lucidum ở lần lặp thứ 3 (g/20ml)

Ytb : là khối lượng trung bình của sinh khối Ganoderma lucidum trong 3 lần lặp lại

Bảng 4.7 : kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm

Số TN 1x 2x 3x y1 Y2 Y3 Ytb

1 3,5 1,2 22 0,495 0,501 0,516 0,504 2 2,5 1,2 22 0,51 0,513 0,519 0,514

Compa

ny C

onfid

entia

l


38

3 3,5 0,8 22 0,534 0,522 0,528 0,528 4 2,5 0,8 22 0,537 0,534 0,534 0,535 5 3,5 1,2 18 0,534 0,537 0,543 0,538 6 2,5 1,2 18 0,573 0,51 0,537 0,54 7 3,5 0,8 18 0,528 0,576 0,57 0,558 8 2,5 0,8 18 0,474 0,54 0,543 0,519

Kiểm tra sự đồng nhất của các phương sai 2iS theo tiêu chuẩn Cochran:

(trung bình cộng của ba lần thí nghiệm)

với k là số lần lặp lại thí nghiệm, k=3

Tra bảng với các thông số

f = k – 1 = 2

N = 8

Thu được 0,5157tbG =

Vậy 0,4471 0,5157tt tbG G= < = . Nên các phương sai đồng nhất, thí nghiệm lặp lại

có nghĩa.

1 2 3

3y y yy + +

=

2 2 22 1 2 3( ) ( ) ( )

1iy y y y y yS

k− + − + −

=−

2 0,000378

iS =∑

2max

2 0,4471tti

SGS

= =∑

Compa

ny C

onfid

entia

l


39

0.47

0.48

0.49

0.5

0.51

0.52

0.53

0.54

0.55

0.56

0.57

NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8

Nghiệm thức

Khối

lượn

g si

nh k

hối (

g/20

ml)

Biểu đồ 4.5: Biểu đồ thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm

Sau khi tiến hành thí nghiệm tối ưu theo qui hoạch thực nghiệm, chúng tôi nhận

thấy nghiệm thức số 7 có các thành phần như sau: MgSO4 (3,5 g/l); KH2PO4 (0,8 g/l) và

Glucose (18 g/l) thì sinh khối nấm Linh chi khô là cao nhất đạt 0,558 g/20ml.

Để tiến hành thu sinh khối sợi nấm Linh chi phục vụ cho thử nghiệm sản xuất trà

túi lọc và phân tích các hoạt chất có trong hệ sợi. Chúng tôi, tiến hành pha môi trường

trường PG có bổ sung các thành phần các hoạt chất như trên và nuôi cấy tĩnh hệ sợi nấm

Linh chi. Kết quả cho thấy, lượng sinh khối nấm Linh chi sau 15 ngày đạt năng suất 17

g/l.

4.6 XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI (GANODERMA

LUCIDUM)

4.6.1 Định tính alkaloid

• Thử nghiệm 1

Cho dịch chiết bột tơ nấm Linh chi đỏ tác dụng với thuốc thử Mayer và thuốc thử

Dragendoff

ống 1 : dịch chiết tơ nấm Linh chi đỏ + thuốc thử Dragendoff

ống 2: dịch chiết tơ nấm Linh chi đỏ + thuốc thử Mayer

1 2

Compa

ny C

onfid

entia

l


40

Hình 4.5: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer và Dragendoff

Kết quả

Dựa và kết quả thử nghiệm trên ta thấy

Ống 1: Khi dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendoff thì dung dịch chuyển

sang màu nâu nhưng không có kết tủa

Ống 2: Dịch chiết có màu vàng nhạt, xuất hiện kết tủa trắng

• Thử nghiệm 2

1 2

Hình 4.6: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer và Dragendoff

Kết quả

Ống 1: xuất hiện màu vàng nhưng không có kết tủa

Ống 2: màu hơi đục xuất hiện kết tủa nhưng với hàm lượng rất ít

Compa

ny C

onfid

entia

l


41

Nhận xét:

Dịch chiết nấm Linh chi ở phần 1 đem thử nghiệm với 2 loại thuốc thử Mayer và

Dragendorff thì nhận thấy kết quả là dương tính. Đối với dịch chiết ở phần 2 đem thử

nghiệm thì kết quả là âm tính:

Bột dược liệu trích với nước – acid: có thể trích hết tấc cả các alcaloid ở dạng baz

tự do (N sẽ biến thành NH+ tan trong nước), alcaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N+

-> O), dạng glycosid, alcaloid loại có tính phân cực mạnh, nhưng sẽ trích luôn những hợp

chất có chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide)… là những hợp chất tuy không phải

là alcaloid nhưng có thể cho kết quả dương tính với thuốc thử.

Bột dược liệu trích với dung môi hữu cơ – kiềm sẽ không trích được những

alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt trong nước. Phương pháp này trích tốt

các alcaloid dạng baz tự do có tính phân cực kém và tính baz yếu, cũng như các alcaloid

có cấu trúc đặc thù –C=C –N – .

Kết luận: hoạt chất alcaloid có trong tơ nấm Linh chi đỏ với hàm lượng rất thấp

nên những phương pháp định tính không thấy đươc sư hiện diện của chúng

4.6.2 Định tính saponin

4.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt

Hình 4.7: thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi

Kết quả:

Độ bền của bọt Kết quả

Sau 15 phút +

Sau 30 phút ++

Sau 60 phút +++

Compa

ny C

onfid

entia

l


42

Độ bền của bọt đều bền vững sau 60 phút. Như vậy dược liệu từ sinh khối có chứa

hoạt chất saponin

4.6.2.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel

Ống 1: dịch chiết sau khi cho acid vào

Ống 2: dịch chiết sau khi cho bazo vào

1 2

Hình 4.8: Thử nghiệm saponin toàn phần theo Fontan – Kaudel

Kết quả

Bọt trong 2 ống nghiêm đều bền hơn 15 phút, bọt trong ống nghiệm 2 cao hơn gấp

3 lần cột bọt trong ống nghiệm 1

Như vậy, trong môi trường kiềm bọt bền hơn trong môi trường acid. Sơ bộ kết

luận là có saponin steroid.

4.6.3 Định tính triterpenoid

1 2

Hình 4.9: Định tính triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard Com

pany

Con

fiden

tial


43

Kết quả thí nghiệm nhận thấy sinh khối và quả thể nấm Linh chi có chứa hoạt chất

triterpenoid (môi trường chuyển sang màu xanh lục sau khi cho acid H2SO4 đậm đặc vào

từ từ).

Ống 1(đối chứng): nước cất + acid

Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc

4.6.4 Định tính acid hữu cơ

Hình 4.10 : Định tính acid hữu cơ có trong quả thể Linh chi.

Sau khi cho dịch chiết nước bột tơ và quả thể nấm Linh chi đỏ tác dụng với tinh

thể Na2CO3 và hơ nóng thì nhận thấy có bọt khí xuất hiện rất ít và bay ra. Như vậy, dịch

chiết nước từ tơ nấm Linh chi đỏ có chứa hàm lượng rất ít thành phần acid hữu cơ.

4.6.5 Định lượng polysaccharide từ sinh khối nấm Linh chi

Tiến hành ly trích polysaccharides từ 10 gam nấm Linh chi đã sấy khô theo qui

trình thí nghiệm. Sau quá trình lọc và sấy khô thu nhận được 0.3144 gam polysaccharide

thô. Như vậy hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi đỏ chỉ đạt

khoảng 0.31%.

Hình 4.11: hình ảnh polysaccharide kết tủa sau khi lọc

Compa

ny C

onfid

entia

l


44

Phần 5: KẾT LUẬN

5.1. KẾT LUẬN

Qua thí quá trình nghiên cứu, chúng tôi đạt được một số kết quả sau:

- Xác định đường cong sinh trưởng của sợi nấm Linh chi trên môi trường PG.

