BÁO CÁO TỔNG HỢP - Cơ sở dữ liệu ngành hóa...

BỘ CÔNG THƯƠNG DNTN TRÀ HOÀN NGỌC

CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

TRỌNG ĐIỂM QUỐC GIA PHÁT TRIỂN CÔNG NGHIỆP HÓA DƯỢC

ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ TẠO CHẾ PHẨM

PHÒNG CHỐNG KHỐI U TỪ CÂY HOÀN NGỌC

PSEUDERANTHEMUM PALATIFERUM (NEES) RALDK.”

Mã số: CNHD. ĐT. 030/11-12

Cơ quan chủ trì đề tài: DNTN Trà Hoàn Ngọc

Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Minh Hằng

HÀ NỘI - 2012




ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI




Mã số: CNHD. ĐT. 030/11-12

Chủ nhiệm đề tài

TS. Nguyễn Thị Minh Hằng

Cơ quan chủ trì đề tài Giám đốc

Ban chủ nhiệm Chương trình

Bộ Công thương

HÀ NỘI - 2012

1

DOANH NGHIỆP TƯ NHÂN

TRÀ HOÀN NGỌC __________________

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

BÁO CÁO THỐNG KÊ

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN

I. THÔNG TIN CHUNG

1. Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm phòng

chống khối u từ cây Hoàn Ngọc Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.

Mã số đề tài: CNHD.ĐT.030/11-12

Thuộc:

- Chương trình (tên, mã số chương trình): Chương trình nghiên cứu khoa

học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến

năm 2020.

2. Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Nguyễn Thị Minh Hằng

Ngày, tháng, năm sinh: 07/08/1979. Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sỹ

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên. Chức vụ: Phó giám đốc Trung tâm

Nghiên cứu và Phát triển thuốc - Viện Hóa sinh biển.

Điện thoại: Tổ chức: 04-37916337 Nhà riêng: 04-38538754

Mobile: 0947216181

Fax: 04-37917054 E-mail: [email protected]

Tên tổ chức đang công tác: Viện Hóa sinh biển - Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

Địa chỉ tổ chức: Viện Hóa sinh biển

Địa chỉ nhà riêng: số 41 ngõ 132 phố Khương Trung, Thanh Xuân, Hà Nội

3. Tổ chức chủ trì đề tài:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Doanh nghiệp Tư nhân Trà Hoàn Ngọc

2

Điện thoại: 066 3621121 Fax: 066 3621121

E-mail: [email protected]

Website: www.hoanngoctea.com

Địa chỉ: 37 Nguyễn Trọng Cát; F - Hiệp Ninh; Thị Xã Tây Ninh

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Bùi Kim Nga

Số tài khoản: 5700211001399

Ngân hàng: Nông nghiệp và phát triển nông thôn Tây Ninh

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Tỉnh Tây Ninh

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 02/ 2011đến tháng 02/ 2012

- Thực tế thực hiện: từ tháng 02/2011 đến hết tháng 05/2012

- Được gia hạn (nếu có):

- Lần 1 từ tháng 03 năm 2012 đến tháng 05 năm 2012.

- Lần 2 ….

2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:

a) Tổng số kinh phí thực hiện: 880tr.đ, trong đó:

+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 880 tr.đ.

+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0tr.đ.

+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): ………….

b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:

Số

TT

Theo kế hoạch Thực tế đạt được Ghi chú

(Số đề nghị

quyết toán) Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí

(Tr.đ)

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí

(Tr.đ)

1 08/2011 612,9 08/2011 612,9

2 01/2012 267,1 12/2011 267,1

…

3

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng

Số TT

Nội dung các khoản chi

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Tổng SNKH Nguồn khác

Tổng SNKH Nguồn khác

1 Trả công lao động (khoa học, phổ thông)

437 437 0 437 437 0

2 Nguyên, vật liệu, năng lượng

150 150 0 150 150 0

3 Thiết bị, máy móc 70 70 0 70 70 0 4 Xây dựng, sửa

chữa nhỏ

5 Chi khác 223 223 0 223 223 0 Tổng cộng 880 880 0 880 880 0

- Lý do thay đổi (nếu có): Không thay đổi 3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án: (Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện... nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh ... nếu có)

Số TT

Số, thời gian ban hành văn bản

Tên văn bản Ghi chú

1 Quyết định số 0154/QĐ-BCT ngày 12 tháng 01 năm 2011

Quyết định về việc giao kế hoạch khoa

học và công nghệ năm 2011 thuộc

“Chương trình nghiên cứu khoa học công

nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công

nghiệp hóa dược đến năm 2020”.

2 Quyết định số 4024/ QĐ-BCT ngày 29 tháng 07 năm 2011

Quyết định về việc phê duyệt kinh phí các đề tài, dự án KHCN năm 2011 thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020”

3 Hợp đồng số 030/2011/HĐ-ĐTCNHD ngày 14 tháng 2 năm 2011

Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ

4 Công văn số 2674/BCT-BĐHHD ngày 29 tháng 03 năm 2012

Công văn về việc thay đổi nội dung đề tài

CNHD.ĐT.030/11-12 .

4

4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Số TT

Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh

Tên tổ chức đã tham gia thực hiện

Nội dung tham gia chủ

yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt

được

Ghi chú*

1 Viện Hóa sinh biển - Viện KHCNVN

Viện Hóa sinh biển - Viện KHCNVN

- Xác định các thành phần tritecpen có trong cây Hoàn Ngọc

- Báo cáo về thành phần các tritecpen có trong rễ vây Hoàn Ngọc.

- Xây dựng quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc

- Báo cáo về quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc.

- Thử độc tính cấp độc tính bán trường diễn và hoạt tính kháng u cả sản phẩm

- Báo cáo về độc tính và hoạt tính kháng u của sản phẩm

2. Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương

Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn ngọc, kiểm nghiệm sản phẩm theo tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của sản phẩm

Tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm.

- Phiếu kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm.

- Kết luận về độ ổn định của sản phẩm

- Lý do thay đổi (nếu có): không thay đổi

5

5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án: (Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Số TT

Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết

minh

Tên cá nhân đã tham gia thực

hiện

Nội dung tham gia

chính

Sản phẩm chủ yếu đạt

được

Ghi chú*

1 TS. Nguyễn Thị Minh Hằng


Nghiên cứu qui trình chiết xuất và thành phần hóa học của sản phẩm.

Báo cáo về thành phần trotecpen của cây Hoàn Ngọc, quy trình chiết xuất tổng tritecpen

2 Bùi Phước Hòa Bùi Phước Hòa Trồng, thu hái và cung cấp nguyên liệu cây Hoàn Ngọc

Báo cáo về tình hình trồng và thu hái cây Hoàn Ngọc

3 Bùi Kim Nga Bùi Kim Nga Trồng, thu hái và cung cấp nguyên liệu cây Hoàn Ngọc

Báo cáo về tình hình trồng và thu hái cây Hoàn Ngọc

4 PGS. TS.Nguyễn Văn Hùng

PGS. TS.Nguyễn Văn Hùng


Báo cáo về thành phần trotecpen của cây Hoàn Ngọc

5 TS Đoàn Thị Mai Hương

TS Đoàn Thị Mai Hương,



6 TS Phạm Văn Cường

TS Phạm Văn Cường



7 CN Nguyễn Thị Tú Oanh

CN Nguyễn Thị Tú Oanh

Nghiên cứu qui trình chiết xuất và thành phần hóa học

Báo cáo về thành phần trotecpen của cây Hoàn

6

của sản phẩm. Ngọc

8 CN Hà Thị Thoa CN Hà Thị Thoa Nghiên cứu qui trình chiết xuất và thành phần hóa học của sản phẩm.


9 TS Đỗ Thị Thảo TS Đỗ Thị Thảo Thử độc tính và khả năng kháng u

Báo cáo về độc tính và khả năng kháng u

- Lý do thay đổi ( nếu có): Không thay đổi 6. Tình hình hợp tác quốc tế:

Số TT

Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia...)

Thực tế đạt được (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia...)

Ghi chú*

1 Đi khảo sát tại Vườn thực vật Bắc Kinh Trung Quốc

Thời gian: tháng 8/2011.

Số đoàn: 01 gồm 05 người

Kinh phí: 115,9 triệu đồng

Đi khảo sát tại Vườn thực vật Bắc Kinh, Trung Quốc

Thời gian: tháng 8/2011.

Số đoàn: 01 gồm 04 người

Kinh phí: 115,9 triệu đồng

- Lý do thay đổi (nếu có): Do sự thay đổi về tỷ giá của USD/VND nên kinh phí dự toán chỉ đủ cho đoàn 04 người.

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

Số TT

Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa

điểm )

Thực tế đạt được (Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm ) Ghi chú*

1 2 ...

- Lý do thay đổi (nếu có): 8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Số TT

Các nội dung, công việc chủ yếu

(Các mốc đánh giá chủ yếu)

Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm)

Người, cơ quan

thực hiện

7

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Tổng quan tài liệu và xây dựng đề cương

Nguyễn Thị Minh Hằng

2 Nội dung 1: Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu

Chăm sóc cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm và thu hái nguyên liệu theo từng độ tuổi:

- Thu hái cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm và xử lí nguyên liệu thành dạng bột khô

1/2011-6/2011

1/2011-6/2011

Bùi Kim Nga Bùi Phước Hòa và

cộng sự

Nghiên cứu thành phần tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm:

- Phân lập các chất tritecpen từ mẫu cây Hoàn Ngọc.

- Xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập.

1/2011-6/2011

1/2011-6/2011

N. T. Minh Hằng

Ng. Văn Hùng Phạm Văn Cường

Đ. T. Mai Hương N. T. Tú Oanh

Hà Thị Thoa Bùi Kim Nga

Bùi Phước Hòa

3 Nội dung 2: Nghiên cứu quy trình công nghệ chiết xuất tổng tritecpen có trong cây Hoàn Ngọc 7/2011-

8/2011 7/2011-8/2011

N. T. Minh Hằng



Hà Thị Thoa Bùi Kim Nga

Bùi Phước Hòa

- Nghiên cứu qui trình chiết xuất tổng tritecpen

- Nghiên cứu qui trình tinh chế tổng tritecpen

4

Nội dung 3: Xây dựng quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc ở quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ.

7/2011-8/2011

7/2011-8/2011

N. T. Minh Hằng



Hà Thị Thoa Bùi Kim Nga Bùi Phước Hòa

8

- Hoàn thiện quy trình đã nghiên cứu ở nội dung trên

- Sản xuất 10 kg sản phẩm

5 Nội dung 4: Chứng minh cấu trúc các thành phần chính của sản phẩm tổng tritecpen.

8/2011-11/2011

8/2011-11/2011

N. T. Minh Hằng



Hà Thị Thoa Bùi Kim Nga Bùi Phước Hòa

- Phân lập các chất có trong sản phẩm tổng tritecpen

- Ghi phổ và xác định cấu trúc

của các chất được phân lập

6 Nội dung 5. Nghiên cứu tính an toàn tiền lâm sàng của mẫu sản phẩm tổng tritecpen:

- Nghiên cứu độc tính cấp

- Nghiên cứu độc tính bán trường diễn

8/2011-11/2011

8/2011-02/2012

Đỗ Thị Thảo

Nguyễn Thị Thu Hà

7 Nội dung 6. Nghiên cứu hoạt tính chống khối u của sản phẩm tritecpen.

8/2011-12/2011

8/2011-02/2012

Đỗ Thị Thảo Nguyễn Thị Thu

Hà

8 Nội dung 7: Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm

08/2011-01/2012

08/2011-03/2012

Thuê khoán chuyên môn tại

Viện kiểm nghiệm thuốc TW

9 Tập hợp kết quả và viết báo cáo

tổng kết đề tài

02/2012 04/2012 Nguyễn Thị Minh Hằng

- Lý do thay đổi (nếu có): Một số nội dung có đã thực hiện chậm hơn tiến độ

đăng ký do một số yếu tố khách quan trong quá trình làm thực nghiệm.

III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

a) Sản phẩm Dạng I:

9

Số TT

Tên sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng

chủ yếu

Đơn vị đo

Số lượng Theo kế hoạch


1 Sản phẩm tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc có hàm lượng tổng lupeol và betulin ≥80%

Kg 01 01 01

- Lý do thay đổi (nếu có): Theo hợp đồng khoa học công nghệ ban đầu thì khối

lượng sản phẩm cần đạt được là 10 kg . Do trong quá trình thực hiện, nhóm

nghiên cứu nhận thấy chỉ cần 01 kg sản phẩm là đủ cho các quá trình nghiên cứu

tiếp theo trước khi đưa sản phẩm vào phục vụ sức khỏe cộng đồng nên đã đề

nghị và được Ban điều hành chương trình hóa dược cho phép giảm xuống còn

01 kg.

b) Sản phẩm Dạng II:

Số TT

Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học cần đạt

Ghi chú

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

1 Báo cáo về tình hình thu hái cây Hoàn Ngọc theo các độ tuổi từng năm

Đúng, đầy đủ các dữ liệu về diện tích trồng, cách thức chăm sóc và thu hái cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm.

Đúng, đầy đủ các dữ liệu về diện tích trồng, cách thức chăm sóc và thu hái cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm.

2 Báo cáo về thành phần tritecpen của cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm

Đúng, chi tiết và đầy đủ về phương pháp phân lập và cấu trúc của các chất tritecpen


3 Quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc ở quy mô phòng thí nghiệm

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy đủ các thông số kỹ thuật, dễ thực hiện, an toàn,

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy đủ các thông số kỹ thuật, dễ thực

10

hiệu suất cao để chiết xuất tổng tritecpen từ mẫu cây Hoàn Ngọc

hiện, an toàn, hiệu suất cao để chiết xuất tổng tritecpen từ mẫu cây Hoàn Ngọc

4 Quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc hoàn thiện scale-up lên quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ theo con đường tối ưu nhất

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy đủ các thông số kỹ thuật đã được tối ưu hóa, dễ thực hiện, an toàn, hiệu suất cao, có thể áp dụng ở quy mô pilot.


5 Bộ phổ chứng minh cấu trúc của các thành phần chính trong sản phẩm tổng tritecpen

Đầy đủ các phổ Đầy đủ các

phổ

6 Báo cáo về tính an toàn tiền lâm sàng của sản phẩm tổng tritecpen.

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về

phương pháp và kết quả nghiên

cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của

sản phẩm

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp

và kết quả nghiên cứu

độc tính cấp và độc tính bán trường diễn

của sản phẩm

7 Báo cáo về hoạt tính chống khối u của sản phẩm.

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về

phương pháp và kết quả nghiên cứu hoạt tính

chống khối u của sản phẩm

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp

và kết quả nghiên cứu hoạt tính

chống khối u của sản phẩm

- Lý do thay đổi (nếu có): Không thay đổi

c) Sản phẩm Dạng III:

11

Số TT

Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học cần đạt

Số lượng, nơi công bố (Tạp chí, nhà

xuất bản) Theo

kế hoạch Thực tế đạt được

1 01 bài báo đăng trên các tạp chí chuyên ngành

Nội dung bài báo đáp ứng yêu cầu của các tạp chí gửi đăng.

01 bài Planta medica

2 01 bằng sáng chế hoặc giải pháp hữu ích

01 Cục sở hữu trí tuệ Việt Nam


d) Kết quả đào tạo:

Số TT

Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo

Số lượng Ghi chú (Thời gian kết

thúc) Theo kế hoạch


1 Thạc sỹ 0 0 2 Tiến sỹ 0 0


đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Số

TT

Tên sản phẩm

đăng ký

Kết quả Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

Theo

kế hoạch

Thực tế

đạt được

1 Bằng sáng chế 01 01

2

...


e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Số

TT

Tên kết quả

đã được ứng dụng Thời gian

Địa điểm

(Ghi rõ tên, địa chỉ nơi ứng dụng)

Kết quả

sơ bộ

1

2

12

2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

Quy trình công nghệ chiết xuất sản phẩm tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc chưa được công bố trước đây.

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của đề tài, cây Hoàn Ngọc sẽ được trồng

rộng rãi và trở thành cây kinh tế của tỉnh Tây Ninh. Bên cạnh đó, sản phẩm dự

kiến sẽ có chất lượng tốt, giá thành hợp lý, có khả năng cạnh tranh trong nước.

3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số TT Nội dung Thời gian

thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

I Báo cáo định kỳ

Lần 1 07/08/2011 Đã hoàn thành các nội dung 1 và 2

Lần 2 08/12/2011 Đã hoàn thành các nội dung 1,2,3,4 và 5. Các nội dung còn lại đang được đẩy nhanh tiến độ

II Kiểm tra định kỳ

Lần 1 11/08/2011 Người chủ trì: Đ/c Phùng Hà

Nhóm thực hiện đề tài về cơ bản đã thực hiện được các nội dung theo đăng ký, cần đẩy nhanh tiến độ thanh quyết toán tài chính để xin cấp tiếp kinh phí.

Lần 2 08/12/2011 Người chủ trì: Đ/c Phùng Hà

Nhóm thực hiện đề tài về cơ bản đã thực hiện được

13

các nội dung theo đăng ký theo tiến độ tuy nhiên cần đẩy nhanh tiến độ thanh quyết toán tài chính để kết thúc đề tài đúng hạn.

III Nghiệm thu cơ sở 21/4/2012 Chủ tịch Hội đồng: TS. Nguyễn Hoài Nam.

Các thành viên hội đồng đã cho ý kiến đánh giá nhận xét về kết quả thực hiện đề tài. Kết thúc phiên họp, cả 7 thành viên hội đồng đều nhất trí nghiệm thu cấp cơ sở với kết quả Đạt

Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký)

Nguyễn Thị Minh Hằng

Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký và đóng dấu)




ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI




Mã số: CNHD. ĐT. 030/11-12

Cơ quan chủ trì đề tài: DNTN Trà Hoàn Ngọc


HÀ NỘI - 2012

MỤC LỤC

I. MỞ ĐẦU................................................................................................... 1

II. TRÍCH DẪN NỘI DUNG THUYẾT MINH CỦA ĐỀ TÀI 8

2.1 Giới thiệu về cơ quan chủ trì đề tài và chủ nhiệm đề tài……………….. 8

2.2 Mục tiêu của đề tài ……………………………………………………. 9

2.3 Các nội dung nghiên cứu của đề tài ……………………………………. 9

2.4 Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lượng đối với sản phẩm đạt được......

9

2.5 Các điểm sửa đổi so với thuyết minh đề cương nghiên cứu và hợp đồng

nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ.......................................

10

2.6 Kinh phí thực hiện đề tài theo các khoản chi...........................................

11

III. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

12

3.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu cây Hoàn Ngọc.......................

12

3.1.1 Quy hoạch và chăm sóc các vùng nguyên liệu cây Hoàn Ngọc theo

độ tuổi

12

3.1.2 Chế độ chăm sóc...........................................................................

12

3.1.3 Thu hái và xử lý nguyên liệu..........................................................

13

3.2 Nghiên cứu thành phần tritecpen của cây Hoàn ngọc theo từng độ tuổi...

13

3.2.1 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………

14

3.2.2 Kết quả và thảo luận………………………………………………

15

3.3 Nghiên cứu quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc..

32

3.3.1 Nghiên cứu quy trình chiết xuất…………………………………………. 32

3.3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc với

quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ…………………………………………

35

3.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của sản phẩm tổng tritecpen thu được.. 35

3.4 Nghiên cứu tính an toàn tiền lâm sàng của sản phẩm tổng tritecpen

từ rễ cây Hoàn Ngọc…………………………………………………

36

3.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm……………………………

3.4.1.1 Vật liệu và phương pháp………………………………………………

36

36

3.4.1.2 Kết quả và thảo luận...................................................................... 37

3.4.1.3 Kết luận………………………………………………………………….. 38

3.4.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của sản phẩm…………….. 38

3.4.2.1 Vật liệu và phương pháp……………………………………………… 39

3.4.2.2 Kết quả và thảo luận....................................................................... 40

3.4.2.3 Kết luận………………………………………………………………….. 43

3.5 Nghiên cứu khả năng kháng u của sản phẩm tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc 44

3.5.1 Vật liệu và phương pháp…………………………………………… 44

3.5.2 Kết quả và thảo luận........................................................................... 47

3.5.2.1 Kết quả xác định khả năng ức chế khối u của Tritecpen-HN trên

chuột gây u thực nghiệm bằng dòng tế bào LLC..........................

47

3.5.2.2 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu chuột bị gây u và

được uống hoạt chất Tritecpen-HN……………………………………

51

3.5.2.3 Kết quả kiểm tra giải phẫu các cơ quan nội tạng........................ 52

3.5.3 Kết luận……………………………………………………………… 53

3.6 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn

Ngọc ………………………………………………………………….

53

3.6.1 Điều chế cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn Ngọc……………….. 53

3.6.2 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao dịch chiết nước từ rễ cây

Hoàn Ngọc…………………………………………………………….

54

3.6.2.1 Vật liệu và phương pháp……………………………………………… 54

3.6.2.2 Kết quả và thảo luận………………………………………………… 54

3.6.2.3 Kết quả kiểm tra giải phẫu các cơ quan nội tạng...................... 58

3.6.3 Kết luận…………………………………………………………….. 59

3.7 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng tritecpen và nghiên

cứu độ ổn định của sản phẩm………………………………………

3.7.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng tritecpen……..

60

60

3.7.1.1 Yêu cầu kỹ thuật……………………………………………………… 60

3.7.1.2 Phương pháp thử…………………………………………………….. 61

3.7.1. 3 Đóng gói, ghi nhãn và bảo quản……………………………….. 65

3.7.2 Kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm theo tiêu chuẩn cơ sở……… 65

3.7.3 Nghiên cứu độ ổn định của sản phẩm Tritecpen-HN…………… 66

3.7.3.1 Đánh giá độ ổn định bằng phương pháp lão hóa cấp tốc….. 67

3.7.3.2 Phương pháp phân tích……………………………………………. 68

3.7.3.3 Kết quả và thảo luận………………………………………………… 68

3.8 Nghiên cứu độc tính và khả năng kháng u của Trà vàng Hoàn Ngọc... 69

3.8.1 Điều chế cao chiết etanol 96% từ trà vàng Hoàn Ngọc……………. 69

3.8.2 Độc tính cấp của cao chiết trà vàng Hoàn Ngọc…………………. 70

3.8.2.1 Động vật thí nghiệm………………………………………………… 70

3.8.2.2 Mẫu thử………………………………………………………………. 70

3.8.2.3 Tiến hành……………………………………………………………… 71

3.8.2.4 Theo dõi………………………………………………………………. 72

3.8.2.5 Kết quả………………………………………………………………….. 73

3.8.2.6 Kết luận……………………………………………………………….. 75

3.8.3 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao chiết etanol Trà vàng Hoàn Ngọc. 75

3.8.3.1 Kết quả và thảo luận……………………………………………………… 76

3.8.3.2 Kết luận…………………………………………………………………… 82

3.9 Các kết quả khác……………………………………………………… 83

IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………….. 83

4.1 Kết luận……………………………………………………………....... 83

4.2 Kiến nghị………………………………………………………………. 85

Tài liệu tham khảo…………………………………………………………. 86

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NMR: Nucleur Magnetic Resonance, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H NMR: Phổ cộng hưởng từ proton

13C NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C.

COSY: Correlated Spectroscopy, phổ COSY.

DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer, phổ DEPT.

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation, phổ HMBC.

HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence, phổ HMQC.

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence, phổ HSQC.

NOE: Nuclear Overhauser Effect, hiệu ứng NOE.

NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy, phổ NOESY.

s: singlet

d: doublet

t: triplet

q: quartet

qui: quintet

sxt: sextet

sep: septet

o: overlapping

b: broad

dd: double doublet

dt: double triplet

dq: double quartet

H, C: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon.

ppm: parts per million, phần triệu.

EIMS: Electron Impact Mass Spectroscopy, Phổ khối va chạm electron.

HRMS: High Resolution Mass Spectrscopy, Phổ khối phân giải cao.

DMSO: Dimethylsulfoxide.

đnc. Điểm nóng chảy.

TLC: Thin Layer Chromatography, Sắc kí bản mỏng.

CC: Column Chromatography, Sắc kí cột thường.

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Độc tính cấp của Tritecpen-HN trên chuột thí nghiệm.............. 38

Bảng 3.2: Khối lượng chuột thí nghiệm khi cho uống Tritecpen-HN

bán trường diễn 1 tháng……………………………………………

41

Bảng 3.3: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu sau khi cho uống

Tritecpen-HN bán trường diễn 1 tháng so với trước khi thí

nghiệm....................................................................................

43

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế khối u sơ cấp phát

triển…………................................................................................

48

Bảng 3.5: Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm…………… 50

Bảng 3.6: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu chuột bị gây u sau khi

cho uống Tritecpen-HN………………………………...................

51

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của Tritecpen-HN lên mô bệnh học của gan, thận,

lách, phổi chuột thí nghiệm...........................................................

52


triển……………………………………………………………………

55

Bảng 3.9: Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm............. 57


cho uống Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc...................

58

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc trên mô

bệnh học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm..

59


triển......................................................................................

77

Bảng 3.13: Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm……….. 79

Bảng 3.14: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu chuột bị gây u sau khi cho

uống Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc.....

81

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn

Ngọc trên mô bệnh học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm....

82

1

I. MỞ ĐẦU:

Cây Hoàn Ngọc có tên khoa học là Pseuderanthemum palatiferum (Nees)

Raldk. thuộc họ Ôrô (Acanthaceae) là cây bản địa của Việt Nam. Cây này

được GS. TSKH. Trần Công Khánh (Đại học Dược Hà Nội) tìm thấy tại vườn

quốc gia Cúc Phương và xác định được tên khoa học của nó là

Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk vào những năm 90 của thế kỉ 20

[1]. Trong dân gian, cây Hoàn Ngọc có nhiều tên gọi khác nhau như Xuân

hoa, Con khỉ, Nhật Nguyệt, Trạc Mã, Thần Tượng Linh.

Trong thời kì kháng chiến chống Mỹ cứu nước, cây Hoàn Ngọc đã được

dược sĩ Phạm Khuê sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa vết thương

với tên cây Con khỉ gọi theo tiếng địa phương là Tú Lình, tuy nhiên lúc này

tên La tinh của cây còn chưa được biết đến. Vào đầu những năm 90 của thế kỉ

20, trong tài liệu viết tay của mình, dược sỹ Phạm Khuê đã giới thiệu về tác

dụng của lá cây Hoàn Ngọc như sau: lá cây có tác dụng khôi phục sức khỏe

cho người ốm yếu, mệt mỏi, người già, suy nhược thần kinh, làm việc quá

sức, khủng hoảng về tinh thần và thể lực; chữa cảm cúm nhiệt độ cao, rối loạn

tiêu hóa; chấn thương chảy máu, dập gãy cơ thể, dùng như nước uống và

thuốc đắp; đặc biệt hiệu nghiệm với vết thương sọ não; đau dạ dầy, chảy máu

đường ruột, lở loét hành tá tràng, viêm loét đại tràng, trĩ nội; đau gan xơ cổ

trướng, viêm thận, viêm đường tiết niệu, đái ra máu, đái buốt, đái đục, đái rắt,

bìu đau nhức; đau mắt đỏ, mắt trắng, đau ứ máu, đau bên trong không rõ

nguyên nhân. Có thể dùng khi bị nhiều bệnh một lúc như bệnh đường ruột,

cảm cúm, gan, thận.

Trong cuốn sách “Cây cỏ Việt Nam” [2], tác giả Phạm Hoàng Hộ đã mô tả

đặc điểm thực vật của cây Hoàn Ngọc như sau: Tiểu mộc cao 1-2 m. Lá có

phiến thon, to đến 20x4,5 cm, đáy tà hay nhọn, mặt dưới có đốm đen, gân phụ

8-9 cặp; cuống dài 5,5 cm. Phát hoa không chia nhánh, cao 30 cm; lá đài như

kim, dài 5-6 mm; vành có ống dài 2-4 cm, tai tím xanh hay trắng, môi trên

2

lõm, môi dưới 3 thùy to; tiểu nhụy thụ 2. Nang có lông mịn, cao 3,5 cm, phần

lép 2,2 cm; hột 4.

Từ năm 2000 đến nay đã có một số công trình nghiên cứu về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của cây Hoàn Ngọc (P. palatiferum).

Về mặt hoạt tính sinh học:

Năm 2005, TS. Phan Minh Giang và cộng sự đã cho biết lá cây Xuân Hoa

có tác dụng chống oxi hóa, kháng khuẩn và kháng nấm [3].

Năm 2006, trường Đại học Cần Thơ, Đại học Nông nghiệp & Công nghệ

Tokyo kết hợp với Trung tâm nghiên cứu quốc tế về khoa học nông nghiệp

Nhật Bản đã công bố về tác dụng phòng chống 25 loại bệnh: huyết áp cao,

tiêu chảy, đau dạ dày, thiếu máu cơ tim, thần kinh xương, u do ung thư, bị

thương chảy máu, táo bón, cúm, chảy máu, liệt cơ mặt, nhũn não, bệnh lị, táo

bón, bệnh phụ khoa, ung thư ruột, sâu răng, bệnh trĩ, viêm mũi, viêm thận,

viêm khớp, viêm họng, viêm vú, viêm gan, viêm ruột kết, của lá cây Hoàn

Ngọc [4,5].

Năm 2009, dịch chiết 80% etanol của lá Hoàn Ngọc khô đã được nghiên

cứu sơ bộ về độc tính. Kết quả cho thấy dịch chiết này không thể hiện độc

tính cấp và bán cấp trên chuột thực nghiệm ở các liều 1000 mg/kg chuộtvà

2000 mg/kg chuột qua đường uống và không thể hiện độc tính đối với các tế

bào lành tính ở nồng độ 50 µg/mL [6].

Năm 2010, P. Padee và cộng sự ở trường Đại học Mahasarakham, Thái

Lan đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao dịch chiết 80% etanol lá

cây Hoàn ngọc (P. palatiferum) trên chuột bị bệnh tiểu đường bình thường và

chuột bị bệnh tiểu đường do streptozotocin gây ra. Kết quả cho thấy, dịch

chiết đã thể hiện tác dụng hạ đường huyết trên chuột bị tiểu đường ở mức liều

250 mg/kg chuột. Dịch chiết cũng có tác dụng ngăn chặn các biến chứng do

bệnh tiểu đường gây ra và tăng cường chức năng của gan và thận [7].

3

Gần đây nhất, vào năm 2011, nhóm nghiên cứu của P. Khonsung ở Đại

học Chiềng Mai, Thái Lan đã cho biết dịch chiết nước của lá cây Hoàn Ngọc

tươi có tác dụng hạ huyết áp và làm giảm nhịp tim. Tác dụng làm giảm áp lực

mạch của dịch chiết phụ thuộc một phần vào nội mô mạch mà không phụ

thuộc vào quá trình tổng hợp oxit nitric và không hoạt động thông qua quá

trình kích hoạt các thụ thể muscarinic [8].

Về mặt thành phần hóa học:

Năm 2003, Võ Hoài Bắc và Lê Thị Lan Oanh đã cho biết lá cây Hoàn

Ngọc (P. palatiferum) có hàm lượng cao các axit amin và nguyên tố khoáng

chất, đặc biệt là canxi, kali và sắt [9].

Thành phần hóa học của cây Hoàn Ngọc đã được nhóm của PGS. TS.

Nguyễn Văn Hùng bước đầu nghiên cứu và thu được một số kết quả đáng chú

ý.

Từ lá cây Hoàn Ngọc thu hái tại Hà Nội đã phân lập được các chất β-

sitosterol, phytol, 3-O-(β-D-glucopyranosyl)-sitosterol, hỗn hợp stigmasterol

và poriferasterol, 1-triacoltanol, glycerol 1-hexadecanoate, axit palmitic và

axit salicylic [10,11].

Năm 2007, rễ cây Hoàn Ngọc thu hái tại tỉnh Tây Ninh cũng đã được

nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Từ rễ cây đã phân

lập được một số hợp chất tritecpen có hoạt tính sinh học thú vị thuộc khung

lupane là Lupeol, Betulin và Lupenone trong đó hàm lượng lupeol chiếm

0,56% và betulin chiếm 0,36% so với lượng nguyên liệu khô ban đầu. Rễ

cây cũng chứa một số tritecpen khác là epifriedelanol và axit pomolic với hàm

lượng nhỏ. Ngoài ra, nó còn chứa một số chất thuộc các lớp chất khác như -

sitosterol, -sitosterol glucoside... Trong hỗn hợp tổng tritecpen từ rễ cây

Hoàn Ngọc thì lupeol chiếm 60,6% và betulin chiếm 39,0%, hàm lượng các

chất khác chỉ chiếm 1%. Hai thành phần chính của rễ cây cũng đã bước đầu

4

được chúng tôi nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào đối với ba dòng tế bào

ung thư vú MCF-7, ung thư gan Hep-G2 và ung thư biểu mô KB. Betulin có

hoạt tính trên cả ba dòng tế bào được thử MCF-7 (IC50 6,65 µg/ml), Hep-G2

(IC50 32 µg/ml) và KB (IC50 26 µg/ml), còn lupeol có tác dụng đối với dòng tế

bào ung thư vú MFC-7 với IC50 là 18,29 µg/ml [12].

Lupeol và Betulin là 2 chất tritecpen phổ biến ở trong các loài thực vật và

có phổ hoạt tính sinh học rất rộng. Cho đến năm 2009, đã có trên 50 công

trình công bố về hoạt tính phòng chống và chữa bệnh của lupeol và betulin.

Các kết quả này khẳng định khả năng sử dụng lupeol và betulin như thành

phần chính cho chế phẩm, thực phẩm thuốc phòng chống khối u.

Betulin là một trong các hợp chất tự nhiên được phân lập sớm nhất, nó

được phân lập lần đầu tiên từ vỏ cây bạch dương (Betula) vào năm 1788.

Betulin có nhiều trong vỏ cây bạch dương và đã được chứng minh là có hoạt

tính chống ung thư, kháng nấm và chống virus [13,14]. Betulin và cao chiết

vỏ cây bạch dương đã được dùng làm thức ăn bổ sung (BeturalR) để bảo vệ

gan, ngăn ngừa và điều trị sự trúng độc cấp do các ancol [15] và làm chất phụ

gia cho các đồ uống chứa cồn [16]. Szuster-Ciesielska và cộng sự đã thông

báo về tác dụng bảo vệ gan của betulin và axit betulinic chống lại độc tính do

etanol gây ra cho các tế bào gan HepG2 [17] Một điều rất quan trọng là cao

chiết vỏ cây bạch dương B. verucosa (70% betulin, 6% axit betulinic và 5%

lupeol) không thể hiện độc tính trong các phép thử lâm sàng cũng như là trong

vòng ba năm từ khi nó trở thành sản phẩm thương mại [18]. Betulin và sản

5

phẩm chiết vỏ cây bạch dương đã được dùng trong mỹ phẩm để làm phụ gia

cho dầu gội đầu [19], sản phẩm chăm sóc da [20], răng [21] và tóc [22]. Hiện

nay, betulin và cao chiết vỏ cây bạch dương đã được cấp bằng phát minh làm

thuốc adaptogenic [23], chất tạo interferon (loại protein do tế bào cơ thể sinh

ra khi bị vi rút tấn công, nhằm ngăn không cho vi rút phát triển) [24], sản

phẩm chống giảm oxy trong máu [25], ngăn chặn và điều trị viêm gan C [26],

chống cúm [27], thuốc phòng lao [28].

Giống như axit betulinic, betulin cũng đã được nghiên cứu kĩ lưỡng về

khả năng gây độc tế bào và nó thể hiện khả năng ức chế đối với một số dòng

tế bào ung thư người nhưng lại không độc đối với các tế bào lành [29]. Tiềm

năng chống ung thư của betulin đã được Wojciech Rzeski và các cộng sự [29]

ở trường đại học Maria Curie-Sklodowska Ba Lan nghiên cứu trên các dòng

ung thư thần kinh người là u nguyên bào thần kinh, u nguyên bào cơ vân, u

nguyên bào tủy, u thần kinh đệm và một nhóm bệnh ung thư ngoại vi như

tuyến giáp, vú, phổi, tuyến tụy, bạch cầu và đa u tủy, cũng như trên các dòng

ung thư nuôi cấy sơ cấp được tách từ bệnh nhân như ung thư biểu mô buồng

trứng, ung thư biểu mô cổ và u tế bào thần kinh đệm. Betulin đã thể hiện khả

năng ức chế sự sinh sản của tất cả các dòng tế bào nuôi cấy được thử (IC50

trong khoảng 2,5-10,3 µM), nhưng nó nhạy nhất đối với u nguyên bào thần

kinh (SK-N-AS, IC50-2,5 µM) và ung thư biểu mô tuyến tụy (HT-29, IC50-4,3

µM). Betulin đã làm thay đổi hình thái học của các tế bào, làm giảm sự hoạt

động của chúng dẫn đến sự chết theo chương trình của các tế bào ung thư.

Amjad và các cộng sự đã thông báo về sự ức chế các vi rút Herpe và

Epstein-Barr của betulin và các dẫn xuất [30]. Hoạt tính chống vi rút Herpe

của betulin cũng đã được đề cập đến trong một số patent [31-33]. Các patent

này cũng đã cho biết các tính chất chống vi rút và điều hòa miễn dịch của

betulin. Betulin có thể dùng trong điều trị vi rút viêm gan C [34,35]. Dẫn xuất

3-O,28-O-dinicotinoylbetulin có tác dụng bảo vệ gan, chống mụn nhọt, kháng

6

viêm, chống ung thư và điều hoà miễn dịch [36]. Các dẫn xuất do biến đối cấu

trúc của betulin ở các vị trí C-3 và C-28 đã được đánh giá hoạt tính kháng vi

rút in vitro. Sự biến đổi đơn giản cấu trúc gốc của khung lupane đã tạo ra các

chất có tác dụng chống vi rút cúm A và các vi rút gây bệnh herpe đơn nhân

týp-1. Baltina cùng các cộng sự [37] đã cho biết một số 3,28-este của betulin

có tác dụng bảo vệ gan và chống cúm. Ngoài ra betulin còn được biết là có

một số hoạt tính thú vị khác. Emzym ADN topoisomerases đóng vai trò quan

trọng trong quá trình tái tạo, phiên mã, tích hợp và phân tách chromosome của

quá trình phân bào. Betulin có khả năng ức chế xúc tác chọn lọc enzym ADN

topoisomerases người với IC50 là 38,6 µM [38]. Năm 1999, Nobuhino Miura

và các cộng sự ở trường đại học Tohoku, Densai, Nhật Bản, đã cho biết

betulin có thể làm giảm độc tính của cadmi bằng cách thúc đẩy sự tổng hợp

một số protein nội bào có tác dụng bảo vệ các tế bào chống lại khả năng gây

độc của cadmi vì khi xâm nhập vào cơ thể động vật dưới dạng CdCl2 thì hầu

hết cadmi sẽ tập trung ở gan và gây độc cho gan [39].

Lupeol là hợp chất tritecpen có mặt trong nhiều loài thực vật như o lưu,

sung, xoài, các loại quả và các loại thuốc thảo mộc. Lupeol đã được chứng

minh là hoạt chất của nhiều cây thuốc dân gian như: Cây Bún (Crateva

nurvala) [40], vỏ cây gạo (Bombax ceiba) [41]… Lupeol có phổ hoạt tính

sinh học rất rộng. Hoạt tính kháng viêm và chống viêm khớp của lupeol được

đề cập đến thường xuyên hơn cả axit betulinic và betulin. Lupeol có khả năng

ức chế không cao (ở mức độ vừa phải) nhưng rất đặc trưng (đặc hiệu) đối với

các dòng tế bào ung thư. Đối với tế bào ung thư tuyến tiền liệt nhạy với

androgen [42], nó ức chế sự sinh sản của các tế bào ung thư bằng cách tấn

công vào các đích tín hiệu β-catenin [43]. Lupeol ức chế quá trình thu nhận

tín hiệu của các tế bào ung thư tuyến tụy [44]. Nó còn có tác dụng chống lại

sự phát triển của khối u trên mẫu sinh khối u ở da chuột nên có thể dùng để

điều trị và ngăn ngừa các rối loạn về da và ung thư da [45,46]. Lupeol đã

được chứng minh là có tác dụng gây ra sự biệt hóa (differentiation) và ức chế

7

sự phát triển của khối u ác tính ở chuột và các tế bào bạch cầu ở người

[47,48]. Lupeol cũng có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại sự gây độc của các

gốc tự do [49-52].

Ngoài ra, Lupeol còn có tác dụng chống viêm. Fernandez và cộng sự [53]

đã cho biết rằng trong dịch chiết của Pimenta racemosa var. osua chứa lupeol

có hoạt tính cao chống lại hai mô hình viêm cấp thực nghiệm (phù chân và

phù tai ở chuột). Sự giảm hoạt tính của enzyme chuyển oxy từ peroxide tủy

(myeloperoxidase) cho biết cơ chế liên quan đến quá trình xâm nhập của

neutrophil. Một bằng phát minh có tính ứng dụng [54] đã chỉ ra rằng lupeol và

các este axit béo của nó là các tác nhân kháng viêm và chống viêm khớp.

Tác dụng chống cholesterol cao cũng là một khả năng ứng dụng khác của

lupeol. Sudhahar và cộng sự [55] đã cho biết khi điều trị bằng lupeol và lupeol

linoleate làm giảm mức LPO và làm tăng các chất chống oxi hóa theo cơ chế

enzyme và không enzyme. Lupeol trong các nguồn tự nhiên đã được ứng

dụng rộng rãi trong các sản phẩm làm thực phẩm cho người đặc biệt là làm

chất phụ gia thực phẩm và mỹ phẩm như là chất kích thích quá trình tổng hợp

các protein gây căng thẳng [56], các thành phần thúc đẩy quá trình tạo

melanin [57], các chất điều hòa sự hình thành sắc tố cho các sản phẩm chăm

sóc tóc [58], các mỹ phẩm ít bị dị ứng [59] và các mỹ phẩm chứa lupeol có tác

dụng ngăn chặn sự lão hóa của da [60].

Từ năm 2001, Doanh nghiệp tư nhân Trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh đã

sử dụng rễ và lá cây tạo chế phẩm Trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh. Sản phẩm

này có tác dụng giải nhiệt, kháng khuẩn, giải độc, tăng cường thể lực, hỗ trợ

tiêu hóa cùng với một số tác dụng chữa bệnh khác đang được bán rộng rãi

trên thị trường và đã có hiệu quả rõ rệt trong việc tăng cường sức khỏe cộng

đồng, nhất là tại miền Nam và đã đạt được các giải thưởng: Cầu vàng; huy

chương vàng; quyền sử dụng con dấu hàng Việt Nam chất lượng cao phù hợp

tiêu chuẩn năm 2005 và 2006. Cúp vàng; huy chương vàng; quyền sử dụng

8

con dấu sản phẩm an toàn vì sức khỏe cộng đồng năm 2005 và 2006. Cúp

vàng thương hiệu Việt do cục sở hữu trí tuệ Việt Nam cấp năm 2005. Cúp

vàng sản phẩm an toàn an sinh xã hội năm 2008. Cúp vàng thương hiệu cạnh

tranh nổi tiếng quốc gia năm 2008. Danh hiệu Rồng vàng Doanh nhân hiền tài

- UNESCO VN và sản phẩm tiêu biểu vùng miền, vùng Đông - Tây Nam Bộ

năm 2010.

Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh

học của cây Hoàn Ngọc (P. palatiferum) như đã trình bày ở trên. Để tăng

cường giá trị sử dụng và phát triển cây Hoàn Ngọc thành cây thuốc quý đóng

góp vào công cuộc bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Được sự ủng hộ của UBND

Tỉnh Tây Ninh, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo

chế phẩm phòng chống khối u từ cây Hoàn Ngọc Pseuderanthemum

palatiferum (Nees) Raldk.” nhằm mục tiêu tạo ra sản phẩm phòng chống và

hỗ trợ điều trị khối u từ cây Hoàn Ngọc - Một cây thuốc quý cần được đầu tư

nghiên cứu để tìm ra khả năng sử dụng cây này có hiệu quả nhất.

II. TRÍCH DẪN NỘI DUNG THUYẾT MINH CỦA ĐỀ TÀI

2.1 Giới thiệu về cơ quan chủ trì đề tài và chủ nhiệm đề tài

Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm phòng chống khối

u từ cây Hoàn Ngọc Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.

Mã số: CNHD.ĐT.030/11-12

Thời gian thực hiện: 02/2011 - 02/2012

Kinh phí: 880 triệu đồng

Thuộc chương trình: Nghiên cứu KHCN trọng điểm quốc gia phát triển

công nghiệp Hóa dược đến năm 2020.


Địa chỉ: Viện Hóa sinh biển - 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu

Giấy, Hà Nội. Điện thoại 04-37916337 Fax: 04-

37917054

9

Mobile: 0947216182; E-mail: [email protected]

Cơ quan chủ trì: Doanh nghiệp Tư nhân Trà Hoàn Ngọc

Địa chỉ: 37 Nguyễn Trọng Cát, phường Hiệp Ninh, thị xã

Tây Ninh.

Điện thoại: 066 3621121 ; Fax: 066 3621121

E-mail: [email protected]

Website: www.hoanngoctea.com

2.2 Mục tiêu của đề tài :

Xây dựng quy trình tạo chế phẩm tổng tritecpen chứa hoạt chất phòng

chống khối u có trong cây Hoàn Ngọc Pseuderanthemum palatiferum (Nees)

Radlk.

2.3 Các nội dung nghiên cứu của đề tài :

Nội dung 1. Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu: Nghiên cứu thời gian thu hái

nguyên liệu và hàm lượng tritecpen theo tuổi nguyên liệu.

Nội dung 2. Nghiên cứu quy trình công nghệ chiết xuất tổng tritecpen có

trong cây Hoàn Ngọc.

Nội dung 3. Xây dựng quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc ở

quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ

Nội dung 4. Chứng minh cấu trúc các thành phần chính của sản phẩm tổng

tritecpen

Nội dung 5. Nghiên cứu tính an toàn tiền lâm sàng của sản phẩm tổng

tritecpen:

Nghiên cứu độc tính cấp.

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn.

Nội dung 6. Nghiên cứu hoạt tính chống khối u của sản phẩm tổng tritecpen.

Nội dung 7. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm:

2.4. Yêu cầu kỹ thuật, chỉ tiêu chất lượng đối với sản phẩm đạt được:

10

Stt Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học

1. 1 kg hỗn hợp tổng tritecpen từ cây

Hoàn Ngọc

Hàm lượng Lupeol ≥ 50%, Betulin ≥

30%, kim loại nặng ≤ 0,002%, nước

≤ 1%.

2. Báo cáo về tình hình thu hái cây Hoàn Ngọc theo các độ tuổi từng năm

Đúng, đầy đủ các dữ liệu về diện tích trồng, cách thức chăm sóc và thu hái cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi.

3. Báo cáo về thành phần tritecpen của cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm


4. Quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc ở quy mô phòng thí nghiệm

Quy trình chi tiết, ổn định, đầy đủ các thông số kỹ thuật, dễ thực hiện, an toàn, hiệu suất cao để chiết xuất tổng tritecpen từ mẫu cây Hoàn Ngọc

5. Quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc hoàn thiện scale-up lên quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ theo con đường tối ưu nhất


6. Bộ phổ chứng minh cấu trúc của các thành phần chính trong sản phẩm tổng tritecpen

Đầy đủ các phổ IR, MS, 1D và 2D NMR

7. Báo cáo về tính an toàn tiền lâm sàng của sản phẩm tổng tritecpen.

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp và kết quả nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường

diễn của sản phẩm

8. Báo cáo về hoạt tính chống khối u của sản phẩm.

Báo cáo chi tiết, đầy đủ về phương pháp và kết quả nghiên cứu hoạt tính chống khối u của sản phẩm

9 Báo cáo về độ ổn định của sản phẩm Hạn dùng 2 năm

2.5 Các điểm sửa đổi so với thuyết minh đề cương nghiên cứu và hợp

đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ:

- Sửa đổi nội dung nghiên cứu: Trong quá trình thực hiện, chúng tôi thấy

rằng 1kg sản phẩm là đủ cho các quá trình nghiên cứu dược học tiếp theo

11

trước khi đưa sản phẩm ra đời sống nên việc sản xuất đủ 10 kg sản phẩm

là chưa cần thiết có thể gây lãng phí nguyên liệu. Do đó, nhóm nghiên

cứu đã kiến nghị và đã được sự đồng ý của Ban điều hành Chương trình

Hóa dược cho phép giảm khối lượng sản phẩm xuống còn 1 kg và

chuyển kinh phí dành cho phần này (30 triệu đồng) sang thực hiện một

nội dung mới là Nghiên cứu hoạt tính kháng u của dịch chiết nước rễ cây

Hoàn Ngọc.

- Sửa đổi thời gian thực hiện so với hợp đồng nghiên cứu khoa học: Do có

một sửa đổi về nội dung nghiên cứu và nhóm nghiên cứu có tiến hành

thêm một số nội dung nghiên cứu khác ngoài các nội dung đã đăng ký

trong thuyết minh đề cương, đề tài đã kiến nghị và được Ban điều hành

Chương trình Hóa dược cho phép gia hạn thực hiện đến hết tháng

5/2012.

2.6 Kinh phí thực hiện đề tài theo các khoản chi:

Đơn vị: triệu đồng

Nguồn kinh phí Tổng

số

Trong đó

Trả công lao động

(khoa học, phổ thông)

Nguyên, vật liệu,

năng lượng

Thiết bị, máy

móc

Xây dựng,

sửa chữa nhỏ

Chi khác

1 2 3 4 5 6 7 8

Tổng kinh phí 880 437 150 70 0 223

Trong đó:

1 Ngân sách SNKH:

- Năm thứ nhất*:

880

880

437

437

150

150

70

70

0

0

223

223

2 Nguồn tự có của cơ quan

0 0 0 0 0 0

3 Nguồn khác (vốn huy động, ...)

0 0 0 0 0 0

12

III. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

3.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu cây Hoàn Ngọc:

Hiện nay, DNTN Trà Hoàn Ngọc đã có 20 ha cây trồng ở độ tuổi từ 1

năm đến nhiều hơn 7 năm. Chăm sóc cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm

và thu hái nguyên liệu theo độ tuổi từng năm.

3.1.1 Quy hoạch và chăm sóc các vùng nguyên liệu cây Hoàn Ngọc theo

độ tuổi:

Quy hoạch và chăm sóc vùng nguyên liệu cây Hoàn Ngọc 1-2 năm

tuổi:

- Tổng diện tích: 2 ha

- Số lượng nhân công phụ trách chăm sóc suốt năm: 15


tuổi:

- Tổng diện tích: 5ha



tuổi:



Quy hoạch và chăm sóc vùng nguyên liệu cây Hoàn Ngọc trên 7 năm tuổi:



3.1.2 Chế độ chăm sóc:

Phân bón: xơ dừa lót giữ nước, tro trấu, vỏ lụa đậu phộng, tro mía, bánh

dầu đậu vào trước khi trồng và bón bổ sung hàng tháng.

Chăm sóc: hoàn thành tốt, giữ cho cây không bị thiếu nước mùa khô và

ngập ún mùa mưa do đã quy hoạch nguồn nước tưới, nguồn điện cho các

máy tưới, và hệ thống kênh, thủy lợi phục vụ xả nước. Luôn làm sạch cỏ

trên các luống cây .

13

3.1.3 Thu hái và xử lý nguyên liệu:

Lá cây Hoàn Ngọc: thu hái lá già vào khoảng tháng 1-2 hằng năm lúc trời

lập xuân, cây sắp ra hoa, lá phát triển, phiến lá dày, màu ngã vàng.

Rễ cây Hoàn Ngọc: thu hoạch toàn bộ phần rễ, trừ thân. Vào khoảng

tháng 7-8 hằng năm lúc cuối thu sang đông, lá ngả màu vàng và đã rụng

bớt, rễ phát triển.

Xử lí mẫu:

Làm sạch:

- Lá: rửa sạch, nhanh, không ngâm lâu trong nước.

- Rễ: rửa sạch, nhanh, sàng sẩy để loại bỏ tạp chất và đất cát.

Phơi sấy: Lá và rễ được sấy đến độ thủy phần an toàn, độ ẩm khoảng

10% (lá), 12% (rễ). Quá trình sấy được chia làm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn đầu sấy ở 40 - 50 oC

- Giai đoạn giữa sấy ở 50 - 60 oC

- Giai đoạn cuối sấy ở 60 - 70 oC

Xay nhuyễn: lá và rễ đều được nghiền nhỏ bằng máy nghiền bánh răng.

Thu được dạng bột thô khoảng 1400/355 (rễ), bột nửa thô khoảng 710/250

(lá).

3.2 Nghiên cứu thành phần tritecpen của cây Hoàn ngọc theo từng độ

tuổi:

Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã công bố trước đây về cây Hoàn Ngọc

và theo kết quả khảo sát ban đầu bằng cách ngâm chiết một lượng nhỏ mẫu

(50 g) từng bộ phận của cây (lá, thân và rễ cây) bằng diclometan, sau đó cất

loại dung môi rồi khảo sát bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng trên bản silica

gel tráng sẵn (TLC Silica gel 60 F254) với hệ dung môi n-hexan/etyl axetat

(4:1) cho thấy rằng rễ cây là bộ phận chứa nhiều chất nhất của cây và có hàm

lượng tritecpen cao nhất trong cây còn lá cây là bộ phận chứa rất ít tritecpen.

Dựa trên kết quả khảo sát ban đầu này chúng tôi đã quyết định lựa chọn rễ

14

cây Hoàn Ngọc làm nguyên liệu để chiết xuất tổng tritecpen xuyên suốt các

nội dung nghiên cứu sau.

3.2.1 Phương pháp nghiên cứu:

Rễ cây Hoàn Ngọc được xử lí dưới dạng bột khô. Bột nguyên liệu khô

được ngâm chiết với etanol 96% (3 lần, 24 giờ/lần). Các dịch chiết etanol

được gộp lai và cất loại dung môi ở áp suất giảm xuống còn 1/10 thể tích ban

đầu. Pha loãng cặn dịch EtOH bằng nước cất theo tỉ lệ 2:1 rồi phân bố lần

lượt với n-hexan và etyl axetat. Làm khô dịch chiết n-hexan và etyl axetat

bằng Na2SO4 rồi cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu các cặn chiết

tương ứng. Các cặn chiết được phân tách bằng phương pháp sắc kí cột trên

chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng các hệ dung môi khác nhau để thu được

các chất sạch.

Các chất sạch được đo phổ NMR, MS và IR để xác định cấu trúc.

Sơ đồ nghiên cứu thành phần tritecpen của cây Hoàn Ngọc như sau:

Ngâm chiết bằng etanol 96% (3 lần, 24 giờ/lần)

Dịch chiết etanol

1. Cất loại dung môi xuống còn 1/10 V ban đầu 2. Pha loãng với nước cất

Dịch etanol - nước

1. Phân bố bằng n-hexan và etyl axetat 2. Làm khô bằng Na2SO4 3. Cất loại dung môi

Cặn chiết

1. Phân tách bằng các phương pháp sắc kí 2. Kết tinh lại

Chất sạch Cấu trúc xác định Đo các phổ

Mẫu nguyên liệu dạng bột khô

15

3.2.2 Kết quả và thảo luận:

Theo phương pháp chiết xuất đã trình bày ở trên. Khi chiết nguyên liệu rễ

Hoàn Ngọc theo độ tuổi, chúng tôi thu được kết quả cho 1 kg nguyên liệu khô

như trong bảng sau:

Độ tuổi

Cặn chiết 1-2 năm 3-4 năm 5-7 năm

n-hexan 8,0 g 8,3 g 8,5 g

EtOAc 6,5 g 6,7 g 6,6 g

Như vậy, khối lượng các cặn chiết thu được từ các nguồn nguyên liệu

có độ tuổi khác nhau là tương tự nhau.

Phân tách các cặn chiết và phân lập các chất của rễ cây 5-7 năm:

Phân tách cặn chiết n-hexan:

Cặn n-hexan (8,5 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải bằng hệ

dung môi n-hexan/etyl axetat theo phương pháp gradient nồng độ etyl axetat

từ 0%-100% để thu được 7 nhóm phân đoạn chính ký hiệu F1-F8. Các nhóm

phân đoạn này tiếp tục được tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột và kết tinh

phân đoạn để thu được các chất: lupeol (1; 4,5 g), betulin (2; 2,5 g), -

sitosterol (3; 0,5 g), lupenone (4; 15 mg), epifriedelanol (5; 5 mg), palatiferin

A (6; 9 mg), palatiferin B (7; 7mg), asperglaucide (8; 6 mg) và -sitosterol

glucoside (10, 15 mg).

Quá trình phân tách cụ thể các cặn chiết để phân lập các chất được trình

bày cụ thể trong sơ đồ sau:

16

Phân tách cặn chiết etyl axetat:

Cặn chiết etyl axetat được phân tách bằng phương pháp sắc ký cột trên

chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/etyl axetat theo tỷ

lệ tăng dần lượng etyl axetat từ 95:5 đến 0:100 để thu được 6 nhóm phân đoạn

chính ký hiệu FA1-FA6. Các nhóm phân đoạn này tiếp tục được kết tinh và

tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột để thu được các chất lupeol (1; 1,2 g),

F16 F17 F18

(6) 9 mg

F19 F20 F21

CC, Sephadex LH-20, MeOH/CH2Cl2 (90/10)

(7) 7 mg

Kt.CH2Cl2 / MeOH (4/1)

Kt.CH2Cl2 / MeOH (4/1)

Cặn chiết n-hexan

CC, SiO2, n-hexan/EtOAc (100:0 - 0:100)

F1 F2 F3 F4 F5 F7 F6 F8

(1) 4,5 g

Kt. CH2Cl2/ MeOH (9:1)

(3)

0,5 g

(2)

2,5 g

CC, SiO2, n-hexan/CH2Cl2 (9:1)

F9 F10 F11

(4) 15 mg

Kt. CH2Cl2/ MeOH

(5) 5 mg

CC, SiO2, n-hexan/CH2Cl2

(80:20 - 0:100)

F12 F13 F14 F15

CC, Sephadex LH-20, MeOH/CH2Cl2 (80/20)

(8) 6 mg

CC, SiO2, n-hexan/ CH2Cl2 (1:1)

(10) 15 mg

Rửa bằng axeton


17

betulin (2; 1,0 g), -sitosterol (3; 0,2 g), axit pomolic (9, 5 mg) và -sitosterol

glucoside (10, 100 mg).

Quá trình chi tiết được trình bày trong sơ đồ sau:

Qua quá trình phân tách trên từ 1,0 kg rễ cây Hoàn Ngọc khô đã thu được

các chất lupeol (5,7 g), betulin (3,5 g), -sitosterol (0,7 g), lupenone (15 mg),

epifriedelanol (5 mg), palatiferin A (9 mg), palatiferin B (7mg), asperglaucide

(6 mg), axit pomolic (5 mg) và -sitosterol glucoside (15 mg).

Như vậy thành phần chính của rễ cây Hoàn Ngọc 5-7 năm tuổi là lupeol

(0,57% so với nguyên liệu khô), betulin (~0,35%), -sitosterol (~0,07%) và

(10) 0,1 g

Cặn chiết EtOAc

CC, SiO2, n-hexan/EtOAc (95:5 - 0:100)

FA1 FA2 FA3 FA4 FA5 FA6

(1) 1,2 g


(3) 0,2 g

(2) 1,0 g

CC, SiO2, CH2Cl2/MeOH (90:10 - 80:20)

F12 F13 F14


Kt. MeOH


(9) 6 mg

18

-sitosterol glucoside (~0,0115%). Ngoài ra còn có một số tritecpen như

epifriedelanol, lupenone , asperglaucide, palatiferin A, palatiferin B và axit

pomolic nhưng với hàm lượng không đáng kể.

Xác định cấu trúc của các chất:

Lupeol (1):

H

H

H

HO

H

1

3 57

9

10

12

1416

18

19 20

21

22

23 24

25 26

27

28

29

30

15

11

Chất 1 được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 210-

2110C. Phổ 13C-NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hưởng của 30 cacbon trong

đó có 2 cacbon sp2 và 28 cacbon sp3 tương ứng với 7 nhóm metyl, 11 nhóm

metylen, 6 nhóm metin và 6 cacbon bậc bốn. Trên phổ khối lượng EIMS pic

ion phân tử xuất hiện ở m/z 426. Các dữ kiện phổ 13C- NMR và EI-MS cho

phép xác định công thức phân tử của chất này là C30H50O và cho biết đây là

một tritecpen có năm vòng cùng với một liên kết đôi và một nhóm hydroxy

trong phân tử. Trên phổ 1H-NMR ở vùng trường thấp có tín hiệu cộng hưởng

của hai proton olefinic (H 4,56 và 4,68, H-29a và H-29b). Các tương tác trên

phổ HSQC cho biết hai proton này thuộc về một nhóm metylen olefinic,

nhóm metylen này rất đặc trưng cho các tritecpen khung lupan. Ở trường cao

hơn có tín hiệu cộng hưởng của một proton của nhóm hydroxymetin (H 3,18,

H-3). Proton này bị tách dưới dạng quintet với hằng số tương tác trung bình

(J=5,5 Hz) cho biết cấu hình của nó. Một proton của nhóm metin nữa xuất

hiện dưới dạng double triplet (H 2,37, J=5,5; 11,0 Hz, H-19). Proton của 7

nhóm metyl đều xuất hiện dưới dạng singlet ở vùng trường cao (H 0,76-

19

1,68). Các tín hiệu cộng hưởng của các proton thuộc các nhóm metylen còn

lại đều xuất hiện ở vùng trường cao dưới dạng multiplet. Trên phổ 13C-NMR

dễ dàng nhận thấy tín hiệu cộng hưởng của một liên kết đôi (C 109,33 và

150,98, C-29 và C-22), một nhóm hydroxymetin (C 79,04, C-3). Kết hợp các

dữ kiện phổ và tham khảo tài liệu [61] cho phép xác định cấu trúc của chất

này là lupeol, một tritecpen khung lupan. Hợp chất này có hoạt tính gây độc

tế bào đối với dòng tế bào Hep-G2, A-431, H-4IIE [62], ngoài ra lupeol còn là

chất chống oxy hoá và kháng viêm [63].

Betulin (2):

H

H

H

HO

H

1

3 57

9

10

12

1416

18

19 20

21

22

23 24

25 26

27

28

29

30

15

11 OH




metylen trong đó có một nhóm hydroxymetylen, 6 nhóm metin trong đó có

một nhóm hydroxymetin và 6 cacbon bậc bốn. Trên phổ khối lượng EI-MS

pic ion phân tử xuất hiện ở m/z 442. Các dữ kiện phổ 13C-NMR và EI-MS cho

phép xác định công thức phân tử của chất này là C30H50O2 và cho biết đây là

một tritecpen có năm vòng cùng với một liên kết đôi và hai nhóm hydroxy

trong phân tử. Các dữ kiện phổ của 2 rất gần với các dữ kiện của 1. Giống

như hợp chất 1, trên phổ 1H-NMR thấy có tín hiệu cộng hưởng của hai proton

olefinic thuộc một nhóm metylen olefinic (H 4,56 và 4,68, H-29a và H-

29b), một proton của nhóm hydroxymetin (H 3,18, H-3). Một proton của

20

nhóm metin nữa xuất hiện dưới dạng double triplet (H 2,38, J=6,0, 11,0 Hz,

H-19). Khác với 1, ở 3 tín hiệu của một nhóm metyl đã được thay thế bởi một

nhóm hydroxymetylen (H 3,33 (1H, dd, J=10,5, 3,0 Hz, H-28b) và 3,80 (1H,

d, J = 8,5 Hz, H-28a). Trên phổ 13C-NMR cũng dễ dàng nhận thấy tín hiệu

cộng hưởng của một liên kết đôi (C 109,68 và 150,48, C-29 và C-22), một

nhóm hydroxymetin (C 79,00, C-3) và một nhóm hydroxymetylen (H

60,58). Các dữ kiện phổ và tài liệu tham khảo [1] đã cho phép xác định cấu

trúc của chất này là betulin. Hợp chất betulin được El Deeb K. S. tách ra từ

loài Maytenus forsskaoliana thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng

HeLa vµ Hep-2 [64], nó cũng thể hiện hoạt tính chống HIV với giá trị IC50 là

6,1 g/ml [65].

Lupenone (4):

H

H

H

O

H

1

3 57

9

10

12

1416

18

19 20

21

22

23 24

25 26

27

28

29

30

15

11




metylen, 5 nhóm metin và 7 cacbon bậc bốn trong đó có một nhóm cacbonyl

(>C=O). Trên phổ khối lượng EIMS pic ion phân tử xuất hiện ở m/z 424. Các

dữ kiện phổ 13C-NMR và EI-MS cho phép xác định công thức phân tử của

chất này là C30H48O và cho biết đây là một tritecpen có năm vòng cùng với

một liên kết đôi và một nhóm cacbonyl trong phân tử. Các dữ kiện phổ của

chất này rất gần với dữ kiện phổ của chất 1. Giống như chất 1, trên phổ 1H-

NMR của 4 có tín hiệu cộng hưởng của hai proton olefinic (H 4,57 và 4,68,

21

H-29a và H-29b). Một proton của nhóm metin (H 2,46, H-19). Proton của các

7 nhóm metyl đều xuất hiện dưới dạng singlet ở vùng trường cao (H 0,78-

1,68). Khác với 1, ở 4 đã mất đi tín hiệu cộng hưởng của proton thuộc nhóm

hydroxymetin. Trên phổ 13C-NMR dễ dàng nhận thấy tín hiệu cộng hưởng

của một liên kết đôi (C 109,80 và 150,89, C-29 và C-22) và một nhóm

cacbonyl (H 218,12, C-3), không có tín hiệu của nhóm hydroxymetin. Như

vậy có thể kết luận chất này cũng là một tritecpen thuộc khung lupan như chất

1 trong đó nhóm hydroxymetin được thay thế bằng nhóm cacbonyl. Qua các

dữ kiện phổ và tham khảo tài liệu [61] cho phép xác định cấu trúc của chất

này là lupenone.

Epifriedelanol (5):

Chất 5 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim màu trắng, nóng chảy ở

281-2820C. Phổ 13C NMR của 5 cho tín hiệu cộng hưởng của 30 cacbon lai

hóa sp3. Chúng được phân tách thành 8 nhóm metyl, 11 nhóm metylen, 5

nhóm metin trong đó có một nhóm hiđroximetin (C 72,78) và 6 cacbon bậc

bốn bằng phổ DEPT. Phổ EIMS cho thấy pic ion phân tử ở m/z 428. Các dữ

kiện phổ trên cho phép xác định công thức phân tử của chất này là C30H52O và

cho biết nó là một chất tritecpen năm vòng và có một nhóm thế hiđroxi. Sự có

mặt của nhóm hiđroxi cũng được xác nhận qua dải hấp thụ đặc trưng ở max

3474 cm-1. Vị trí của các nguyên tử trong phân tử được xác định bằng các dữ

kiện phổ NMR. Trên phổ 1H NMR, các tín hiệu tập trung chủ yếu ở vùng

trường cao (H 0,86-1,91), trong đó dễ dàng nhận thấy tín hiệu cộng hưởng

22

của 8 nhóm metyl trong đó có 7 nhóm dưới dạng singlet [H 0,86 (3H, s, H-

25); 0,94 (3H, s, H-29+H-24); 0,96 (3H, s, H-27); 0,99 (6H, s, H-26 và H-28);

0,99 (3H, d, J=6,5 Hz, H-23); 1,17 (3H, s, H-30)]. Các tín hiệu cộng hưởng

dưới dạng các multiplet chồng chập lên nhau trong vùng này thuộc về các

proton của các nhóm metylen và metin. Ở vùng trường thấp hơn chỉ có tín

hiệu cộng hưởng của một proton thuộc nhóm hiđroximetin xuất hiện dưới

dạng singlet rộng (H 3,73). Dạng phân tách của proton này cho biết cấu hình

của nó. Kết hợp các dữ kiện phổ và tài liệu tham khảo [61] có thể kết luận

cấu trúc của 5 là epifriedelanol.

Palatiferin A(6):

Chất 6 thu được dưới dạng tinh thể màu vàng nhạt, có độ quay cực

+ 28,2 (c 0,71; CHCl3). Phổ khối phân giải cao HR-ESI có pic [M+Na]+

tại m/z 423,1064 cho phép xác định công thức phân tử của chất 6 là C21H20O8.

Trên phổ hồng ngoại có dải hấp thụ tại max 3427 cm-1 cho biết sự có mặt của

nhóm hydroxy trong phân tử. Trên phổ 1H NMR có tín hiệu cộng hưởng của

một vòng benzen thế tại 3 vị trí 1,3,4 [H 6,87 (dd, J = 8,0 và 1,5 Hz); 6,83 (d,

J = 8,0 Hz); 6,92 (d, J = 1,5 Hz)] và một vòng benzen thế tại bốn vị trí [H

6,96 (d, J = 8,5 Hz) và 6,52 (d, J = 8,5 Hz). Ngoài ra còn có tín hiệu cộng

hưởng của một nhóm metoxy ở H 4,01 (s), 2 nhóm metylendioxy ở H 5,92

(d, J = 1,0 Hz) và 5,97 (s), 3 nhóm metin ở H 5,07 (d, J = 5,0 Hz); 2,93 (m)

và 4,79 (s); 2 nhóm metylen ở H 4,53 (dd, J = 9,5 và 8,5 Hz) và 3,94 (dd, J =

9,5 và 5,5 Hz); 3,92 (d, J = 9,0 Hz) và 4,04 (d, J = 9,0 Hz). Phổ 13C NMR và

23

DEPT cho thấy sự có mặt của bảy cacbon thơm bậc bốn (C 126,5; 140,6;

136,2; 156,6; 129,4; 148,1 và 147,8) và một cacbon bậc bốn lai hóa sp3 (C

91,2). Phân tích các hằng số tương tác 1H-1H có thể suy ra 3 hệ tương tác

spin-spin là H-5’-H-6’, H-7’-H-8’-H-9’ và H-5-H-6-H-2 (vòng benzen thế 3

lần). Các tương tác trên phổ HMBC đã cho biết chất 6 là một furanofuran

lignan. Nhóm methylenedioxy CH2-10 (C 101,0, H 5,92) được gắn với C-3

(C 148,1) và nhóm CH2-10’ (C 101,2; H 5,97)C-4 (C 147,8) được gắn với

C-3’ (C 136,2) và C-4’ (C 149,1). Nhóm metoxy được xác định gắn vào vị

trí C-2’ (C 140,6). Trên phổ NOESY, H-9’α có tương tác với H-8’, H-9’α và

H-9’ có tương tác với nhau và cả 2 proton này có tương tác với H-7 và H-7’.

Các dữ liệu này cho biết cấu hình trans giữa H-7’ và H-8’. Tương tác không

gian giữa H-7 và H-7’ cho biết vòng B/B’ tiếp giáp nhau theo dạng cis và 2

proton này ở vị trí pseudo-axial. Phân tích hằng số tương tác giữa proton H-7’

[H 5,07 (J = 5,0 Hz)] cho biết vòng A’ có phân bố pseudo-equatorial [66,67].

So sánh độ quay cực (+ 28,2, c 0,71; CHCl3) của chất 6 với độ quay cực của

một chất có cấu trúc tương tự là paulownin (+28,4, c 1,09; CHCl3) có cấu

hình tuyệt đối đã biết cho phép suy ra cấu hình của chất 6 là 7S,7’R,8S,8’R.

Hợp chất này được xác định là 7S,7’R,8S,8’R-8-hydroxy-6-methoxy-

3,4:3’,4’-bis(methoxylenedioxy)-7,9’:7’,9-diepoxylignan và được gọi tên là

palatiferin A.

Palatiferin B (7):

24

Hợp chất 7 được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng nhạt và hoạt động

quang học, với độ quay cực là -53,0 (c 0,28; CHCl3). Phổ khối phân giải

cao HR-ESI cho pic [M+Na]+ tại m/z 439,1007. Các phổ 1D NMR của chất 7

rất giống với phổ của chất 6 ngoại trừ sự có mặt của một cacbon bậc bốn lai

hóa sp3 ở C 88,2 (C-8) thay thế cho một nhóm metin sp3. Tín hiệu cộng

hưởng của các proton trong các vòng furan có sự khác nhau đáng kể. Độ

chuyển dịch hóa học của H-7 và CH2-9 ở chất 6 tại H 5,07; H 4,53 và 3,94

nhưng ở chất 7 tại H 5,94, H 4,07 và 4,28. Độ chuyển dịch hóa học của C-8’

(C 88,2) cho biết nó gắn với một nguyên tử oxy. Phân tích phổ DEPT và các

phổ 2D NMR cho phép xác định được cấu trúc của chất 7. Cấu hình tương đối

của chất đã được thiết lập dựa trên phổ NOESY theo cách đã làm với chất 6

đã xác định được cấu hình tương đối của chất 7 tương tự như chất 6. Tương

tác giữa H-7 và H-7’ trên phổ NOE cho biết 2 vòng furan ghép với nhau theo

dạng cis và 2 vòng thơm có dạng pseudo-equatorial. So sánh chất 7 với một

chất có cấu trúc tương tự và có độ quay cực âm ( -34,6, CHCl3) và có

cấu hình 7S,7’S,8R,8’R có thể xác định chất 7 có cấu hình 7S,7’S,8R,8’R

[68,69] . Kết hợp các dữ liệu cho phép xác định cấu trúc của chất là

7S,7’S,8R,8’R-8,8’-dihydroxy-6-methoxy-3,4:3’,4’-bis(methylenedioxy)-

7,9’:7’,9-diepoxylignan và được gọi là palatiferin B

Asperglaucide (8):

Chất 8 được phân lập dưới dạng tinh thể màu trắng. Điểm nóng chảy

180- 1810C. Phổ 13C NMR và DEPT cho tín hiệu cộng hưởng của 27 cacbon

25

trong đó có 21 cacbon sp2 và 6 cacbon sp3 tương ứng với 1 nhóm metyl, 3

nhóm metylen, 2 nhóm metin bão hoà và 15 nhóm metin thơm, 3 nhóm

cacbonyl và 3 cacbon bậc bốn thơm. Trên phổ khối lượng EIMS pic ion phân

tử xuất hiện ở m/z 444. Các dữ kiện phổ 13C-NMR và EI-MS cho phép xác

định công thức phân tử của chất này là C27H28N2O4. Trên phổ 1H-NMR ở

vùng trường thấp dễ dàng nhận thấy tín hiệu cộng hưởng của 15 proton thơm

(H 7,06-7,72) cho biết trong phân tử có thể có 3 vòng benzen bị thế 1 lần. Tín

hiệu cộng hưởng của 2 proton thuộc 2 nhóm amin bậc hai (>NH) xuất hiện ở

trường khá thấp (H 6,74 và 5,96) cho biết các nhóm amin này thuộc về hai

liên kết amit (-NH-CO-). Các tín hiệu của hai proton của hai nhóm metin xuất

hiện dưới dạng multiplet ở vùng trường khá thấp (H 4,75 và 4,34) chứng tỏ

các nhóm metin này có liên kết với nguyên tố có độ âm điện lớn. Tiếp theo là

tín hiệu của một nhóm metylen có liên kết với oxi xuất hiện dưới dạng 2

double doublet (H 3,94 và 3,82). Một nhóm metylen khác cũng xuất hiện

dưới dạng 2 double doublet (H 3,21 và 3,03). Các proton của nhóm metylen

thứ ba xuất hiện dưới dạng multiplet (H 2,73). Nhóm metyl xuất hiện dưới

dạng singlet (H 2,16) chứng tỏ nó thuộc về một nhóm acetyl (CH3-CO-).

Trên phổ 13C-NMR dễ dàng nhận thấy tín hiệu của 3 nhóm cacbonyl ở vùng

trường thấp trong đó có hai nhóm cacbonyl amit (C 170,63, C-1 và 167,50,

C-1') và một nhóm cacbonyl este (C 171,16, C-3). Ở vùng trường cao hơn có

tín hiệu cộng hưởng của 18 cacbon thơm thuộc 3 vòng benzen (C 127-137).

Tín hiệu của các cacbon còn lại cũng dễ dàng nhận thấy trên phổ. Các tín hiệu

trên phổ 2D NMR cho phép xác định vị trí các nhóm trong phân tử. Từ các dữ

kiện phổ trên cùng với việc tham khảo tài liệu [70] cho phép xác định chất

này là một dipeptide có tên là asperglaucide.

26

Axit pomolic (9):

HO

COOH

HO

1

3

57

9

10

1113

1416

1718

19

20

22

23 24

25 26

27

28

29

30




metylen, 6 nhóm metin trong đó có một nhóm hydroxymetin và 6 cacbon bậc

bốn, một cacbon bậc ba gắn với nhóm hydroxyl (C 78,84) và một nhóm

cacbonyl (C 180,74) . Trên phổ khối lượng EI-MS thấy pic [M-46]+ xuất hiện

ở m/z 426. Các dữ kiện phổ 13C-NMR và EI-MS cho phép xác định công thức

phân tử của chất này là C30H48O4 và cho biết đây là một tritecpen có năm

vòng cùng với một liên kết đôi và hai nhóm hydroxy trong phân tử. Trên phổ

1H-NMR thấy có tín hiệu của một proton olefinic (H 5,29, H-12), một proton

thuộc nhóm hydroxymetin dưới dạng double douplet (H 3,15, H-3) với hằng

số tương tác lớn (J=5,5 và 11.0 Hz) cho biết cấu hình của proton này.

Proton của một nhóm metin xuất hiện dưới dạng singlet (H 2,50, H-18), một

proton khác có dạng double triplet (H 2,43, H-16). Có một nhóm metyl xuất

hiện dưới dạng doublet (H 0,86, H-30) còn các nhóm metyl khác đều xuất

hiện dưới dạng singlet ở vùng trường cao (H 0,70-1,15). Trên phổ 13C-NMR

dễ dàng nhận thấy tín hiệu của nhóm cacbonyl (C 180,74), nối đôi (C 138,01

và 129,05), một nhóm hydroxymetin (C 78,84) và một cacbon bậc ba gắn với

nhóm hydroxyl (C 72,98). Trên phổ HMBC, các tương tác của proton

olefinic (H 5,29) với các cacbon C-11, C-18, C-9, C-14 cho biết vị trí của nối

27

đôi là 12,13. Các tương tác khác trên phổ HMBC cho phép xác định vị trí của

các nhóm trong phân tử. Các dữ kiện phổ cùng với tài liệu tham khảo [71] cho

phép xác định chất này là axit pomolic. Hợp chất này có hoạt tính gây độc tế

bào đối với dòng tế bào biểu mô đốt sống cổ ME-180 và ung thư tế bào có

hắc tố phát triển M-14 [72], đồng thời nó cũng thể hiện hoạt tính chống HIV

[73].

-sitosterol (3) và -sitosterol glucoside (10) được nhận dạng nhờ chấm

so sánh với chất chuẩn trên sắc kí lớp mỏng.

Dữ liệu phổ của các chất:

Lupeol (1) : Tinh thể hình kim màu trắng (CH2Cl2). Điểm nóng chảy 210-

2110.

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) ppm: 0,76 (3H, s, H-24), 0,79 (3H, s, H-28),

0,83 (3H, s, H-25), 0,94 (3H, s, H-27), 0,96 (3H, s, H-23), 1,68 (3H, s, H-30),

2,37 (1H, dt, J=5,5, 11,0 Hz, H-19), 3,18 (1H, quin, J = 5,5 Hz, H-3), 4,56

(1H, m, H-29a), 4,68 (1H, t, J=2,0 Hz, H-29b).

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) ppm: 14,58 (q, C-27), 15,38 (q, C-24), 16,02

(q, C-26), 16,14 (q, C-25), 18,03 (q, C-28), 18,36 (t, C-6), 19,34 (q, C-30),

20,98 (t, C-11), 25,21 (t, C-12), 27,47 (t, C-2), 27,50 (t, C-15), 28,02 (q, C-

23), 29,90 (t, C-21), 34,34 (t, C-7), 35,63 (t, C-16), 37,22 (s, C-10), 38,12 (d,

C-13), 38,76 (t, C-1), 38,89 (s, C-4), 40,04 (t, C-22), 40,89 (s, C-8), 42,88 (s,

C-14), 43,03 (s, C-17), 48,02 (d, C-19), 48,37 (d, C-18), 50,50 (d, C-9), 55,36

(d, C-5), 79,04 (d, C-3), 109,33 (t, C-29), 150,98 (s, C-20). EI-MS (70 eV)

m/z (%):426 ([M]+., 5,1), 411 (2,0), 315 (1,8), 257 (1,4), 207 (85,5), 189

(99,9), 135 (81,1), 121 (85,6), 109 (95,7), 95 (100), 69 (73,6), 55 (71,7).

Betulin (2) : Tinh thể hình kim màu trắng (CH2Cl2). Điểm nóng chảy 248-

2490C.

28


0,97 (3H, s, H-23), 0,98 (3H, s, H-27), 1,02 (3H, s, H-26), 1,68 (3H, s, H-30),

2,38 (1H, dt, J=6,0, 11,0 Hz, H-19), 3,18 (1H, m, H-3), 3,33 (1H, dd, J=10,5,

3,0 Hz, H-28b), 3,80 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-28a), 4,57 (1H, t, J=1,0 Hz, H-

29a), 4,68 (1H, d, J=2,0 Hz, H-29b).


(q, C-26), 16,11 (q, C-25), 18,33 (t, C-6), 19,10 (q, C-30), 20,86 (t, C-11),

25,26 (t, C-12), 27,09 (t, C-15), 27,42 (t, C-2), 28,00 (q, C-23), 29,21 (t, C-

16), 29,80 (t, C-21), 33,99 (t, C-22), 34,28 (t, C-7), 37,19 (s, C-10), 37,35 (d,

C-13), 38,74 (t, C-1), 38,89 (s, C-4), 40,96 (s, C-8), 42,75 (s, C-14), 47,81 (s,

C-17, C-19), 48,81 (d, C-18), 50,44 (d, C-9), 55,33 (d, C-5), 60,58 (t, C-28),

79,00 (d, C-3), 109,68 (t, C-29), 150,48 (s, C-20). EI-MS (70 eV) m/z

(%):442 ([M]+., 2,3), 411 (4,9), 234 (4,3), 203 (74,1), 189 (93,2), 175 (39,8),

147 (43,8), 135 (64,8), 107 (6,7), 95 (100), 69 (65,7), 55 (69,2).

Lupenone (4): Tinh thể hình kim màu trắng (CH2Cl2). Điểm nóng chảy 164-

1650C.


0,95 (3H, s, H-27), 1,02 (3H, s, H-24), 1,07 (6H, s, H-23 và H-26), 1,68 (3H,

s, H-30), 1,87-1,97 (2H, m, H-1a và H-21a), 2,40 (2H, m, H-2), 2,46 (1H, m,

H-19), 4,57 (1H, q, J=1,0 Hz, H-29a), 4,68 (1H, d, J=2,0 Hz, H-29b).


(q, C-25), 18,03 (q, C-28), 19,33 (q, C-30), 19,71 (t, C-6), 21,05 (q, C-24),

21,50 (t, C-11), 25,20 (t, C-12), 26,68 (q, C-23), 27,46 (t, C-15), 29,87 (t, C-

21), 33,60 (t, C-7), 34,17 (t, C-2), 35,55 (t, C-16), 36,91 (s, C-10), 38,21 (d,

C-13), 39,65 (t, C-1), 40,00 (t, C-22), 40,82 (s, C-8), 42,93 (s, C-14), 43,02 (s,

C-17), 47,35 (s, C-4), 47,98 (d, C-19), 48,28 (d, C-18), 49,83 (d, C-9), 54,97

(d, C-5), 109,40(t, C-29), 150,89 (s, C-20), 218,12 (d, C-3). ESI-MS m/z: 425

([M+H+).

29

Epifriedelanol (5):

Tinh thể hình kim màu trắng (CH2Cl2/MeOH), điểm nóng chảy 281-2820C.

IR (KBr) max cm-1: 3474, 2931, 2865, 1451, 1384.

1H NMR (500 MHz, CDCl3): H 0,86 (3H, s, H-25), 0,94 (3H, s, H-29+H-24),

0,96 (3H, s, H-27), 0,99 (6H, s, H-26 và H-28), 0,99 (3H, d, J=6,5 Hz, H-23),

1,17 (3H, s, H-30), 1,73 (1H, dt, J= 12,5; 3,0 Hz H-6a), 1,91 (1H, dt, J=10,0;

2,5 Hz, H-2a), 3,73 (1H, bd, J=1,5 Hz, H-3);

13C NMR (125 MHz, CDCl3): C 11,62 (C-23), 15,83 (C-1), 16,41 (C-24),

17,58 (C-7), 18,27 (C-25), 18,65 (C-27), 20,13 (C-26), 28,10 (C-20), 30,06

(C-17), 30,67 (C-12), 31,81 (C-30), 32,38 (C-15), 32,88 (C-21), 32,12 (C-

28), 35,03 (C-29), 35,25 (C-2), 35,38 (C-19), 35,61 (C-11), 36,13 (C-16),

37,16 (C-9), 37,89 (C-5), 38,42 (C-14), 39,31 (C-22), 41,79 (C-6), 39,72 (C-

13), 42,90 (C-18), 49,24 (C-4), 53,25 (C-8), 61,42 (C-10), 72,78 (C-3).

EIMS m/z (%): 428 ([M]+., 52), 413 ([M-CH3]+, 38), 275 (46), 234 (47), 206

(43), 179 (29), 165 (100), 125 (47), 109 (47), 96 (71), 69 (38).

Palatiferin A (6): Tinh thể màu vàng nhạt, nóng chảy ở 103- 104°C; Rf 0.62,

silica gel 60 F254, n-hexane/CH2Cl2/acetone (1/1/0.5); [α]D 30+ 28.2 (c 0.71,

CHCl3), UV (MeOH): λmax (log ε) = 284 (3.2), 215 (3.8); IR (KBr): νmax =

3427, 2926, 1631, 1471, 1344, 1262, 1034, 808, 560 cm−1; positive EI-MS:

m/z = 400 [M]+; positive HR-EIS-MS: m/z = 423.1064 [M + Na]+ (công thức

phân tử tính là C21H20O8Na 423.1056).

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) ppm: 6,92 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2); 6,83 (1H,

d, J = 8,0 Hz, H-5); 6,87 (1H, dd, J = 8,0; 1,5 Hz, H-6); 4,79 ((1H, s, H-7);

3,92 (1H, d, J = 1,5 Hz, Hα-9); 4,04 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-9); 5,92 (1H, d, J

= 1,0 Hz, H-10); 6,52 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 6,96 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-

6’); 5,07 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-7’), 2,93 (1H, m, H-8’); 4,53 (1H, dd, J = 9,5;

30

8,5 Hz, Hα-9’); 3,94 (1H, dd, J = 9,5; 5,5 Hz, H-9’); 5,97 (1H, s, H-10’);

4,01 (3H, s, OMe); 1,65 (1H, s, OH).

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) ppm: 129,4 (C-1); 107,4 (C-2); 148,1 (C-3);

147,8 (C-4); 108,5 (C-5); 120,1 (C-6); 86,9 (C-7); 91,2 (C-8); 74,4 (C-9);

101,0 (C-10); 126,5 (C-1’); 140,6 (C-2’); 136,2 (C-3’); 149,1 (C-4’); 102,1

(C-5’); 118,7 (C-6’); 82,4 (C-7’); 60,2 (C-8’); 72,7 (C-9’); 101,2 (C-10’);

59,4 (-OCH3).

Palatiferin B (7): Tinh thể màu vàng nhạt, nóng chảy ở 167-169°C, Rf 0.49,

silica gel 60 F254, n-hexane/CH2Cl2/acetone (1/1/0.5); [α]D 30 − 53.0 (c 0.28,

CHCl3), UV (MeOH): λmax (log ε) = 284 (3.6), 213 (4.3); IR (KBr): νmax =

3446, 2884, 1629, 1495, 1440, 1243, 1041, 928, 778 cm−1; positive EI-MS:

m/z = 416 [M]+; positive HR-EI-MS: m/z = 439.1007 [M]+ (công thức tính

được là C21H20NaO9 439.1005).

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) ppm: 6,91 (1H, br.s, H-2); 6,81 (1H, d, J = 8,0

Hz, H-5); 6,84 (1H, br.d, J = 8,0; H-6); 4,91 ((1H, s, H-7); 4,06 (2H, m, H-9);

5,95 (1H, s, H-10); 6,57 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’); 6,94 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-

6’); 5,94 (1H, s, H-7’), 4,07 (1H, d, J = 10,0; Hz, Hα-9’); 4,28 (1H, d, J =

10,0 Hz, H-9’); 5,95 (1H, s, H-10’); 4,03 (3H, s, OMe); 2,65 (1H, s, 8’-OH);

2,66 (1H, s, 8-OH).

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) ppm: 130,1 (C-1); 107,8 (C-2); 147,8 (C-3);

147,6 (C-4); 108,2 (C-5); 120,5 (C-6); 86,0 (C-7); 88,1 (C-8); 76,1 (C-9);

101,1 (C-10); 121,3 (C-1’); 140,5 (C-2’); 136,3 (C-3’); 149,7 (C-4’); 102,8

(C-5’); 120,3(C-6’); 84,7 (C-7’); 88,2 (C-8’); 77,0 (C-9’); 101,2 (C-10’); 59,6

(-OCH3).

Asperglaucide (8): Điểm nóng chảy 180-1810C.

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) ppm: 2,04 (3H, s, OCOCH3), 2,75 (2H, m,

CH2-b’), 3,05 (1H, dd, J=13,5; 8,5 Hz, H-b), 3,21 (1H, dd, J=13,5; 6,0 Hz, H-

31

b), 3,82 (1H, dd, J = 11,5; 4,5 Hz, H-2), 3,92 (1H, dd, J=11,5; 5 Hz, H-2),

4,34 (1H, m, H-a’), 4,75 (1H, m, H-a’), 5,96 (1H, d, J=8,5 Hz, NH-a’), 6,73

(1H, d, J=7,5 Hz, NH-a),7,06 (2H, dd, J=6,6 Hz, H-d + H-h), 7,11-7,18 (3H,

m, H-e + H-f + H-g), 7,21-7,30 (5H, m. H-d’ + H-e’ + H-f’ + H-g’ + H-h’),

7,43 (2H, t, J=7,3 Hz, H-4’ + H-6’), 7,52 (1H, td, J=7,3 ; 1,2 Hz, H-5’) ; 7,70

(2H, dd, J= 7,3 ; 1,2 Hz, H-3’ + H-7’).

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) ppm: 2,18 (s, C-4), 37,84 (t, C-b’), 38,81 (t,

C-b), 49,85 (d, C-a’); 55,39 (d, C-a); 64,97 (t, C-2), 128,98 (d, C-f), 127,44

(d, C-3’ + C-7’), 128,98 (d, C-e’ + C-g’), 129,03 (d, C-e + C-g), 129,16 (d, C-

4’ + C-6’), 129,52 (d, C-d’ + C-h’), 129,68 (d, C-d + C-h), 132,31 (d, C-5’),

134,06 (s, C-2’), 137,01 (s, C-c’), 137,08 (s, C-c), 167,50 (s, C-1’), 170,63 (s,

C-1), 171,16 (s, C-3).

ESI-MS m/z: 445 [M+H]+.

Axit pomolic (9): Tinh thể hình kim màu trắng (CH2Cl2). Điểm nóng chảy

290-2910C.

1H-NMR (CDCl3+MeOD, 500 MHz) ppm: 0,70 (3H, s, H-26), 0,72 (3H, s,

H-24), 0,85 (3H, s, H-25), 0,89 (3H, d, J=6,5 Hz, H-30), 0,92 (3H, s, H-23),

1,15 (3H, s, H-29), 1,20 (3H, s, H-27), 1,91 (2H, m, H-11), 2,43 (1H, dt,

J=4,5, 12,8 Hz, H-16), 2,5 (1H, brs, H-18), 3,14 (1H, dd, J=5,5, 11,0 Hz, H-

3), 5,29 (1H, t, J=8,5 Hz, H-12).

13C-NMR (CDCl3+MeOD, 125 MHz) ppm: 15,10 (q, C-25), 15,43 (q, C-

24), 15,98 (q, C-30), 16,46 (q, C-26), 18,34 (t, C-6), 23,57 (t, C-11), 24,32 (q,

C-27), 25,42 (t, C-16), 25,93 (t, C-21), 26,79 (t, C-2), 27,10 (q, C-29), 27,92

(q, C-23), 28,12 (t, C-15), 32,72 (t, C-7), 36,87 (s, C-10), 37,46 (t, C-1), 38,39

(s, C-4), 38,61 (t, C-22), 39,82 (s, C-8), 41,05 (s, C-14), 41,10 (t, C-20), 47,11

(s, C-17), 47,47 (d, C-9), 53,09 (d, C-18), 55,07 (d, C-5), 72,98 (s, C-19),

78,84 (d, C-3), 129,05 (d, C-12), 138,01 (s, C-13), 180,74 (s, C-28). EI-MS

32

(70 eV) m/z (%):426 ([M-46]+, 4,9 %), 354 (3,2), 246 (10,5), 190 (32,5), 146

(100), 119 (34,8), 105 (37,9), 69 (50,6), 55 (81,5).

Nghiên cứu thành phần tritecpen của cây Hoàn Ngọc 1-2 năm và 3-4

năm tuổi:

Tiến hành phương pháp chiết xuất và phân lập chất tương tự như đã làm

với rễ cây Hoàn Ngọc 5-7 năm tuổi, chúng tôi xác định được thành phần

chính của các rễ này cũng tương tự như rễ cây 5-7 năm tuổi chỉ khác nhau về

hàm lượng các chất tuy nhiên không đáng kể.

Kết quả nghiên cứu với 1,0 kg nguyên liệu khô được trình bày trong bảng

sau:

Stt Khối lượng Hàm lượng

1-2 năm 3-4 năm 1-2 năm 3-4 năm

Lupeol 5,5 g 5,6 g 0,55% 0,56%

Betulin 3,7 g 3,5 g 0,37% 0,35%

-sitosterol 0,75 g 0,8 g 0,075% 0,08%

-sitosterol glucoside 0,2 g 0,15 g 0,02% 0,015%

Lupenone 10 mg 12 mg 0,001% 0,0012%

Epifriedelanol 8 mg 6 mg 0,008% 0,006%

Như vậy, thành phần chính của rễ cây Hoàn Ngọc ở các độ tuổi khác nhau

là tương tự nhau về thành phần và hàm lượng.

3.3 Nghiên cứu quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc :

3.3.1 Nghiên cứu quy trình chiết xuất:

Nguyên liệu đã được ngâm chiết thử với nhiều loại dung môi để lựa chọn

dung môi chiết xuất được tổng tritecpen với hiệu suất cao nhất và thuận lợi

33

cho quá trình tinh chế về sau. Chúng tôi đã sử dụng các loại dung môi: n-

hexan, n-hexan/diclometan (1:1), n-hexan/axeton (8:2) và 100% diclometan.

Kết quả cho thấy khi ngâm chiết bằng 100% n-hexan sau khi cất loại

dung môi thu được cặn chiết dạng bột màu vàng, chiết bằng n-

hexan/diclometan (1:1) thu được cặn chiết màu vàng xanh hơi keo, chiết bằng

n-hexan/axeton (4:1) cho cặn chiết keo màu xanh đen còn khi chiết với 100%

diclometan thì thu được cặn chiết keo màu xanh đen.

Kết quả cụ thể khối lượng cặn chiết thu được cho 1kg nguyên liệu ngâm

trong các hệ dung môi, mỗi dung môi ngâm 4 lần (lần đầu 3,5 L, mỗi lần sau

2 L) như sau:

Dung môi dùng để

ngâm chiết

Loại rễ nguyên liệu

Loại 1 (1-2 năm) Loại 2 (3-4 năm) Loại 3 (5-7 năm)

n-hexan 7,50 g chất bột màu

vàng

7,6 g chất bột màu

vàng

7,8 g chất bột

màu vàng

n-hexan/CH2Cl2

(1:1)

8,76 g chất hơi keo

màu vàng xanh

8,89 g chất hơi keo

màu vàng xanh

8,94 g chất hơi

keo màu vàng

xanh

n-hexan/axeton

(8:2)

9,40 chất keo màu

xanh đen

9,60 g chất keo

màu xanh đen

9,65 g chất keo

màu xanh đen

CH2Cl2 9,50g chất keo màu

xanh đen

9,40 g chất keo

màu xanh đen

9,75 g chất keo

màu xanh đen

Kết quả khảo sát sắc ký lớp mỏng có so sánh với các chất chuẩn cho biết

thành phần chính của các cặn chiết thu được khi chiết bằng các dung môi như

trên là hai tritecpen lupeol và betulin. Ngoài ra còn có một số chất khác nhưng

rất ít so với hai chất chính. Như vậy, hệ dung môi n-hexan/axeton (1:4) và

CH2Cl2 100% cho khối lượng chiết tổng tritecpen thô từ rễ cây Hoàn Ngọc

tương đương nhau và cao hơn chiết bằng n-hexan 100% và n-

hexan/diclometan (1:1).

34

Sản phẩm tổng tritecpen thô được nghiên cứu tinh chế bằng cách rửa với

etanol 96% và hỗn hợp etanol 96%/axeton (1:1). Hỗn hợp tổng tritecpen thô

được hòa trong etanol 96%, lọc lấy phần không tan rồi tiếp tục rửa lại với

etanol 96% như trên để thu được phần tổng tritecpen màu trắng ngà. Các dịch

etanol sau khi lọc được gộp lại và cất loại dung môi để thu được cặn chiết keo

màu xanh đen. Cặn này tiếp tục được rửa bằng hỗn hợp etanol 96%/axeton

(1:1) theo cách tương tự rửa với etanol 96% để thu được phần tritecpen sạch

còn lại

Kết quả cho thấy, đối với cao chiết bằng n-hexan 100% chỉ cần rửa 2-3

lần với etanol 96% đã thu được tổng tritecpen dạng bột màu trắng ngà. Với

cao chiết bằng các dung môi khác n-hexan/diclometan (1:1), n-hexan/axeton

(4:1) và diclometan 100% sau khi rửa bằng etanol 96% cần phải rửa lại bằng

hỗn hợp etanol 96%/axeton (1:1) mới thu được sản phẩm có chất lượng giống

như sản phẩm thu được khi chiết bằng hexan và rửa bằng etanol.

Sau khi tinh chế thì từ cặn chiết với n-hexan cho khối lượng tổng tritecpen

sạch cao nhất (~5 g/1kg nguyên liệu). Các cặn chiết khác có chứa keo nên khó

tinh chế hơn và hiệu suất thu tổng tritecpen từ cặn chiết thô thấp hơn (2 - 4 g).

Qua kết quả nghiên cứu trên chúng tôi quyết định lựa chọn n-hexan

làm dung môi để chiết xuất tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc và etanol làm

dung môi để tinh chế tổng tritecpen thô sau khi chiết.

Quy trình chiết xuất và tinh chế như sau:

Rễ cây đã sấy khô, nghiền nhỏ

Ngâm chiết với n-hexan Dịch chiết

Cất loại dung môi

Dung môi

Cao chiết

Phần không tan

Rửa bằng etanol 96% Lọc hút

Sản phẩm Sấy khô ở 50oC

35

3.3.2 Nghiên cứu quy trình chiết xuất tổng tritecpen từ cây Hoàn Ngọc với

quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ:

Từ các kết quả nghiên cứu chiết xuất tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc ở quy

mô nhỏ, chúng tôi đã nghiên cứu và nâng quy mô chiết xuất lên 0,5 kg sản

phẩm trên mẻ theo sơ đồ sau:

Quy trình trên có độ lặp lại tương đối ổn định. Chúng tôi đã sản xuất 1 kg

sản phẩm theo quy trình trên. Mẻ 1 từ 100 kg nguyên liệu chúng tôi thu được

495 g sản phẩm. Mẻ 2 từ 100 kg nguyên liệu thu được 510 g sản phẩm.

3.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của sản phẩm tổng tritecpen thu được:

Sản phẩm tổng tritecpen (1,0 g) được phân tách bằng phương pháp sắc ký

cột trên chất hấp phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-

hexan/diclometan (98:2 - 0:100) để thu được 6 nhóm phân đoạn kí hiệu F1-

Cặn chiết

Rễ cây đã sấy khô, nghiền nhỏ

(100 kg)

Ngâm chiết với n-hexan (400 L) Dịch chiết


Dung môi

Hòa rửa với etanol 96% (3 lần) Phần không tan

Dịch lọc hút

Cặn


Hòa với etanol 96%, lọc hút (2-3 lần)

Sản phẩm (~ 0,5 kg)

Sấy khô ở 50 oC

36

F5. Nhóm phân đoạn F1+F2 được tinh chế lại bằng sắc ký cột trên chất hấp

phụ silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/etyl axetat (95:5) thu được

các chất lupenone (4, 5mg) và epifriedelanol (5, 4 mg) và chất màu (~ 10

mg). Nhóm phân đoạn F3-F6 lần lượt được kết tinh trong hệ dung môi

diclometan/metanol (9:1) để thu được các chất lupeol (1, 570 mg), betulin (2,

320 mg ), -sitosterol (3, 70 mg ), -sitosterol glucoside (10, 20 mg).

Như vậy trong sản phẩm tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc gồm có

khoảng lupeol (~57%), betulin (~32%), -sitosterol (~8%), -sitosterol

glucoside (~1%) và các thành phần khác (~2%) bao gồm lupenone (~0,5%),

epifriedelanol (~0,4%) và chất màu (~1,1%).

3.4 Nghiên cứu tính an toàn tiền lâm sàng của sản phẩm tổng tritecpen từ

rễ cây Hoàn Ngọc:

Độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của sản phẩm tổng tritecpen từ rễ

cây Hoàn Ngọc (ký hiệu là Tritecpen-HN) được thử tại phòng thử nghiệm

hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

3.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm:

Nội dung thực hiện: Xác định độ độc cấp của hoạt chất Tritecpen-HN thông

qua liều gây chết 50% động vật thí nghiệm LD50 (Lethal Dose).

3.4.1.1 Vật liệu và phương pháp:

Vật liệu:

Động vật: chuột BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, được nuôi tại

khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học. Chuột được cho ăn thức ăn

tiêu chuẩn và nước uống tự do.

Dụng cụ thí nghiệm: kim uống và các thiết bị phụ trợ khác.

Phương pháp:

Phương pháp thử độc cấp tính của Tritecpen-HN:

37

40 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuôi tại khu nuôi động vật của Viện

Công nghệ Sinh học, được chia làm 5 lô (8 chuột/lô), và bị bỏ đói hoàn toàn

16 h trước khi cho uống hoạt chất Tritecpen-HN. Hoạt chất Tritecpen-HN

được cho uống một lần duy nhất ở các ở nồng độ 1000, 2000, 3000, 4000 và

5000 mg/kg thể trọng (kgP) tương ứng với 5 lô thí nghiệm. Sau khi cho uống

hoạt chất 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự

do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô

sau khi cho uống Tritecpen-HN và tính giá trị LD50 (Abraham, 1978; Turner,

1965).

k-1

LD50= Xk - d/2 - d/n x mi

i=2

Trong đó: LD50: liều chết 50% động vật thí nghiệm

n: số động vật sử dụng trong từng lô thí nghiệm

k: số lô động vật

mi: số động vật chết đếm theo từng lô trong 72 giờ

d: khoảng cách giữa các mức liều

Xk: liều thuốc thấp nhất gây chết 100% động vật thí nghiệm

Phương pháp xử lí số liệu :

Các số liệu được xử lí trên Excel, thuật toán thống kê student t’ test và

F’test

3.4.1.2 Kết quả và thảo luận:

Kết quả xác định khả năng gây độc cấp tính của Tritecpen-HN:

Độc tính cấp của Tritecpen-HN được tiến hành theo phương pháp của

Abrham (1978) như đã mô tả trong phần phương pháp. Sau khi cho uống hoạt

chất Tritecpen-HN, chuột được theo dõi liên tục trong vòng 24 giờ đối với các

biểu hiện chức năng, đồng thời đếm số lượng chuột chết ở từng lô trong vòng

38

72 giờ. Kết quả thu được về tính độc cấp của Tritecpen-HN được trình bày ở

bảng 3.1.

Bảng 3.1: Độc tính cấp của Tritecpen-HN trên chuột thí nghiệm

Lô

Uống

Tritecpen-HN

(mg/kgP/lần)

Số chuột chết/tổng

số chuột thí nghiệm

sau 72 giờ

Biểu hiện chức năng trong vòng

24 giờ

1 1000 0/0 chuột khoẻ mạnh, di chuyển và ăn

uống bình thường









Kết quả trên cho thấy, không có con chuột nào bị chết ở tất cả các nồng

độ thử mặc dù nồng độ chất thử là rất cao. Liều 5000 mg/kgP/lần có thể nói là

liều tối đa có thể cho chuột uống đối với hoạt chất Tritecpen-HN do chúng tôi

không thể pha hoạt chất này ở nồng độ cao hơn nữa vì đây là thể tích tối đa

mà chuột có thể uống cho một lần thí nghiệm.

Với kết quả như trên, chúng tôi kết luận là không thể xác định được liều

độc cấp gây chết 50% động vật thí nghiệm (hay chưa xác định giá trị LD50).

Có thể nói theo tiêu chuẩn an toàn độc tính của OECD đối với hoạt chất có

nguồn gốc tự nhiên thì mẫu Tritecpen-HN không có độc tính cấp.

3.4.1.3 Kết luận:

Tritecpen-HN không gây độc tính cấp trên chuột thực nghiệm (theo tiêu

chuẩn của tổ chức OECD).

3.4.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn của sản phẩm:

39

Các nội dung thực hiện:

Nghiên cứu tính độc bán trường diễn 1 tháng của hoạt chất Tritecpen-HN

trên chuột BALB/c được đánh giá thông qua:

- Theo dõi biểu hiện bên ngoài của động vật thí nghiệm.

- Sự tăng khối lượng chuột thí nghiệm .

- Sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học, chỉ tiêu sinh hoá máu từ

đó đánh giá chức năng gan, thận.


Vật liệu:

Động vật: chuột BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, được nuôi tại

khu nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học. Chuột được cho ăn thức ăn



Phương pháp:

a) Phương pháp nghiên cứu độc tính bán trường diễn:

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 1 tháng được tiến hành theo phương

pháp của Bergmeyer (1974). Bao gồm nghiên cứu sự thay đổi của lông, theo

dõi về khả năng thu nhận thức ăn, khả năng di chuyển so với lô đối chứng,

nghiên cứu quá trình thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm cũng như ảnh

hưởng của hoạt chất nghiên cứu lên một số chỉ tiêu huyết học, ảnh hưởng đến

chức năng gan, thận. Theo đó 18 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuôi tại khu nuôi

động vật của Viện Công nghệ Sinh học, được chia làm 3 lô (8 chuột/lô).

Lô 1: cho uống bột ăn liền (dung môi hòa tan mẫu) 0,3ml/con/ngày.

Lô 2: cho uống hoạt chất Tritecpen-HN (pha trong bột ăn liền) ở

nồng độ 500 mg/kgP/ngày, với thể tích 0,3ml/con/ngày.

Lô 3: cho uống hoạt chất Tritecpen-HN (pha trong bột ăn liền)

1000mg/kgP/ngày với thể tích 0,3ml/con/ngày.

40

Thời gian cho uống là 1 tháng, hàng ngày theo dõi chuột, đồng thời cân

khối lượng chuột thí nghiệm 5 ngày/lần để theo dõi quá trình tăng khối lượng

và qua đó đánh giá được tính độc khi cho uống bán trường diễn 1 tháng.

b) Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học và hóa

sinh khi cho chuột uống Tritecpen-HN bán trường diễn 1 tháng

Chuột trước và sau khi cho uống Tritecpen-HN bán trường diễn 1 tháng

được lấy máu (mỗi lô chọn ngẫu nhiên 2 con) để làm các xét nghiệm sinh hoá

máu gồm các chỉ tiêu: số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin,

hoạt độ các enzyme creatine phosphokinase (CPK), serum glutamic

oxaloacetic transaminase (SGOT), serum glutamic purivic transaminase

(SGPT) để đánh giá chức năng gan, thận theo phương pháp của Bergmeyer

(1974).


Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn:

Chuột ở các lô thí nghiệm được theo dõi biểu hiện bên ngoài như hiện

tượng xù lông, khả năng di chuyển, khả năng phản xạ ánh sáng, âm thanh, khả

năng thu nhận thức ăn, sự chết (nếu có). Bên cạnh đó, chúng tôi còn cân khối

lượng của chuột ở các thời điểm 0, 5, 10, 15, 20, 25 và 30 ngày thí nghiệm để

xác định ảnh hưởng của Tritecpen-HN lên sự tăng trọng lượng của chuột thí

nghiệm. Đồng thời, trước khi thí nghiệm và sau 30 ngày thí nghiệm, chuột ở

các lô được thu mẫu máu để kiểm tra các chỉ tiêu huyết học và sinh hoá (do

điều kiện có hạn nên mỗi lô chúng tôi chỉ chọn ngẫu nhiên 3 con để làm các

xét nghiệm).

Kết quả theo dõi biểu hiện bên ngoài:

Theo dõi sự biểu hiện chức năng của chuột thí nghiệm, chúng tôi nhận

thấy chuột ở lô 2 uống Tritecpen-HN liều 1000 mg/kgP/ngày có hiện tượng

xù lông, đã có 2 con bị chết (ở thời điểm 27 và 29 ngày thí nghiệm). Chuột

41

uống Tritecpen-HN các liều còn lại không có hiện tượng xù lông, không bị

chết, di chuyển nhanh nhẹn, khả năng thu nhận thức ăn rất tốt, khả năng phản

xạ ánh sáng và âm thanh bình thường. Như vậy, hoạt chất Tritecpen-HN ở các

liều ≥ 1000 mg/kgP/ngày có thể gây ảnh hưởng đến động vật khi cho uống dài

ngày. Có thể nói liều 1000 mg/kgP/ngày khi cho uống liên tục 30 ngày là mức

liều rất cao. Ngoài ra, đây là kết quả nghiên cứu ban đầu và trên số lượng

chuột còn thấp. Vì thế, tìm hiểu kĩ hơn nguyên nhân hoặc cơ chế gây độc bán

trường diễn của Tritecpen-HN thì chúng tôi cần các thử nghiệm ở qui mô lớn

hơn và thời gian lâu hơn.

Kết quả tăng khối lượng của chuột thí nghiệm:

Không chỉ có theo dõi biểu hiện bên ngoài của chuột thí nghiệm, chúng tôi

còn theo dõi sự thay đổi khối lượng của chuột trong quá trình thí nghiệm. Kết

quả về khối lượng của chuột thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2: Khối lượng chuột thí nghiệm khi cho uống Tritecpen-HN

bán trường diễn 1 tháng

Nồng độ 0 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày

(ĐC) 25,23 ± 0,26

25,95 ± 1,08

27,28 ± 0,57

27,60 ± 0,62

27,95 ± 0,39

28,15 ±0,26

28,43 ± 1,08

500

mg/kgP/ngày 24,55 ± 0,42

24,78 ± 0,26

25,58 ± 0,51

25,95 ± 0,40

26,23 ± 0,66

26,50 ± 0,82

27,25 ±1,04

1000

mg/kgP/ngày 25,48 ± 0,21

25,75 ± 0,25

26,18 ± 0,63

25,68 ± 1,18

25,30 ± 0,69

24,23 ± 0,91

23,13 ± 0,21

Bảng 3.2 cho thấy sau 1 tháng uống Tritecpen-HN nồng độ 500

mg/kgP/ngày, chuột có sự tăng khối lượng so với trước khi thí nghiệm, so với

đối chứng sự tăng này là không có sự sai khác thống kê (p>0,05). Nhưng sau

1 tháng uống Tritecpen-HN nồng độ 1000 mg/kgP/ngày, chuột lại có sự giảm

khối lượng và so với trước khi thí nghiệm, và so với đối chứng sự giảm này là

có sự sai khác thống kê (p<0,05), ở nồng độ 1000 mg/kgP/ngày còn bị chết 2

42

con/6 con. Như vậy, sau khi cho uống Tritecpen-HN bán trường diễn 1 tháng

ở nồng độ 500 mg/kgP/ngày, không ảnh hưởng đến sự tăng khối lượng động

vật thí nghiệm. Tritecpen-HN bán trường diễn 1 tháng ở nồng độ 1000

mg/kgP/ngày thì ảnh hưởng đến sự tăng khối lượng động vật thí nghiệm.

Một lần nữa chúng tôi khẳng định rằng liều 1000 mg/kgP/ngày khi cho

uống liên tục 30 ngày là mức liều rất cao. Ngoài ra, đây là kết quả nghiên cứu

ban đầu và trên số lượng chuột còn thấp. Vì thế, tìm hiểu kĩ hơn nguyên nhân

hoặc cơ chế gây độc bán trường diễn của Tritecpen-HN thì chúng tôi cần các

thử nghiệm ở qui mô lớn hơn và thời gian lâu hơn.

Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa máu chuột thí nghiệm khi

cho uống bán trường diễn 1 tháng:

Để đánh giá ảnh hưởng của việc cho uống Tritecpen-HN bán trường diễn

thì trước khi thí nghiệm và sau 30 ngày thí nghiệm chuột ở các lô được lấy

máu để xét nghiệm. Kết quả xét nghiệm các chỉ tiêu về số lượng hồng cầu,

bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin đồng thời hoạt độ các enzym creatin

phosphokinase (CPK), serum glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT),

serum glutamic purivic transaminase (SGPT) được trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu sau khi cho uống Tritecpen-HN

bán trường diễn 1 tháng so với trước khi thí nghiệm

Các chỉ tiêu ĐC Liều 500

mg/kgP/ngày

Liều 1000

mg/kgP/ngày

Hồng cầu

(106/L) -0,12 ± 0,14 -0,19 ± 0,00 -0,25 ± 0,09

Bạch cầu

(103/L) 6,90 ± 1,13 6,65 ± 0,78 6,95 ± 0,78

Tiểu cầu

(103/L) -9,50 ± 0,36 -11,00 ± 1,41 -13,50 ± 1,19

Hemoglobin -0,20 ± 0,00 -0,25 ±0,21 -0,35 ± 0,35

43

(g/dL)

SGOT

(U/L) 5,50 ± 2,12 5,00 ±1,41 7,00 ± 1,24

SGPT (U/L) 6,50 ± 0,36 6,00 ± 0,24 7,00 ± 0,83

Creatin

(minimol/L) 0,50 ± 0,11 4,00 ± 0,24 11,00 ± 0,00

Bảng 3.3 cho thấy:

Chỉ tiêu hồng cầu, tiểu cầu, hemoglobin sau khi uống Tritecpen-HN bán

trường diễn 1 tháng bị giảm so với trước khi thí nghiệm, điều này chứng tỏ

Tritecpen-HN có thể ảnh hưởng đến 2 chỉ tiêu này nhưng so với lô đối chứng

(không sử dụng Tritecpen-HN) thì không có sự sai khác. Chỉ tiêu bạch cầu

tăng so với trước khi thí nghiệm và so với lô đối chứng âm thì sự tăng này là

không có sự sai khác. Điều này chứng tỏ Tritecpen-HN bán trường diễn ở liều

500 và 1000mg/kgP/ngày không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu hồng câu, bạch

cầu, tiểu cầu và hemoglobin so với đối chứng

Chỉ tiêu hoạt độ các enzym (SGOP, SGPT) sau 30 ngày thí nghiệm ở lô

được sử dụng Tritecpen-HN liều 500 và 1000 mg/kgP/ngày so với đối chứng

là không có sự sai khác. Trong khi đó, chỉ tiêu Creatine ở lô được sử dụng

Tritecpen-HN liều 500 và 1000 mg/kgP/ngày so với đối chứng là có sự sai

khác Như vậy, việc sử dụng Tritecpen-HN liều 500 và 1000 mg/kgP/ngày bán

trường diễn trên chuột thí nghiệm có thể gây ảnh hưởng tới chức năng thận

động vật thí nghiệm.


Tritecpen-HN có khả năng gây độc bán trường diễn ở mức liều cao là ≥

1000 mg/kgP/ngày. Ở mức liều trung bình và thấp là 500 mg/kgP/ngày,

hoạt chất này không gây độc bán trường diễn trong khoảng thời gian nghiên

cứu 30 ngày, không ảnh hưởng đến các chỉ tiêu huyết học và một số enzyme

chức năng gan, thận là SGPT, SGOT và Creatinin.

44

3.5 Nghiên cứu khả năng kháng u của sản phẩm tritecpen từ rễ cây

Hoàn Ngọc:

Khả năng kháng u của sản phẩm tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc (ký

hiệu là Tritecpen-HN) được thử tại phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học, Viện

Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


Nghiên cứu khả năng kháng u của hoạt chất Tritecpen-HN trên chuột gây

u thực nghiệm bằng dòng tế bào LLC (Lewis Lung Carcinoma):

Nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển khối u sơ cấp của hoạt chất

Tritecpen-HN.

Nghiên cứu khả năng kéo dài tuổi thọ của hoạt chất Tritecpen-HN

trên chuột bị gây u.

Nghiên cứu khả năng chống khối u ung thư di căn của hoạt chất

Tritecpen-HN bằng trực quan và mô bệnh học trên chuột gây u thực

nghiệm

Nghiên cứu ảnh hưởng của Tritecpen-HN đối với sự thay đổi một số

chỉ tiêu huyết học, chỉ tiêu sinh hoá máu từ đó đánh giá chức năng

gan, thận.

3.5.1. Vật liệu và phương pháp:

a) Vật liệu:

Động vật: chuột BALB/c khoẻ mạnh, không mắc bệnh, được nuôi tại khu

nuôi động vật của Viện Công nghệ sinh học. Chuột được cho ăn thức ăn



Tế bào: Dòng tế bào gây ung thư di căn mạnh LLC (Lewis lung

carcinoma) được sử dụng để gây ung thư cho chuột (do TS. Jeanette

Maier, Trường Đại học Milan, Ý cung cấp).

45

b) Phương pháp:

Phương pháp gây u cho chuột bằng dòng tế bào LLC:

Tế bào LLC được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết

thanh phôi bò và 1% kháng sinh ở 370C và 5% CO2, khi tế bào mọc tốt tiến

hành thu hoạch và tiêm vào bắp đùi chuột nồng độ 2x106 tế bào/con (là nồng

độ gây u 100% chuột thí nghiệm). Theo dõi chuột bằng mắt thường hàng ngày

để xác định thời gian xuất hiện khối u sơ cấp cho các bước thí nghiệm tiếp

theo [76].

Phương pháp xác định khả năng ức chế khối u của hoạt chất

Tritecpen-HN trên chuột gây u thực nghiệm bằng dòng tế bào LLC:

30 chuột BALB/c khoẻ mạnh, có độ tuổi từ 9-10 tuần tuổi, được chia làm

5 lô (6 chuột/lô):

Lô 1: tiêm LLC, đồng thời cho uống bột ăn liền là dung môi hòa tan

mẫu

Lô 2: tiêm LLC đồng thời cho uống hoạt chất Tritecpen-HN ở nồng độ

200 mg/kgP/ngày.

Lô 3: tiêm LLC, đồng thời cho uống hoạt chất Tritecpen-HN ở nồng độ

500 mg/kgP/ngày.

Lô 4: tiêm LLC, đồng thời cho uống hoạt chất Tritecpen-HN ở nồng độ

1000 mg/kgP/ngày.

Lô 5: lô đối chứng dương, tiêm LLC đồng thời cho uống Doxorubicin

với nồng độ 5mg/kgP/ngày

Như vậy, với bố trí thí nghiệm như trên, chúng tôi nghiên cứu được khả

năng kháng u ung thư của Tritecpen-HN ở các liều lượng khác nhau (lô 2, 3,

4) thông qua việc ức chế khối u sơ cấp phát triển, cũng như khả năng diệt tế

46

bào ung thư LLC ở giai đoạn sớm. Kết quả được so sánh với chất chuẩn

Doxorubicin (lô 5) và với chuột ở lô số 1 (đối chứng âm của thí nghiệm).

Theo dõi chuột hàng ngày, cân khối lượng và đo kích thước khối u sơ

cấp tại vị trí tiêm 5 ngày/lần theo phương pháp của Abrham (1978) [74], Iigo

et al (1991), Eun-Ok Lee el all (2006) để xác định khả năng ức chế khối u của

C. Thể tích khối u được tính theo công thức của Iigo (1991).

V = a b x c /2

Trong đó: V : thể tích khối u

a : chiều dài khối u

b : chiều rộng khối u

b : chiều cao khối u

Phương pháp nghiên cứu sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học và hóa

sinh khi cho chuột uống Tritecpen-HN:

Chuột gây u trước và sau khi cho uống Tritecpen-HN (mỗi lô chọn ngẫu

nhiên 2-3 con) để làm các xét nghiệm sinh hoá máu gồm các chỉ tiêu: số

lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, hoạt độ các enzyme creatine

phosphokinase (CPK), serum glutamic oxaloacetic transaminase (SGOT),

serum glutamic purivic transaminase (SGPT) để đánh giá chức năng gan, thận

theo phương pháp của Bergmeyer (1974) [75].

Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của Tritecpen-HN đối với các

biến đổi giải phẫu bệnh lí ở gan, thận, lách, phổi chuột gây u thực

nghiệm:

Sau quá trình thí nghiệm mổ toàn bộ chuột để kiểm tra xem có u di căn

đến các cơ quan nội tạng hay không. Đồng thời làm tiêu bản và ảnh chụp trên

các tiêu bản để đánh giá mức độ chống khối u di căn của Tritecpen-HN.

Phương pháp xử lí số liệu:

Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê student t’ test và

F’test.

47

3.5.2 Kết quả và thảo luận:

3.5.2.1 Kết quả xác định khả năng ức chế khối u của Tritecpen-HN trên

chuột gây u thực nghiệm bằng dòng tế bào LLC:

Theo nhiều báo cáo, dòng tế bào LLC (Lewis Lung Carcinoma) là dòng tế

bào ung thư phổi, gây di căn rất mạnh và hiện được sử dụng làm tác nhân gây

u thực nghiệm trên chuột ở nhiều phòng thí nghiệm với hiệu quả cao. Trong

các thí nghiệm của chúng tôi, với việc sử dụng tế bào LLC (tỉ lệ 2x106

tb/chuột/lần) để gây u trên dòng chuột thuần chủng BALB/c thì u sơ cấp xuất

hiện sau 7 ngày và hiệu quả đạt tới 95 - 100 % (theo Đỗ Thị Thảo và cs,

2008).

Hình 1.Tế bào LLC nuôi cấy in vitro

Vì thế chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào LLC để gây u thực nghiệm trong

thí nghiệm kiểm chứng khả năng ức chế sự phát triển ung thư in vivo của hoạt

chất Tritecpen-HN.

Để đánh giá khả năng ức chế khối u của Tritecpen-HN trên chuột gây u

thực nghiệm, chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Abrham (1978) và

Iigo (1991) như đã mô tả ở trên. Theo đó, chuột được kiểm tra trọng lượng và

đo kích thước khối u sơ cấp 5 ngày/1 lần tính từ thời điểm tiêm tế bào LLC.

Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.

48

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển

Lô thí nghiệm 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày

Lô 1: ĐC âm Trọng lượng

trung bình

(gram)

29,75

±0,35

28,65

±0,21

29,45

±0,07

30,00

±0,71

31,65

±0,92

34,25

±1,77

Thể tích

khối u

(mm3)

125,25

±76,72

1372,00

±15,83

2256,00

±62,04

4480,00

±101,38

6100,00

±62,74

7904,50

±108,33

Số chuột

chết 0 0 0 0 2 1

% ức chế 0 0 0 0 0 0

Lô 2: 200

mg/kgP/ngày

Trọng lượng

trung bình (gram)

30,30

±0,99

29,50

±1,12

29,00

±0,71

29,00

±0,71

29,40

±0,14

28,50

±0,08

Thể tích

khối u

(mm3)

114,00

±77,19

1281,25

±65,82

2180,00

±86,68

4200,00

±82,84

6056,00

±103,65

7844,00

±103,65

Số chuột

chết 0 0 0 0 0 0

% ức chế 8,98 6,61 3,37 6,25 0,72 0,77

Lô 3: 500

mg/kgP/ngày

Trọng lượng

trung bình (gram)

29,50

±1,41

28,00

±1,83

26,50

±2,66

25,75

±3,72

25,75

±3,72

26,75

±4,42

Thể tích

khối u (mm3)

108,00

±36,66

982,75

±82,25

1882,00

±66,75

3235,25

±99,20

5687,50

±74,28

6324,50

±70,24

Số chuột

chết 0 0 0 0 0 0

% ức chế 13,77 28,37 16,58 27,78 16,60 19,99

Lô 4: 1000

mg/kgP/ngày

Trọng lượng

trung bình

(gram)

29,67

±0,76

29,17

±1,06

29,20

±2,07

28,17

±2,25

27,97

±3,29

26,90

±0,57

Thể tích

khối u

(mm3)

95,25

±27,98

582,75

±63,84

799,25

±83,82

1536,00

±76,22

2193,75

±62,93

2857,75

±82,21

Số chuột

chết 0 0 0 0 1 1

49

% ức chế 23,95 57,53 64,57 65,71 64,04 63,85

Lô 5: ĐC

(Doxorubicin 5

mg/kgP/ngày)

Trọng lượng

trung bình

(gram)

29,00

±0,87

30,83

±0,61

30,32

±0,61

30,67

±1,02

29,87

±0,97

28,02

±0,63

Thể tích

khối u

(mm3)

62,25

±0,00

332,88

±54,97

527,67

±74,92

901,13

±62,73

993,13

±98,38

912,67

±54,72

Số chuột

chết 0 0 0 0 0 0

% ức chế 50,10 75,74 76,61 79,89 83,72 88,45

Kết quả bảng 3.4 cho thấy:

Khả năng bảo vệ chung và kéo dài tuổi thọ cho động vật nghiên cứu của

Tritecpen-HN:

Chuột thí nghiệm được uống hoạt chất Tritecpen-HN ở liều 200 và 500

mg/kgP/ngày không bị chết con nào tai thời điểm kết thúc thí nghiệm, trong

khi đó ở những lô được sử dụng Tritecpen-HN liều cao 1000 mg/kgP/ngày bị

chết 2 con trong số 6 con tương đương 33,33% (2con/6con). Chuột ở lô đối

chứng (bị gây u mà không được uống hoạt chất bảo vệ) cũng bị chết 3 trong

tổng số 6 chuột thí nghiệm. Như vậy, hoạt chất Tritecpen-HN ở liều

1000mg/kgP/ngày không biểu hiện rõ khả năng bảo vệ và kéo dài tuổi thọ cho

chuột bị gây u. Tuy nhiên, hai liều còn lại đã cho thấy khả năng bảo vệ và kéo

dài tuổi thọ cho chuột bị gây u.

Khả năng ức chế khối u phát triển:

Thông qua so sánh sự phát triển của khối u có thể nhận thấy:

- Sử dụng Tritecpen-HN liều 200 mg/kgP/ngày không thấy rõ được quá

trình ức chế khối u sơ cấp phát triển ở mức ý nghĩa thống kê so với lô đối

chứng (chuột bị gây u không uống hoạt chất) (p>0,05).

- Sử dụng Tritecpen-HN liều 500 mg/kgP/ngày chưa cho thấy rõ khả năng

ức chế sự phát triển của khối u so với lô đối chứng (không uống hoạt chất).

Kích thước khối u tăng trong quá trình thí nghiệm. Phần trăm ức chế sự

phát triển của khối u ở liều này sau 30 ngày cho uống hoạt chất là 19,99%.

50

Thể tích khối u sau quá trình thí nghiệm là không có sự sai khác có ý nghĩa

thống kê (p>0,05) so với lô đối chứng (không được sử dụng Tritecpen-

HN).

- Sử dụng Tritecpen-HN liều 1000 mg/kgP/ngày đã cho thấy rõ khả năng ức

chế sự phát triển của khối u so với lô đối chứng (không uống hoạt chất).

Kích thước khối u tăng trong quá trình thí nghiệm, nhưng vẫn nhỏ hơn

nhiều so với đối chứng. Phần trăm ức chế sự phát triển của khối u ở liều

này sau 30 ngày cho uống hoạt chất là 63,85%. Thể tích khối u sau quá

trình thí nghiệm là có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lô

đối chứng (không được sử dụng Tritecpen-HN).

- Đây là một kết quả khả quan và có thể nhận định rằng Tritecpen-HN có

khả năng ức chế sự phát triển khối u ung thư ở mức liều 1000

mg/kgP/ngày. Tuy nhiên, ở liều này hoạt chất Tritecpen-HN lại có thể gây

ảnh hưởng đến cơ thể động vật thí nghiệm, làm chết động vật.

- Chất đối chứng Doxorubicin thể hiện hoạt tính kháng u tốt và ổn định. So

với đối chứng Doxorubicin, Tritecpen-HN có thể được coi là có hoạt tính

kháng u.

Khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển còn được đánh giá thông qua quá

trình đánh giá khối lượng u so cấp sau quá trình thí nghiệm 30 ngày. Kết quả

giải phẫu khối u, xác định khối lượng u sơ cấp được trình bày ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm

Liều Khối lượng u sơ cấp (g)

ĐC âm 11,25 ± 3,83

200 mg 10,74 ± 2,12

500 mg 8,79 ± 3,83

1000 mg 6,07 ± 2,74

Doxorubicin 5,00 ± 3,05

51

Như vậy, khối lượng u sơ cấp tại vị trí tiêm tế bào LLC ở lô không được

sử dụng hoạt chất Tritecpen-HN là lớn nhất, ở các lô được sử dụng Tritecpen-

HN khối lượng u sơ cấp đã nhỏ hơn so với đối chứng, điều này một lần nữa

khẳng định Tritecpen-HN có khả năng ức chế khối u phát triển. Nồng độ

Tritecpen-HN 1000mg/kgP/ngày đã cho thấy rõ khả năng ức chế khối u sơ

cấp phát triển, khối lượng u sơ cấp là 6,07g sau 30 ngày cho uống hoạt chất,

trong khi đó ở lô đối chứng không được sử dụng hoạt chất là 11,25g.

3.5.2.2 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu chuột bị gây u và được

uống hoạt chất Tritecpen-HN:

Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm (30 ngày), toàn bộ chuột được lấy máu

làm các xét nghiệm sinh hóa. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu được

trình bày ở bảng 3.6.


cho uống Tritecpen-HN

Các chỉ tiêu ĐC âm Liều 200

mg/kgP/ngày

Liều 500

mg/kgP/ngày

Liều 1000

mg/kgP/ngày

Chuột khỏe

mạnh, không u

Hồng cầu

(106/L) 7.31 ± 1,81 7.54 ± 0,85 8.13 ± 0,29 8.15 ± 0,33 9,54 ± 0,37

Bạch cầu

(103/L) 46.10 ± 5,64 41.36 ± 5,87 33.00 ± 5,24 23.30 ± 5,89 9,62 ± 0,68

Tiểu cầu

(103/L) 440.50 ±94,86

447.50 ±52,42

451.50 ±77,48

373.50 ±67,18

527,17 ±10,15

Hemoglobin

(g/dL) 7.38 ±1,09 7.83 ±1,09 12.20 ± 0,42 12.40 ±0,71 14,87 ±1,45

SGOT (U/L) 584.50 ±40,94

521.50 ±52,62

452.00 ±53,13

587.00 ± 42,23

91,17

±4,79

SGPT (U/L) 32,00 ± 1,90 32,50 ± 1,52 32.50 ±1,78 37.50 ±0,71 32,83 ± 12,12

Creatin

(minimol/L) 23,00 ± 1,41 23,00 ± 0,82 23.50 ±1,54 24.00 ± 1,83 21,00 ± 1,67

52

Như vậy, chuột bị gây u và được uống hoạt chất Tritecpen-HN thì hầu hết

các chi tiêu huyết học đã được phục hồi nhiều so với không được sử dụng

hoạt chất, tuy vẫn còn khác so với đối chứng chuột hoàn toàn khỏe mạnh. Ở

chuột bị gây u chỉ tiêu SGOT và bạch cầu là có thay đổi đáng kể so với đối

chứng là chuột khỏe mạnh chưa thí nghiệm. Như vậy, có thể nói Tritecpen-

HN có khả năng ảnh hưởng và thay đổi hoạt động hệ miễn dịch theo chiều

hướng tích cực trên cơ thể động vật bị gây u.

3.5.2.3 Kết quả kiểm tra giải phẫu các cơ quan nội tạng:

Sau khi lấy máu để làm các xét nghiệm sinh hóa, toàn bộ chuột thí

nghiệm được giết mổ để kiểm tra trực quan các nội quan. Kết quả mổ kiểm tra

trực quan nội tạng được trình bày ở bảng 3.7.

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của Tritecpen-HN lên mô bệnh học của gan, thận,

lách, phổi chuột thí nghiệm

Mô Lô 1: 0 mg Lô 2: 200 mg Lô 3: 500 mg Lô 4: 1000 mg Lô5: Doxorubicin

Gan

Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Màu nâu, mô

gan đều

Màu nâu, mô

gan đều

Màu nâu, mô

gan đều

Màu nâu, mô

đồng nhất

Thận

Màu nâu nhạt,

hai thận đều nhau

Màu nâu nhạt,


Màu nâu

nhạt, hai thận đều nhau

Màu nâu nhạt,


Màu nâu nhạt, hai

thận đều nhau

Lách Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Màu nâu, mô

đồng nhất

Màu nâu, mô

đồng nhất

Màu nâu, mô

đồng nhất

Màu nâu, mô

đồng nhất

Phổi Có khối u màu

trắng

Màu hồng

tươi, hai bên đều nhau

Màu hồng

tươi, hai bên đều nhau

Màu hồng tươi,

hai bên đều nhau

Màu hồng tươi,


Dạ

dày

Hình dạng và

kích thước bình thường

Hình dạng và


Hình dạng và


Hình dạng và


Hình dạng và


Các lô thí nghiệm được sử dụng Tritecpen-HN cho thấy không có nội

quan bị di căn từ khối u sơ cấp ban đầu. Các cơ quan nội tạng khác nhau là dạ

dày, gan, lách, thận, tuyến vú ... đều không thấy xuất hiện u. Lô đối chứng

53

(không sử dụng hoạt chất Tritecpen-HN) thấy có khối u màu trắng nhưng xét

nghiệm cho thấy đây là các khối hoại tử, không phải tế bào ung thư.

3.5.3 Kết luận:

Tritecpen-HN có khả năng kéo dài tuổi thọ cho chuột bị u thực nghiệm ở

mức liều trung bình. Liều cao có khả năng gây độc.

Tritecpen-HN có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong

các khối u thực nghiệm trên mô hình chuột bị gây ung thư in vivo, cụ thể

như sau:

- Tritecpen-HN liều 200 mg/kgP/ngày không cho thấy khả năng ức chế sự

phát triển của các khối u so với đối chứng.

- Tritecpen-HN liều 500 mg/kgP/ngày có khả năng ức chế 19,99% sự phát

triển của các tế bào ung thư so với đối chứng.

- Tritecpen-HN liều 1000 mg/kgP/ngày có khả năng ức chế 63,85% sự phát

triển của các tế bào ung thư so với lô đối chứng .

- Tritecpen-HN chưa cho thấy khả năng diệt tế bào ung thư trong các khối u

một cách hoàn toàn.

- Tritecpen-HN có khả năng ảnh hưởng và làm thay đổi một số chỉ tiêu

huyết học và enzyme chức năng gan, thận theo chiều hướng tốt so với đối

chứng.

3.6 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn

Ngọc:

3.6.1 Điều chế cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn Ngọc:

1,5 kg rễ cây Hoàn Ngọc được ngâm chiết bằng nước đun sôi (ủ như pha

chè để uống) 4 lần (lần đầu10 L, mỗi lần sau 7 L). Sau khi loại nước thu được

121 g cao chiết màu nâu. Hiệu suất chiết đạt 8,6% khối lượng nguyên liệu

khô.

54

3.6.2 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn Ngọc:


Nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển khối u sơ cấp của Dịch chiết

nước từ cây Hoàn Ngọc.

Nghiên cứu khả năng kéo dài tuổi thọ của Cao dịch chiết nước từ cây

Hoàn Ngọc trên chuột bị gây u.

Nghiên cứu khả năng chống khối u ung thư di căn của Cao dịch chiết

nước từ cây Hoàn Ngọc bằng trực quan và mô bệnh học trên chuột gây

u thực nghiệm

Nghiên cứu ảnh hưởng của Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc đối

với sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học, chỉ tiêu sinh hoá máu từ đó

đánh giá chức năng gan, thận.


Khả năng kháng u của cao dịch chiết nước rễ cây Hoàn Ngọc được nghiên

cứu trên vật liệu và phương pháp như đã trình bày ở mục 3.5.1 trên 24 chuột

BALB/c khoẻ mạnh, có độ tuổi từ 9-10 tuần tuổi, có khối lượng từ 26-28g,

được chia làm 4 lô (6 chuột/lô)

Lô 1: tiêm LLC, đồng thời cho uống nước cất, là dung môi hòa tan mẫu

Lô 2: tiêm LLC đồng thời cho uống Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn

Ngọc ở nồng độ 3000 mg/kgP/ngày.

Lô 3: tiêm LLC, đồng thời cho uống Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn


Lô 4: tiêm LLC, đồng thời cho uống Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn



Để đánh giá khả năng ức chế khối u của Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn

Ngọc trên chuột gây u thực nghiệm, chúng tôi tiến hành theo phương pháp

của Abrham (1978) và Iigo (1991) như đã mô tả ở trên. Theo đó, chuột được

55

kiểm tra trọng lượng và đo kích thước khối u sơ cấp 5 ngày/1 lần tính từ thời

điểm tiêm tế bào LLC. Kết quả được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển

Lô thí nghiệm 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày

Lô 1: ĐC âm

Khối lượng trung bình

(gram)

31,50 ±0,68

32,25 ±0,35

33,30 ±0,42

34,00 ±0,28

35,50 ±0,72

38,15 ±1,20

Thể tích khối u (mm3)

256,12 ±8,22

1687,50 ±97,34

3420,08 ±73,84

6083,51 ±93,73

8788,03 ±102,62

10976,0±122,83

Số chuột chết 0 0 0 0 0 1

% ức chế 0 0 0 0 0 0

Lô 2: 3000 mg/kgP/ngày

Mức tăng trọng trung bình (gram)

30,68 ±0,76

30,25 ±1,06

30,45 ±1,34

31,25 ±1,06

31,50 ±0,71

32,50 ±1,41


117,75

±7,07

1529,75

±123,29

2652,25 ±88,85

4615,25 ±85,84

6357,00 ±127,43

8800,25±89,78


% ức chế 16,28 9,35 22,45 24,13 27,66 19,82



29,00 ±0,50

29,93 ±0,90

30,50 ±2,29

30,83 ±2,47

31,17 ±2,75

31,33 ±2,89


62,50 ±44,90

764,75 ±104,36

1332,00 ±66,85

2310,50 ±127,24

4011,25 ±108,75

6912,00 ±121,63


% ức chế 55,28 54,68 61,05 62,02 54,36 37,03



28,83 ±0,76

29,00 ±1,00

28,60 ±1,68

26,00 ±3,36

25,85 ±3,44

25,50 ±3,95


62,5 ±2,93

500,21 ±47,74

665,52 ±43,92

1372,52 ±92,12

2916,63 ±83,55

4315,25 ±109,49


% ức chế 55,28 70,36 80,54 77,44 66,81 60,68


56

Khả năng bảo vệ chung và kéo dài tuổi thọ cho động vật nghiên cứu

của Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc:

Chuột thí nghiệm được uống Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc ở liều

3000 và 5000 mg/kgP/ngày không bị chết con nào tại thời điểm kết thúc thí

nghiệm, trong khi đó ở những lô được sử dụng Cao dịch chiết nước từ cây

Hoàn Ngọc liều rất cao 7000 mg/kgP/ngày có 2 chuột bị chết. Chuột ở lô đối

chứng (bị gây u mà không được uống hoạt chất bảo vệ) bị chết 1 con. Như

vậy, cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc ở liều rất cao có tác dụng ức chế

sự phát triển của khối u sơ cấp so với đối chứng nhưng lại ảnh hưởng đến cơ

thể động vật thí nghiệm, làm khối lượng cơ thể giảm và làm chết động vật khi

cho uống liều cao và dài ngày.

Khả năng ức chế khối u phát triển:


- Sử dụng Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc liều 3000 mg/kgP/ngày,

sau 30 ngày thí nghiệm ức chế được 19,82% sự phát triển khối u sơ cấp so

với lô đối chứng (chuột bị gây u không uống hoạt chất).

- Sử dụng Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc liều 5000 mg/kgP/ngày đã

thấy rõ việc ức chế sự phát triển của khối u một cách rõ ràng, có ý nghĩa

thống kê (p< 0,05) so với lô đối chứng (không uống hoạt chất). Phần trăm

ức chế sự phát triển của khối u ở liều này sau 30 ngày cho uống hoạt chất

đạt tới 37,03%. Thể tích khối u sau quá trình thí nghiệm là có sự sai khác

có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lô đối chứng không được sử dụng Cao

dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc.

- Sử dụng Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc liều 7000 mg/kgP/ngày

cho thấy rõ việc ức chế sự phát triển của khối u một cách rõ ràng, có ý

nghĩa thống kê (p< 0,05) so với lô đối chứng (không uống hoạt chất). Phần

trăm ức chế sự phát triển của khối u ở liều này sau 30 ngày cho uống hoạt

chất là 60,68%. Thể tích khối u sau quá trình thí nghiệm là có sự sai khác

57

có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lô đối chứng không được sử dụng Cao

dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc.

- Đây là một kết quả khả quan và có thể nhận định rằng Cao dịch chiết nước

từ cây Hoàn Ngọc có khả năng ức chế rõ ràng sự phát triển khối u ung thư

bắt đầu ở mức liều 5000 mg/kgP/ngày. Tuy nhiên, ở liều này Cao dịch chiết

nước từ cây Hoàn Ngọc sử dụng liều rất cao trong thời gian dài lại có thể

gây ảnh hưởng đến cơ thể động vật thí nghiệm, làm chết động vật.


trình đánh giá khối lượng u sơ cấp sau quá trình thí nghiệm 30 ngày. Kết quả


Bảng 3.9: Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm

Liều Khối lượng u sơ cấp (gram)

ĐC âm 12,51

3000 mg 9,95

5000 mg 7,48

7000 mg 6,52

Bảng 3.9 cho thấy khối lượng u sơ cấp tại vị trí tiêm tế bào LLC ở lô

không được sử dụng hoạt chất Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc là lớn

nhất, ở các lô được sử dụng Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc khối

lượng u sơ cấp đã nhỏ hơn so với đối chứng, điều này một lần nữa khẳng định

Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc có khả năng ức chế khối u phát triển.

Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc liều 7000mg/kgP/ngày đã cho thấy rõ

khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển, khối lượng u sơ cấp là 6,52 g sau 30

ngày cho uống hoạt chất, trong khi đó ở lô đối chứng không được sử dụng

hoạt chất là 12,51g (giảm 47,88%). Như vậy, dịch chiết đã có khả năng tác

động trực tiếp đến khối u rắn và làm giảm thể tích khối u.

58

Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu chuột bị gây u và được

uống Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc:

Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm (30 ngày), toàn bộ chuột được lấy

máu làm các xét nghiệm sinh hóa. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu

được trình bày ở bảng 3.10.

Bảng 3.10: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu chuột bị gây u sau khi cho uống

Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc

Chỉ tiêu ĐC âm Liều 3000

mg/kgP/ngày

Liều 5000

mg/kgP/ngày

Liều 7000

mg/kgP/ngày

Chuột khỏe

mạnh,

không u

Hồng cầu

(106/L) 7,05 ± 0.82 8,38 ± 0,73 8,48 ±0,36 9,63 ± 0,54 9,54 ± 0,37

Bạch cầu

(103/L)

30,20 ±

0,52 22,50 ± 0,83 15,30 ± 0,62 9,20 ± 0,36 9,62 ± 0,68

Tiểu cầu

(103/L)

265,00 ±

2,87

372,00 ±

3,27

445,00 ±

4,44

591,00 ±

5,03

527,17 ±

10,15

Hemoglobin

(g/dL)

11,90 ±

12,86

13,40 ±

13,83

14,20 ±

11,81 14,70 ±10,52

14,87 ±

0,45

SGOT (U/L) 1135,00±

5,77

481,00 ±

3,88

447,00 ±

5,22

425,00 ±

3,98

91,17 ±

4,79

SGPT (U/L) 44,00 ±

1,28 31,00 ± 0,96 30,00 ± 1,04 31,00 ± 0,94

37,83 ±

12,12

Creatin

(minimol/L)

22,00 ±

0,97 21,00 ± 0,73 22,00 ± 0,00 20,00 ± 0,08

21,00 ±

1,67

Bảng 3.10 cho thấy Chuột bị gây u và được uống hoạt chất Cao dịch

chiết nước từ cây Hoàn Ngọc thì hầu hết các chi tiêu hóa sinh và huyết học đã

được phục hồi nhiều so với không được sử dụng hoạt chất, tuy vẫn còn khác

so với đối chứng chuột hoàn toàn khỏe mạnh. Như vậy, có thể nói Cao dịch

chiết nước từ cây Hoàn Ngọc có khả năng ảnh hưởng và thay đổi hoạt động

hệ miễn dịch theo chiều hướng tích cực trên cơ thể động vật bị gây u.

3.6.2.3 Kết quả kiểm tra giải phẫu các cơ quan nội tạng:

59




Bảng 3.11: Ảnh hưởng của Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc trên mô bệnh

học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm

Mô ĐC âm Lô 2: 3000 mg Lô 3: 5000 mg Lô 4: 7000 mg

Gan

Màu nâu

hồng, mô

đồng nhất

Màu nâu, mô

gan đều

Màu nâu, mô gan

đều

Màu nâu, mô

gan đều

Thận

Màu nâu

nhạt, hai

thận đều

nhau

Màu nâu nhạt,

hai thận đều

nhau

Màu nâu nhạt,


Màu nâu nhạt,

hai thận đều

nhau

Lách Màu nâu

đậm, mô

đồng nhất

Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Phổi Màu hồng

tươi, hai bên

đều nhau

Màu hồng tươi,

hai bên đều

nhau

Màu hồng tươi,


Màu hồng tươi,

hai bên đều

nhau

Dạ dày Hình dạng và

kích thước

bình thường

Hình dạng và

kích thước bình

thường

Hình dạng và


thường

Hình dạng và


thường

Bảng 3.11 cho thấy:

- Các lô thí nghiệm được sử dụng Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc

cho thấy không có nội quan bị di căn từ khối u sơ cấp ban đầu. Các cơ

quan nội tạng khác nhau là dạ dày, gan, lách, thận, tuyến vú ... đều không

thấy xuất hiện u.

- Lô đối chứng (không sử dụng hoạt chất Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn

Ngọc) cũng không thấy có hiện tượng u di căn.

3.6.3 Kết luận:

Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc ở liều trung bình có khả năng kéo

dài tuổi thọ cho chuột bị u thực nghiệm.

60

Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc có khả năng ức chế sự phát triển

của tế bào ung thư trong các khối u thực nghiệm trên mô hình chuột bị gây

ung thư in vivo, cụ thể như sau:

- Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc liều 3000 mg/kgP/ngày có khả

năng ức chế 19,82 % sự phát triển của các tế bào ung thư so với đối

chứng.


năng ức chế 37,03% sự phát triển của các tế bào ung thư so với đối

chứng.


năng ức chế 60,68% sự phát triển của các tế bào ung thư so với lô đối

chứng.

Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc chưa cho thấy khả năng chữa trị ung

thư hiệu quả do phải sử dụng mức liều rất cao.

Cao dịch chiết nước từ cây Hoàn Ngọc có khả năng thay đổi một số chỉ tiêu

huyết học và enzyme chức năng gan, thận theo chiều hướng tốt so với đối

chứng.

3.7 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng tritecpen và nghiên

cứu độ ổn định của sản phẩm

3.7.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng tritecpen:

3.7.1.1 Yêu cầu kỹ thuật:

a) Chất lượng thành phẩm:

Tính chất: Bột màu trắng ngà

Định tính: Chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của tritecpenoit

Độ trong: Dung dịch chế phẩm 10mg/ml diclomethan phải trong.

Hàm lượng nước: ≤ 1,0%

Tạp chất liên quan: Phải đạt theo quy định của phần phương pháp thử.

61

Hàm lượng kim loại nặng: ≤ 0,002%

Tro sulfat: Không quá 0,2%.

Định lượng: Chế phẩm phải chứa tổng hàm lượng 2 chất lupeol (C30H50O)

và betulin (C30H50O2) ≥ 80% trong đó hàm lượng Lupeol ≥ 50% và hàm

lượng Betulin ≥ 30%, tính theo chế phẩm khan.

3.7.1.2 Phương pháp thử:

Tính chất: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu.

Định tính: Dung dịch thử trong phần tạp chất liên quan phải cho 2 vết có màu

sắc và Rf tương ứng với vết Lupeol trên sắc đồ dung dịch chuẩn A và vết

Betulin trên sắc đồ dung dịch chuẩn C.

Độ trong: Pha dung dịch chế phẩm có nồng độ 10mg/ml diclomethan. Dung

dịch thu được phải trong.

Hàm lượng nước: Sấy 0,1 g chế phẩm ở 50oC đến khối lượng không đổi.

Tạp chất liên quan: Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Điều kiện sắc ký:

- Bản mỏng silicagel F254

- Pha động: n-hexan - ethyl acetat (8 : 2)

- Thể tích chấm: 10µl

- Phát hiện: thuốc thử ceri sulfat (hòa 1g ceri sulphat trong 100 ml acid

sulfuric 10%)

Dung dịch chuẩn A (dung dịch chuẩn Lupeol): Cân chính xác khoảng 10,0

mg lupeol chuẩn rồi hòa tan trong 1 mL diclomethan, lắc đều khoảng 2 phút

để được dung dịch chuẩn A.

Dung dịch chuẩn B: Pha loãng dung dịch chuẩn A 10 lần trong diclomethan

để được dung dịch chuẩn B.

62

Dung dịch chuẩn C (dung dịch chuẩn Betulin): Cân chính xác khoảng 10,0

mg betulin chuẩn rồi hòa tan trong 1 mL diclomethan, lắc đều khoảng 2 phút để

được dung dịch chuẩn B.

Dung dịch chuẩn D: Pha loãng dung dịch chuẩn C 10 lần trong diclomethan

để được dung dịch chuẩn D.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 10,0 mg chế phẩm Tritecpen-HN, thêm

1ml diclomethan, lắc đều khoảng 2 phút.

Chấm 10µl dung dịch chuẩn A, chuẩn B, chuẩn C, chuẩn D và dung dịch thử,

để khô và cho triển khai trong pha động. Sau khi triển khai xong để bản mỏng

khô tự nhiên và hiện màu bằng thuốc thử ceri sulfat.

Yêu cầu: Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải cho 2 vết chính tương ứng về

Rf với vết của dung dịch chuẩn A (lupeol) và dung dịch chuẩn C (betulin).

Các vết này có màu xanh cửu long khi hiện màu bằng thuốc thử ceri sulfat.

Bất kỳ vết phụ nào trên sắc ký đồ dung dịch thử không được đậm hơn vết

chính trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn B và D.

Kim loại nặng: Tiến hành theo chỉ dẫn của Dược điển Mỹ 32 - <231> -

phương pháp II:

- Dung dịch đệm acetat pH 3,5: Hòa tan 25g amoni acetate trong 25ml

nước, thêm 38ml dung dịch acid hydrochloric 6N. Điều chỉnh (nếu cần)

tới pH 3,5 bằng dung dịch amoni hydroxyd 6N hoặc dung dịch acid

hydrocloric 6N. Thêm nước cho vừa đủ 100ml và lắc đều.

- Dung dịch chuẩn : Lấy 4ml dung dịch Pb2+ chuẩn ( dung dịch Pb2+

10ppm) vào ống so màu thể tích 50ml, thêm nước tới thể tích 25ml, điều

chỉnh bằng dung dịch acid acetic 1N hoặc dung dịch NH4OH 6N tới pH

= 3-4, thêm nước tới thể tích 40ml, trộn đều.

- Mẫu thử: cân 2,006 g chế phẩm/chén sứ, làm ẩm bằng H2SO4 và đun nhẹ

cho đến khi cháy hoàn toàn, thêm vào đó 2ml HNO3 đặcvà 5 giọt H2SO4

63

và đun nóng đến khi không còn khói trắng bay ra. Nung ở 600°C cho đến

khi không còn carbon. Làm nguội cắn, thêm vào đó 4ml HCl 6N, đun

cách thủy 15 phút, bốc hơi hết cắn. Làm ẩm cắn với 1 giọt HCl + 10 ml

nước nóng, để yên 2 phút, thêm từng giọt NH3 6N cho đến khi dung dịch

chuyển sang kiềm, pha loãng với nước đến 25ml. Điều chỉnh pH = 4

bằng dung dịch acid acetic 1N, lọc rửa chén sứ và giấy lọc với 10ml

nước. Kết hợp dịch lọc và pha loãng với nước thành 40ml.

- Ống thử : 2ml dung dịch đệm acetat pH 3,5, thêm vào đó 1,2ml

thioacetatamid glicerin, thêm 40 ml dung dịch mẫu thử trên, pha loãng

với nước thành 50ml, trộn đều và để yên 2 phút.

- Ống chứng: 2ml dung dịch đệm acetat pH 3,5, thêm vào đó 1,2ml

thioacetatamid glicerin, thêm vào đó 2ml dung dịch Pb2+ 10ppm ở trên,

pha loãng thành 50ml nước, trộn đều và để yên 2 phút.

Quan sát màu của dung dịch thử không được đậm hơn mầu của ống chứng.

Tro sulfat: Tiến hành theo chỉ dẫn của Dược điển Mỹ 32 - (281).

- Nung một chén sứ tới khối lượng không đổi . Làm nguội trong bình hút

ẩm. Cân trên cân phân tích ta được mc.

- Cân một lượng chính xác khoảng 2g (mt) chế phẩm vào chén sứ. Làm ẩm

bằng 1ml H2SO4 đặc. Đun nóng nhẹ cho đến khi cháy thành than, để

nguội, rồi lại làm ẩm với dung dịch 1ml H2SO4 đặc và đun đến khi hết

khói. Sau đó đem nung ở 600°C cho đến khi thành tro. Để nguội trong

bình hút ẩm. Đem cân được khối lượng m.

- Lượng tro (tính bằng phần trăm) được tính theo công thức:

(m-mc) ×100/mt

Định lượng: Phương pháp HPLC

* Điều kiện sắc ký:

- Cột: Rp18, 5µm (250x 4,6mm)

64

- Thể tích tiêm: 20µl

- Tốc độ dòng: 1,5ml/phút

- Detector: 210nm

- Pha động: MeOH (0,1% TFA) : H2O theo tỉ lệ như sau:

Thời gian (Phút) MeOH (0,1%TFA) H2O

0 80 20

30 100 0

34 100 0

34.1 80 20

40 80 20

* Phương pháp xử lý mẫu:

Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác khoảng 500 mg chế phẩm Triterpen-HN

hòa tan hoàn toàn trong 50 ml diclomethan (có thể thêm vài giọt aceton). Cân

chính xác 1 g silica gel. Rót dung dịch chứa chế phẩm vào silica gel, khuấy

đều cho đến khi dung môi bay hết, silica gel trở nên khô như ban đầu.

Chuẩn bị cột sắc ký: Cân chính xác 20 g silica gel, đổ lên cột thủy tinh có

đường kính 1,5 cm, dài 50 cm, gõ thật đều cho silica gel được nhồi chặt. Đổ

phần mẫu đã được tẩm vào silica gel ở phần chuẩn bị mẫu lên phía trên lớp

silica gel nhồi cột. Dàn đều thành lớp phẳng.

Rửa cột: Cho n-hexan chạy qua cột cho đến khi hết bọt khí trong cột. Tiến

hành rửa cột bằng 200 mL hỗn hợp dung môi n-hexan - ethyl acetat (95:5),

thu các phân đoạn (hứng vào các ống nghiệm, 10 mL mỗi phân đoạn). Sau đó,

tiếp tục rửa cột bằng 200 mL hỗn hợp dung môi n-hexan - ethyl acetat (9:1),

thu các phân đoạn. Khảo sát các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng có

đối chứng với chất chuẩn lupeol và betulin.

Gom các phân đoạn có chứa lupeol, cất loại dung môi thu được chất lupeol.

65

Tương tự, gộp các phân đoạn chứa betulin với nhau, cất loại dung môi thu

được chất betulin.

* Tiến hành định lượng:

Dung dịch thử: Cho toàn bộ lượng lupeol và betulin thu được ở trên vào bình

định mức 250ml, thêm khoảng 200ml methanol, lắc siêu âm 30 phút cho tan

hoàn toàn, thêm methanol vừa đủ, lọc.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50mg lupeol chuẩn và 30mg betulin

chuẩn vào bình định mức 50ml, hòa tan và pha loãng bằng methanol đến

vạch.

Lần lượt tiêm dung dịch chuẩn và thử vào hệ thống sắc ký và ghi lại sắc đồ.

* Kết quả: Hàm lượng Lupeol và Betulin trong chế phẩm được tính theo công

thức:

X% 100250

50

mt

Cmc

S

S

C

T

Trong đó:

ST, SC : Lần lượt là diện tích pic của Lupeol (Betulin) của dung dịch thử

và chuẩn

mc, mt: Lần lượt là lượng cân của chuẩn Lupeol (Betulin) và thử (mg)

C: Hàm lượng của chuẩn Lupeol (Betulin) (%)

3.7.1. 3 Đóng gói, ghi nhãn và bảo quản

- Chế phẩm đóng trong lọ thủy tinh kín, màu nâu.

- Bảo quản ở nhiệt độ thường.

- Nhãn ghi theo qui định của Bộ Y tế.

3.7.2 Kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm theo tiêu chuẩn cơ sở:

Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương đã tiến hành kiểm nghiệm sản phẩm

tổng tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc theo tiêu chuẩn cơ sở.

66

Kết quả như sau:

Stt Chỉ tiêu Yêu cầu Kết quả

1 Mô tả Bột màu trắng ngà Đúng

2 Định tính Dung dịch thử phải cho 2

vết có Rf tương ứng với hai

vết của Lupeol và Betulin

trên sắc ký đồ lớp mỏng

Đúng

3 Độ trong Dung dịch chế phẩm 10

mg/mL diclometan phải

trong

Đạt

4 Hàm lượng nước Không quá 1% Đạt (0,9%)

5 Tạp chất liên quan Bất kỳ vết phụ nào trên sắc

ký đồ lớp mỏng của dung

dịch thử không được đậm

hơn vết chính trên sắc ký

đồ của các dung dịch chuẩn

loãng lupeol và betulin

Đạt

6 Hàm lượng kim loại

nặng

Không quá 0,002% Đạt

7 Cắn sau nung Không quá 0,2% Đạt

8 Định lượng Chế phẩm phải chứa tổng

hàm lượng 2 chất Lupeol và

≥ 80% trong đó hàm lượng

lupeol ≥ 50%, hàm lượng

betulin ≥ 30%.

- Lupeol: Đạt

(56,7%)

- Betulin: Đạt

(31,6%)

3.7.3 Nghiên cứu độ ổn định của sản phẩm Tritecpen-HN:

Độ ổn định của sản phẩm được nghiên cứu tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc

Trung ương theo phương pháp lão hóa cấp tốc ở điều kiện 45oC ± 1oC và độ

ẩm tương đối 75% ± 5%.

Phương pháp lão hóa cấp tốc dựa trên mối quan hệ giữa nhiệt độ và tốc độ

phản ứng gây phân hủy thuốc, nguyên nhân quan trọng nhất gây biến đổi chất

lượng, ảnh hưởng tới độ ổn định của thuốc.

67

Tốc độ phản ứng phân hủy thuốc phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ và được

biểu hiện bởi phương trình Arrhenius:

-E

K = A x e ------

RT

hay

E

lgK = lgA - e ----------

2,303RT

Độ ổn định (tuổi thọ) của thuốc được tính từ tuổi thọ thực nghiệm theo

công thức sau:

(t – 25)

P = Pt x σ --------- + P0

10

Trong đó:

P = Tuổi thọ của thuốc (tính bằng tháng).

Pt = Tuổi thọ thực nghiệm của mẫu khi bảo quản ở nhiệt độ t (tính

bằng tháng).

P0 = Khoảng thời gian từ ngày xuất xưởng đến ngày bắt đầu bảo quản

thực nghiệm (tính bằng tháng).

σ = Hệ số nhiệt độ của tốc độ phản ứng, biểu thị mức độ tăng tốc độ

phản ứng khi nhiệt độ tăng lên 10oC (σ = 2, hay được xác định bằng thực

nghiệm).

t = Nhiệt độ bảo quản thực nghiệm (oC).

25 = Nhiệt độ bảo quản bình thường.

3.7.3.1 Đánh giá độ ổn định bằng phương pháp lão hóa cấp tốc:

a. Điều kiện bảo quản: Nhiệt độ 45oC ± 1oC, độ ẩm tương đối 75% ± 5%.

b. Thời gian bảo quản: 06 tháng

c. Tần suất lấy mẫu phân tích: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 tháng sau khi chiết xuất

d. Các chỉ tiêu cần đánh giá:

68

Chỉ tiêu Yêu cầu

Tính chất Bột màu trắng ngà

Độ trong Dung dịch chế phẩm 10mg/ml diclomethan phải trong

Hàm lượng nước Không quá 1,0%

Tạp chất liên quan Phải đạt theo quy định

Định lượng Chế phẩm phải chứa tổng hàm lượng 2 chất lupeol

(C30H50O) và betulin (C30H50O2) ≥ 80% trong đó hàm

lượng Lupeol ≥ 50% và hàm lượng Betulin ≥ 30%, tính

theo chế phẩm khan.

3.7.3.2 Phương pháp phân tích: Theo TCCS

Tính chất: Kiểm tra bằng cảm quan

Độ trong: Pha dung dịch chế phẩm có nồng độ 10mg/ml diclomethan. Dung

dịch thu được phải trong.

Hàm lượng nước: Sấy 0,1 g chế phẩm ở 50oC đến khối lượng không đổi.

Tạp chất liên quan: được tiến hành bằng phương pháp như phương pháp đã

trình bày trong mục 3.7.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng

tritecpen.

Định lượng: Phương pháp HPLC như đã trình bày ở mục 3.7.1. Xây dựng tiêu

chuẩn cơ sở cho sản phẩm tổng tritecpen.


Kết quả của quá trình nghiên cứu độ ổn định của sản phẩm Tritecpen-HN

được thể hiện trong bảng sau:

Chỉ

tiêu Yêu cầu

0

tháng

1

tháng

2

tháng

3

tháng

4

tháng

5

tháng

6

tháng

Tính

chất

Bột màu trắng

ngà

Bột

màu

trắng

ngà

Bột

màu

trắng

ngà

Bột

màu

trắng

ngà

Bột

màu

trắng

ngà

Bột

màu

trắng

ngà

Bột

màu

trắng

ngà

Bột

màu

trắng

ngà

Độ

trong

Dung dịch chế

phẩm 10mg/ml Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt

69

Kết quả thu được cho thấy các tính chất hóa lý của nguyên liệu Tritecpen

chiết xuất từ rễ cây Hoàn ngọc vẫn đạt yêu cầu theo TCCS trong suốt quá

trình lão hóa cấp tốc ở 45oC ± 1oC và độ ẩm tương đối 75% ± 5%. Điều đó

chứng tỏ nguyên liệu Tritecpen chiết xuất từ rễ cây Hoàn ngọc là ổn định ở

điều kiện nhiệt độ 45oC ± 1oC và độ ẩm tương đối 75% ± 5% trong thời gian

6 tháng lão hóa cấp tốc. Như vậy ,về lý thuyết, nguyên liệu Tritecpen chiết

xuất từ rễ cây Hoàn ngọc sẽ ổn định trong hơn 24 tháng ở điều kiện bảo quản

bình thường (nhiệt độ 25oC và độ ẩm tương đối 75%).

3.8 Nghiên cứu độc tính và khả năng kháng u của Trà vàng Hoàn Ngọc:

3.8.1 Điều chế cao chiết etanol 96% từ trà vàng Hoàn Ngọc:

Công thức của Trà vàng Hoàn Ngọc bao gồm: Hoàn Ngọc rễ (65g), Hoàn

Ngọc lá (35g), cúc hoa (19g) và hoa ngâu (1g).

diclomethan phải

trong

Hàm

lượng

nước

Không quá 1,0% Đạt

(0,8%)

Đạt

(0,9%)

Đạt

(0,8%)

Đạt

(0,9%)

Đạt

(0,8%)

Đạt

(0,9%)

Đạt

(0,9%)

Tạp

chất

liên

quan

Phải đạt theo quy

định Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt

Định

lượng

Chế phẩm phải

chứa tổng hàm

lượng 2 chất

lupeol (C30H50O)

và betulin

(C30H50O2) ≥

80% trong đó

hàm lượng

Lupeol ≥ 50% và

hàm lượng

Betulin ≥ 30%,

tính theo chế

phẩm khan.

Đạt

Lupeol

(56,6)

Betulin

(31,8)

Đạt

Lupeol

(56,8)

Betulin

(32,1)

Đạt

Lupeol

(57,0)

Betulin

(31,9)

Đạt

Lupeol

(56,2)

Betulin

(31,7)

Đạt

Lupeol

(57,0)

Betulin

(31,2)

Đạt

Lupeol

(56,9)

Betulin

(32,3)

Đạt

Lupeol

(56,7)

Betulin

(31,6)

70

Điều chế cao chiết etanol 96% từ trà vàng Hoàn Ngọc: 0,9 kg Trà vàng

Hoàn Ngọc ngâm chiết trong etanol 96% (6 lần, 24 giờ/lần). Các dịch chiết

được gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được 56 g cao

chiết etanol trà vàng Hoàn Ngọc (kí hiệu HNCV). Hiệu suất chiết đạt 6,22%

lượng nguyên liệu khô.

3.8.2 Độc tính cấp của cao chiết trà vàng Hoàn Ngọc:

Độc tính cấp của cao chiết etanol 96% Trà vàng Hoàn Ngọc được nghiên

cứu tại Khoa dược lý, Viện kiểm nghiệm Thuốc Trung ương.

Tài liệu thử:

1. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của thuốc từ dược thảo 2006.

2. OECD guidelines for testing of chemicals. Acute oral toxicity - Fixed

dose procedure OECD 420, 2001.

3.8.2.1 Động vật thí nghiệm:

- Loài: chuột nhắt trắng giống Swiss.

- Cân nặng: 18-20 g.

- Số lượng: 70 con

- Nguồn gốc cung cấp: Viện vệ sinh dịch tễ trung ương.

- Điều kiện chăm sóc: Động vật thí nghiệm (ĐVTN) được nuôi trong điều

kiện chuồng thoáng mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của

chuột.

- Cân nặng: Tất cả ĐVTN được để ổn định trước khi tiến hành thử

nghiệm và theo dõi cân nặng khi tiến hành thử nghiệm.

3.8.2.2 Mẫu thử:

a) Thử sơ bộ:

71

- Cách xử lý và chuẩn bị mẫu thử: Pha loãng cao đặc với dung dịch tinh

bột khoai tây 1% . Dùng hỗn dịch có chứa khoảng 0,54 g cao đặc/ml

(hd A) để thử sơ bộ.

- Thăm dò ở mức liều không làm chết chuột thí nghiệm:

Cho 10 chuột uống hd A, mỗi chuột 0,1ml (tương đương mức liều 2,7

g cao đặc/ kg chuột). Sau 24 giờ theo dõi không có chuột thí nghiệm

bị chết.

- Thăm dò mức liều làm chết 100% số chuột thí nghiệm:

Cho 10 chuột uống hd A, mỗi chuột 0,5 ml (tương đương mức liều 13,5

g cao đặc/ kg chuột). Sau 24 giờ theo dõi 100% chuột thí nghiệm bị chết.

b) Thử nghiệm chính thức:

- Các mức liều thử nghiệm:

Mức liều 1: 2,7 g cao đặc/ kg chuột





- Cách xử lý mẫu và chuẩn bị mẫu thử:

Cân chính xác một lượng cao đặc, cho từ từ dung dịch tinh bột khoai tây

1% nghiền kỹ để tạo thành hỗn dịch mịn, đồng nhất chứa 0,54 g cao đặc/ml

hỗn dịch.

3.8.2.3 Tiến hành:

- Chuột được nhịn ăn 15 giờ trước khi thí nghiệm, nước uống theo nhu

cầu. Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm. Chuột đạt các yêu cầu về cân

nặng được đưa vào thử nghiệm.

72

- Cách dùng: Lấy thể tích mẫu thử theo quy định đưa thẳng vào dạ dày

chuột bằng kim cong đầu tù.

- Dựa trên kết quả thăm dò trong thử nghiệm sơ bộ, tiến hành thử nghiệm

chính thức trên 50 chuột, chia thành 5 nhóm thử theo mức liều đã dự tính. Các

nhóm thử được uống dung dịch thử ở các mức liều và số lần đưa mẫu thử như

sau:

Nhóm

chuột

Liều dùng

(ml hỗn dịch thử/20g chuột)

Liều dùng

(g cao đặc/kg chuột)

Số chuột

thí nghiệm

Mức liều 1 0,1 ml dd thử 2,7 g cao đặc/kg chuột 10




Mức liều 5 0,5 ml dd thử 13,5g cao đặc/kg chuột 10

- Lịch theo dõi: Theo dõi biểu hiện của chuột sau khi uống trong 24 giờ

đầu và theo dõi hoạt động của ĐVTN trong thời gian 7 ngày sau khi uống.

3.8.2.4 Theo dõi:

a. Tiêu thụ thức ăn và uống của chuột:

Sau khi uống dung dịch thử: Ở mức liều 1 không nhận thấy biểu hiện ngộ

độc, chuột ăn uống hoạt động bình thường. Ở mức liều 2,3,4 và 5 sau khi

uống mẫu thử khoảng 1,5 giờ, một số chuột có biểu hiện ngộ độc và chết. Số

chuột sống sót sau khi cho uống 24 giờ ở các nhóm đều ăn uống, hoạt động

bình thường.

b. Quan sát dấu hiệu ngộ độc:

Sau khi uống dung dịch thử: Ở mức liều 1, không nhận thấy có biểu hiện

ngộ độc, ở mức liều 2, 3, 4 và 5, chuột có biểu hiện nằm mệt, vã mồ hôi, giảm

hoạt động, và thở gấp. Một số chuột chết trong khoảng 1,5 - 4 giờ, số khác

73

chết trong khoảng 24 giờ theo dõi tiếp theo. Số lượng chuột chết ở các nhóm

tỷ lệ thuận với mức liều thử. Chuột chết trong tình trạng kích động, co giật.

3.8.2.5 Kết quả:

Bảng số liệu:

Mức liều

Liều thử

(g cao đặc/kg chuột)

Số chuột chết/ sống thực tế

Số chuột chết/ sống kỳ vọng

% Chết

1 2,7 0/10 0/26 0

2 5,4 2/8 2/16 11,1

3 8,1 5/5 7/8 46,7

4 10,8 7/3 14/3 82,3

5 13,5 10/0 24/0 100

Vẽ đồ thị theo các số liệu trên bảng:

74

Tính LD50 theo Behrens:

( 50 – a) x d

LD50 = A + ----------------

b – a

Trong đó: A - Liều gây chết a% ĐVTN

a - % ĐVTN chết sát dưới 50% sao cho a < 50%

b - % ĐVTN chết sát trên 50% sao cho b >50%

d - khoảng cách giữa các liều (g)

Theo bảng trên, ta có:

a = 46,7% b = 82,3%

A = 8,1 g cao đặc/ kg chuột d = 2,7 g cao đặc/ kg

chuột

( 50 – 46,7) x 2,7

LD50 = 8,1 + ------------------------ = 8,35 mg mẫu thử/ kg chuột

82,3 – 46,7

Tính sai số chuẩn:

kSd

(SLD50)2 = -------------

n

Trong đó:

k: hệ số Behrens = 0,66

n: Số chuột trong mỗi nhóm.

LD84 - LD16

S = ----------------

2

Theo đồ thị, ta có:

LD16 = 5,9 g cao đặc/ kg chuột

LD84 = 11,0 g cao đặc/ kg chuột

11,0 – 5,9

S = ------------------- = 2,55 g cao đặc/ kg chuột.

2

75

kSd 0,66 x 2,55 x 2,7

Sai số chuẩn: (SLD50)2 = ------------- = ------------------------- = 0,45441

n 10

SLD50 = 0,67 g cao đặc/ kg chuột

Vậy LD50 = (8,35 ± 0,67) g cao đặc/ kg chuột.


Mẫu thử HNCV thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng có kết quả như sau:

Sau khi uống thuốc, chuột có các biểu hiện ngộ độc như sau: Chuột giảm

hoạt động, nằm mệt, vã mồ hôi, thở gấp và chết trong tình trạng co giật, kích

động. Riêng nhóm thử 1, không nhận thấy có biểu hiện ngộ độc. Sau khi uống

khoảng 2 giờ bắt đầu có chuột chết ở các nhóm 2, 3, 4, và 5. Trong vòng 24

giờ sau khi uống, nhóm thử 5 gây chết 100% số chuột thử nghiệm, các nhóm

2, 3 và 4 có chuột chết tăng dần theo mức liều. Trong thời gian theo dõi tiếp

theo (sau khi uống 24 giờ đến 7 ngày) không có thêm chuột chết. Toàn bộ số

chuột không chết sau khi uống 24 giờ ở các nhóm đều ăn uống, hoạt động

bình thường.

Trong thử nghiệm này, chúng tôi đã tìm được liều không gây chết chuột

là 2,7 g cao đặc/ kg chuột, liều gây chết 100% số chuột thử nghiệm là 13,5 g

cao đặc/ kg chuột. Dựa trên số liệu thực nghiệm, chúng tôi đã tìm được liều

LD50 trong khoảng (8,35 ± 0,67) g cao đặc/kg chuột.

3.8.3 Nghiên cứu khả năng kháng u của cao chiết etanol Trà vàng Hoàn Ngọc:

Khả năng kháng u của cao chiết etanol Trà vàng Hoàn Ngọc đang được

tiến hành theo phương pháp như đã trình bày ở phần khả năng kháng u của

sản phẩm Tritecpen-HN ở mục 3.5.1 trên 24 chuột BALB/c khoẻ mạnh, có

độ tuổi từ 9-10 tuần tuổi, có khối lượng từ 26-28g, được chia làm 4 lô (6

chuột/lô):

76

Lô 1: tiêm LLC, đồng thời cho uống Tween 20 ở nồng độ 10%, là dung

môi hòa tan mẫu

Lô 2: tiêm LLC đồng thời cho uống Dịch chiết etanol Trà vàng Hoàn


Lô 3: tiêm LLC, đồng thời cho uống Dịch chiết etanol Trà vàng Hoàn


Lô 4: tiêm LLC, đồng thời cho uống Dịch chiết etanol Trà vàng Hoàn



Nghiên cứu khả năng ức chế sự phát triển khối u sơ cấp của Dịch chiết

etanol Trà vàng Hoàn Ngọc Hoàn Ngọc.

Nghiên cứu khả năng kéo dài tuổi thọ của Dịch chiết etanol Trà vàng

Hoàn Ngọc trên chuột bị gây u.

Nghiên cứu khả năng chống khối u ung thư di căn của Dịch chiết etanol

Trà vàng Hoàn Ngọc bằng trực quan và mô bệnh học trên chuột gây u

thực nghiệm

Nghiên cứu ảnh hưởng của Dịch chiết etanol Trà vàng Hoàn Ngọc đối

với sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học, chỉ tiêu sinh hoá máu từ đó

đánh giá chức năng gan, thận.


a) Kết quả xác định khả năng ức chế khối u của Cao dịch chiết etanol 96%

từ Trà vàng Hoàn Ngọc trên chuột gây u thực nghiệm bằng dòng tế bào

LLC

Để đánh giá khả năng ức chế khối u của cao dịch chiết etanol Trà vàng

Hoàn Ngọc trên chuột gây u thực nghiệm, chúng tôi tiến hành theo phương

pháp của Abrham (1978) và Iigo (1991) như đã mô tả ở trên. Theo đó, chuột

77

được kiểm tra khối lượng và đo kích thước khối u sơ cấp 5 ngày/1 lần tính từ

thời điểm tiêm tế bào LLC. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12.

Bảng 3.12. Kết quả nghiên cứu khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển

Lô thí nghiệm 0 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày

Lô 1: Đối

chứng

Khối lượng

trung bình

(gram/con)

24,63 ±0,95

22,55

±1,12 26,13 ±0,48

26,75

± 0,50

27,13

± 0,25

27,18

± 0,35

26,78

± 0,72

Thể tích khối

u (mm3) 0

150,33 ± 36,66

1257,33

±75,11 1859,33 ±95,20

3369,00±92,15

5181,00±138,16

7412,17

±71,51

Số chuột chết 0 0 0 0 0 0 1

% ức chế 0 0 0 0 0 0 0

Lô 2: 1000

mg/kgP/ngày

Khối lượng

trung bình

(gram/con)

24,00

± 0,54

24,50

± 0,21

25,28

± 0,36

26,06

± 2,30

27,50

± 2,66

28,50

± 3,26

30,04

± 3,20

Thể tích khối

u (mm3) 0 73,88

± 22,75 1068,00± 40,28

1462,75

± 87,36

3215,38

± 76,62

4728,38

±103,03

6791,75

± 150,50


% ức chế 0 50,85 15,06 21,33 4,56 8,74 8,37

Lô 3: 2000

mg/kgP/ngày

Khối lượng

trung bình

(gram/con)

24,63 ±0,11

25,05 ±0,61

24,80 ±0,90

25,05 ±0,61

25,50

± 1,31

26,95

± 2,08

26,93

± 2,35

Thể tích khối

u (mm3) 0

73,88 ±22,75

764,75 ±86,99

1201,13

±74,27

2991,5

±86,61 4397,63 ±184,51

6299,13

± 153,71


% ức chế 0 50,86 39,18 35,40 11,21 15,12 15,02

Lô 4: 3000

mg/kgP/ngày

Khối lượng

trung bình

(gram/con)

24,75

± 0,29

25,58

± 0,85

25,63

± 1,03

25,58

± 0,85

24,00

± 2,45

23,33

± 2,82

22,73

± 2,42

Thể tích khối

u (mm3) 0

74,83

± 19,71

757,50

5,95

1141,67

± 40,06

1870,50

±101,58

2601,00

±165,50

3694,50

±148,29


% ức chế 0 50,22 40,55 38,60 44,48 49,80 50,16

78


Khả năng bảo vệ chung và kéo dài tuổi thọ cho động vật nghiên cứu của

cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc

Chuột thí nghiệm được uống Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn

Ngọc ở liều 1000 và 2000 mg/kgP/ngày không bị chết con nào tại thời điểm

kết thúc thí nghiệm, trong khi đó ở lô được sử dụng Cao dịch chiết etanol

96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc liều cao 3000 mg/kgP/ngày có 1 chuột bị chết.

Chuột ở lô đối chứng (bị gây u mà không được uống hoạt chất bảo vệ) cũng

bị chết 1 chuột. Như vậy, Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc

ở liều cao có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u sơ cấp so với đối chứng

nhưng lại ảnh hưởng đến cơ thể động vật thí nghiệm, làm khối lượng cơ thể

giảm và chưa thể hiện rõ khả năng bảo vệ chung và kéo dài tuổi thọ cho động

vật bị u khi cho uống liều cao và dài ngày. Cao dịch chiết này ở liều thấp hơn

2000 mg/kgP/ngày không gây chết chuột và cũng có khả năng ức chế khối u

nên cho thấy khả năng kéo dài tuổi thọ cho chuột bị u. Tuy nhiên, những kết

quả này mới chỉ là ban đầu và cần nghiên cứu ở cấp độ sâu hơn và với số

lượng chuột lớn hơn.

Khả năng ức chế khối u phát triển


- Sử dụng Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc liều 1000

mg/kgP/ngày, sau 30 ngày thí nghiệm ức chế được 8,37% sự phát triển

khối u sơ cấp so với lô đối chứng (chuột bị gây u không uống hoạt chất).


mg/kgP/ngày sau 30 ngày thí nghiệm ức chế được 15,02% sự phát triển

khối u sơ cấp so với lô đối chứng (chuột bị gây u không uống hoạt chất).


mg/kgP/ngày cho thấy rõ việc ức chế sự phát triển của khối u một cách

rõ ràng, có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) so với lô đối chứng (không uống

79

hoạt chất). Phần trăm ức chế sự phát triển của khối u ở liều này sau 30

ngày cho uống hoạt chất là 50,16%. Thể tích khối u sau quá trình thí

nghiệm là có sự sai khác có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lô đối

chứng (không được sử dụng Cao dịch chiết cồn từ cây Hoàn Ngọc).

- Đây là một kết quả khả quan và có thể nhận định rằng Cao dịch chiết

etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc có khả năng ức chế sự phát triển

khối u ung thư bắt đầu ở mức liều 3000 mg/kgP/ngày. Tuy nhiên, ở liều

này Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc lại có thể gây ảnh

hưởng đến cơ thể động vật thí nghiệm, làm chết động vật.


trình đánh giá khối lượng u sơ cấp sau quá trình thí nghiệm 30 ngày. Kết quả


Hình 2. Chuột bị gây u bằng dòng tế bào LLC

Bảng 3.13. Khối lượng u sơ cấp tại thời điểm kết thúc thí nghiệm

Liều Khối lượng u sơ cấp

(g)

ĐC âm 12,83 0,82

1000 mg 10,27 0,91

2000 mg 8,40 0,35

3000 mg 6,73 0,29

80

Số liệu ở bảng 3.13 cho thấy khối lượng u sơ cấp tại vị trí tiêm tế bào LLC

ở lô không được sử dụng hoạt chất Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng

Hoàn Ngọc là lớn nhất. Các lô được sử dụng Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà

vàng Hoàn Ngọc khối lượng u sơ cấp có khối lượng khối u nhỏ đáng kể hơn

so với đối chứng và có ý nghĩa thống kê (P< 0,05). Điều này một lần nữa

khẳng định Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc có khả năng ức

chế khối u phát triển. Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc liều

3000mg/kgP/ngày đã cho thấy rõ khả năng ức chế khối u sơ cấp phát triển,

khối lượng u sơ cấp là 6,73g sau 30 ngày cho uống hoạt chất, trong khi đó ở

lô đối chứng không được sử dụng hoạt chất là 12,83g.

(A) (B)

Hình 1. U sơ cấp tại vị trí tiêm (sau giải phẫu)

(A). Nhìn từ trái qua phải: ĐC (-), ĐC (-), liều 1000 mg, 2000 mg và 3000 mg.

(B). Nhìn từ trái qua phải: ĐC (-), ĐC (-), liều 3000 mg, 1000 mg và 2000 mg.

b) Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu chuột bị gây u và được uống

Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc

Tại thời điểm kết thúc thí nghiệm (30 ngày), toàn bộ chuột được lấy

máu làm các xét nghiệm sinh hóa. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa máu

được trình bày ở bảng 3.14.

81

Bảng 3.14: Sự thay đổi các chỉ tiêu hoá sinh máu chuột bị gây u sau khi cho uống

Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc

Các chỉ tiêu Liều 0

mg/kgP/ngày

Liều 1000

mg/kgP/ngày

Liều 2000

mg/kgP/ngày

Liều 3000

mg/kgP/ngày

Chuột khỏe

mạnh, không u

Hồng cầu

(106/L) 6,98 ± 0,17 5,26 ± 0,52 7,82 ± 0,58 9,06 ± 0,33 9,54 ± 0,37

Bạch cầu

(103/L) 73,00 ± 10,18 63,15 ± 27,51 23,45 ± 10,82 16,50 ± 4,95 9,62 ± 0,68

Tiểu cầu

(103/L) 348,5 ± 26,16 327,5 ± 4,95

385,50 ± 20,51

471,00 ± 7,07 527,17 ± 10,15

Hemoglobin

(g/dL) 10,3 ± 0,71 9,05 ± 1,77 12,80 ±1,41 15,05 ± 0,92 14,87 ± 0,45

SGOT

(U/L) 723,50 ± 102,53

470,00 ± 60,81

453,50 ± 10,61

423,50 ± 6,36 91,17 ± 4,79

SGPT (U/L) 52 ±11,31 44 ± 1,41 39,50 ± 2,12 34,00 ±1,41 37,83 ± 12,12

Creatin

(minimol/L) 23,00 ± 1,41 26,00 ± 5,66 25,00 ± 4,24 24,00 ±1,41 21,00 ± 1,67

Bảng 3.14 cho thấy: Chuột bị gây u và được uống hoạt chất Cao dịch

chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc liều 2000 và 3000 mg/kgP/ngày thì

hầu hết các chỉ tiêu hóa sinh và huyết học đã được phục hồi nhiều so với

không được sử dụng hoạt chất, tuy vẫn còn khác so với đối chứng dương là

chuột hoàn toàn khỏe mạnh. Như vậy, có thể nói Cao dịch chiết etanol 96% từ

Trà vàng Hoàn Ngọc có khả năng ảnh hưởng và thay đổi hoạt động hệ miễn

dịch theo chiều hướng tích cực trên cơ thể động vật bị gây u.

c) Kết quả kiểm tra giải phẫu các cơ quan nội tạng




82

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọctrên

mô bệnh học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm

Mô Lô 1: 0 mg Lô 2: 1000 mg Lô 3: 2000 mg Lô 4: 3000 mg

Gan

Màu nâu hồng,

mô đồng nhất

Màu nâu, mô

gan đều

Màu nâu, mô

gan đều

Màu nâu, mô

gan đều

Thận

Màu nâu nhạt,

hai thận đều

nhau

Màu nâu nhạt,

hai thận đều

nhau

Màu nâu nhạt,

hai thận đều

nhau

Màu nâu nhạt,

hai thận đều

nhau

Lách Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Màu nâu đậm,

mô đồng nhất

Phổi Màu hồng tươi,

hai bên đều

nhau

Màu hồng tươi,

hai bên đều

nhau

Màu hồng tươi,

hai bên đều

nhau

Màu hồng tươi,

hai bên đều

nhau

Bảng 3.15 cho thấy: Các lô thí nghiệm được sử dụng Cao dịch chiết

etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc cho thấy không có nội quan bị di căn từ

khối u sơ cấp ban đầu. Các cơ quan nội tạng khác nhau là dạ dày, gan, lách,

thận, tuyến vú ... đều không thấy xuất hiện u. Lô đối chứng (không sử dụng

hoạt chất Dịch chiết cồn từ cây Hoàn Ngọc) cũng không thấy có hiện tượng u

di căn.


- Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc không có khả năng kéo

dài tuổi thọ cho chuột bị u thực nghiệm ở mức liều trung bình. Liều cao

uống dài ngày có khả năng gây độc.

- Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc có khả năng ức chế sự

phát triển của tế bào ung thư trong các khối u thực nghiệm trên mô hình

chuột bị gây ung thư in vivo, cụ thể như sau:

o Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc liều 1000

mg/kgP/ngày có khả năng ức chế 8,37 % sự phát triển của các tế bào

ung thư so với đối chứng.

83


mg/kgP/ngày có khả năng ức chế 15,02% sự phát triển của các tế bào

ung thư so với đối chứng.


mg/kgP/ngày có khả năng ức chế 50,16% sự phát triển của các tế bào

ung thư so với lô đối chứng .

- Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc chưa thể hiện rõ khả

năng chữa trị ung thư với hiệu quả cao.

- Cao dịch chiết etanol 96% từ Trà vàng Hoàn Ngọc có khả năng thay đổi

một số chỉ tiêu huyết học và enzyme chức năng gan, thận theo chiều hướng

tích cực.

3.9 Các kết quả khác:

Bài báo khoa học: Đã đăng 01 một bài báo

Huong Doan Thi Mai; Hang Nguyen Thi Minh; Pham Van Cuong; Kim

Nga Bui; Van Hung Nguyen; Van Minh Chau, Lignans and Other

Constituents from the Roots of the Vietnamese Medicinal Plant

Pseuderanthemum palatiferum, Planta Med 2011; 77: 951-954

Bằng sáng chế: Đã đăng ký được một bằng sáng chế “Hợp chất

diepoxylignan và phương pháp chiết hợp chất này ra khỏi rễ cây Hoàn Ngọc”

số 9119 theo Quyết định số 3182/QĐ-SHTT ngày 01/03/2011.

IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 Kết luận:

Đề tài đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu và sản phẩm đề ra.

Hiện nay, DNTN Trà Hoàn Ngọc đã có 20 ha cây trồng ở độ tuổi từ 1đến

nhiều hơn 7 năm. Chăm sóc cây Hoàn Ngọc theo độ tuổi từng năm và thu

hái nguyên liệu theo từng độ tuổi từ 1 đến 7 năm vào thời gian phù hợp

trong năm.

84

Đã nghiên cứu thành phần tri tecpen cũng như thành phần hóa học của rễ

cây Hoàn Ngọc. Kết quả cho thấy thành phần chính của rễ cây là 2

tritecpen lupeol và betulin. Trên cơ sở đó lựa chọn rễ cây làm nguyên liệu

để chiết xuất tritecpen.

Đã nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất và tinh chế tổng

tritecpen từ rễ cây Hoàn Ngọc trên quy mô 0,5 kg sản phẩm/mẻ. Hiệu suất

tổng tritecpen thu được đạt ~ 0,5 % tính theo trọng lượng nguyên liệu khô.

Sản phẩm này có thành phần bao gồm Lupeol (~57%), betulin (~32%),

-sitosterol (~8%), -sitosterol glucoside (~1 %), lupenone (~0,5%),

epifriedelanol (~0,4%) và chất màu (~1,1%) . Đã chiết xuất được 1 kg sản

phẩm.

Sản phẩm tổng tritecpen chiết xuất ra (Tritecpen-HN) đã được nghiên cứu

độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và khả năng kháng u. Kết quả cho

thấy Tritecpen-HN không gây độc cấp tính trên chuột thực nghiệm (theo

tiêu chuẩn của tổ chức OECD). Tritecpen-HN có khả năng gây độc bán

trường diễn ở mức liều cao là ≥ 1000 mg/kgP/ngày. Ở mức liều trung bình

và thấp là 500 mg/kgP/ngày, hoạt chất này không gây độc bán trường

diễn trong khoảng thời gian nghiên cứu 30 ngày, không ảnh hưởng đến các

chỉ tiêu huyết học và một số enzyme chức năng gan, thận là SGPT, SGOT

và Creatinin. Tritecpen-HN có khả năng kéo dài tuổi thọ cho chuột bị u

thực nghiệm ở mức liều trung bình. Liều cao có khả năng gây độc.

Tritecpen-HN có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư trong

các khối u thực nghiệm trên mô hình chuột bị gây ung thư in vivo, cụ thể

như sau: Tritecpen-HN liều 200 mg/kgP/ngày không cho thấy khả năng

ức chế sự phát triển của các khối u so với đối chứng. Tritecpen-HN liều

500 mg/kgP/ngày có khả năng ức chế 19,99% sự phát triển của các tế bào

ung thư so với đối chứng. Tritecpen-HN liều 1000 mg/kgP/ngày có khả

năng ức chế 63,85% sự phát triển của các tế bào ung thư so với lô đối

85

chứng .

Đã nghiên cứu và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm Tritecpen-HN.

Đánh giá độ ổn định của sản phẩm theo phương pháp lão hóa cấp tốc ở

45oC ± 1oC và độ ẩm tương đối 75% ± 5% cho thấy sản phẩm Tritecpen-

HN chiết xuất từ rễ cây Hoàn ngọc là ổn định ở điều kiện nhiệt độ 45oC ±

1oC và độ ẩm tương đối 75% ± 5% trong thời gian 6 tháng lão hóa cấp tốc.

Do đó về mặt lý thuyết sản phẩm này sẽ ổn định trong hơn 24 tháng ở điều

kiện bảo quản bình thường (nhiệt độ 25oC và độ ẩm tương đối 75%).

Đã nghiên cứu khả năng kháng u của cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn

Ngọc. Kết quả cho thấy với liều 3000 mg/kgP/ngày cao dịch chiết nước có

khả năng ức chế 19,82 % sự phát triển của các tế bào ung thư so với đối

chứng. Cao dịch chiết nước từ rễ cây Hoàn Ngọc liều 5000 mg/kgP/ngày

có khả năng ức chế 37,03% và liều 7000 mg/kgP/ngày có khả năng ức chế

60,68% sự phát triển của các tế bào ung thư so với lô đối chứng .

Ngoài ra chúng tôi đã nghiên cứu độc tính cấp và khả năng kháng u của

cao chiết etanol 96% của sản phẩm Trà vàng Hoàn Ngọc đang được lưu

hành trên thị trường. Kết quả thử độc tính cấp đã xác định được giá trị liều

LD50 trong khoảng (8,35 ± 0,67) g cao đặc/kg chuột. Kết quả nghiên cứu

khả năng kháng u của sản phẩm này cho thấy cao chiết etanol trà vàng

Hoàn Ngọc với liều 1000 mg/kgP/ngày có khả năng ức chế 8,37 %, liều

2000 mg/kgP/ngày có khả năng ức chế 15,02% và liều 3000 mg/kgP/ngày

có khả năng ức chế 50,16% sự phát triển của các tế bào ung thư so với lô

đối chứng.

Đã thanh quyết toán tài chính đúng dự toán và theo quy định của nhà

nước.

Về tiến độ, đề tài thực hiện cơ bản đúng tiến độ. Thời gian thực hiện đề tài

được giao là từ tháng 2/2011 đến tháng 2/2012, được gia hạn đến hết

tháng 5/2012.

86

4.2 Kiến nghị

Trên cơ sở các kết quả đạt được và nhận thấy tiềm năng có thể sử dụng

một số sản phẩm từ cây Hoàn Ngọc (sản phẩm tổng tritecpen, cao dịch

chiết nước, cao chiết etanol trà vàng Hoàn Ngọc) đặc biệt là sản phẩm

tổng tritecpen từ rễ cây dưới dạng chế phẩm hỗ trợ và phòng chống khối u,

đề nghị Ban điều hành chương trình Hóa dược tiếp tục ủng hộ Doanh

nghiệp Tư nhân Trà Hoàn Ngọc để có thể nhanh chóng đưa các sản phẩm

này phục vụ sức khỏe cộng đồng.

Cần tiếp tục nghiên cứu để bổ sung và đi sâu vào các nội dung sau:

- Nghiên cứu hoàn thiện quy trình để nâng cao hiệu suất chiết các sản

phẩm từ cây Hoàn Ngọc.

- Nghiên cứu bào chế các sản phẩm và các tính chất dược học của chúng.

- Tiếp tục nghiên cứu theo dõi khả năng ức chế khối u của các sản phẩm

trong thời gian dài ở mức liều an toàn.

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Cơ quan chủ trì đề tài

Giám đốc

Chủ nhiệm đề tài


87

Tài liệu tham khảo:

1. Khanh TC, The truth of a miraculous medicinal plant: Pseuderanthemum

palatiferum. J Med Health 101:10-11(1997).

2. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, quyển 3, trang 69 (2000).

3. Phan Minh Giang, Hà Việt Bảo, Phan Tống Sơn, Nghiên cứu hoạt tính chống

oxy hoá và khảo sát sơ bộ tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các phần chiết

giàu flavonoid từ lá Xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.),

Tạp chí Dược học, 45 (9), 9-12 (2005).

4. Huỳnh Kim Diệu, Hiệu quả điều trị bệnh tiêu chảy heo con của các chế phẩm từ

lá cây Xuân hoa so với kháng sinh, Khoa học Kỹ thuật Thú y, tập XIV, số 5, 56-

60 (2007).

5. Huynh Kim Dieu, Chau Ba Loc, Seishi Yamasaki and Yutaka Hirara, the effects

of Pseuderanthemum palatiferum, a new medicinal plant, on growth

performances and Diarrhea of piglets, JARQ, 40(1), 85-90, 2006

6. Padee P, Nualkeaw S, Current information of medicinal plants:

Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk., J Health Sci 8:131–138 (2009).

7. P. Padee, S. Nualkaew, C. Talubmook, S. Sakuljaitrong, Hypoglycemic effect of

a leaf extract of Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk. in normal and

streptozotocin-induced diabetic rats, Journal of Ethnopharmacology , 132, 491-496 (2010).

8. P. Khonsung, A. Panthong, N. Chiranthanut and S. Intahphuak, Hypotensive

effect of the water extract of the leaves os Pseuderanthemum palatiferum, J.

Nat. Med, 65:551-558 (2011).

9. Võ Hoài Bắc, Lê Thị Lan Oanh, Hàm lượng acid amin và các nguyên tố khoáng trong

lá cây Xuân hoa, Tạp chí Dược liệu, 8(1), 11-15, 2003.

10. Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Góp phần nghiên

cứu thành phần hóa học trong lá cây Xuân hoa, Tạp chí Dược liệu, 5(6), 163-

167, 2000.

11. Nguyễn Văn Hùng, Lê Anh Tuấn, Nguyễn Quyết Chiến, Tiếp tục nghiên cứu

thành phần hóa học cây Xuân hoa (Pseuderanthemum palatiferum), Tuyển

tập các session, Hội nghị Hóa học toàn quốc lần thứ IV, Tập III, 130-132, 2003.

12. Trần Công Khánh, Nguyễn Thị Minh Hằng, Đoàn Thị Mai Hương, Nguyễn Văn

Hùng, Nghiên cứu thành phần hóa học rễ cây Xuân hoa (Pseuderanthemum

palatiferum), Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 45(6), 309-314, 2007.

13. Alakurtti Sami, Ma kela Tarua, Koskimies Salmea, Yli-Kauhaluoma Jari,

Pharmacological properties of the ubiquitous natural product betulin, Eur J

Pharm Sci, 29, 1-13, 2006.

88

14. Pavel A. Krasutsky, Birch bark research and development, Nat. Prod. Rep. , 23,

919–942, 2006.

15. Bang Yeon Hwang, Hee-Byung Chai et al., Cytotoxic triterpenes from the

twigs of Celtis philippinensis, Phytochemistry ,62, 197–201, 2003.

16. Russ. Pat., 2,184,772, 2002.

17. A. Szuster-Ciesielska and M. Kandefer-Szerszn, Protective effects of betulin and

betulinic acid against ethanol-induced cytotoxicity in HepG2 cells, Pharmacol.

Rep., 57, 588–595, 2005.

18. http://www.betulin.ru/eng/.

19. PCT Int. Appl., WO 2001072315, 2001.

20. Ger. Pat., 19,824,454, 1999.

21. Russ. Pat., 2,251,407, 2005.

22. Jpn. Pat., 09067253, 1997.

23. Russ. Pat., 2,240,799, 2004.

24. Russ. Pat., 2,252,775, 2005.

25. Russ. Pat., 2,252,773, 2005.

26. Russ. Pat., 2,244,554, 2005.

27. Russ. Pat., 2,252,774, 2005.

28. Russ. Pat., 2,262,349, 2005.

29. Wojciech Rzeski, Andrzej Stepulak et al., Betulin Elicits Anti-Cancer Effects in Tumour Primary Culturesand Cell Lines In Vitro, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 105, 425–432, 2009.

30. M. Amjad, R. Carlson, P. Krasutsky and M. Karim, J. Microbiol. Biotechnol., 2004, 14, 1086.

31. US Pat., 5,750,578, 1998.

32. PCT Int. Appl., US 9802445, 1998.

33. US Pat., 6,369,101, 2002.

34. Russ. Pat., 2,244,554, 2005.

35. Russ. Pat., 2,240,799, 2004.

36. O. B. Flekhter, L. Karachurina et al., Synthesis and Pharmacological Activity of

Betulin Dinicotinate, Russ. J. Bioorg. Chem., 28, 494-500, 2002.

37. L. Baltina, O. B. Flekhter, L. Nigmatullina, E. Boreko, N. Pavlova, S. Nikolaeva,

O. Savinova and G. Tolstikov, Lupane Triterpenes and Derivatives with Antiviral

Activity, Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 3549, 2003.

38. S. Wada, A. Iida and R. Tanaka, Screening of Triterpenoids Isolated from

Phyllanthus flexuosus for DNA Topoisomerase Inhibitory Activity, J. Nat. Prod.,

89

64, 1545, 2001.

39. Nobuhiko Miura, Yoko Matsumoto, Shinichi Miyairi, Shoji Nishiyama, and Akira

Naganuma, Protective Effects of Triterpene Compounds Against the Cytotoxicity

of Cadmium in HepG2 Cells, Molecular Pharmacology, 56, 1324–1328, 1999.

40. R. Anand, G. K. Patnaik, D. K. Kulshreshtha and B. N. Dhawan, Antiurolithiatic

Activity of Lupeol, the Active Constituent Isolated from Crateva nurvala,

Phytother. Res., 8, 417- 421, 1994.

41. -J. You, N.-H. Nam, Y. Kim, K.-H. Bae and B.-Z. Ahn, Antiangiogenic Activity of

Lupeol from Bombax ceiba, Phytother. Res., 17, 341-344, 2003.

42. Mohammad Saleem, Mee-Hyang Kweon, Jung-Mi Yun, Vaqar Mustafa Adhami,

Naghma Khan, Deeba N. Syed, and Hasan Mukhtar, A Novel Dietary Triterpene

Lupeol Induces Fas-Mediated Apoptotic Death of Androgen-Sensitive Prostate

Cancer Cells and InhibitsTumor Growth in a Xenograft Model, Cancer Reseach,

65 (23), 2005, 11203 -11213.

43. Mohammad Saleemy, Imtiyaz Murtazay, Rohinton S.Tarapore1, Yewseok Suh,

Vaqar Mustafa Adhami, Jeremy James Johnson et al., Lupeol inhibits proliferation

of human prostate cancer cells by targeting β-catenin Signaling, Carcinogenesis,

30(5), 808–817, 2009.

44. Mohammad Saleemy, Satwinderjeet Kaury, Mee-Hyang Kweony, Vaqar Mustafa

Adhami, Farrukh Afaq and Hasan Mukhtar, Lupeol, a fruit and vegetable based

triterpene, induces apoptotic death of human pancreatic adenocarcinoma cells via

inhibition of Ras signaling pathway, Carcinogenesis, 26(11), 1956–1964, 2005.

45. US Pat. Appl., 2005201956, 2005

46. Mohammad Saleem1, Farrukh Afaq, Vaqar Mustafa Adhami1 and Hasan Mukhtar,

Lupeol modulates NF-B and PI3K/Akt pathways and inhibits skin cancer in CD-1

mice, Oncogene, 23, 5203-5214, 2004.

47. Hata K, Hori K, Takahashi S., Differentiation- and apoptosis-inducing activities by

pentacyclic triterpenes on a mouse melanoma cell line. J Nat Prod, 65, 645–8,

2002.

48. Aratanechemuge Y, Hibasami H, Sanpin K, Katsuzaki H, Imai K, Komiya T,

Induction of apoptosis by lupeol isolated from mokumen (Gossampinus

malabarica L. Merr) in human promyelotic leukemia HL-60 cells, Oncol Rep, 11,

289–92, 2004.

49. R. Anand, G. K. Patnaik, D. K. Kulshreshtha and B. N. Dhawan, Antiurolithiatic

Activity of Lupeol, the Active Constituent Isolated from Crateva nurvala,

Phytotherapy Research, 8, 417-421, 1994.

50. PT Sudharsan, Y Mythili, E Selvakumar and P Varalakshmi, Cardioprotective

effect of pentacyclic triterpene, lupeol and its ester on cyclophosphamide-induced

90

oxidative stress, Human & Experimental Toxicology, 24, 2005, 313 - 318.

51. Periyasamy Thandavan Sudharsan, Yenjerla Mythili, Elangovan Selvakumar and

Palaninathan Varalakshmi, Lupeol and its ester ameliorate the cyclophosphamide

provoked cardiac lysosomal damage studied in rat, Molecular and Cellular

Biochemistry, 282, 2006, 23–29.

52. Periyasamy Thandavan Sudharsan, Yenjerla Mythili, Elangovan Selvakumar and

Palaninathan Varalakshmi, Lupeol and its ester inhibit alteration of myocardial

permeability in cyclophosphamide administered rats, Molecular and Cellular

Biochemistry 292: 39–44, 2006.

53. Fernandez,A.Alvarez,M.D.Garcia and M. T. Saenz, Anti-inflammatory effect of

Pimenta racemosa var. ozua and isolation of the triterpene lupeol, Farmaco, 56,

335-338, 2001.

54. PCT Int. Appl., WO 9309129, 1993.

55. V. Sudhahar, S. A. Kumar and P. Varalakshmi, Role of lupeol and lupeol linoleate

on lipemic-oxidative stress in experimental hypercholesterolemia, Life Sci., 2006,

78,1329-1335.

56. Fr. Pat., 2,857,596, 2005.

57. Jpn. Pat., 2004345959, 2004.

58. PCT Int. Appl., WO 2003082227, 2003.

59. Jpn. Pat., 10139601, 1998.

60. Jpn. Pat., 05186326, 1993.

61. Shashi B. Mahato and Asish P. Kundu, Review article number 98: 13C NMR

spectra of pentacyclic triterpenoids - a compilation and some salient features,

Phytochemistry, 1994, vol. 37, No. 6, pp. 1517-1575.

62. Moriarity D.M., Huang J., Yancey C.A., Zhang P., Setzer W.N., Lawton R.O.,

Bates R.B., Caldera S. (1998), Lupeol is the cytotoxic principle in the leaf

extract of Dendropanax cf. querceti, Planta Med., 64 (4), 370-372.

63. Fernandez M.A., De las Heras B., Garcia M.D., Saenz M.T., Villar A., New

insights into the mechanism of action of the anti-inflammatory triterpene

lupeol, J. Pharm. Pharmcol., 2001, 53(11), 1533-1539.

64. Atsushi Numata, Peiming Yang et al., Cytotoxic triterpenes from a Chinese

medicine, Goreishi, Chem. Pharm. Bull., 1989, 37(3), 648-651).

65. El Deed K.S., Al-Haidari R.A., Mossa J.S., Abdel Monem A.A., Phytochemical

and pharmacological studies of Maytenus forsskaoliana, Saudi Pharmaceutical

Journal, 2003, 11(4), 184-191

91

66. Vlietinck A.J., De Bruyne T., Apers S., Pieters L.A., Plant-derived leading

compounds for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV)

infection, Planta Med., 1998, 64 (2), 97-109.

67. Peter A, Ward RS., General methods for assignment of stereochemistry to 2,6-

diaryl-3,7-dioxabicyclo [3.3.0]actane lignans, Tetrahedron, 1976, 32, 2783-

2788.

68. Kikuchi T, Matsuda S, Kadota S, Tai T., Studies on the constituents of

medicinal and related plants in Sri Lanka. III. Novel sesquilignan from

Hedyotis lawsoniae, Chem. Pharm. Bull., 1985; 33, 1444-1451.

69. Anjaneyulu ASR, Ramaiah PA, Row LR, Pelter A, Ward RS.,The structure of

wodeshiol - the first of a new series of lignan, Tetrahedron Lett., 1975, 16,

2961-2964.

70. Han X, Corey EJ., A catalytic enantioselective total synthesis of (-)-wodeshiol,

Org Lett, 1999,1,1871-1872.

71. K. Ishiguro, S. Nagata, H. Fukumoto, M. Yamaki, S. Takagi and K. Isoi, A

flavanonol rhamnoside from Hypericum japonicum. Part 7. A dipeptide

derivative from Hypericum japonicum, Phytochemistry, 1991, vol. 30, No. 11,

pp. 3639-3641.

72. Yoshiki K., Hui-Kang W., Tsuneatsu N., Susumu K., Ichiro Y., Toshihiro F.,

Anti-AIDS agents. 30. Anti-HIV activity of oleanolic acid, pomolic acid, and

structurally related triterpenoids, J. Nat. Prod., 1998, 61, 1090-1095.

73. Catherine C. N., Abrahm J. V., Bing-Nam Z., David G. I. K. and Gerald B. H.,

Cytotoxic triterpene acids from the peruvian medicinal plant Polylepis

racemosa, Planta Med., 2000, 66(5), 483-484.

74. Abrham WB (1978) Techniques of animal and clinical toxicology. Med Pud

Chicago, p: 55 - 68.

75. Bergmeyer, H. U. and Bernt, E. (1974) Methods of Enzymatic Analysis, 2nd

ed. New York: Academic Press. Herman E H, Mhatre R M, Chadwick D P

(1974) Modification of some of the toxic effects of daunomycin (NSC-82,151)

by pretreatment with the antineoplastic agent ICRF 159 (NSC-129,943)

Toxicology and Applied Pharmacology, 27(3), 517-526.

76. Tuner A R (1965) Screening methods in pharmacology. Academic Press. New

York and London. 60-68.

77. WH0. Research guidelines for evaluating the safety and efficacy of herbal

medicines. Manila.

BÁO CÁO TỔNG HỢP - Cơ sở dữ liệu ngành hóa...

Documents

Transcript of BÁO CÁO TỔNG HỢP - Cơ sở dữ liệu ngành hóa...