- Xác định điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển của sợi nấm Linh chi

+ pH môi trường nuôi cấy: pH = 5,5

- Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy theo phương pháp qui hoạch thực

nghiệm. Kết quả về thành phần môi trường tốt nhất như sau »

Ø Glucose : 18g/l

Ø KH2PO4 : 0,8g/l

Ø MgSO4 : 3,5g/l

Ø Khoai tây : 200g/l

Lượng sinh khối thu được sau 15 ngày là 17g/l.

- Sinh khối hệ sợi (Ganoderma lucidum) có chứa các thành phần hóa học:

Saponine, saponin triterpenoid, acid béo và hàm lượng polysaccharide thô ly trích được

trong sinh khối nấm Linh chi là khoảng 0,31%

5.2 ĐỀ NGHỊ

Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên tôi chưa thể nghiên cứu đầy đủ về nấm

Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum), đề nghị nghiên cứu thêm về:

ü Khảo sát sâu hơn tác dụng của một số khoáng chất khác và thành phần hóa học, tác

dụng dược lý, lâm sàng. Nhằm hoàn thiện quy trình nuôi cấy trong môi trường

lỏng và có thể ứng dụng trong ngành dược và ngành sản xuất trà thảo dược.

ü Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tơ nấm Linh chi, nhằm đa dạng hóa sản phẩm các

sản phầm từ hệ sợi nấm.

Compa

ny C

onfid

entia

l


45

Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Đoàn Sáng, 2003 Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay. Nhà xuất bản Y học, Hà

nội, Việt nam.

2. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điển hấp thu khoáng

nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst. Luận án phó tiến sỹ khoa

học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam.

3. Lê Xuân Thám, 1996. Nấm Linh chi - dược liệu quí ở việt nam. Nhà xuất bản mủi

cà mau.

4. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập 1. Nhà xuất bản Nông

nghiệp.

5. Nguyễn Lân Dũng, 2001. Công nghệ nuôi trồng nấm, tập 1 và 2. Nhà xuất bản

Nông nghiệp, Hà nội.

6. Nguyễn Hữu Đống, 2003. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa

bệnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội.

7. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000. Nấm ăn nấm dược liệu - công

dụng và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Hà nội.

8. Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn và Zani Federico, 2002. Cơ sở khoa học và

công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội.

9. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nuyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm

công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc

Gia TPHCM.

10. Nguyễn Phước Nhuận, 2001. Giáo trình sinh hoá học, phần 1. Nhà xuất bản Đại

học Quốc Gia TPHCM.

11. Trần Hùng, 2004. Phương pháp nghiên cứu dược liệu. Đại học Y Dược TP.HCM.

12. Trần Văn Mão, 2004. Nuôi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh.

Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà nội.

Compa

ny C

onfid

entia

l


46

Tài liệu tiếng anh

13. Steyaert R.L, 1972. Species of Ganoderma and related genera mainly of the

boyor and leiden herbaria. National de Beigique, Burxelle.

14. Shufeng Zhou, A clinical Study of a Ganoderma lucidum extract in patients with

type II diabetes mellitus. Division of Pharmacology and Clinical Pharmacology,

Faculty of Medicine and Health Science, Auckland University, Auckland, New

Zealand.

15. Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001.

Extractoin of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int

Symposium Ganoderma Sci, Auckland.

16. Yihuai Gao, Jin Lan and Zhifang Liu, Extraction and determination of

Ganoderma polysaccharides. Int Med Complement Med Vol 1, Supplement 1,00-

00.

17. Zhaoji – Ding, 1980. The Ganodermataceae in chine. Berlin Shiffigart.

Tài liệu internet

18. http://www.About Lingzhi.htm

19. http://www .activeCompoundsReishi.html

20. http://www. Biomed~1.htm

21. http://www.bfa-ernaehrung.de/Deutsch/Information/pflanzenstoffe/artikel3.pdf

22. http://www. Mushroom Information Gano HIV.mht

23. http://203.162.44.79/khcn/magazine/Tap7/So6/06.htmđnh5

Compa

ny C

onfid

entia

l

http://www.About

http://www.bfa-ernaehrung.de/Deutsch/Information/pflanzenstoffe/artikel3.pdf

http://203.162.44.79/khcn/magazine/Tap7/So6/06.htm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO...

Documents

Transcript of BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO...