BỘ NÔNG NGHIỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN NGHIÊN CỨU

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC

THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ

CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP

HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN

MÃ SỐ ĐỀ TÀI:

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II

Chủ nhiệm đề tài/dự án: ThS. Cao Thành Trung

TP.HCM – 2014

BỘ NÔNG NGHIỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN NGHIÊN CỨU

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC

THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ

CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)

NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP

HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN

MÃ SỐ ĐỀ TÀI:

Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài

Th.S. Cao Thành Trung

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn

TP.HCM - 2014

1

MỞ ĐẦU

Ngành nuôi trồng thủy sản có vai trò hết sức quan trọng trong việc phát triển

nền kinh tế của đất nước. Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có điều kiện tự

nhiên rất thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm thủy sản. Vài năm trở lại đây, các

tỉnh trong khu vực này phát triển khá nhanh nghề nuôi tôm thủy sản. Tuy nhiên,

ngoài những giá trị kinh tế mang lại ngành nuôi tôm còn phải đối mặt với nhiều

thách thức và rủi ro như dịch bệnh do vi sinh vật gây ra như vi nấm, vi khuẩn và

virus. Đặc biệt phải kể đến các bệnh trên tôm do virus gây ra đang là một trở ngại

lớn cho sự phát triển bền vững của ngành nuôi tôm trên thế giới cũng như Việt Nam

nói riêng.

Trong vài thập niên qua, bệnh do virus gây ra lúc đầu chỉ có 6 virus (năm

1989) được biết đến nhưng chỉ trong vài năm sau đó đã có hơn 20 virus (năm 1997)

được phát hiện (Hernández-Rodríguez và ctv., 2001), trong đó có thể kể đến bệnh

đốm trắng do WSSV gây thiệt hại nặng nề đối với nghề nuôi tôm sú Penaeus

monodon thì virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô

(IHHNV) lại gây thiệt hại to lớn cho nghề nuôi tôm Penaeus (Litopenaeus)

stylirostris với tỉ lệ tử vong lên tới 90% (Lightner, 1983). Kể từ khi IHHNV được

phát hiện ở Hawaii vào năm 1981, virus này đã lan truyền nhanh chóng và đã được

ghi nhận ở nhiều khu vực khác nhau. Với nhiều mức độ thiệt hại do IHHNV gây ra

đã được báo cáo từ nhiều trang trại nuôi tôm ở nhiều khu vực trên thế giới. Bằng

chứng cho thấy mức độ thiệt hại do virus gây ra ước tính khoảng 8,5 tỷ USD thì

riêng thiệt hại do IHHNV gây ra ước tính khoảng 0,5 – 1 tỷ USD (Lightner, 2005).

Trước những ảnh hưởng và thiệt hại do IHHNV gây ra trên các trang trại tôm,

nó đã được liệt vào danh mục vào những virus gây bệnh nguy hiểm trên tôm vào

năm 2000 của Tổ chức Thú y Thế giới (Office Internationnal des Epizooties - OIE)

(Lightner và ctv., 1997; OIE, 2009). Hơn nữa, Chương trình trang trại nuôi tôm

nước mặn của Hoa Kỳ (UMSFP) cũng công bố IHHNV là một trong những tác

nhân gây bệnh quan trọng ảnh hưởng đến giá trị kinh tế tôm thương phẩm và virus

này được liệt vào danh mục bệnh của tổ chức này (Lotz và ctv., 1995). Sau khi

2

Shike và ctv, (2000) công bố những thông tin về trình tự bộ gen của IHHNV được

phân lập ở Hawaii trên GenBank (AF218226) thì trình tự gen của một số chủng

IHHNV cũng được công bố rộng rãi ở nhiều nước khác trên thế giới. Qua những

nghiên cứu về vật liệu di truyền của các chủng IHHNV phân lập từ nhiều vùng trên

thế giới, các nhà khoa học cho rằng bộ gen của IHHNV khá ổn định (Tang và

Lightner, 2002). Và nhiều phương pháp chẩn đoán đã được phát triển hỗ trợ phát

hiện sớm sự hiện của virus IHHNV. Trong đó, tập trung chủ yếu là các phương

pháp phát hiện vật liệu di truyền của virus này. Như phương pháp PCR, Real-time

PCR, phương pháp lai tại chỗ, phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP đã được

giới thiệu cho phép phát hiện IHHNV nhanh chóng và tiện lợi (Rai và ctv., 2012).

Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, cho thấy trình tự IHHNV có rất nhiều biến

đổi khi nhiễm trên tôm sú (Tang và ctv. 2006; Saksmerprome và ctv., 2011). Sự

hiện diện của 2 type IHHNV A và B gắn vào bộ gen của tôm sú thì việc chẩn đoán

IHHNV rất phức tạp bởi các biến thể di truyền của virus trong các khu vực địa lý

khác nhau và sự tương đồng rất lớn về vật liệu di truyền giữa các type IHHNV. Bên

cạnh đó sự chèn trình tự IHHNV type lây nhiễm ngẫu nhiên vào bộ gen tôm sú

thường xảy ra mà những cặp mồi do OIE và bộ kít thương mại có thể bắt cặp với

trình tự chèn này như là trình tự đích. Dẫn đến kết quả chẩn đoán dương tính giả khi

sử dụng những qui trình này (Saksmerprome và ctv., 2010; 2011).

Hiện nay, vẫn còn có nhiều nghiên cứu trái ngược nhau về sự tác động của

virus lên sự tăng trưởng của tôm sú, một số nghiên cứu cho thấy, trên tôm sú nuôi ở

có hiện tượng dị dạng còi cọc, chậm lớn, phát triển có kích thước không đều khi

nhiễm IHHNV (Primavera & Quinitio., 2000; Rai và ctv., 2009). Một số nghiên cứu

khác cho rằng việc nhiễm IHHNV không có tác động lớn về sự phát triển của tôm

nuôi, cũng như số lượng trứng được đẻ và tỷ lệ nở trứng từ tôm mẹ nhiễm hay

không nhiễm cũng như sản lượng nuôi (Withyachumnarnkul và ctv., 2006; Flegel,

1997).

Sự lan truyền của virus này còn được nhiều nghiên cứu cho rằng chúng có thể

lan truyền theo cả trục dọc lẫn trục ngang, do đó mức độ lây nhiễm của virus này

3

trở nên nhanh chóng. Sự lan truyền theo trục dọc là khả năng truyền bệnh từ bố mẹ

mang mầm bệnh và truyền cho thế hệ sau của chúng (Mottle và ctv., 2003), trong

khi đó lan truyền theo trục ngang do tập tính ăn thịt lẫn nhau hay do nguồn nước bị

nhiễm (Lightner và ctv., 1983a,b). Mặc dù, có nhiều nghiên cứu về sự lan truyền

theo trục dọc cũng như theo trục ngang của IHHNV ở các loài tôm he như P.

stylirostris, P. vannamei nhưng có rất ít nghiên cứu về sự lan truyền của IHHNV

trên tôm sú Penaeus monodon.

Ở Việt Nam tôm nhiễm virus xảy ra hàng năm và IHHNV đã xuất hiện trên

tôm nuôi Việt Nam, chủ yếu lây nhiễm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Khảo sát

trên 307 mẫu tôm sú thu từ miền Trung, tây Nam Bộ và Đông Nam Bộ cho thấy có

đến 52% mẫu nghiên cứu nhiễm các type IHHNV khác nhau (Hùng và ctv., 2009).

Trong khi đó những hiểu biết về virus này trên tôm sú ở Việt Nam không nhiều do

có ít nghiên cứu về IHHNV mặc dù những hậu quả tiêu cực do loại vius này gây ra

cho ngành công nghiệp nuôi tôm đã được cảnh báo trên toàn thế giới. Chỉ có một

vài tổ chức chỉ tập trung ứng dụng các qui trình chẩn đoán PCR đã được OIE công

bố để phát triển các kít thương mại để chẩn đoán virus. Một nghiên cứu mới đây của

Hùng và ctv. (2009) cho thấy trình tự chủng IHHNV này có quan hệ rất gần với các

chủng IHHNV ở Đài Loan (AY 355307) và Thái Lan. Chưa có một nghiên cứu nào

về sự lây nhiễm IHHNV trên tôm sú bằng cách cho ăn hay sống chung với tôm

bệnh, như lây nhiễm từ mẹ sang con, hay lây nhiễm giữa các cá thể tôm mang

IHHNV và cá thể trong một quần đàn. Cũng như đánh giá sự hiện diện của chúng

trên tôm sú nuôi trong các mô hình ương nuôi khác nhau. Do đó, nghiên cứu này

của chúng tôi nhằm khảo sát có hay không sự hiện diện chủng mang di truyền khác

nhau của chủng IHHNV, để qua đó nhằm góp phần làm rõ thêm những thông tin về

chủng IHHNV nhiễm trên tôm sú ở Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng như phát triển

các công cụ chẩn đoán, đề xuất các giải pháp hạn chế sự lây lan và có biện pháp

phòng trị trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL.

4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở Đồng bằng Sông Cửu Long

2.1.1 Tình hình nuôi tôm

Trong những năm gần đây, ngành thủy sản với phát triển không ngừng đã và

đang trở thành ngành kinh tế đóng vai trò quan trọng trong việc xuất khẩu. Việt

Nam với lợi thế bờ biển dài chạy dọc theo địa lý từ Bắc chí Nam nên có một tiềm

năng to lớn cho sự phát triển của ngành thủy sản nước mặn và nước lợ. Trong đó,

nuôi tôm nước lợ chiếm một vị trí và vai trò quan trọng trong ngành thủy sản. Ngoài

những giá trị kinh tế mang lại trong việc xuất khẩu thu nguồn ngoại tệ lớn, ngành

nuôi tôm ở nước ta còn góp phần vào việc giải quyết công ăn việc làm cho đông đảo

người lao động. Theo Tổng cục thống kê (2010) cho thấy vào năm 2000 cả nước chỉ

có khoảng hơn 324.000 ha diện tích nuôi tôm nhưng trong vòng khoảng 10 năm trở

lại diện tích nuôi tôm đã tăng lên gần gấp đôi khoảng 629.000 ha vào năm 2008 và

diện tích nuôi trồng có xu hướng mở rộng vào những năm sau đó (năm 2013 là

652.612 ha).

Ở Việt Nam, các giống tôm nuôi chủ yếu có nguồn gốc tự nhiên như tôm sú,

tôm chì, tôm sắt, tôm nghệ và tôm thẻ được nhập vào nước ta ở thập niên gần đây.

Tuy nhiên, hiện nay tôm sú (Penaeus monodon) vẫn là loài quan trọng được nông

dân lựa chọn nuôi nhiều tại Việt Nam từ nhiều năm qua. Theo Tổng cục Thủy sản

Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn (2011) thì đến năm 2011 cả nước thả nuôi

được 656.425 ha tôm nước lợ thì trong đó diện tích nuôi tôm sú là 623.377 ha.

Trong nhiều năm tôm sú được xem là giống chính giúp đưa Việt Nam vào danh

sách những nước cung cấp tôm quan trọng của thế giới. Năm 2011, tôm sú vẫn giữ

vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt Nam với tổng giá trị xuất khẩu tôm

trong năm 2011 đạt 2,396 tỷ USD thì trong đó xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ

USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị.

Phần lớn diện tích nuôi tôm và sản lượng tôm tập trung từ Nam Bộ đặc biệt là

một số tỉnh ở ĐBSCL có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi để phát triển nghề nuôi

tôm he. Theo điều tra của Tổng cục Thủy sản Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông

5

thôn (2011), tổng diện tích thả nuôi tôm là 602.416 ha chiếm 91,8 % diện tích nuôi

tôm của cả nước, trong đó có diện tích nuôi tôm sú đã lên tới 588.419 ha. Các tỉnh

có diện tích nuôi tôm lớn như Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng,

Kiên Giang…

2.1.2 Tình hình dịch bệnh

Mặc dù ngành nuôi tôm mang lại nhiều thuận lợi về kinh tế và xã hội nhưng

cũng gặp phải nhiều khó khăn và thách thức cho ngành. Đó là tình hình dịch bệnh

do vi sinh vật gây ra, đặc biệt là virus trên tôm diễn biến rất phức tạp và khó lường.

Tình hình gia tăng nhanh về diện tích nuôi trồng kéo theo những vấn đề xử lý ao

nuôi, nguồn nước đặc biệt là con giống đầu vào không được kiểm soát chặt chẽ dẫn

đến dịch bệnh trên tôm thường xảy ra thường xuyên. Những dẫn chứng cụ thể từ

năm 1999 đến năm 2003, dịch bệnh tràn lan và bùng phát mạnh làm nhiều diện tích

nuôi tôm mất trắng do tôm chết hàng loạt. Do đó, nó gây ra nhiều thiệt hại to lớn về

tài sản và kinh tế của người nuôi. Qua những nghiên cứu và tìm hiểu cho thấy các

tác nhân gây bệnh cho tôm nuôi đều có nguồn gốc từ virus.

Các bệnh do virus gây ra và dẫn đến nhiều thiệt hại nặng nề về kinh tế cho

ngành nuôi tôm thâm canh phải kể đến như bệnh hoại tử gan tụy do

Hepatopancreatic Parvovirus (HPV), bệnh còi do Monodon Baculovirus (MBV),

bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng do virus

gây hội chứng đầu vàng (YHV - Yellow head virus), và trong những năm gần đây

(từ 2011 đến nay) bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS - Acute Hepatopancreatic

Necrosis Syndrome) do Vibrio parahaemolyticus mang gen độc gây ra khiến tôm

chết hàng loạt ở những vùng nuôi tôm trong nước (ở Đồng Bằng Sông Cửu Long và

các tỉnh Miền Trung). Gần đây, ở Việt Nam còn xuất hiện thêm bệnh do virus gây

bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) tuy nhiên chưa ghi

nhận được bất kỳ thiệt hại nào do virus này gây ra trên tôm nuôi. Những dấu hiệu

bệnh lâm sàng do virus này cho thấy không rõ ràng, bệnh không gây chết đối với

tôm sú nuôi và những thông tin tìm hiểu và nghiên cứu về virus này ở Việt Nam

hiện chưa có nhiều.

6

2.2. Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious

hypothermal and hemotopoietic necrosis)

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô có tác nhân gây bệnh là

virus hypothermal and hemotopoietic necrosis (IHHNV) còn có tên khoa học là

PstDNV (Penaeus stylirostris densovirus), đây là một trong số bệnh nguy hiểm trên

tôm Litopenaeus stylirostris. Bệnh IHHN lần đầu tiên được mô tả trên hệ thống

nuôi siêu thâm canh tôm L. stylirostris tại Hawaii năm 1981 (Lightner và ctv.,

1983). Khi mắc bệnh này, tôm L. stylirostris có tỷ lệ chết lên đến 90%. Sau khi

được phát hiện ở Hawaii, bệnh IHHN tiếp tục được phát hiện phân bố rộng rãi ở Mỹ

và các vùng nuôi ven bờ biển Thái Bình Dương. Ngay sau khi phát hiện IHHNV

trên tôm L. stylirostris các nhà khoa học đã phát hiện virus này có mặt ở cả tôm thẻ

chân trắng Penaeus vannamei cũng từ cùng khu vực phát hiện IHHNV trên tôm L.

stylirostris ở khu vực này, và những tôm thẻ này là vật mang virus không biểu hiện

các bệnh tích (Lightner và ctv, 1983; Bell và Lightner, 1984). Các nghiên cứu sau

này cho thấy IHHNV là nguyên nhân gây biến dạng lớp vỏ kitin của chủy, râu, vùng

đốt ngực và vùng bụng ở tôm thẻ chân trắng và được gọi là hội chứng dị dạng còi

cọc (Runt-deformity Syndrome, RDS). Tác động IHHNV lên tôm thẻ gây ảnh

hưởng về giá trị thương mại do tôm chậm lớn, có kích thước nhỏ, biến dạng vỏ kitin

mặc dù IHHNV không gây chết nghiêm trọng khi tôm nhiễm virus.

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan thành lập biểu mô là một trong

những bệnh do virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm. Virus này khi xâm nhiễm

vào tôm sẽ gây hoại tử máu và nhiễm trùng dưới vỏ. Tôm nuôi ở giai đoạn

postlarvae và juvenile với mật độ cao rất dễ nhiễm virus này. Tôm nhiễm virus này

có biểu hiện ít ăn, lừ đừ, nổi nước, xoay tròn và chết từ từ trong 2 – 3 tuần. Các loài

tôm khác nhau khi nhiễm bệnh thì có dấu hiệu khác nhau. Loài P. monodon, những

con nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ và hệ cơ vân ở phần bụng có thể bị

mờ đục, chậm lớn (Rai và ctv., 2009). Loài P. vannamei, khi bị bệnh ở dạng mãn

tính và thể hiện một số đặc điểm như còi cọc, dị dạng, như chùy đầu sẽ bị uốn cong

hoặc bị dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin thì bị sùi. Tôm kém ăn dẫn đến phân

7

đàn cao. Loài P. stylirostris, nếu bị nhiễm ở cấp tính có thể gây chết tôm ở giai đoạn

ấu niên, ấu trùng và hậu ấu trùng có thể đã nhiễm bệnh nhưng không phát bệnh, sau

35 ngày trở đi bệnh mới bộc phát. Ở mức độ nặng thì tôm sẻ kém ăn, có sự thay đổi

về trạng thái và diện mạo, tôm bơi lội chậm chạp và chết sau vài giờ, xuất hiện các

vùng trắng hay vàng sẫm ở lớp biểu bì kitin, đặc biệt là ở các khớp nối làm cơ thể

tôm xuất hiện các vùng vằn vện (Lightner và Bell, 1984).

2.3. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious

hypothermal and hemotopoietic necrosis virus – IHHNV)

2.3.1. Tên khoa học và phân loại

Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) là

virus có kích thước nhỏ nhất được phát hiện lần đầu tiên trên tôm Penaeus

(Litopenaeus) stylirostris. Do đó, IHHNV còn có tên khoa học là PstDNV (Penaeus

stylirostris densovirus) (Shike và ctv., 2000). Virus này có kích thước từ 20 – 22

nm, có cấu trúc khối đa diện và không có vỏ ngoài. Dựa trên kích thước và hình thái

học, hóa sinh IHHNV được xếp vào họ Parvoviridae và có thể là thành viên của chi

Brevidensovirus (Bonami, 1990).

2.3.2. Bộ gen và chức năng của các protein

Virus này mang vật liệu di truyền là DNA mạch đơn, kích thước khoảng 4,1

kb chứa 3 trình tự ORF (1, 2, 3) (Nunan và ctv. 2000, Shike và ctv. 2000) ở hình

2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của chủng IHHNV phân lập ở Mỹ (AF273215,

Shike và ctv., 2000). Ba khung đọc mở (ORF trái, ORF giữa, ORF phải ) được chỉ

ra trong khung cùng với vị trí của chúng. Vị trí cho (donor-D1) và nhận (Receptor-

A1, A2 và A3) giả định được thể hiện hình tam giá. P2, P11 và P61 là vị trí các

vùng promotor (Bổ sung Dhar và ctv., 2010)

Trong bộ gen của IHHNV, ORF bên trái hay còn được gọi ORF1 có kích

thước 2001 nucleotide (nt), chiếm 50% trình tự bộ gen và được dự đoán có thể mã

8

hóa cho một chuỗi peptide 666 amino acid với trọng lượng phân tử là 75.77 kDa,

trên cơ sở tương đồng trình tự với 2 virus Brevidensoviruses trên muỗi, trình tự

amino acid này được dự đoán là non-structural protein 1 (NS1). Trình tự acid amin

được mã hóa bởi ORF1 chứa các motif đặc trưng cho IHHNV. Bao gồm motif nhân

tố khởi đầu sao chép có tính bảo tồn cao (RCR – motifs) chứa motif I (ở vị trí a.a

258 đến a.a 266) và motif II (ở vị trí a.a 307 đến a.a 314) của protein khởi đầu sao

chép và vùng NTP – binding và helicase (ATPase motifs) chung cho tất cả các

parvoviruses (Rai và ctv., 2011; Shike và ctv., 2000). So sánh sự tương đồng trình

tự a.a giữa các chủng ở nhiều vùng trên thế giới cho thấy, mặc dù có sự khác biệt về

trình tự, có nhiều sự thay đổi được tìm thấy ở trong 200 a.a đầu tiên nhưng các

motif đặc trưng của IHHNV vẫn được bảo tồn (Shike và ctv., 2000; Tang và

Lightner, 2003). Tương tự các parvovirus khác, ORF ở giữa (ORF2) bắt đầu từ

nucleotide 56 tính theo chiều ngược và có đoạn chồng lấp trình tự với ORF1, có

kích thước 1092 nt, có khả năng mã hóa cho vùng N – terminal của một chuỗi

peptide mang 343 a.a và được gọi là protein không cấu trúc 2 (NS2). Cuối cùng,

ORF bên phải (ORF3) cũng chồng lấp trình tự với ORF2 (56 nucleotide), có kích

thước 990 nt và có thể mã hóa cho một chuỗi peptide chứa 329 a.a (Dhar và ctv.,

2007; Nunan và ctv, 2000, Shike và ctv, 2000). Bằng phân tích SDS-PAGE có ít

nhất bốn protein cấu trúc khác nhau được phát hiện từ thể virus IHHNV tinh sạch

và chúng có trọng lượng phân tử 74, 47, 39 và 37,5 kD (Bonami và ctv., 1990; Mari

và ctv., 1993). Trong đó protein có kích thước 47 kD đã được xác định là có nguồn

gốc từ ORF3.

2.3.3. Sự đa dạng di truyền của IHHVN

2.3.3.1 Phân loại kiểu gen

Cho đến nay, có rất nhiều bộ gen hoàn chỉnh của chủng IHHNV khác nhau đã

được giải trình tự và mô tả chi tiết. Bao gồm một số chủng như Hawaii ở Mỹ (trên

Genbank có kí hiệu AF218266) có kích thước 3909 bp; Ấn Độ (GQ411199) có kích

thước 3908 bp (Rai và ctv., 2011); Hàn Quốc (JN377975) có kích thước 3914 bp

(Kim và ctv., 2011) và Trung Quốc (EF633688) có kích thước 3833 bp và cùng một

9

số chủng IHHNV có trên GenBank như từ Mexico (AF273215), Đài Loan

(AY355307, AY355306 và AY355308); Thái Lan (AY362547 và AY102034); Việt

Nam (JN616415); Ecuador (AY362548) và Úc (GQ475529). Qua những nghiên

cứu trên vật liệu di truyền của các chủng IHHNV phân lập từ nhiều nơi trên thế giới

cho thấy có ít nhất bốn kiểu gen (type) IHHNV bao gồm: kiểu gen 1 có nguồn gốc

từ Châu Mỹ, Đông Á (chủ yếu là Phillippines), kiểu gen 2 có nguồn gốc từ Đông

Nam Á và hai kiểu gene này là kiểu gen lây nhiễm. Những thí nghiệm lây nhiễm đã

chứng minh kiểu gen 1 và 2 có khả năng lây nhiễm từ vật chủ này sang vật chủ

khác, đại diện là tôm thẻ chân trắng P. vannamei và hoặc tôm sú P. monodon

(Chayaburakul và ctv., 2005). Thông qua việc phân tích bằng PCR và trình tự DNA,

IHHNV được phát hiện ở tôm sú từ vùng Đông Nam Á và 2 biến thể (đại diện là

các chủng từ Thái Lan và Philippine) được nhận diện dựa trên phân tích cây di

truyền (Tang và ctv., 2003).

Bên cạnh trình tự bộ gen IHHNV lây nhiễm, hai trình tự bộ gen IHHNV không

lây nhiễm được chèn vào bộ gene của tôm (IHHNV type 3A/3B) gần đây đã được

phát hiện trên tôm sú ở tự nhiên từ Đông Phi và Úc (Krabsetsve và ctv., 2004; Tang

và Lightner, 2006). Những trình tự tương đồng với virus này có mức độ tương đồng

trình tự nucleotide khá cao (từ 86 – 92 %) với bộ gen virus IHHNV (Tang và ctv.,

2007). Kiểu gen 3A có nguồn gốc từ Đông Phi (Madagascar), Ấn Độ và Úc

(Genbank DQ228358) có chiều dài 4655 bp nucleotide (Tang và Lightner, 2006).

Cuối cùng kiểu gen 3B với trình tự vật liệu di truyền dài 2935 nucleotide (kí hiệu

trên Genbank AY123937) có nguồn gốc từ khu vực phía tây Ấn Độ - Thái Bình

Dương (Indo-Pacific) bao gồm Mozambic, Mauritius và Tanzania (Tang và ctv.,

2003). Các nghiên cứu cho thấy kiểu gen 3A và 3B chỉ tồn tại ở tôm sú và không có

khả năng lây truyền (Tang và ctv., 2006). Tuy nhiên, các parvovirus khác được biết

đến như nguyên nhân lây nhiễm tiềm tàng, đôi khi chúng liên quan đến sự chèn vào

bộ gene và có thể có hoạt tính trở lại dưới tác động của nhân tố môi trường hoặc sự

xâm nhiễm cùng với các virus DNA không có họ hàng với chúng (Tattersall và ctv.,

2005; Geoffroy và ctv., 2006).

10

2.3.3.2. Đa dạng di truyền

Những nghiên cứu ở mức độ di truyền chỉ ra có sự thay đổi đáng kể giữa các

chủng virus phân lập ở Châu Á và có sự thay đổi nhỏ ở các chủng phân lập ở Châu

Mỹ (Tang và Lightner, 2006; Tang và ctv., 2003). Tất cả các chủng IHHNV phân

lập ở Châu Mỹ có sự tương đồng gần với chủng IHHNV từ Philippine. Xem xét về

khía cạnh lịch sử và dịch bệnh của IHHNV ở Châu Mỹ, các tác giả cho rằng

IHHNV từ tôm nuôi ở Mỹ là có nguồn gốc từ Philippine thông qua việc nhập khẩu

tôm P. monodon như là loài thủy sản nuôi trong thập niên 1970 của các trang trại

nuôi tôm (Lightner, 1996; Tang và ctv., 2003). Một vài nghiên cứu trước kia cho

thấy, IHHNV trên P. stylirostris và P. vannamei từ Tây bán cầu đã chứng minh bộ

gen IHHNV rất ổn định và sự phát triển giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ đã ổn

định hơn (Tang và Lightner, 2002). Mặt khác, dựa trên phân tích sự đa dạng trình tự

bộ gen IHHNV mã hóa vùng protein không cấu trúc và vỏ capsid (trình tự

nucleotide có kích thước 2,9 kb của IHHNV chứa đựng 3 ORF), cho thấy sự khác

biệt trình tự thấp (ít hơn 0,5 % trình tự nucleotide khác biệt) được tìm thấy trong 14

chủng phân lập từ Hawaii và châu Mỹ từ năm 1982 đến 1997. Thậm chí không có

sự mất đi hay thêm vào trong vùng này của bộ gen virus. Sự thay đổi của 30

nucleotide được ghi nhận thì chỉ có 15 nucleotide thay đổi dẫn đến sự thay đổi của

các a.a (7 ở ORF1, 1 ở ORF2 và 7 ở ORF 3) nhưng không có sự liên hệ giữa sự thay

đổi và động lực virus (Tang và Lightner, 2002). Tuy nhiên, trái ngược với báo cáo

của Tang và Lighter (2002), một nghiên cứu gần đây cho thấy sự đa dạng di truyền

của IHHNV còn cao hơn nữa và ước tính tỉ lệ thay đổi nucleotide ở những chủng

IHHNV phân lập khoảng 1,39 ×10−4 thay đổi/vị trí/năm (Robles-Sikisaka và ctv.,

2010). Bên cạnh đó, khi phân tích trinh tự gen ORF 3 mã hóa cho vỏ capsid của

chủng IHHNV mới được phân lập ở Philippine cho thấy trình tự mới phân lập này

có thể là một chủng khác biệt với các chủng còn lại ở nước này (Caipang, và ctv.,

2011).

Bên cạnh đó, chủng IHHNV từ Hawaii (AF218266) cũng được dùng để so

sánh với các chủng khác được phân lập trên tôm sú từ các vùng khác nhau trên thế

11

giới. Trình tự 2,9 kb được so sánh (chứa đựng khoảng 70 % toàn bộ bộ gen virus

bao gồm cả chiều dài của ORF1 và ORF2) cho thấy chủng IHHNV phân lập từ

Philippine khá giống với chủng ở Hawaii với sự khác biệt khoảng 0,2 % trong trình

tự nucleotide. Chủng IHHNV ở Thái Lan cho thấy sự sai khác lớn hơn so với chủng

Hawaii (ở mức 96 % sự tương đồng). Chủng phân lập từ Đài Loan rất giống (99,7

%) với chủng phân lập từ Thái Lan, sự khác biệt chỉ là 9 nucleotide. Ngoài ra, DNA

ly trích từ tôm sú ở Đông Phi (Tanzania, Madagascar và Mauritius) cũng chứa trình

tự IHHNV và sự khác biệt với chủng từ Hawaii khoảng từ 8,2 % đến 14,1 % (Tang

và ctv., 2003). Nhìn chung, sự sai khác di truyền ở trong họ parvovirus chỉ lên đến 4

% (Erdman và ctv, 1996). Tuy nhiên, trình tự IHHNV được phân lập từ tôm sú có

sự sai khác cao hơn lên tới 14 %. Điều này trái với những kết quả trước đó có ít hơn

0,5 % sự sai khác giữa các chủng IHHNV được phân lập trên tôm P. stylirostris và

P. vannamei ở Tây bán cầu (Tang và Lightner, 2002). Sự đa dạng di truyền cao của

IHHNV trên tôm sú cho thấy các đoạn trình tự ngẫu nhiên của virus được chèn vào

bộ gen của tôm. Kết quả của nghiên cứu ở Thái Lan khi sử dụng 7 cặp mồi ngẫu

nhiên để khuếch đại trình tự gen của IHHNV chỉ ra 20 trong tổng số 99 mẫu tôm (tỉ

lệ khoảng 20 %) có sự chèn vào một hoặc hai đoạn trình tự ngẫu nhiên

(Saksmerprome và ctv., 2011). Sự đa dạng di truyền ở P. stylirostris và P. vannamei

thấp hơn có thể được giải thích do đời sống ngắn nên ít có sự biển đổi di truyền, trái

lại tôm P. monodon lại có khả năng mang virus trong suốt vòng đời của chúng. Các

loài này bị nhiễm IHHNV sau khi IHHNV từ nguồn tôm sú nhiễm bệnh được xuất

khẩu từ châu Á từ giữa và cuối những năm 1970.

2.3.4. Sự lan truyền của IHHNV

Sự lan truyền của IHHNV diễn ra trong tự nhiên cả truyền dọc và truyền

ngang đã được nghiên cứu và chứng minh khi nhiễm trên tôm he. Một số cá thể

trong quần đàn L. stylirostris và P. vannamei sống sót qua các đợt dịch bệnh và

mang IHHNV trong suốt thời gian sống, chúng đã truyền IHHNV sang thế hệ con

và các quần đàn khác thông qua cả đường truyền ngang, lẫn truyền dọc (Bell và

Lightner, 1984; Lotz, 1997). IHHNV rất dễ gây bệnh cho tôm L. Stylirostris, tôm

12

thẻ chân trắng L. vannamei và postlarvae tôm càng xanh Macrobrachium

rosenbergii (Hsieh và ctv., 2006). Kết quả là tôm tăng trưởng bất thường trong suốt

quá trình phát triển (Kalagayan và ctv, 1991.; Lightner và ctv, 1992). Trong sản

xuất tôm thẻ chân trắng, khi nhiễm virus này, tôm có sự chênh lệch về kích thước,

dị dạng còi cọc và thiệt hại về kinh tế khoảng 10-50% sản lượng so với tôm nuôi

không nhiễm virus (Lightner và Redman, 1998). Hiện tại rất ít thông tin liên quan

đến đáp ứng miễn dịch và sinh lý học của tôm khi nhiễm IHHNV, đặc biệt là liên

quan đến sinh sản và phát triển của phôi. Sự lây nhiễm IHHNV tùy thuộc chủng

virus, tùy vào ký chủ lây nhiễm trong tự nhiên và phân bố theo vùng địa lý khác (từ

châu Mỹ đến châu Á, Châu Úc và Châu Phi). Ký chủ của IHHNV hầu hết là các

loài họ tôm he, có thể bị nhiễm bởi IHHNV như tôm sú P. monodon, tôm thẻ chân

trắng P. Vannamei, tôm xanh P. Stylirostris, và một số loài tôm trong tự nhiên P.

occidentalis, P. semisulcatus, Litopenaeus Schmitti, Farfantepenaeus

Californiensis, Marsupenaeus japonicus. IHHNV nhiễm tự nhiên trên postlarvae

và cận trưởng thành trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) được ghi

nhận ở miền Nam Đài Loan, còn những loài tôm khác như Fenneropenaeus indicus,

Fenneropenaeus merguiensis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus duorarum

và Litopenaeus setiferus cũng được cho lây nhiễm trong phòng thí nghiệm (Rai và

ctv., 2012; Hsieh và ctv., 2006). Cho đến nay chưa có vật chủ trung gian truyền lây

của IHHNV được biết đến.

Thí nghiệm truyền dọc cũng đã được xác lập thông qua giám sát sự hiện diện

IHHNV ở phôi và thế hệ ấu trùng trên tôm thẻ chân trắng khi cho thụ tinh trứng từ

hai tôm thẻ chân trắng cái (một bị nhiễm IHHNV và một không nhiễm IHHNV) với

tôm đực không mang IHHNV. Kết quả phân tích PCR cho thấy khi tôm cái nhiễm

IHHNV thì phôi và thế hệ con của chúng cũng nhiễm IHHNV, trường hợp tôm mẹ

không mang IHHNV thì phôi và thế hệ con không mang virus IHHN (Motte và ctv.,

2003). Một nghiên cứu khác về lây truyền dọc cho thấy, IHHNV nhiễm trên mô của

buồng trứng và trứng đã thụ tinh của tôm Fenneropenaeus chinesis thì các giai đoạn

con của chúng đều mang virus này (Zhang và Sun., 1997). Lây truyền dọc đã được

xác định, vì virus đã được phát hiện trong các mô buồng trứng và nang buồng trứng

13

(Lotz, 1997). Truyền dọc có thể là một yếu tố rất quan trọng cho sự gia tăng của

IHHNV phổ biến trong gia hóa tôm từ thế hệ này sang thế hệ khác. Một vấn đề thực

tế, khi bố mẹ bị nhiễm virus sinh ra một số lượng lớn thế hệ con mang mầm bệnh và

tiếp tục truyền cho các cá thể khác trong cùng một ao. Vì phần lớn các tôm bị nhiễm

bệnh tồn tại mà không có dấu hiệu lâm sàng, nhiều con tôm này sẽ được lựa chọn

làm bố mẹ mang IHHNV và chúng có thể truyền virus cho thế hệ con sau này

(Motte và ctv., 2003).

Thử nghiệm lây truyền ngang của IHHNV đã được thực hiện bằng cách tiêm

virus, cho tôm ăn vật liệu mang virus, sống chung với tôm mang virus hoặc ngâm

tôm khỏe trong nước có chứa virus (Bell và Lightner, 1984; Lotz, 1997). Kết quả

lây nhiễm cho thấy, lây nhiễm tự nhiên từ tôm bệnh mang virus chết truyền cho tôm

khỏe cao nhất. Trong các trang trại, tôm bùng phát nhiễm virus có thể là kết quả của

con đường truyền ngang thông qua tôm khỏe ăn những con tôm mang mầm bệnh

chết.

Để nghiên cứu sự lây nhiễm của virus trên tôm, có rất nhiều mô hình (phương

pháp) lây nhiễm cho tôm trong phòng thí nghiệm như phương pháp tiêm vào cơ thể

tôm, phương pháp cho tôm ăn nguồn nhiễm bệnh hay cho tôm tiếp xúc với nguồn

nước nhiễm virus và phương pháp cho tôm sống chung với đối tượng nhiễm virus.

Phương pháp tiêm là phương pháp cho kết quả gây nhiễm nhanh và có độ tin cậy

cao tuy nhiên phương pháp này thường gây sốc với tôm và con đường xâm nhập

không giống với cách xâm nhiễm của virus trong tự nhiên. Nên phương pháp này

được chọn để chuẩn bị nguồn lây nhiễm (sống chung và làm nguồn thức ăn nhiễm

bệnh) cho thí nghiệm lan truyền theo trục ngang và tiêm vào cá thể tôm mẹ trong thí

nghiệm theo trục dọc. Có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để cảm

nhiễm nhiều loại virus cho tôm như WSSV (Vijayan và ctv., 2005), MrXV và XSV

(Sudhakaran và ctv., 2007), IHHNV (Brock và ctv., 2007). Tùy thuộc vào kích

thước mà liều lượng được tiêm cho tôm có thể được tính toán thông thường thể tích

từ 10 -100µl. Phương pháp cho ăn mô tôm bệnh là phương pháp khá giống với cách

thức xâm nhiễm của virus trong tự nhiên thông qua tập tính ăn thịt những cá thể yếu

mang mầm bệnh hay xác bã mà cá thể tôm thải ra. Phương pháp này được sử dụng

14

rất nhiều trong những nghiên cứu cảm nhiễm virus cho tôm như thí nghiệm lây

nhiễm WSSV cho tôm thông qua Polycharte Pereneis nuntia nhiễm virus (Vijayan

và ctv., 2005; Loarun và ctv., 2005), lây nhiễm MrNV và XSV cho tôm thông qua

Artemia (Sudhakaran và ctv., 2007) và lây nhiễm IHHNV cho tôm thẻ thông qua

nguồn thức ăn nhiễm virus (Bell và Lightner, 1984; Lotz và ctv., 1997; Tang và

ctv., 2006; Coelho và ctv., 2009). Trong thí nghiệm lây nhiễm bằng cách thức cho

ăn, nguồn thức ăn được thu thập hay sàng lọc từ những cá thể cho kết quả dương

tính với virus. Sau đó chúng được xay nhuyễn và cân đo liều lượng cho ăn, thông

thường các bể thí nghiệm sẽ được cho ăn với tỉ lệ từ 5 – 10 % trọng lượng tôm thí

nghiệm. Đối với các bể đối chứng tôm sẽ được cho ăn mô tôm khỏe hoặc thức ăn

viên. Do đó, phương pháp này thường được lựa chọn để nghiên cứu sự lan truyền

của virus theo trục ngang. Phương pháp sống chung (cohabitant) là phương pháp

khắc phục được nhược điểm của phương pháp tiêm là làm cho tôm nhiễm bệnh

giống với cách thức xâm nhiễm trong tự nhiên của virus. Đây là phương pháp cho

tôm khỏe mạnh sống chung với các cá thể tôm bệnh. Các cá thể tôm bệnh được tạo

ra bằng phương pháp tiêm virus vào cơ thể tôm và được kiểm tra dương tính với

virus bằng PCR. Mô hình này cũng được sử dụng cho nhiều thí nghiệm cảm nhiễm

WSSV (Corre và ctv., 2012) và IHHNV (Lightner và Bell, 1984).

2.3.5 Sự phân bố và lây nhiễm

IHHNV được báo cáo trên nhiều loài tôm và ở nhiều vùng trên thế giới bao

gồm Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Trung Mỹ; khu vực Caribe và vùng Indo – Thái Bình

Dương. Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào ghi nhận sự hiện diện của virus này ở vùng

duyên hải Đại Tây Dương. Hiện nay, với tốc độ lan truyền nhanh chóng IHHNV

được xem như tác nhân có tính phân phối toàn cầu (Lightner và ctv., 1996). Sự xâm

nhiễm trong tự nhiên đã được công bố ở các loài như P. vanamei, P. stylirostris, P.

occidentalis, P. monodon, P. semisulcatus, P. californiensis, P. schmitti và P.

japonicas trên khắp thế giới (Flegel và ctv., 1997; Morales-Covarrubias, 1999). Sự

lây nhiễm trong thí nghiệm cũng được báo cáo ở P. setiferus, P. azteau và P.

15

duoranrum. Tuy nhiên P. indicus và P. merguiensis có lẽ không cảm nhiễm với sự

lây nhiễm của IHHNV (Lightner, 1996).

IHHNV lần đầu tiên được công bố trên tôm P. stylirostris và P. vanamei ở

Hoa kỳ (Lightner và ctv., 1983) và sau đó là ở trên tôm P. monodon từ Châu Á.

Người ta cho rằng, nó được tìm thấy thông qua quá trình nhập khẩu tôm sú có

nguồn gốc từ Philippine (Lightner và ctv., 1992; 1996; 1999). Ở Châu Mỹ, IHHNV

còn được ghi nhận ở các trang trại nuôi tôm ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Trung Mỹ, vịnh

Carribe và khu vực Indo – Thái Bình Dương. Vịnh California ở Mexico virus này

được phát hiện ở các trang trại nuôi tôm xanh P. stylirostris (Lightner, 1992). Sự

phân bố địa lý và giới tính của tôm là yếu tố ảnh hưởng đến mức độ nhiễm virus

trong quần đàn. Trong các vùng mà virus gây thành dịch trên các đàn tôm hoang dã,

thì IHHNV đã được phát hiện trên các mẫu tôm tự nhiên ở các địa phương là từ 0

đến 100%. Một vài số liệu đã được báo cáo về sự hiện diện IHHNV trong các đàn

tôm hoang dã lần lượt là 26% và 46% trong P. stylirotris ở hạ lưu và thượng lưu của

Vịnh California, 100% và 57% ở tôm cái và tôm đực trưởng thành của P. stylirotris

ở vùng giữa của Vịnh California. Trên tôm P. vannamei thu thập được từ bờ biển

Thái Bình Dương của Panama là 28% khi kiểm tra bằng lai dot blot (Nunan và ctv.,

2001). Mặt khác, những báo cáo gần đây cho thấy sự lưu hành của IHHNV trên tôm

P. setiferus và P. aztecus hoang dã ở Mexico là rất thấp khoảng 4,4 % (Guzman-

Saenz và ctv., 2009). Ở Nam Mỹ, những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được

tiến hành trên các mẫu xét nghiệm tôm hoang dã F. subtilis thu thập từ cửa sông

Pacoti ở vùng biển miền Đông Bắc Brazil cho thấy chúng cảm nhiễm với IHHNV

(Coelho và ctv., 2009). Sự lưu hành cao của IHHNV được báo cáo ở các trang trại

tôm từ vùng Đông Bắc Brazil ở phạm vi từ 9,4 – 81 % (Braz và ctv., 2009). Sự lưu

hành thấp (1,1 – 1,3 %) được tìm thấy ở tôm P. vanamei nuôi ở Venezuela và Peru

(0.31%) (Boada và ctv., 2008; Alfaro-Aguilera và ctv.,2010). Ngoài các loại họ tôm

he thì IHHNV hiện diện trên 3 loài giáp xác khác Artemesia longinaris,

Cyrtograpsus angulatus, và Palaemon macrodactylus ở Argentina với tỷ lệ nhiễm

56%, 67% và 40% (Martorelli và ctv., 2010).

16

Owen và ctv., (1992) đã báo cáo sự hiện của IHHNV trong tự nhiên ở

Australia (Úc) thuộc vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương. Năm 2008, dạng lây nhiễm

của IHHNV được tìm thấy trên tôm P. monodon nuôi ở Úc (Saksmerprome và ctv.,

2010). Ngoài ra, IHHNV được phát hiện ở P. stylirostris được nhập khẩu vào

Polynesia (thuộc địa Pháp) và Guam để nuôi trồng (Costa và ctv., 1998; Tang và

ctv., 2002).

Ở Châu Á, virus này đã được tìm thấy ở kiện hàng tôm P. vannamei nhập khẩu

từ tôm nuôi ở Đài Loan vào năm 1986 (Lightner và ctv., 1987). Sau đó, những báo

cáo về sự hiện diện của virus này trên tôm P. monodon hoang dã và nuôi ở các nước

thuộc vùng Đông Á (Trung Quốc và Đài Loan), Đông Nam Á (Singapore,

Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Philippin) và Ấn Độ (Flegel, 1997; Lightner và ctv.,

1996; Tang và ctv., 2003; Rai và ctv., 2009). Những nghiên cứu gần đây cho thấy

sự hiện diện của IHHNV trên tôm P. monodon hoang dã ở Brunei với sự lưu hành

thấp khoảng 14,1 % (Claydon và ctv., 2010). Một cuộc điểu tra ở Trung Quốc cho

thấy sự hiện diện của vius này ở cua biển hoang dã Hemigrapsus penicillatus ở

miền bắc Trung Quốc (Zhang và ctv., 1997). Hơn nữa, sự lưu hành của IHHNV ở

tôm và cua thu thập từ các vùng nuôi trồng thủy sản lần lượt là 51,5 % và 8,3 %

(Yang và ctv., 2007). Gần đây Virus IHHN cũng đã được nghi nhận trên tôm thẻ

nuôi ở Hàn Quốc và trong nước (Kim và ctv., 2011). Ở nuôi trồng thủy sản nước

ngọt, sự xâm nhiễm trong tự nhiên của IHHNV ở giai đoạn ấu trùng và cận trưởng

thành của Macrobrachium rosenbergii được công bố ở miền nam Đài Loan và

Malaysia (Hsieh và ctv., 2006). Một nghiên cứu ở Malaysia cho thấy sự hiện diện

của IHHNV ở tôm giống M. rosenbergiii với sự lưu hành khoảng 20 % (Hazreen-

Nita và ctv., 2012).

2.4. Các nghiên cứu IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam

Kể từ khi IHHNV được tổ chức thú y thế giới (OIE) xếp loại vào một trong

những virus gây thiệt hại đến nghề nuôi tôm, đặc biệt là tôm xanh và tôm thẻ chân

trắng, đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến loại virus này. Tuy nhiên, trên tôm sú

nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng và ở Việt Nam nói chung, chỉ có ít

17

nghiên cứu liên quan đến việc phát hiện IHHNV nhiễm trên tôm sú và đặc tính di

truyền cũng như phân bố của chúng. Nghiên cứu về tần xuất hiện diện và sự lan

truyền của IHHNV trên tôm sú nuôi rất hạn chế. Chỉ có một vài nghiên cứu gần đây

của nhóm nghiên cứu Hùng và ctv (2009) đánh giá về tần xuất xuất hiện IHHNV

trên tôm sú ở một số lượng mẫu rất hạn hẹp, 307 mẫu (tỷ lệ nhiễm 160/307 ≈

52,12%), cũng như phân tích trình tự bộ gen của virus (An và ctv., 2009) . Các

thông tin về sự hiện diện của IHHNV và tác động lên tôm sú nuôi tại Việt Nam vẫn

chưa được làm rõ. Hiện tại chỉ có 1 nghiên cứu giải trình tự bộ gen chủng IHHNV

thu nhận từ mẫu tôm ở Bạc Liêu, kết quả cho thấy bộ gen IHHNV từ mẫu nghiên

cứu này có kích thước 3815 bp, có độ tương đồng cao nhất 98% với chủng IHHNV

phân lập ở Đài Loan, 97% với chủng IHHNV Thái Lan (An và ctv., 2009). Tuy

nhiên, do sự du nhập tôm bố mẹ từ nhiều nguồn khác nhau nên rất có thể có sự đa

dạng về di truyền của các chủng IHHNV truyền nhiễm hiện diện tại ĐBSCL. Sự

thiếu hụt các hiểu biết về IHHNV trong hệ thống nuôi tôm sú tại Việt Nam làm lúng

túng trong việc chọn lựa phương pháp xét nghiệm để kiểm soát chất lượng tôm

nuôi.

2.5. Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh IHHNV hiện nay

Khi tôm nhiễm bệnh, IHHNV được tìm thấy ở rất nhiều bộ phận như mang,

biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh…(Lightner và ctv.,1983). Những bộ

phận này thường được sử dụng để chẩn đoán bệnh.

2.5.1. Dựa trên dấu hiệu lâm sàng

Tôm sú nhiễm IHHNV khi hấp hối có màu xanh lơ (hình 2.2) và hệ cơ vân ở

phần bụng có thể bị mờ đục (Rai và ctv, 2009). Ngoài ra IHHNV hiện diện trên tôm

sú cũng gây ra hội chứng RDS làm biến dạng lớp vỏ kitin. Chùy đầu sẽ bị uốn cong

hoặc dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin thì bị xùi, tôm kém ăn (Bell và

Lightner., 1984; Kalagayan và ctv., 1991; Primavera và Quinitio., 2000). Tuy nhiên,

dấu hiệu lâm sàng không phải luôn luôn rõ ràng, dễ nhầm lẫn với dấu hiệu các cơ

quan gây ra bởi các bệnh khác như bệnh đốm trắng WSSV.

18

Hình 2.2. Tôm sú (P. monodon) 50 ngày tuổi bị nhiễm IHHNV với các kích thước

khác nhau (Rai và ctv., 2009). P. monodon bị nhiễm IHHNV khi gần chết có màu

xanh biếc, hệ cơ ở phần bụng có thể mờ đục.

2.5.2. Phương pháp mô học

Đây là phương pháp sử dụng phổ biến nhất trong chẩn đoán bệnh thủy sản

(Lightner và ctv., 1983; Bell và Lightner., 1984). Các tế bào bị bệnh xuất hiện ở

mang, biểu bì, dưới vỏ, biểu mô phía trước, ruột sau, dây thần kinh, hạch thần kinh

cũng như ở cơ quan tạo máu, tuyến anten, tuyến sinh dục, cơ quan bạch huyết và

mô liên kết. Nội nhân bắt màu thuốc nhuộm Eosin (với thuốc nhuộm H&E), các thể

vùi Cowdry type A (CAIs) hình 2.3 sẽ giúp cho việc dự chẩn nhiễm virus IHHNV.

Nhân của tế bào bệnh bị phồng to với thể vùi trung tâm bắt màu Eosin đôi khi bị

tách ra từ chất nhiễm sắc có viền bằng một vòng không bắt màu, được lưu giữ bằng

các chất cố định có chứa axit acetic. Ngoài vấn đề thời gian kỹ thuật này thực tế

không đủ nhạy để phát hiện giai đoạn sớm, thường chỉ cho kết quả chính xác khi

tôm nhiễm bệnh nặng, cũng như dấu hiệu bệnh lý tế bào của một số bệnh giống

nhau, dễ nhầm lẫn. Kính hiển vi điện tử được áp dụng để chẩn đoán song rất đắt

tiền.

19

Hình 2.3. Một lát cắt mô học trên tôm sú nhiễm IHHNV nhuộm với H& E ở độ

phóng đại 1000X lần cho thấy các thể vùi nội nhân bắt màu Eosin (thể vùi Crowdry

type A) đặc trưng cho nhiễm virus IHHNV (Rai và ctv., 2009)

2.5.3. Lai Dot Blot

Kỹ thuật dot blot đã được ứng dụng nghiên cứu IHHNV và chỉ ra sự hiện diện

của IHHNV ở tôm cái và tôm đực là khác nhau (Morales−Covarrubia và ctv., 1999)

ngoài ra lai dot blot còn dùng thử nghiệm độ nhạy và độ đặc hiệu với DNA IHHNV,

kết quả cho thấy các đầu dò DNA có độ nhạy cao và độ đặc hiệu mạnh mẽ với DNA

IHHNV không có DNA tôm, độ nhạy là 24.8 pg (Zhi−Qin Yue và ctv., 2006).

Nhưng phương pháp này cũng có nhược điểm là phân tích, định lượng các phân tử

lai kém chính xác, hiệu quả thấp, do một phần các nucleic acid được cố định trên

giá thể bị che khuất, không tiếp xúc với các trình tự bổ sung.

2.5.4. Real−time PCR

Phương pháp Real−time PCR là một trong những cải tiến mới nhất của kỹ

thuật PCR. Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA (hay

RNA) được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Do đó có

thể phát hiện và định lượng được nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên

cường độ phát huỳnh quang (Tang và ctv., 2000). Kỹ thuật Real−time PCR được

ứng dụng nghiên cứu IHHNV và biết được độ nhạy của phương pháp này dùng

chẩn đoán DNA IHHNV trong mẫu là 0.15 pg (Khawsak và ctv., 2008). Bên cạnh

đó phương pháp này còn được dùng trong phát hiện IHHNV trên các cơ quan khác

20

nhau của tôm sú bố mẹ hoang dã, thế hệ con của chúng (Chayaburakul và ctv.,

2005). Hiện đã có bộ kit Real-time PCR (IHHNV) (trung tâm công nghệ sinh học

Tp. Hồ Chí Minh., 2008). Tuy nhiên kỹ thuật Real-time PCR đòi hỏi phòng thí

nghiệm phải có trang thiết bị máy hiện đại, giá thành khá cao và người phân tích

phải có kiến thức cơ bản về chúng.

2.5.5. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)

Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự nucleic acid cần tìm (trình

tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô lai tại chỗ cho phép nghiên cứu

nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào. Hiện

nay phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) cũng được phát triển để chẩn

đoán bệnh IHHNV (Mari và ctv., 1993; Jimenez và ctv., 1999), phát hiện IHHNV

ngay trên mẫu mô mà không cần li trích DNA. Kỹ thuật này được dùng để nghiên

cứu sự thay đổi tế bào và mẫn cảm giữa hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng khi

nhiễm IHHNV (Chayaburakul và ctv., 2005). Mẫu dò đặc hiệu với virus IHHNV

được đánh dấu và đem lai trực tiếp với DNA virus trên mô đích trong điều kiện

nghiêm ngặt. Phương pháp này nhạy và mang tính đặc hiệu cao nhưng lại cần thời

gian dài để hoàn thành (2 – 3 ngày) .

2.5.6. Phương pháp kháng thể đơn dòng

Phương pháp kháng thể đơn dòng cũng được xem như là 1 công cụ ứng dụng

cho những nghiên cứu khác về IHHNV. Kháng thể đơn dòng này có thể phát hiện

IHHNV ở độ nhạy 0.1–0.5 x 10−3 μg/μl GP3 protein. Đồng thời cũng thể hiện băng

đậm khi phát hiện vi khuẩn E. Coli chứa protein tái tổ hợp GP3−pET15b ở vị trí 37

kDa với độ pha loãng 1:100. Hơn thế nữa, kháng thể với nồng độ 1:10 cũng cho

phản ứng đặc hiệu khi bao xung quanh các thể vùi IHHNV ở nhiều bộ phận của tôm

bị nhiễm IHHNV như mang, dây thần kinh, cơ và tế bào biểu bì (Hằng và Flegel.,

2008). Nhưng phương pháp này không đề cập đến chẩn đoán IHHNV lây

nhiễm hay không lây nhiễm.

21

2.5.7. Phương pháp khuyếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop−mediated isotheral

amplification)

Phương pháp LAMP được Tsugunori Notomi và các cộng sự công bố năm

2000 (Notommi và ctv., 2000). Phương này cho phép phát hiện số lượng DNA mẫu

ban đầu rất nhỏ chỉ vài bản mẫu cho tới 100 bản mẫu gốc. Trong lĩnh vực chẩn đoán

bệnh trên tôm nuôi, phương pháp LAMP đã được phát triển để phát hiện cho nhiều

tác nhân virus gây bệnh nguy hiểm trên cá và các thủy sản khác (Savan và ctv.,

2005). Phương pháp LAMP cũng được công bố cho phép phát hiện IHHNV với giới

hạn phát hiện là 5− 500 bản sao của bộ gen IHHNV bằng cách xác định sản phẩm

theo phương pháp đo độ đục và quan sát sự đổi màu với thuốc nhuộm SYBR Green

I, kết quả so sánh còn cho thấy phương pháp LAMP cũng cho phép phát hiện

IHHNV nhạy hơn 100 lần so với phương pháp PCR thông thường (Sun và ctv.,

2006).

So với các phương khác truyền thống, LAMP được xem có nhiều điểm ưu việt

như không cần thiết bị luân nhiệt và thời gian khuếch đại ngắn hơn (40−60 phút),

ngoài ra, độ nhạy của phản ứng cũng tăng cao 10 − 100 lần so với phương pháp

PCR truyền thống (Savan và ctv., 2005), do vậy việc áp dụng phương pháp này trở

nên dễ dàng hơn cho nhiều phòng thí nghiệm không trang bị máy luân nhiệt mà thay

vào đó chỉ cần bể ủ nhiệt (water bath) hoặc thiết bị nhiệt khô (heating block). Mặc

dù mới được giới thiệu nhưng số lượng công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp

LAMP như một công cụ chẩn đoán tăng lên đáng kể trong một vài năm gần đây đã

cho thấy tính hấp dẫn của phương pháp này. Nhưng nhìn chung thì LAMP vẫn còn

là một phương pháp mới và đang được nghiên cứu thêm.

2.5.8 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR được ứng dụng phát hiện IHHNV từ các động vật biển (Shi

và ctv., 2003). Hiện có nhiều quy trình PCR được công bố từ các nhóm nghiên cứu

trên toàn thế giới như PCR phát hiện IHHNV (Nunan và ctv., 2000; Rai và ctv.,

2009). Một số quy trình PCR còn cho phép phát hiện phân biệt IHHNV lây nhiễm

và không lây nhiễm (Tang và ctv., 2007; Saksmerprome và ctv., 2010). Đến nay,

PCR vả realtime PCR được xem là một trong những phương pháp hiện đại, nhanh

22

chóng và cho kết quả chính xác nhất trong chẩn đoán IHHNV (Tang và Lightner.,

2001; Dhar và ctv., 2001). Multiplex reverse transcription polymerase (mRT-PCR)

cũng được phát triển để chẩn đoán đồng thời 6 loại virus khác nhau gây bệnh trên

tôm bao gồm IHHNV với độ nhạy phát hiện IHHNV là 0.15pg trong phản ứng

(Khawsak và ctv., 2008). Yang và ctv. (2006) đã phát triển PCR một bước phát hiện

đồng thời 2 virus WSSV và IHHNV nhiễm trên một mẫu tôm với độ đặc hiệu khá

cao. Gần đây, Chen và ctv. (2012) cũng đã phát triển multiplex PCR phát hiện

IHHNV và WSSV mới nhiễm trên tôm với độ nhạy cá 1x 103 copy DNA trong bản

mẫu. Khắc phục được những nhược điểm của các phương pháp nêu trên, phương

pháp PCR cho kết quả nhanh (trong khoảng 4 giờ) và có độ tin cậy cao. Kết quả thu

được mang tính khách quan, trung thực khi người phân tích kết quả tốt. Do những

ưu điểm trên chúng tôi đã chọn phương pháp PCR để thực hiện đề tài này.

2.5.9 Các nghiên cứu PCR về chẩn đoán IHHNV lây nhiễm trên tôm nuôi

ở Việt Nam

Nhờ tiến bộ về công nghệ sinh, các phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh

trên thủy sản ngày càng đa dạng và phong phú như: chẩn đoán dựa trên vật liệu di

truyền hoặc phản ứng miễn dịch đặc hiệu với tác nhân gây bệnh. Trong đó, PCR là

phương pháp được đánh giá có hiệu quả và độ tin cậy cao. Các đơn vị nghiên cứu

trong nước (Viện công nghệ sinh học, trường Đại học và Viện Nghiên cứu Nuôi

trồng Thủy sản) đã phát triển áp dụng nhiều công cụ chẩn đoán giúp cho việc sàng

lọc con giống sạch bệnh. Hiện nay, một số nghiên cứu về IHHNV đã được đưa

vào ứng dụng và thương mại như bộ Kit Mono PCR (IHHNV) hay bộ hóa chất

cho phép phát hiện đồng thời ba virus WSSV, MBV, IHHNV (Trung tâm công

nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh., 2008). Tuy nhiên bộ hóa chất này không đề

cập đến chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm hay không lây nhiễm. Công ty Nam

Khoa cũng đưa ra bộ hóa chất phát hiện đồng thời và phân biệt type IHHNV lây

nhiễm và type A IHHNV không lây nhiễm dựa trên hai cặp mồi 309F/R và

MG831F/R do OIE công bố. Đại học Cần Thơ cộng tác với Thái Lan đã tạo được

dòng kháng thể đơn dòng nhận diện protein 37 kDa của IHHNV (Hằng và Flegel.,

23

2008) nhưng cũng không đề cập đến chẩn đoán IHHNV lây nhiễm hay không lây

nhiễm.

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Xác định được đặc tính di truyền, phương thức lan truyền của IHHNV, đề xuất

giải pháp nhằm hạn chế sự lây lan của virus này.

CÁCH TIẾP CẬN

Virus IHHNV (type truyền nhiễm) có bộ gen với kích thước nhỏ (3,8 - 4,1kb),

một vài nghiên cứu chỉ ra rằng có một số khác biệt về trình tự bộ gen giữa các

chủng IHHNV phân lập giữa các vùng địa lý khác nhau (giữa các quốc gia và trong

cùng một quốc gia). Nghiên cứu này sẽ khảo sát các mẫu IHHNV thu nhận từ 5 tỉnh

thuộc khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) và 3 mẫu từ Miền Trung và

Vũng tàu. Trình tự gen của các type IHHNV thu nhận sẽ được giải trình tự và so

sánh kiểm tra sự khác biệt để có được cái nhìn tổng quan về mặt di truyền những

type IHHNV lây nhiễm đang hiện diện tại khu vực ĐBSCL và mối quan hệ di

truyền của chúng đối với các chủng khác đã được phân lập và nghiên cứu từ các

nước trong khu vực và trên toàn cầu.

Trong quần đàn tôm sú tự nhiên, sự xuất hiện hai dạng trình tự “related

sequences IHHNV” (Type không lây nhiễm) gồm type 3A và type 3B chèn trong

bộ gen của tôm sú đã được công bố. Hai trình tự của type 3A và type 3B được cho

là có nguồn gốc từ IHHNV và có độ tương đồng về trình tự cao với virus này, đồng

thời, sự hiện diện của chúng trong bộ gen tôm cũng không gây ra triệu chứng bệnh

hoặc truyền bệnh. Do trình tự bộ gen IHHNV nhỏ và sự xuất hiện trình tự Type 3A

và Type 3B (khoảng 2,9 kb) trong bộ gen của tôm sú đã gây ra sự nhầm lẫn trong

chẩn đoán sự lây nhiễm IHHNV ở nhiều phương pháp PCR. Nghiên cứu một phần

trình tự type 3A và type 3B trên các mẫu tôm thu được từ 5 tỉnh sẽ cho phép chọn

lựa được phương pháp PCR thích hợp cho ứng dụng phát hiện sớm IHHNV tại Việt

Nam.

IHHNV được cho lây nhiễm ở tất cả các giai đoạn phát triển của tôm thẻ chân

trắng và sự truyền lan được xác định diễn ra theo cả chiều ngang và chiều dọc. Mặc

24

dù có nhiều báo cáo cho biết IHHNV có hiện diện trên tôm sú và gây một số biểu

hiện chậm lớn và biến dạng nhưng chưa có thông tin về sự lây nhiễm IHHNV trên

tôm sú ở các giai đoạn khác nhau trong vòng đời của loài này. Nghiên cứu trong đề

tài này sẽ thực hiện giám sát sự diện diện của IHHNV ở tất cả các giai đoạn trong

vòng đời của tôm sú tại các trại sản xuất giống và trại nuôi, ở cả mô hình trại có

mức độ an toàn sinh học cao và mức độ an toàn sinh học thấp. Nghiên cứu cũng

được thực hiện trên cả mô hình nuôi công nghiệp tại trại lớn, trại nhỏ và mô hình

nuôi quảng canh để nắm được sự truyền nhiễm IHHNV trên các mức độ quản lý

nuôi khác nhau. Do nguồn giống tôm sú được sản xuất nhiều tại khu vực Miền

Trung và chuyển vào các vùng nuôi ở ĐBSCL nên mẫu tôm bố mẹ và tôm giống

trong nghiên cứu sẽ được thu tại các trại sản xuất ở Miền Trung và cả ĐBSCL.

Trong khi đó, mẫu tôm nuôi thương phẩm sẽ được thu và phân tích từ các ao nuôi ở

các tỉnh ĐBSCL. Kết hợp với thông tin điều tra và kết quả phân tích sự hiện diện

IHHNV Type 1, 2 để bước đầu đánh giá mối quan hệ giữa việc nhiễm IHHNV và

khả năng gây bệnh trên tôm sú nuôi.

25

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Nghiên cứu đặc trưng di truyền của chủng IHHNV thu nhận ở

Việt Nam

1.1 Khảo sát thu mẫu

1.2 Phân lập, dòng hóa và giải trình tự bộ gen IHHNV type lây nhiễm

1.3 Phân lập, dòng hóa, giải trình tự và định danh IHHNV TypeA/B

1.4 Phân tích cấu trúc vật liệu di truyền các type IHHNV và mối quan hệ giữa

chúng

Nội dung 2: Lựa chọn phương pháp tối ưu phát hiện IHHNV trên tôm sú nuôi

2.1 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR phát hiện IHHNV type lây nhiễm

2.2 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp LAMP phát hiện IHHNV type lây nhiễm

2.3 So sánh và lựa chọn phương pháp tối ưu phát hiện IHHNV type lây nhiễm

Nội dung 3: Nghiên cứu xác định phương thức truyền lan theo trục dọc và trục

ngang của IHHNV trên tôm sú trong phòng thí nghiệm

3.1 Phương thức truyền lan theo trục dọc

3.2 Phương thức truyền lan theo trục ngang cùng loài

3.3 Phương thức truyền lan theo trục ngang khác loài

Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện, truyền lan và các giải pháp hạn

chế IHHNV trên tôm sú

1.1 Đánh giá sự hiện diện và truyền lan của IHHNV trên tôm sú

1.2 Các giải pháp hạn chế sự truyền lan của IHHNV trên tôm sú

26

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian nghiên cứu từ tháng 1/2011 tới cuối tháng 3/2014 tại Trung tâm

Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực

Nam Bộ, Trung tâm giống Hải sản Nam Bộ và Khu thực nghiệm Gò Vấp thuộcViện

Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.

1.2. Vật liệu

1.2.1. Mẫu tôm

Mẫu tôm sú nuôi thương phẩm, tôm sú giống, tôm ấu trùng, tôm sú bố mẹ và

tôm thẻ chân trắng trong nghiên cứu được thu từ các ao nuôi ở ĐBSCL và Miền

Trung từ năm 2011-2014. Mẫu tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm được cung cấp từ

trường Đại học Arizona, Mỹ.

1.2.2. Thu và bảo quản mẫu

Mẫu tôm postlarvae nguyên con, tôm nuôi thương phẩm, tôm bố mẹ gồm phần

mang và chân bơi được cố định trong cồn và bảo quản ở 4°C hoặc −20°C & −80°C.

1.2.3. Mồi sử dụng đã được thiết kế và công bố trên các tạp chí của thế giới

Để khuếch đại DNA của virus IHHNV type lây nhiễm và type A/B chúng tôi

sử dụng các mồi đã được công bố trên các công trình nghiên cứu của thế giới và

thiết kế đã được trình bày trong bảng 6.1.

27

Bảng 6.1. Mồi được thiết kế và công bố trên các tạp chí của thế giới

Mồi Trình tự của mồi Kích thước

(bp) Tác giả

77012F

77353R

5′−ATCGGTGCACTACTCGGA−3′

5′−TCGTACTGGCTGTTCATC−3′

356 OIE (2009)

MG831F

MG831R

5′−TTGGGGATGCAGCAATATCT−3′

5′−GTCCATCCACTGATCGGACT−3′

831

Tang và ctv (2007) IHHNV309F

IHHNV309R

5’TCCAACACTTAGTCAAAACCAA3’

5’TGTCTGCTACGATGATTATCCA−3’

309

IHHNV279F

IHHNV940R

5’−GTGAACCAACAGAAGTCTTTC−3’

5’−GGACCTGGGGTGAGAAGGCT−3’

662

Saksmerprome và

ctv (2010)

IHHNVABF

IHHNVABR

5’-ATGTGCGCCGATTCAACAAG-3’

5’-CTAAGTGACGGCGGACAATA-3’

1200 Tang & Lightner

(2002)

Deca-20a2

Deca-20s9

5’CTTCCCCCGGAACCCAAAGACT-3’

5’-GGGGGCATTCGTATTGCGA- 3’

240 CSIRO, 2008

F1

R1

F2

5’-AGCGCTTCGCAGGAAACCGTTA-3’

5’-CTGGGCAGTAGCGCAGCGATAT-3’

5’-ACGAACGACCACCCATGGCA-3’

295

437

Trung và ctv

(2013a,b)

vnIHF

vnIHR

5’− AATTGCTTCGAGAACGCACG−3’

5’− GGACATGGTCCGTCTACTGC−3’

997

28

NỘI DUNG I: NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG DI TRUYỀN CỦA

CHỦNG IHHNV THU NHẬN Ở VIỆT NAM

Mục tiêu: Sự đa dạng di truyền các chủng IHHNV ở các vùng địa lý khác

nhau đã được nghi nhận trên tôm sú nuôi. Ở Việt Nam, sự du nhập tôm bố mẹ từ

nhiều nguồn khác nhau nên có thể có sự đa dạng về di truyền của các chủng

IHHNV truyền nhiễm hiện diện tại ĐBSCL là rất cao. Do vậy, việc thu mẫu ở các

vùng khác nhau và giải trình tự IHHNV sẽ cho biết được cấu trúc vật liệu di truyền

các chủng IHHNV tại Việt Nam và mối quan hệ di truyền với các chủng trên thế

giới IHHNV. Qua đó hiểu rõ hơn về đặc tính di truyền như đột biến dẫn đến ảnh

hưởng độc lực của chủng IHHNV và sự tiến hóa trong di truyền của chủng IHHNV

phân lập trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL để tìm ra những kỹ thuật chẩn đoán phù hợp

nhằm phát hiện hiệu quả bệnh này là một yêu cầu cấp thiết trong nghiên cứu và

phòng ngừa bệnh do IHHNV cho tôm nuôi cũng như cung cấp thông tin về đặc tính

di truyền của chúng cho nhà quản lý để kiểm soát sự lan rộng của IHHNV trên tôm

nuôi ở Việt Nam.

1. Khảo sát thu mẫu

Mẫu tôm sú nuôi thương phẩm (1-2 tháng sau khi thả nuôi) được thu trực

tiếp ngẫu nhiên từ các ao nuôi tôm ở các tỉnh ĐBSCL như Bến Tre, Kiên Giang,

Sóc Trăng, Tiền Giang và Bạc Liêu, tôm bố mẹ được thu từ các trại giống ở Vũng

Tàu, ĐBSCL. Tôm sú giống được thu từ những nông hộ bắt giống từ Miền Trung

mang về nuôi ở ĐBSCL. Các mẫu tôm sú được thu từ cuối tháng 12 năm 2010 đến

tháng 8 năm 2013. Mẫu tôm mẹ được bảo quản âm sâu (-800C) để làm nguồn vật

liệu ly trích virus. Đối với mẫu post và tôm nuôi thương phẩm sau khi thu nhận sẽ

được ghi lại thông tin lâm sàng và bảo quản trong cồn 95% để phân tích sự hiện

diện IHHNV các type khác nhau.

2. Sàng lọc mẫu tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm và không lây nhiễm

Do IHHNV có type lây nhiễm và type A/B không lây nhiễm nên sàng lọc

mẫu cần sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau đã được nghiên cứu, đặc hiệu cho mỗi

type. Dựa vào các điều kiện đã tối ưu và chu trình luân nhiệt của các cặp mồi đã

29

được công bố chúng tôi thiết lập lại phản ứng PCR với hóa chất hiện có tại phòng

thí nghiệm.

Sau khi sàng lọc các mẫu tôm có sự hiện diện type lây nhiễm và không lây

nhiễm bằng các qui trình PCR phát hiện type lây nhiễm (OIE., 2009; Saksmerprome

và ctv., 2010). Các mẫu tôm này sẻ được tiếp tục sàng lọc type không lây nhiễm

bằng các quy trình PCR chẩn đoán IHHNV type A/B của Tang và ctv (2007) với

cặp mồi IHHNV ABF/R và MG831F/R, dựa theo công bố của tác giả chúng tôi sử

dụng cặp mồi IHHNV ABF/R sàng lọc type A/B để thực hiện PCR với các điều

kiện phản ứng của quy trình: tổng thể tích 50 µl hỗn hợp phản ứng PCR, thành phần

cho mỗi phản ứng như sau: 10 µl Buffer Flexi 5X, 3 µl MgCl2 (25 mM), 1 µl dNTP

(10 mM) (Promega, Mỹ), 0.5 µl MG831F (50 µM) và 0.5 µl MG831R (50 µM),

0.25 µl Go Taq Flexi polymerase 5 U/µl (Promega, Mỹ), thêm H20 khử ion cho đủ

48 µl, 2 µl mẫu DNA. Chu kì luân nhiệt cho phản ứng như sau: 1 chu kì gồm: 94°C

trong 5 phút; 30 chu kì gồm: 94°C trong 30 giây, 56°C trong 45 giây, 72°C trong 45

giây; 1 chu kì: 72°C trong 7 phút, 4°C cho đến khi sử dụng.

Thành phần phản ứng của các quy trình chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm

của OIE (2009) với cặp mồi IHHNV 77012F/77353R, IHHNV 309F/R và IHHNV

279F/940R cũng giống như thành phần phản ứng sàng lọc type A/B. Phương pháp

sàng lọc theo giả định để chọn mẫu giải trình tự theo bảng 6.2

Bảng 6.2 Giả định kết quả sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B

Kết quả giả

định

IHHNV

77012F/773

53R

IHHNV

279F/940R

IHHNV

309F/R

MG831

F/R

IHHNV

ABF/R

Chọn mẫu

giải trình

tự

Mẫu nhiễm

IHHNV type

lây nhiễm

(+) (+) (+) (-) (-) √

Mẫu nhiễm

IHHNV type

A/B

(-) (-) (-) (+/-) (+) √

Sau khi có kết quả kiểm tra bằng phản ứng PCR, chọn những mẫu không

nhiễm IHHNV type lây nhiễm (xác nhận âm tính với IHHNV type lây nhiễm bằng

30

phương pháp PCR với với cặp mồi IHHNV 279F/940R hoặc IHHNV

77012F/77353R và 309F/R đặc hiệu cho virus IHHN gây bệnh). Sau đó sử dụng

phương pháp PCR với cặp mồi IHHNV ABF/R để xác định sự hiện diện IHHNV

type A/B trong những mẫu nghi nhiễm IHHNV type A/B đã chọn trên. Ngược lại,

các mẫu DNA thỏa điều kiện sàng lọc ở trên sẽ được nhân dòng và giải trình tự.

Những mẫu nhiễm IHHNV type lây nhiễm (xác nhận dương tính với với cặp mồi

IHHNV 279F/940R hoặc IHHNV 77012F/77353R và 309F/R) sẽ được chọn đi giải

trình tự gen cho IHHNV type lây nhiễm.

3. Dòng hóa và giải trình tự

3.1. Đối với IHHNV type A/B

Khuếch đại đoạn DNA IHHNV type A/B có kích thước 1,2 kb trên mẫu tôm

bằng phương pháp PCR với cặp mồi IHHNV ABF và IHHNV ABR (Tang và ctv.,

2007) với enzyme DNA polymerase Pfu (Invitrogen, Mỹ). Sau đó gắn đuôi poly A

vào sản phẩm khuếch đại sẽ được nối với vector pGEM T-easy. Vector tái tổ hợp

pGEM T-easy-IHHNV type A/B được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli JM 109.

Tế bào vi khuẩn mang gen tái tổ hợp được nhân sinh và tinh sạch sạch bằng Kit

Wizard®Plus SV Miniprep DNA purification system (Promega, Mỹ) từ sinh khối

nói trên. Vector pGEM T-easy chứa đoạn sản phẩm khuếch đại sau đó sẽ được ly

trích bằng bộ hóa chất SV Winzad miniprep (Promega, Mỹ) và giải trình tự trên cả

2 mạch bằng mồi trên vector pGEM T-easy (thực hiện giải trình tự tại Cty Nam

Khoa).

3.2. Đối với IHHNV type lây nhiễm

Sau khi sàng lọc các mẫu tôm nhiễm IHHNV bằng các qui trình PCR chẩn

đoán IHHNV type lây nhiễm của OIE (2009) với cặp mồi IHHNV 77012F/77353R,

IHHNV 309F/R cùng quy trình của Saksmerprome và ctv (2010) với cặp mồi

IHHNV 279F/940R và khẳng định mẫu tôm không nhiễm virus IHHN type A/B

bằng cặp mồi IHHNV ABF/R. Tiến hành gửi mẫu cho công ty Nam Khoa giải trình

tự bằng các cặp mồi genome walking bảng 6.3. Phân tích giải trình tự các đoạn

DNA của IHHNV đã tinh sạch trên máy 313xl Genetic Anzyzer với bộ kít

31

BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing. Sau khi giải trình tự, dùng phần mềm

BioEdit nối các trình tự này lại thành bộ gen hoàn chỉnh.

Bảng 6.3. Trình tự từng cặp mồi để khuếch đại gen IHHNV type lây nhiễm để giải

trình tự do Công ty Nam Khoa cung cấp.

Số thứ tự Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước

khuếch đại

1 IHHNV9-5F GCTTCGCAGGAAACCGTTAC 691bp

IHHNV9-696R GGGTGAGAAGGCTTGGAGAAA

2 IHHNV10-643F AACGCACGAACGAAACTCACT 635bp

IHHNV10-1297R GGTTTTTCTCTGATGACGAAGGTG

3 IHHNV11-1223F GCGACTGGAAGAGAGTGAGATTG 627bp

IHHNV11-1870R AGTTGGCTTTGGTTTGACTTTTT

4 IHHNV12-1838F CAACAACAAGAAAAAGTCAAACCA 662bp

IHHNV12-2520R GGTTGTCTATGATGTCGTCGATTT

5 IHHNV13-2456F CAGCGACGACTTCCTAGGACTC 631bp

IHHNV13-3107R TGTTGGATTGGGTCTTCATAGTTT

6 IHHNV14-2936F AGACTCTCACATTTACAGACACCCC 600bp

IHHNV14-3556R GGTAAAAGCTGGATATAATCGGGT

7 IHHNV15-3316F ATGAGAATGTCACCAATCAAAGG 495bp

IHHNV15-3830R CAGAAACCGTTAACTTAATATGTGA

3.2.1. Phân tích cấu trúc di truyền các type IHHNV

Trình tự DNA của đoạn gen IHHNV type A/B và bộ gen IHHNV type lây

nhiễm thu nhận trên các tỉnh sẽ được phân tích trên nhiều phần mềm trên máy tính

và trang web, so sánh độ tương đồng nucleotide (nt), amino acid (a.a) của chủng thu

nhận được từ các tỉnh ở Việt Nam với các chủng trên ngân hàng gen (Genbank)

bằng chương trình Clustal W 2.1 của phần mềm DNASTAR Lasergene V7.1.0 và

http://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=clustalw2. Để khẳng

định trình tự IHHNV type lây nhiễm thu nhận được sử dụng chương trình phân tích,

so sánh Basic local alignment search tool (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Theo các nghiên cứu của Shike và ctv. (2000) bộ gen của IHHNV gồm 3 vùng, các

vùng này mã hóa cho các loại protein khác nhau (protein giả định 1 (NS1), protein

giả định NS2 và protein vỏ) gồm vùng gen ORF1, ORF2 và ORF3 tìm kiếm khung

đọc mở mã hóa protein (ORF) trên bộ gen virus IHHN thu nhận bằng chương trình

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) và Vector NTI 15.6 (Invitrogen, Mỹ).

32

Chương trình mã hóa cho trình tự DNA của bộ gen thành amino acid giả định

ExPASy (http://us.expasy.org) và Vector NTI 15.6 được dùng để phân tích bộ gen

và dịch mã từ nucleotide thành amino acid trên các đoạn ORF của bộ gen IHHNV.

- Xác định khung đọc mở: Sử dụng các phần mềm Vector NTI 15.6 để xác

định các đoạn ORF và dịch mã giả định từ trình tự nucleotide sang trình tự

amino acid.

- Xác định promoter giả định đóng vai trò điều hòa phiên mã: Promoter là

vùng gần vị trí bắt đầu phiên mã của bộ gen, có vai trò trong điều hòa, chúng

thường nằm phía trước vùng trình tự có chức năng mã hóa. Promoter có

chiều dài khoảng 100-1000 nucleotide. Vùng lỏi promoter thường có bán

kính 35 nt tình theo chiều ngược hoặc chiều xuôi kể từ điểm bắt đầu phiên

mã +1. Lỏi của promoter như hộp TATA, yếu tố khởi đầu (Inr), và lỏi chiều

xuôi –DPE. Để xác định promoter, chương trình Neural Network Promoter

Prediction (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html).

- Phân tích chức năng các vùng của bộ gen: Sử dụng chương trình Vector NTI

15.6 để xác định các vùng chức năng như NTP, enzyme helicase của họ

parvovirus.

3.2.2. Phân tích mối quan hệ và cây tiến hóa di truyền

Việc so sánh trình tự virus thu nhận được ở Việt Nam và các nước khác

nhằm để đánh giá mối quan hệ tiến hóa của IHHNV. Khi hai trình tự gen hay trình

tự acid amino có độ tương đồng cao thì thường chúng có trình tự bảo tồn cao và có

trình tự tổ tiên chung. Ngoài ra khi so sánh nhiều trình tự để cung cấp các thông tin

về trình tự giống nhau trong tập hợp các trình tự đang so sánh.

Xác định các mối quan hệ và tiến hóa di truyền giữa các chủng IHHNV thu

nhận ở Việt Nam thu được trong nghiên cứu này được so sánh với các chủng

IHHNV trong khu đã công bố trên ngân hàng gen thế giới bằng phần mềm MegAlig

(DNASTAR Lasergene V7.1.0). So sánh trình tự 2,9 kb của bộ gen chủng IHHNV

thu nhận từ tôm sú (P. monodon) với nhau, hoặc so sánh với các bộ gen IHHNV đã

công bố trên thế giới (Type không lây nhiễm Tanzania AY124937, Madagascar

33

type A DQ228358, Úc type A EU675312). Type lây nhiễm phân lập ở Thái Lan

2000 AY102034, Thái Lan 2003 AY263547, Đài Loan A AY355306, Đài Loan B

AY355307, Đài Loan C AY355308, Ấn Độ GQ411199, Ecuador AY362548, Trung

Quốc EF633688, Hawaii (Mỹ) AY218266, Úc (GQ475529) và Mexico AF273215.

Các dữ liệu trình tự nucleotide của bộ gen IHHNV phân lập trên tôm sú ở ĐBSCL,

Miền Trung và trình tự nucleotide bộ gen của IHHNV từ các nước khác sẽ được

phân tích bằng phần mềm này. Kết quả sẽ xác định được nguồn gốc của chủng

IHHNV phân lập và chủng IHHNV trên thế giới. Cây tiến hóa di truyền được xây

dựng bởi các thuật toán neighbor-joining dựa trên tính toán giữa khoảng cách trình

tự nucleotide giữa đại diện IHHNV và giữa các nhóm bằng cách sử dụng phần mềm

MegAlig. Độ dài nhánh ngang là tỷ lệ thuận với khoảng cách di truyền, số hiển thị

là độ dài của nhánh chính xác hơn 70% ở độ tái lập lại 1000. Các chỉ số xác định có

độ tin cậy 95% trong cây di truyền.

34

NỘI DUNG II: LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU PHÁT HIỆN

IHHNV TRÊN TÔM SÚ NUÔI

Mục tiêu: Sự hiện diện của 2 type IHHNV A và B gắn vào bộ gen của tôm sú thì

việc lựa chọn quy trình PCR ứng dụng trên tôm sú phải được cân nhắc do có sự

tương đồng rất lớn về vật liệu di truyền giữa các type IHHNV (trình tự 2.9 kb

nucleotide của type A/B không lây nhiễm tương đồng 90−96% so với 4.1 kb của

type IHHNV lây nhiễm) dẫn đến kết quả dương tính giả (Tang và ctv., 2006). Như

vậy kết quả phân tích không thể phân biệt được mẫu mang vius IHHN có khả năng

gây bệnh (type 1, type 2) hay mẫu mang IHHNV không gây bệnh (type A/ B). Điều

này ảnh hưởng đến khâu chọn con giống ban đầu, giá trị thương phẩm của tôm

nuôi. Một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Thái Lan trên tôm sú nuôi cho

thấy, khi sử dụng qui trình IQ2000 (Đài Loan) và mồi 309F/R để khuếch đại gen

IHHNV thì tỷ lệ dương tính giả chiếm tỷ lệ rất cao, vì có sự chèn ngẫu nhiên DNA

của IHHNV vào bộ gen tôm mà vùng này là trình tự đích cho mồi của 2 qui trình

trên bắt cặp. Thêm vào đó, theo khuyến cáo của tổ chức thú y thế giới OIE (2009)

để khẳng định mẫu tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm thì ngoài sử dụng qui trình

PCR có mồi 309F/R phát hiện virus cho kết quả dương tính còn phải sử dụng một

quy trình PCR khác để khẳng định mẫu đó là dương tính virus IHHN thật. Từ

những lý do nêu trên, trong nghiên cứu này chúng tôi phát triển quy trình Multiplex

PCR khuếch đoạn 2 vùng của một trình tự bộ gen IHHNV type lây nhiễm (chiếm

2/3 bộ gen) với cặp mồi vnIHF/vnIHR kết hợp mồi 309F/R để phát hiện virus thật

IHHN nhiễm trên tôm nuôi. Quy trình này được áp dụng để kiểm tra IHHNV ở tất

cả các giai đoạn tôm giống, tôm thương phẩm, tôm bố mẹ và tôm đông lạnh trên

tôm sú và các loài tôm khác

1. Ly trích DNA virus từ tôm

1.1. Chuẩn bị mẫu

Mẫu tôm giống: lấy toàn bộ phần đầu của tôm (có cả các cơ quan bên trong),

số lượng khoảng 100 − 150 con, tùy số lượng tôm trong đàn nhưng tổng trọng

lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, mẫu đã được cố định

trong cồn 95o.

35

Mẫu tôm nuôi thương phẩm: lấy một phần nhỏ mang của 5 – 10 con nhưng

tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0.1 gam của mẫu tươi

hoặc mẫu được cố định trong cồn 950.

Mẫu tôm mẹ: lấy mẫu tôm mẹ phức tạp hơn vì phải đảm bảo tôm vẫn còn sống

để tham gia sinh sản. Do vậy, ưu tiên lấy mẫu chân bơi 2 hoặc một phần mang, mẫu

được cố định trong cồn 950. Lượng mẫu lấy không quá 1 gam và cũng không nhỏ

hơn 0.1 gam.

1.2 Ly trích và tinh sạch DNA (Desoxyribonucleic Acid) virus

Ly trích thô: Sử dụng 200 − 500 mg mô tôm nghiền trong 1 ml dung dịch

NaOH − SDS (NaOH 0.025N, SDS 0.0125%) sau đó được đun sôi 10 phút và làm

lạnh nhanh trong nước đá. Sau khi ly tâm 13.000 vòng/10 phút, dịch nổi được sử

dụng trực tiếp cho phản ứng PCR.

Ly trích tinh DNA của virus theo quy trình của Gudkovs (2008) có điều chỉnh:

sử dụng 200 − 500 mg mô tôm nghiền trong 500 µl dịch đệm ly trích DNA (50 mM

Tris, pH8; 1 mM EDTA, pH8; 500 mM NaCl; 1% SDS), ủ trong nước đá 5 phút,

sau đó đun ở 100°C trong 10 phút, lấy mẫu ra cho vào trong nước đá 5 phút, ly tâm

13.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi bên trên chứa DNA cho vào

eppendorf 1.5 ml mới. Sau đó tủa dịch nổi bằng 2 thể tích cồn tuyệt đối, ly tâm ở

13.000 vòng/phút trong 5 phút thu tủa DNA. Loại bỏ dịch nổi, tủa DNA được làm

khô ở 580C trong 10 phút, hòa tan cặn tủa DNA trong 200 µl nước khử ion và giữ ở

−20°C.

2. Dòng hóa

Để thuận tiện cho việc nghiên cứu nhạy quy trình bằng cách tính số lượng bản

copy mẫu trong 1 phản ứng, chúng tôi tiến hành dòng hóa đoạn DNA của IHHNV

vào plasmid pGEM T-easy. Mẫu DNA IHHNV được chọn để dòng hóa là mẫu đối

chứng dương IHHNV được cung cấp từ trường Đại học Arizona. Đoạn DNA của

IHHNV có kích thước 2589 bp được khuếch đại với cặp mồi F1 5’−ACG AAC

GAC CAC CCA TGG CA−3’ và 77353R 5′-TCG TAC TGG CTG TTC ATC-3′

(Trung và ctv., 2013; OIE., 2009) này dùng làm bản mẫu cho các qui trình PCR

thiết kế và PCR của OIE đã công bố. Qui trình PCR khuếch đại với 50 µM mỗi

36

mồi F1, 77353R và enzyme DNA polymerase Pfu rồi dòng hóa vào Vector pGEM

T-easy và chuyển vào vi khuẩn E.coli JM109 (Promega, Mỹ). Plasmid pGEM T-

easy - IHHNV type lây nhiễm tiếp đó được tinh sạch từ vi khuẩn bằng Kit

Wizard®Plus SV Miniprep DNA purification system (Promega, Mỹ,) sẽ được xác

định nồng độ bằng phương pháp đo mật độ quang OD và số lượng bản sao

(http://www.vsmmb.com/data/upload_file/File/PCR book 1). Đồng thời đoạn

plasmid DNA IHHNV đại được sử dụng làm cho bản mẫu cho các cặp mồi khác và

để khảo sát giới hạn phát hiện virus trong các qui trình PCR.

3. Phương pháp đo nồng độ DNA

Lấy 100 µl nước khử ion vô trùng vào cuvet 100 µl, đo đối chứng. Hoà 10 µl

dịch ADN cần đo vào 90 µl nước khử ion, trộn đều rồi bơm vào cuvet, đo ở bước

sóng 260 nm, 280 nm. Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm,

280 nm.

4. Phương pháp tính số bản sao plasmid DNA

Với dung dịch plasmid DNA, chúng ta có thể tính được số bản sao plasmid

DNA trong dung dịch có nồng độ (C ng) của plasmid DNA. Cách tính như sau:

1 mole của một cặp base trên đoạn DNA là có khối lượng 650 gr, do vậy

plasmid dài L base (kể cả đoạn DNA chèn vào) sẽ có khối lượng (650 × L)

gr hay (650 × 109 × L) ng.

Theo định luật Avogadro, 1 mole sẽ có (650 × 1023) phân tử (hay là số bản

sao plasmid).

Do vậy nếu dung dịch plasmid DNA có nồng độ C ng/ml thì số bản sao

plasmid DNA có trong dung dịch này sẽ là: N (bản sao/ml) = (650 × 1023) ×

C/(650 × 109 × L) bản sao/ml.

5. Phương pháp pha loãng nồng độ DNA

Dịch tách chiết DNA được pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10. Dùng

micropipette hút 5 µl dịch tách chiết DNA cho vào 45 µl H20 khử ion, tiến hành

trộn mẫu trên máy vortex ta sẽ được nồng độ pha loãng cao nhất, sau đó hút 5 µl

mẫu từ ống eppendorf vừa vortex ở trên chuyển sang ống eppendorf thứ hai có chứa

sẵn 45 µl nước khử ion, trộn đều. Quá trình cứ lặp lại, sau cùng ta thu được một dãy

37

các nồng độ DNA theo chiều giảm dần đến eppendorf cuối sẽ có nồng độ DNA pha

loãng thấp nhất.

6. Phương pháp điện di trên gel agarose

Cân 1.5 g agrarose (Promega, Mỹ) cho vào chai thủy tinh, sau đó cho vào chai

100 ml dung dịch TBE 0.5 X. Lắc chai cho agrarose hòa tan vào dung dịch TBE,

sau đó đem đun trong microwave trong 3 phút ở 450 W (đun cho agrarose hòa tan

hoàn toàn), agrarose sau khi đun xong để nguội khoảng 60oC rồi cho thêm 5 µl

ethium bromide (nồng độ 10 mg/µl), trộn đều, đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay

dung dịch sẽ tự trải đều khay. Khoảng 30 phút sau gel đặc lại, lấy lược ra nhưng

phải cẩn thận tránh bị bể gel. Hút 2 µl dung dịch nạp mẫu 6X (40% glycerol, 0,25%

bromophenol blue và 0,25% xylencyanol) nhỏ thành giọt ra giấy parafilm, sau đó

hút 10 µl dung dịch sản phẩm khuếch đại trộn đều với dung dịch nạp mẫu và tiến

hành nạp mẫu vào giếng của gel. Sau khi nạp mẫu xong ta đậy nắp bể điện di lại và

tiến hành chạy điện di ở 100V. Thời gian điện di 30 phút. Sau khi chạy điện di xong

bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn gel và chụp hình trên bộ đọc gel Doc (Bio-Rad,

Mỹ). Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng.

38

PHẦN 1: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG

PHÁP PCR PHÁT HIỆN IHHNV TYPE LÂY NHIỄM

I. PHÁT TRIỂN QUI TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN IHHNV TYPE

LÂY NHIỄM

1.1. Thiết kế mồi cho phản ứng Multiplex PCR chẩn đoán IHHNV type lây

nhiễm

Hiện nay, có rất nhiều trình tự mồi của kỹ thuật PCR đã được công bố trên

nhiều tạp chí và tạp chí hướng dẫn chẩn đoán virus gây bệnh trên động vật thủy sản

(Rai., ctv. 2012). Và nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy trên tôm sú nuôi có sự hiện

diện của 2 type IHHNV A và B gắn vào bộ gen của tôm nuôi ở Thái Lan, Úc, Châu

Phi và Ấn Độ. Việc chẩn đoán IHHNV dựa trên vật liệu di truyền trở nên rất phức

tạp bởi các biến thể di truyền của virus trong các khu vực địa lý khác nhau (Tang và

ctv, 2006). Do đó việc lựa chọn quy trình PCR ứng dụng trên tôm sú phải được cân

nhắc do có sự tương đồng rất lớn về vật liệu di truyền giữa các type IHHNV (trình

tự 2.9 kb nucleotide của type A/B không lây nhiễm tương đồng 90−96% so với 4.1

kb của type IHHNV lây nhiễm) (Saksmerprome và ctv., 2010). Một số phương pháp

PCR có thể cho kết quả dương tính giả đối với virus truyền nhiễm IHHN type lây

nhiễm trên P. monodon nếu mồi được thiết kế thuộc khu vực vật liệu di truyền

IHHNV của type A/B chèn vào hệ gen tôm (Tang và ctv., 2003; Krabsetsve và ctv.,

2004; Tang và Lightner., 2006). Hiện nay cặp mồi khuếch đại IHHNV là 309F/R

(Tang và ctv., 2007), 77012F/77353R (OIE., 2012) và Kít IQ 2000 (Inteligent, Đài

Loan) phát hiện IHHNV type truyền nhiễm được đánh giá cao. Tuy nhiên, gần đây

theo nghiên cứu của Saksmerprome và ctv. (2011) cho thấy có sự gắn chèn trình tự

DNA ngẫu nhiên của IHHNV type lây nhiễm vào gen tôm sú. Chính vì vậy, khi sử

dụng các kỹ thuật PCR khuyến cáo hiện tại để phát hiện virus có thể cho kết quả

dương tính giả.

Theo khuyến cáo của tổ chức thú y thế giới OIE (2009) để khẳng định mẫu

tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm thì ngoài sử dụng qui trình PCR mồi 309F/R

phát hiện virus cho kết quả dương tính còn phải sử dụng một quy trình PCR khác để

39

khẳng định mẫu đó là dương tính virus IHHN thật. Từ những lý do nêu trên, trong

nghiên cứu này chúng tôi phát triển quy trình Multiplex PCR chẩn đoán IHHNV

type lây nhiễm với cặp mồi vnIHF/vnIHR kết hợp mồi 309F/R để cải thiện quy

trình chẩn đoán phát hiện virus thật IHHN nhiễm trên tôm nuôi.

Dựa vào trình tự bộ gen của IHHNV type lây nhiễm ở ĐBSCL này (Genbank:

JX840067 và KC513422) và đề tài sử dụng chương trình Primer 3

(http://primer3.wi.mit.edu/) để thiết kế cặp mồi vnIHF và vnIHR thể hiện ở hình

6.1.

Hình 6.1. Sơ đồ vị trí thiết kế mồi trên genome của IHHNV type lây nhiễm thu nhận

ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (Genbank: JX840067 và KC513422) vnIHF: mồi xuôi

và vnIHR: mồi ngược (màu xanh lá cây) và cặp mồi 309F/R (OIE., 2009). Vùng

khuếch đại từ vị trí 622-1618 có kích thước DNA khoảng 997 bp.

Bảng 6.4. Mồi sử dụng trong nghiên cứu này

Tên mồi Trình tự mồi Kích

thước (bp)

Tài liệu

tham khảo

vnIHF 5’− AATTGCTTCGAGAACGCACG−3’ 997

Nghiên

cứu vnIHR 5’− GGACATGGTCCGTCTACTGC−3’

309F 5’-TCCAACACTTAGTCAAAACCAA-3’ 309 OIE, 2009

309R 5’-TGTCTGCTACGATGATTATCCA-3’

Deca-20a2 5’-ACTTCCCCCGGAACCCAAAGACT- 3’ 240 CSIRO, 2008

Deca-20s9 5’-GGGGGCATTCGTATTGCGA- 3’

1.2. Kiểm tra sự hoạt động của mồi

Đoạn plasmid DNA IHHNV type lây nhiễm đã được dòng hóa trước đó được

sử dụng làm bản mẫu DNA cho phản ứng Mutiplex PCR và để khảo sát giới hạn

phát hiện virus trong các quy trình PCR.

Trước khi để thiết kế một phản ứng Mutiplex PCR phát hiện các vùng gen

khác nhau trên cùng một trình tự. Chúng tôi phải kiểm tra sự hoạt động của mồi

thiết kế để xem các mồi này có hoạt động hay không. Thành phần phản ứng được

thiệt lập dựa trên khuyến cáo của nhà sản xuất, tổng thể tích mỗi phản ứng là 50 µl

40

gồm: 10 µl Buffer Flexi 5X, 1 µl dNTP (10 mM), 4l MgCl2 (25mM), 0.5 µl mỗi

mồi vnIHF, vnIHR (50 µM) và 0.25 µl Go Taq Flexi polymerase (5 U/µl)

(Promega, Mỹ). Thêm H2O khử ion cho đủ 48 µl, 2 µl bản mẫu DNA (100 ng). Chu

kì luân nhiệt cho phản ứng như sau: Bước 1: 1 chu kì gồm: 95°C trong 4 phút; Bước

2: 30 chu kì gồm: 95°C trong 30 giây, 58°C trong 45 giây, 72°C trong 60 giây;

Bước 3: 1 chu kì gồm: 72°C trong 5 phút, 4°C cho đến khi đem điện di.

Sau khi đã có kết quả kiểm tra hoạt động mồi, dựa trên các điều kiện phản ứng

khảo sát riêng lẻ trước đó, chúng tôi thiết lập điều kiện và thành phần phản ứng

multiplex khuếch đại DNA của IHHNV như sau: tổng thể tích mỗi phản ứng là 50

µl gồm 10 µl Buffer Flexi 5X, 1 µl dNTP (10 mM), 3l MgCl2 (25mM), 0.5 µl mỗi

mồi vnIHF, vnIHR (50 µM) và 0.2 µl mỗi mồi 309F và 309R (50 µM), 0.25 µl Go

Taq Flexi polymerase (5 U/µl) (Promega, Mỹ). Thêm H2O khử ion cho đủ 48 µl, 2

µl bản mẫu DNA. Chu kì luân nhiệt cho phản ứng như sau: Bước 1: 1 chu kì gồm:

95°C trong 4 phút; Bước 2: 30 chu kì gồm: 95°C trong 30 giây, 58°C trong 45 giây,

72°C trong 60 giây; Bước 3: 1 chu kì gồm: 72°C trong 5 phút, 4°C cho đến khi đem

điện di.

1.3. Khảo sát các điều kiện của phản ứng Multiplex PCR

Trong một phản ứng PCR thành phần MgCl2, dNTPs và nhiệt độ bắt cặp của

mồi là những nhân tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của quá trình

PCR. Vì vậy, phản ứng PCR sau khi thiết lập sẽ được khảo sát các thành phần phản

ứng nêu trên. Nồng độ MgCl2 trong mỗi phản ứng được khảo sát là (1 mM, 1.5 mM,

2 mM, 2.5 mM, 3 mM), dNTPs (0.05 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM), và nhiệt độ

bắt cặp của mồi (nhiệt độ lai biến thiên từ 50oC đến 65oC). Plasmid IHHNV type

lây nhiễm sẽ được pha loãng bậc 10, chọn 3 nồng độ DNA plasmid IHHNV khác

nhau (10−4, 10−5, 10−6).

1.3.1. Khảo sát nồng độ dNTPs

Deoxy Nucleoside Triphosphat (dNTP) là đơn vị để tổng hợp được các bản sao

của DNA đích, dNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có

thể là adenine (dATP) hay thymine (dTTP), cytosine (dCTP), guanine (dGTP).

41

Trong phản ứng PCR nồng độ dNTP quá cao sẽ liên kết với Mg2+, Mg2+ là một ion

rất cần cho sự hoạt động của enzym tổng hợp và sự tổng hợp mạch của enzyme Taq

polymerase. Vì vậy, dNTP mà sẽ ảnh hưởng tới phản ứng tổng hợp. Do đó để phát

triển quy trình chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm cần tối ưu nồng độ dNTPs (dATP,

dCTP, dGTP, dTTP).

Chọn 3 độ pha loãng 10−4, 10−5, 10−6 trong dãy pha loãng plasmid – DNA (mục

2.4.2.6) làm mẫu tối ưu nồng độ dNTPs. Khảo sát ở một số nồng độ dNTPs phản

ứng như sau: 0.05 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, bố trí 4 lô thí nghiệm tương ứng

với 4 nồng độ trên, mỗi lô có 3 phản ứng với các mẫu plasmid-DNA pha loãng ở

các nồng độ 10−4, 10−5, 10−6 làm đối chứng dương và 1 mẫu nước làm đối chứng

âm. Tổng thể tích mỗi phản ứng là 50 µl gồm 10 µl Buffer Flexi 5X, 1 µl dNTP (10

mM), 3l MgCl2 (25mM), 0.5 µl mỗi mồi vnIHF, vnIHR (50 µM) và 0.2 µl mỗi

mồi 309F và 309R (50 µM), 0.25 µl Go Taq Flexi polymerase (5 U/µl) (Promega,

Mỹ). Thêm H2O khử ion cho đủ 48 µl, 2 µl bản mẫu DNA cho vào 3 phản ứng đối

chứng dương tương ứng với 3 độ pha loãng và 2 µl H20 khử ion cho vào mẫu đối

chứng âm. Chu kì luân nhiệt như đã khảo sát ở trên. Kết quả được phân tích trên gel

agarose 1.5%. Nồng độ dNTPs thích hợp nhất là tại nồng độ đó 3 mẫu đối chứng

dương cho tín hiệu đúng kích thước và sáng rõ nhất.

1.3.2. Khảo sát nồng độ Mg+2

Nồng độ Mg+2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả hoạt động

của enzyme polymerase và tính đặc hiệu của quá trình PCR. Nồng độ Mg+2 cao có

thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm không đặc hiệu. Tuy nhiên nếu nồng độ Mg+2

thấp sẽ làm giảm hiệu quả nhân bản dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp. Do vai trò

quan trọng của Mg+2 trong phản ứng PCR, nên cần tối ưu nồng độ Mg+2

để phát

triển quy trình PCR trong chẩn đoán IHHNV.

Tương tự như đã khảo sát dNTPs, chúng tôi chọn 3 độ pha loãng 10−4, 10−5,

10−6 trong dãy pha loãng plasmid DNA IHHNV làm mẫu tối ưu nồng độ Mg+2.

Khảo sát ở một số nồng độ Mg+2 phản ứng như sau: 1 mM, 1.5 mM, 2 mM, 2.5

mM, 3 mM, bố trí 5 lô thí nghiệm tương ứng với 5 nồng độ trên, mỗi lô có 3 phản

ứng với các mẫu có độ pha loãng 10−4, 10−5, 10−6 làm đối chứng dương và 1 mẫu

42

nước làm đối chứng âm. Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR tương tự như khảo sát

dNTPs mục bên trên sử dụng nồng độ dNTPs đã tối ưu và bổ sung Mg+2 với các

nồng độ trên, thêm H2O khử ion cho đủ 50 µl, 2 µl mẫu pha loãng plasmid-DNA

IHHNV cho vào 3 phản ứng đối chứng dương tương ứng với 3 độ pha loãng và 2 µl

H20 khử ion cho vào mẫu đối chứng âm. Chu kì luân nhiệt như đã khảo sát ở mục

bên trên. Kết quả được phân tích trên gel agarose 1.5%. Nồng độ Mg+2 thích hợp

nhất là tại nồng độ đó mẫu đối chứng dương cho tín hiệu đúng kích thước và sáng

rõ nhất so với các nồng độ còn lại.

1.3.3. Khảo sát nhiệt độ lai

Nhiệt độ lai của phản ứng có ảnh hưởng rất lớn đến độ đặc hiệu của phản ứng.

Nhiệt độ cao quá hay thấp quá sẽ dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào

DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Để tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ lai, chọn 3

độ pha loãng 10−4, 10−5, 10−6 trong dãy pha loãng plasmid DNA IHHNV type lây

nhiễm, làm mẫu trong thí nghiệm này.

Thực hiện quy trình PCR phát hiện IHHNV type lây nhiễm với nhân tố biến

thiên là nhiệt độ lai. Dựa vào nhiệt độ lai của phản ứng thiết lập ban đầu (550C), cài

đặt quy trình PCR sao cho nhiệt độ lai biến thiên từ 50oC đến 60oC. Phản ứng PCR

được thực hiện tại 8 điểm nhiệt theo gradient nhiệt độ của máy Icycler (Biorad, Mỹ)

như sau: 500C, 50.80C, 52.10C, 53.90C, 56.40C, 580C, 59.50C, 600C, mỗi lô có 3

phản ứng với các mẫu pha loãng đã chọn 10−4, 10−5, 10−6. Thành phần hỗn hợp PCR

cho mỗi phản ứng có tổng thể tích 50 µl gồm 10 µl Buffer Flexi 5X, 0.5 µl mỗi mồi

vnIHF, vnIHR (50 µM) và 0.2 µl mỗi mồi 309F và 309R (50 µM), 0.25 µl Go Taq

Flexi polymerase (5 U/µl) (Promega, Mỹ) và sử dụng dNTPs, MgCl2 theo nồng độ

đã tối ưu, thêm H20 khử ion cho đủ 48 µl, 2 µl mẫu pha loãng plasmid – DNA

IHHNV cho vào 3 phản ứng đối chứng dương tương ứng với 3 độ pha loãng và 2 µl

H20 khử ion cho vào mẫu đối chứng âm. Kết quả được phân tích trên gel agarose

1.5%. Nhiệt độ lai thích hợp là nhiệt độ mà phản ứng PCR có thể phát hiện được

virus trong mẫu pha loãng nồng độ thấp nhất và rõ ràng nhất trong các lô bố trí thí

nghiệm.

43

1.4. Giới hạn phát hiện

Độ nhạy của quy trình khảo sát dựa vào số lượng bản sao plasmid IHHNV

type lây nhiễm thấp nhất có trong phản ứng mà vẫn thấy được sản phẩm khuếch đại

mong muốn khi điện di. Thí nghiệm khảo sát độ nhạy lặp lại 3 lần trên mẫu plasmid

IHHNV type lây nhiễm pha trong dịch ly trích DNA tôm (SDS-NaOH, 0.0125%-

0.025N). Tiến hành phản ứng PCR theo quy trình mới (quy trình tự thiết kế với cặp

mồi vnIHF/vnIHR và 309F/309R) đã được tối ưu các điều kiện với dãy pha loãng

Plasmid pGEM T-easy - IHHNV type lây nhiễm 10−1 →10−15 trong dịch DNA tôm.

Kết quả được phân tích trên gel agarose 1.5%.

1.5. Độ đặc hiệu của quy trình

Tính đặc hiệu của quy trình tự thiết kế trong nghiên cứu này được khảo sát

trên một số virus và vi khuẩn thường gặp trong tôm sú nuôi gồm: mẫu tôm nhiễm

HPV, mẫu tôm nhiễm MBV, mẫu tôm nhiễm NHP, mẫu tôm nhiễm WSSV, mẫu

tôm nhiễm Vibrio sp., mẫu tôm nhiễm IHHNV type A/B đã được xác định ở Việt

Nam bằng các cặp mồi MG831F/R và IHHNVAB F/R (Tang và ctv., 2007), mẫu

đối chứng dương là plasmid IHHNV type lây nhiễm. 2 μl từ mỗi mẫu trên sẽ được

khuếch đại trong phản ứng PCR phát hiện IHHNV type lây nhiễm với quy trình tự

thiết kế đã được tối ưu các điều kiện. Kết quả được phân tích trên gel agarose 1.5%.

Đồng thời chúng tiến hành đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của phương pháp

chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên tổng số 20 mẫu tôm sú. Trong đó có 10 mẫu

không mang virus IHHNV và 10 mẫu được bổ sung virus IHHNV từ mẫu chuẩn

của ĐH Arizona. Thử nghiệm được thực hiện 1 lần bởi một nhân viên. Độ nhạy và

độ đặc hiệu được tính toán như sau:

Mẫu thử nghiệm Dương tính Âm tính

Kết quả kiểm tra bằng

Multiplex PCR

Dương tính Dương tính thật (TP) Dương tính giả (FP)

Âm tính Âm tính giả (FN) Âm tính thật (TN)

Kết quả đánh giá như sau:

Độ nhạy: TP/(TP+FN)x 100

Độ đặc hiệu: TN/(FP+TN) x100

44

1.6. Ứng dụng kiểm tra IHHNV type lây nhiễm trên mẫu thực

Tiến hành kiểm tra quy trình tự thiết kế trên 90 mẫu tôm thương phẩm, 20

mẫu tôm giống, 130 mẫu tôm bố mẹ. Các mẫu trên được thu tại ĐBSCL, tất cả các

mẫu trên đều được ly trích DNA bằng phương pháp ly trích SDS-NaOH và khuếch

đại bằng quy trình multiplex PCR chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm đã thiết lập.

Kết quả được phân tích trên gel agarose 1.5 %.

PHẦN 2: ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP LOOP-

MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP) CHẨN

ĐOÁN IHHNV TYPE LÂY NHIỄM

Kỹ thuật LAMP được Tsugunori Notomi và các cộng sự giới thiệu năm 2000

(Notommi và ctv, 2000). Kỹ thuật Loop-mediated Isothermal Amplification

(LAMP) có thể khuếch đại nucleic acid đích một cách nhanh chóng khoảng 109 bản

sao trong 1 giờ khuếch đại ở nhiệt độ 60-65 0C. Thành phần phản ứng gồm bốn mồi

đặc hiệu bắt cặp bổ sung với trình tự gốc (hình 6.1). Nhờ khả năng tách mạch của

enzyme Bst DNA polymerase, mồi sẽ bắt cặp và tổng hợp phân tử nucleic acid mới

trong điều kiện đẳng nhiệt (không cần sự biến thiên về nhiệt độ). Thời gian phản

ứng của kỹ thuật LAMP có thể rút ngắn xuống 60 phút khi bổ sung thêm mồi Loop

(Nagamine và ctv, 2002). Sản phẩm khuếch đại là một tập hợp các sợi DNA có cấu

trúc hình quả tạ với các độ dài sản phẩm khuếch đại khác nhau (hình 6.2) (Savan và

ctv, 2005). Sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng nhiều cách khác nhau: điện di

gel agarose, đo độ đục của dung dịch sau phản ứng, nhuộm với chất chỉ thị nucleic

acid để quan sát kết quả bằng mắt thường, hoặc ứng dụng kỹ thuật sắc ký màng để

gia tăng độ đặc hiệu (Savan và ctv 2005; Pillai và ctv 2006; Kiatpathomchai và ctv

2008; Puthawibool và ctv 2009). Tương tự kỹ thuật PCR, kỹ thuật LAMP chỉ có thể

thiết lập khi có thông tin về vật liệu di truyền của tác nhân gây bệnh. Do có độ nhạy

cao, nên kỹ thuật LAMP có nguy cơ tạp nhiễm rất lớn và dễ gây ra kết quả dương

tính giả trong các phép chẩn đoán. Do tính thuận tiện trong thao tác và không cần

đầu tư trang thiết bị đắt tiền nên phương pháp LAMP rất có tiền năng ứng dụng

trong phòng thí nghiệm và tại hiện trường. Hiện nay rất nhiều tác nhân gây bệnh

45

trên vật nuôi thủy sản được nghiên cứu chẩn đoán bằng kỹ thuật LAMP. Nhiều

phương pháp LAMP đã được công bố để phát hiện nhiều tác nhân virus gây bệnh

trên tôm nuôi như yellow head virus (YHV), Taura syndrome virus (TSV),

Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV), white

spot syndrome virus (WSSV), infectious myonecrosis virus (IMNV),

hepatopancreatic parvovirus (HPV) (Savan và ctv, 2005; Chaivisuthangkura và ctv.,

2009).

Vào năm 2006, kỹ thuật LAMP được phát triển để chẩn đoán IHHNV trên tôm

nuôi dựa trên trình tự đích DNA của IHHNV (AF218266). Kết quả chẩn đoán cho

thấy, độ nhạy của kỹ thuật này cao hơn kỹ thuật chẩn đoán PCR thông thường gấp

100 lần. Gần đây Arunrut và ctv (2011) đã phát triển thành công kỹ thuật LAMP kết

hợp với sắc ký mao dẫn (LED). Có thể nhanh chóng đọc kết quả các băng vạch sản

phẩm khuếch đại đặc hiệu bằng mắt thường. Trong kỹ thuật này ngoài 4 cặp mồi

được thiết kế trong phản ứng, còn có một mồi thêm để làm tăng tốc phản ứng

LAMP. Kỹ thuật này cho kết quả nhanh hơn kỹ thuật LAMP thông thường. Một kỹ

thuật mới để phát hiện IHHNV là kỹ thuật định lượng LAMP, với 4 mồi trong phản

ứng, độ nhạy của phản ứng có thể có thể phát hiện là 102-103 copy/µl virus IHHN

(Sudhakaran và ctv., 2008). Gần đây, kỹ thuật multiplex LAMP cũng được phát

triển để phát hiện đồng thời hai virus gây bệnh trên tôm, virus WSSV và IHHNV.

Hình 6.2. Cấu trúc mồi khuếch đại trong

phương pháp LAMP (Eiken Genome)

Hình 6.3. Cấu trúc sản phẩm

của phương pháp LAMP

(Eiken Genome)

Hình 6: Cấu trúc mồi và sản phẩm khuếch đại trong phương pháp LAMP (Eiken Genome)

46

Độ nhạy của kỹ thuật này so với các phương pháp thông thường PCR và nested

PCR là gấp 100-1000 lần (He và Xu., 2011).

2.1. Ứng dụng quy trình LAMP phát hiện IHHNV (He và Xu, 2011)

2.1.1. Thử nghiệm phản ứng LAMP theo công bố

Điều kiện tối ưu của qui trình LAMP được thiết lập đúng như tác giả Hu và

Xu. (2011) công bố như sau: 5 pmol mỗi mồi HHNV-F3 5’- CGA CAT CCG TGT

ACC AGA -3’, IHHNV-B3: 5’- AGA GCG TAG GAC TTT CCG -3’ và 40 pmol

mỗi mồi IHHNV-FIP 5’- GTC CTT GGA GTA CAA GAG TGT TTA TGG ATC

CAA TCT TAG CTT GGA TAA TCA TCG T -3’ và IHHNV-BIP 5’- GAA AAT

CTC TTA CCA TCG GTG CAG GAT CCG AAG GTG TTT GAG TCT CCT -3’

với 1,4 mM dNTPs (Promega, Mỹ), 2.5 μl dung dịch đệm phản ứng 10X (200 mM

Tris–HCl pH 8.8, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-

100), 6mM MgSO4, 8U Bst DNA polymerase (Neb, Mỹ), 2.5 μl Betain 5M (Sigma,

Mỹ). Hút 1ul mẫu DNA IHHNV cho vào 24 ul hỗn hợp phản ứng nêu trên và ủ ở

64oC trong 60 phút. Sau đó đem phân tích trên gel agarose 1,5%. Thí nghiệm kiểm

tra quy trình LAMP được bố trí như sau:

Thử nghiệm trên mẫu đối chứng âm (nước, mẫu tôm không nhiễm

IHHNV) và mẫu chứng dương (tôm nhiễm IHHNV được cung cấp

từ trường đại học Arizona, Mỹ)

Thử nghiệm trên một loạt DNA của IHHNV pha loãng

2.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng (dNTPs, Mg2+, nhiệt độ ủ, thời gian

và độ nhạy)

2.2. Quy trình LAMP tự thiết kế phát hiện IHHNV

Dựa trên đoạn gen (ORF1) mã hóa cho protein giả định 1 của IHHNV type

lây nhiễm. Bốn mồi của qui trình LAMP được thiết kế dựa trên trình tự của bộ gen

virus Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) được công

bố trên ngân hàng gen (GenBank accession no.AF218266). Phần mềm dùng thiết kế

cho trình tự mồi có tên là Primer Explorer V4

(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html ). Mồi xuôi bên trong (FIP) và bên

ngoài F3, Mồi ngược bên trong (BIP) và bên ngoài B3 hình 6.4. Trình tự mồi và vị

47

trí mồi thiết kế trên đoạn gen của virus IHHNV type lây nhiễm đã được trình bày ở

hình 6.4 và bảng 6.5.

Hình 6.4. Sơ đồ vị trí nucleotide mồi thiết kế bắt trên genome của IHHNV type lây

nhiễm, mồi xuôi ngoài F3, mồi ngược ngoài B3, và mồi xuôi trong FIP

(F1c/TTTT/F2), mồi ngược trong BIP(B1c/TTTT/B2

Bảng 6.5. Trình tự mồi thiết kế để khuếch đại gen IHHNV type lây nhiễm

Tên mồi Vị trí mồi Trình tự mồi

IHHNVvn-B3 294-318 5’- GTCAATTAGGAATTTAATGGATCGT -3’

IHHNVvn-F3 106-127 5’- GCTATTCCAAGTGACTAAGGAC-3’

IHHNVvnFIP 128-150/TTTT/174-198 5’-TGATCCAAATAATGACGGACTAGGTTTT

AATTTTGGAACATGGAAGATACG 3’

IHHNVvnBIP 199-222/TTTT/259-282 5’-TCAAGTAACAGTGAACCAACAGAATTTTCA

CTTGTACTTACATTTGTATCC-3’

2.2.1. Thiết lập điều kiện phản ứng

Điều kiện chuẩn của quy trình LAMP được thiết lập dựa trên tác giả

Notommi và ctv, (2000) công bố như sau: 5 pmol mỗi mồi HHNVvn-F3 5’- GCT

ATT CCA AGT GAC TAA GGA C-3’, IHHNVvn-B3: 5’- GTC AAT TAG GAA

TTT AAT GGA TCG T -3’ và 40 pmol mỗi mồi IHHNVvn FIP 5’-TGA TCC AAA

TAA TGA CGG ACT AGG TTT TAA TTT TGG AAC ATG GAA GAT ACG 3’

và IHHNVvn-BIP 5’-TCA AGT AAC AGT GAA CCA ACA GAA TTT TCA

CTT GTA CTT ACA TTT GTA TCC-3’ với 1,4 mM dNTPs (Promega, Mỹ), 2.5 μl

48

dung dịch đệm phản ứng 10X (200 mM Tris–HCl pH 8.8, 100 mM KCl, 100 mM

(NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100), 6mM MgSO4, 8U Bst DNA

polymerase (Neb, Mỹ), 2.5 μl Betain 5M (Sigma, Mỹ). Hút 1ul mẫu DNA IHHNV

cho vào 24ul hỗn hợp phản ứng nêu trên và ủ ở 63oC trong 60 phút. Sau đó đem

phân tích trên gel agarose 1,5%.

Thí nghiệm kiểm tra qui trình LAMP được bố trí như sau:

Thử nghiệm trên mẫu đối chứng âm (nước, mẫu tôm không nhiễm IHHNV)

và mẫu chứng dương (tôm nhiễm IHHNV)

Thử nghiệm trên một loạt DNA của IHHNV pha loãng bậc 10 (từ 10-1-10-10 )

2.2.2. Thử nghiệm các điều kiện phản ứng

Dựa theo các nghiên cứu trước về phương pháp LAMP (Notomi và ctv.,

2000; He và Xu, 2011; Sun và ctv., 2006 và Arunrut và ctv., 2012) trong nghiên cứu

này chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện phản ứng như: nhiệt độ phản ứng,

thời gian phản ứng, dNTP và Mg2+ trong phản ứng theo hóa chất hiện tại ở phòng.

Thử nghiệm nồng độ dNTPs

Theo các nghiên cứu trước của các nhà khoa học công bố nồng độ dNTP có

ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của quá trình khuếch đại DNA của enzyme tổng hợp

DNA polymerase (Innis và ctv., 1988). Vì vậy phản ứng LAMP thiết kết được khảo

sát thực hiện trên các nồng độ khác nhau của dNTP bao gồm: 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6

mM, 0.8 mM, 1 mM, 1.2 mM, 1.4 mM và 1.6 mM. Các thành phần khác của hỗn

hợp phản ứng LAMP được giữ nguyên như điều kiện tối ưu mà các tác giả khác

công bố khác công bố: 5 pmol mỗi mồi IHHNVvnF3 và IHHNVvnB3, 40 pmol mỗi

mồi IHHNVvnBIP và IHHNVvnFIP, 2.5 μl dung dịch đệm phản ứng 10X (200 mM

Tris–HCl pH 8.8, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-

100)(Neb, Mỹ), 1M Betain, 8mM MgSO4, 8U Bst DNA polymerase (Neb, Mỹ). Sau

khi biến tính, 1ul mẫu sẽ được cho vào 24 ul hỗn hộp phản ứng nêu trên và ủ ở 63oC

trong 60 phút. Sau đó đem phân tích trên gel agarose 1,5%.

Thí nghiệm được lặp lại trên mẫu DNA ly trích từ tôm nhiễm virus IHHNV,

mẫu nước và mẫu tôm không nhiễm virus IHHNV.

49

Thử nghiệm nồng độ MgSO4

Nồng độ Mg2+ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme cũng như

nhiệt độ lai của mồi (Saiki và ctv., 1998). Tổng thể tích của phản ứng là 25 ul với

nồng độ của MgSO4 được khảo sát khác nhau bao gồm: 4 mM, 6 mM và 8 mM, 10

mM và 12 mM. Các thành phần khác của hỗn hợp giữ nguyên như điều kiện tối ưu

mà các tác giả công bố : Các thành phần khác của hỗn hợp phản ứng LAMP được

giữ nguyên như điều kiện tối ưu mà các tác giả công bố khác công bố: 5 pmol mỗi

mồi IHHNVvnF3 và IHHNVvnB3, 40 pmol mỗi mồi IHHNVvnBIP và

IHHNVvnFIP, 2.5 μl dung dịch đệm phản ứng 10X (200 mM Tris–HCl pH 8.8, 100

mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100)(Neb, Mỹ), 1M

Betain, 8U Bst DNA polymerase (Neb, Mỹ), 1.4 mM dNTPs. Sau khi biến tính, 1ul

mẫu sẽ được cho vào 24 ul hỗn hộp phản ứng nêu trên và ủ ở 63oC trong 60 phút.

Sau đó đem phân tích trên gel agarose 1,5%.

Thí nghiệm được lặp lại trên mẫu DNA ly trích từ tôm nhiễm virus IHHNV,

mẫu nước và mẫu tôm không nhiễm virus IHHNV.

Thử nghiệm nhiệt độ ủ phản ứng

Theo khuyến cáo của nhà sản xuất nhiệt độ ủ của phản ứng là 650C. Tuy

nhiên trong một số nghiên cứu cho thấy nhiệt độ ủ của phản ứng tối ưu thấp hơn

(Iwamoto và ctv., 2003), nên chúng tôi khảo sát nhiệt độ ủ từ 600C-650C. Thành

phần khác của hỗn hợp phản ứng LAMP được giữ nguyên như điều kiện tối ưu mà

các tác giả công bố khác công bố: 5 pmol mỗi mồi IHHNVvnF3 và IHHNVvnB3,

40 pmol mỗi mồi IHHNVvnBIP và IHHNVvnFIP, 2.5 μl dung dịch đệm phản ứng

10X (200 mM Tris–HCl pH 8.8, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM

MgSO4, 1% Triton X-100)(Neb, Mỹ), 1M Betain, 8U Bst DNA polymerase (Neb,

Mỹ), 1.4 mM dNTPs. Sau khi biến tính, 1ul mẫu sẽ được cho vào 24 ul hỗn hộp

phản ứng nêu trên và ủ ở nhiệt độ của phản ứng được khảo sát ở 600C, 630C, 64

0Cvà 650C. Thí nghiệm được lặp lại trên mẫu DNA ly trích từ tôm nhiễm virus

IHHNV và mẫu tôm không nhiễm virus IHHNV.

50

Khảo sát thời gian ủ

Trong chẩn đoán thì thời gian rất cần thiết cho việc điều trị và phòng ngừa

bệnh virus. Hiện này các phương pháp chẩn đoán bệnh virus như phương pháp

PCR, hay nuôi cấy tế bào tốn rất nhiều thời gian (3 h đến vài ngày). Trong khi đó,

thời gian ủ của phản ứng LAMP được cho là tối ưu khoảng 60 phút (Savan và ctv.,

2004; Iwamoto và ctv., 2003). Tùy vào mồi thiết kế cũng như trình tự gen đích

khuếch đại mà thời gian ủ của phản ứng LAMP khác nhau. Vì vậy, thời gian ủ của

phản ứng được thực hiện khảo sát ở 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút và 75 phút.

Hỗn hợp hóa chất phản ứng được thực hiện theo điều kiện tối ưu mà tác giả công

bố. Thí nghiệm được lặp lại trên mẫu DNA tổng số ly trích từ tôm nhiễm virus

IHHNV và mẫu tôm không nhiễm virus IHHNV.

51

NỘI DUNG III: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PHƯƠNG THỨC TRUYỀN

LAN THEO TRỤC DỌC VÀ TRỤC NGANG CỦA IHHNV TRÊN TÔM

SÚ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Mục tiêu: Xác định Khả năng lây truyền của chúng sang thế hệ con trong điều kiện

sản suất và an toàn sinh học thực tế tại Việt Nam. Khả năng lây nhiễm giữa các thể

cùng loài và khác loài trong cùng một một môi trường nuôi.

1. Vật liệu sinh học

– Tôm sú nuôi thương phẩm (Peneaus monondon) khỏe có trọng lượng 3-5

gram, được cung cấp từ Trại thực nghiệm thủy sản Bạc Liêu. Tôm được nuôi trong

bể composite 3000 lít, có hệ thống lọc tuần hoàn. Độ mặn nước biển khoảng 15 ppt.

Tôm được cho ăn hằng ngày với thức ăn viên công nghiệp với lượng bằng 3-10%

trọng lượng cơ thể.

– Tôm sú bố mẹ nhiễm IHHNV thu từ các trại ương giống ở Vũng Tàu và

ĐBSCL còn sống và sau cho vào tủ lạnh âm sâu -80oC để bảo quản làm nguồn vật

liệu ly trích virus.

– Tôm thẻ (Peneaus vannamei) có trọng lượng 3-5 gram được cung cấp từ

Trung tâm quốc gia giống hải sản Nam Bộ cũng được nuôi trong hệ thống bể

composite có hệ thống lọc và sục khí như tôm sú.

– Bắt ngẫu nhiên 10-15 cá thể tôm sú hoặc tôm thẻ được kiểm tra White spot

syndrome virus (WSSV), yellow head virus (YHV), Taura syndrome virus (TSV),

Infectious Mionecrosis Virus (IMNV) và IHHNV bằng PCR để trước khi nuôi và

cho vào lây nhiễm.

2. Dụng cụ và thiết bị

- Bể kính 40 x 60 x 40 cm dùng để bố trí lây nhiễm (30 bể). Bể kính 50 x 90 x

40 cm (khoảng 3-5 bể) dùng để lây nhiễm virus trên giáp xác và tôm nuôi sống

chung với tôm thí nghiệm.

- Máy lọc nước có sục khí (12W).

- Bể xi măng 4000 lít và 500 lít để nuôi tôm sú, tôm thẻ.

52

- Vợt, xô xách nước, hóa chất tẩy trùng (chlrorine, xà phòng) và thức ăn tôm

công nghiệp CP hoặc UP.

- Nước biển được mua về dự trữ trong bể composite 20 khối, và được xử lý với

chlorin 30 ppm, trước khi cho vào bể thí nghiệm.

3. Phương pháp ly trích nguồn virus

Ly trích được thực hiện theo phương pháp của Montgomery-Brock và ctv

(2007), Tang và Lightner (2006) có thay đổi. Đầu tôm bố mẹ thu ở ĐBSCL đã được

xác định nhiễm virus IHHN bằng PCR được bảo quản trong tủ -700C và đã được

giải trình bộ gen, lấy ra cho vào đá vảy để rã đông, sau đó bóc tách nắp giáp vỏ đầu

ngực và loại bỏ gan. Cân khoảng 5-10 gam mô tôm cho vào cối lạnh, nghiền trong

15-30 ml TN (0.02M Tris HCl, 0.4 NaCl, pH 7.4) trong điều kiện lạnh, tỷ lệ mô tôm

với dung dịch TN là 3:1. Sau đó ly tâm (5000 vòng/ phút) trong 30 phút ở nhiệt độ

40C. Hút dịch nổi, lọc qua màng lọc 0.45 µM. Sau đó cho vào từng eppendorf 1.5

ml vô trùng và bảo quản ở -700C để sử dụng lây nhiễm.

4. Phương pháp nhân sinh virus trong tôm sú, tôm thẻ chân trắng

Phương pháp nhân sinh virus thực hiện theo phương pháp của Montgomery-

Brock và ctv (2007) có thay đổi. Năm mươi cá thể tôm thẻ chân trắng, 50 tôm sú đã

nuôi ổn định trong 7 ngày trong 2 bể riêng biệt. Sau đó, mỗi cá thể tôm được tiêm

giữa đốt thứ 2 và thứ 3 của đốt đuôi với 20µl dịch huyền phù virus. Tôm sau khi lây

nhiễm, hằng ngày sẽ được chăm sóc và cho ăn với thức ăn viên công nghiệp 3%

trọng lượng cơ thể tôm. Sau 7 đến 14 ngày lây nhiễm, từng cá thể tôm được cắt

chân bơi, cho vào eppendorf vô trùng. Mẫu sẽ được gửi về phòng thí nghiệm để

kiểm tra sự hiện diện của virus trên tôm này bằng kỹ thuật PCR. Sau khi kiểm tra,

những tôm có kết quả dương tính IHHNV sẽ được đưa vào thí nghiệm lây nhiễm

nuôi chung với tôm khỏe hoặc làm nguồn bệnh phẩm cho ăn.

5. Kiểm tra sự hiện diện IHHNV bằng phản ứng PCR

Quy trình Multiplex PCR chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm của OIE (2009)

sử dụng cặp mồi IHHNV 77012F và IHHNV 77353R, thành phần và điều kiện phản

53

ứng theo công bố OIE (2009). Dựa theo các điều kiện đã công bố của OIE và có

điều chỉnh chúng tôi pha được hỗn hợp phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl, thành

phần: 10 µl Buffer Flexi 5X, 1 µl dNTP (10 mM), 3 µl mM MgCl2 (25mM), 0.5 µl

F2 (50 µM) và 0.5 µl R1 (50 µM), 0.25 µl Go Taq Flexi polymerase 5 U/µl. Thêm

H20 khử ion cho đủ 48 µl, thêm 2 µl mẫu DNA IHHNV tổng số ly trích từ mô tôm.

Mẫu chứng âm sẽ là nước cất vô trùng. Chu kì luân nhiệt cho phản ứng như sau: 1

chu kì 95°C trong 4 phút; 30 chu kì gồm: 95°C trong 30 giây, 55°C trong 30 giây,

72°C trong 45 giây; kết thúc phản ứng 72°C trong 5 phút, 4°C. Sản phẩm sau khi

khuyếch đại sẽ được điện di trên gel agarose 1.5% có nhuộm SafeView Nucleic

Acid Stain (ABM, Canada) và sản phẩm sẽ được ghi lại hình ảnh bởi máy chụp gel

(Geldoc, Biorad, Mỹ).

6. Xác định phương thức lan truyền theo trục dọc

Trong thí nghiệm lây nhiễm theo trục dọc của IHHNV, chúng tôi muốn chứng

minh khả năng lây truyền virus cho thế hệ sau của tôm sú. Đó là các cá thể mẹ

mang bệnh sẽ truyền lại virus cho con cháu của chúng, trong khi cá thể mẹ không

mang mầm bệnh sẽ cho thế hệ sau không nhiễm virus này khi được kiểm tra bằng

PCR. Qua đó, củng cố thêm thông tin về sự lan truyền của virus này, cũng như có

những biện pháp sàng lọc cẩn thận để loại bỏ mầm bệnh khi thế hệ sau của chúng sẽ

được sử dụng làm giống. Sơ đồ bố trí thí nghiệm

54

Để xác định sự truyền lây của IHHNV từ mẹ sang con, sử dụng phương pháp

PCR để sàng lọc ra khoảng 100 cá thể tôm sú mẹ đã giao vĩ trước, từng cá thể tôm

sú mẹ trên đàn thu nhận từ Đà Nẵng và Rạch Gốc được nuôi riêng và xác định có

hay không nhiễm các loại virus nguy hiểm như WSSV, YHV và IHHNV để xác

định được 6 tôm mẹ nhiễm virus IHHNV và 3 tôm sú mẹ không nhiễm IHHNV.

Sáu tôm mẹ nhiễm IHHNV được nuôi trong một bể riêng (4000 lít) và 3 tôm mẹ

không nhiễm IHHNV (đối chứng âm) được nuôi một bể riêng.

+ Đối với 3 tôm mẹ không lây nhiễm IHHNV (nghiệm thức đối chứng âm)

sẽ được bố trí cho đẻ riêng biệt. Sau khi tôm mẹ đã giao vỹ thành thục được chọn

nuôi trong các bể xi măng 5-7 ngày để ổn định, độ mặn trong nước biển đã vô trùng

được ổn định 35ppt, nhiệt độ duy trì từ 27-300 C, có sục khí, oxy hòa tan 4-7 mg/lít

và cho thức ăn như mực tươi, nhuyễn thể hoặc ốc mượn hồn. Lượng cho ăn hàng

ngày bằng 10-15% tổng trọng lượng cơ thể đàn tôm mẹ trong thời kỳ phát dục. Tuy

nhiên, không cho ăn thức ăn có thể mang mầm bệnh virus IHHN như tôm, cua.

Kiểm tra tôm nếu phát hiện tôm mang trứng ở giai đoạn III, IV hoặc tôm sậm màu

thì chuyển ngay tôm mẹ sang bể cho đẻ (bể composite 1000 lít, có sục khí). Sau khi

tôm đẻ, trứng sẽ được chuyển qua bể ương và thu mẫu mẫu trứng. Thu mẫu tôm ở

các giai đoạn ấu trùng Nauplli 1 – 3, Zoea 1 – 3, Mysis 1 – 3, Postlarvae 1 – 6 được thu

và cho vào tube 1.5 ml có cồn 90% hoặc lọ thu mẫu riêng biệt. Mẫu được đánh số

và ghi chú cho từng loại mẫu bố trí thí nghiệm tránh trường hợp bị trùng. Mẫu thu

sẽ được chuyển về phòng thí nghiệm và phân tích sự hiện diện IHHNV bằng PCR.

+ Đối với tôm mẹ nhiễm IHHNV có 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức, tiến

hành cho 2 con mẹ bị nhiễm IHHNV nuôi vào 1 bể 1000 lít, nhiệt độ (27-300 C), có

sục khí và cho thức ăn giống như nghiệm thức đối chứng âm. Tôm được bố trí cho

đẻ và thu mẫu cũng giống như đối chứng âm trên. Thu mẫu trứng và mẫu tôm ở các

giai đoạn ấu trùng Nauplli 1 – 3, Zoea 1 – 3, Mysis 1 – 3, Postlarvae 1 – 6 được thu

và cho vào tube 1.5 ml có cồn 900 hoặc lọ thu mẫu riêng biệt, được đánh dấu cho

từng loại mẫu bố trí thí nghiệm tránh trường hợp bị trùng, sau đó phân tích sự lây

nhiễm bằng PCR.

55

7. Lây nhiễm theo trục ngang

Thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang của IHHNV, chúng tôi muốn xem xét

khả năng lan truyền virus theo cách thức cho ăn, sống chung giữa các loài với nhau,

khi mà ở ngoài tự nhiên tôm sú và tôm thẻ được nuôi nhiều ở ĐBCSL. Ngoài ra,

khả năng nhiễm IHHNV trong tự nhiên cũng như trong trang trại nuôi ở hai loài này

rất cao mà không hề gây ra sự tử vong nào cả. Do đó, mô hình thí nghiệm này nhằm

đánh giá khả năng lây nhiễm giữa các loài, cũng như những thông tin về thời gian

biểu hiện bệnh lý trên tôm khi có tác nhân gây bệnh trong cùng môi trường sống. Sơ

đồ bố trí thí nghiệm

Lây truyền ngang của IHHNV được biết là bằng con đường tôm ăn thịt xác vật

chủ bị nhiễm bệnh, tiếp xúc trực tiếp giữa tôm bệnh và không bệnh hoặc tiếp xúc

gián tiếp thông qua nước. Khi xảy ra dịch bệnh, hiện tượng tôm ăn lẫn nhau được

xem như là con đường lây nhiễm nhanh và hiệu quả nhất trong tự nhiên. (Lightner

và ctv.,1983a; Bell & Lightner, 1984; Tang và ctv., 2003). Đây là cơ sở để nghiên

cứu và hiểu rõ vể bản chất lây truyền tự nhiên của virus nhằm nghiên cứu các quần

đàn tôm có mang virus mà không biểu hiện bệnh, những loài tôm kháng IHHNV

hoặc giai đoạn sớm của tôm đã mang mầm bệnh virus lây truyền qua những loài

tôm nhạy cảm hơn theo giai đoạn sống bằng cách thông qua các thí nghiệm lây

truyền cho ăn tôm bệnh.

Theo các nghiên cứu, giai đoạn tôm PL và hậu ấu trùng là tôm đang giai

đoạn phát triển mạnh nhất. Parvovirus, như IHHNV không có DNA polymerase để

mã hóa mà tùy thuộc vào tế bào chủ để nhân sinh DNA. Chính vì vậy sự nhân lên

của virus tùy vào sự nhân lên và biệt hóa của tế bào bị nhiễm. Ở tôm Pl và tôm hậu

ấu trùng có rất nhiều tế bào đang phân chia hoạt động. Chính điều này làm tôm ở

giai đoạn này dễ nhiễm hơn tôm lớn (Kalagayan và ctv., 1991; Lightner, 1996).

Chính vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi chọn tôm sú 3-5g để bố trí trong thí

nghiệm lây nhiễm này.

56

Lây nhiễm cùng loài và khác loài được bố trí thí nghiệm lây truyền theo trục

ngang cùng loài dựa theo phương pháp của Tang và Lighner (2006) và Bonami và

ctv (1990) có điều chỉnh. Tôm sú trưởng thành 3-5g (khoảng 1-1,5 tháng tuổi) từ ao

tôm nuôi công nghiệp tại Trại Thực Nghiệm Bạc Liêu được đưa về phòng thí

nghiệm Gò Vấp, tôm được nuôi trong bể composite 4000 lít (800 con/bể) để nuôi

thuần trong khoảng 7-10 ngày trước khi bố trí lây nhiễm. Tôm được xét nghiệm các

loại virus thông dụng WSSV, HPV, YHV và IHHNV trước khi đem về nuôi và sau

khi cho vào bể kính 15 ngày. Để khẳng định rằng tôm trong thí nghiệm không có

hiện diện IHHNV, chúng tôi tiến hành cắt 1 chân bơi của từng con theo thứ tự chân

bơi và được mã hóa với số tương ứng. Sau đó, kiểm tra sự hiện diện của IHHNV

bằng các qui trình PCR. Thí nghiệm được thực hiện trên 3 nghiệm thức bảng 6.6.

57

Bảng 6.6. Phương pháp lây nhiễu IHHNV trên tôm sú với mẫu bệnh phẩm là tôm sú

nhiễm IHHNV và tôm thẻ nhiễm IHHNV

Nghiệm thức

lây nhiễm

Số lượng tôm

(lặp lại 3 lần)

Cho ăn và số lượng tôm

nhiễm IHHNV sống chung

Thời gian

thu mẫu

Sống Chung 10 5 tôm nhiễm IHHNV sống

chung

7, 14, 21

và 28

Cho Ăn 10 Cho ăn tôm nhiểm IHHNV 2

lần/ngày (10% trọng lượng

tôm) 5 ngày liên tục

7, 14, 21

và 28

Sống chung và

cho ăn

10 5 tôm nhiễm IHHNV sống

chung và cho ăn tôm nhiễm 2

lần/ngày (10% trọng lượng

tôm) 5 ngày liên tục

7, 14, 21

và 28

Đối chứng 10 Giống 3 nghiệm thức trên với

tôm sạch bệnh

7, 14, 21

và 28

7.1. Lây nhiễm cùng loài

+ Nhóm 1 - sống chung: 10 cá thể tôm sú không nhiễm IHHNV đã được

kiểm tra bằng PCR được nuôi trong bể kính khoảng 70 lít nước biển với độ mặn 15-

20 ppt, có máy lọc và sục khí oxy. Điều kiện môi trường được theo dõi hàng tuần.

Tôm này được nuôi chung với 5 cá thể tôm sú nhiễm IHHNV đã được gây nhiễm

trước đó bằng phương pháp tiêm. Nhóm đối chứng 1, bao gồm 10 cá thể tôm sú

khỏe mạnh sống chung với 5 cá thể tôm sú không mang virus khác. Tôm được cho

ăn thức viên công nghiệp 3 lần/ngày bằng 10% trọng lượng cơ thể.

+ Nhóm 2 - thức cho ăn mẫu tôm bệnh: 10 cá thể tôm sú không nhiễm

IHHNV được nuôi trong bể kính khoảng 70 lít nước biển với độ mặn 15- 20 ppt, có

máy lọc và sục khí oxy. Điều kiện môi trường được theo dõi hàng tuần. Tôm được

cho ăn mô tôm sú nhiễm virus này với tỉ lệ bằng 10% trọng lượng tôm trong 1 ngày.

Tôm được cho ăn 2 lần trong ngày trong thời gian 5 ngày liên tục. Sau ngày cho ăn

cuối cùng, tôm được cho ăn lại thức ăn viên bình thường. Đối với nhóm đối chứng

tôm được cho ăn mô tôm sú không nhiễm virus trong 5 ngày liên tục sau đó cho ăn

lại thức ăn viên công nghiệp.

58

+ Nhóm 3 - lây nhiễm bằng cách thức sống chung đồng thời cho ăn mô tôm

bệnh: 10 cá thể tôm sú không nhiễm IHHNV được nuôi trong bể kính khoảng 70 lít

nước biển với độ mặn 15- 20 ppt, có máy lọc và sục khí oxy. Điều kiện môi trường

được theo dõi hàng tuần. Tôm được sống chung với 5 cá thể tôm sú nhiễm IHHNV

đã được lây nhiễm trước đó, đồng thời sẽ được cho ăn mô tôm sú nhiễm IHHNV

với tỉ lệ 10% trọng lượng tôm trên ngày. Tôm sẽ được cho ăn 2 lần trong ngày trong

5 ngày liên tục. Sau thời gian cho ăn này, tôm sẽ được cho ăn lại thức ăn viên. Đối

với nhóm đối chứng, 10 cá thể tôm sú khỏe mạnh sẽ sống chung với 5 cá thể tôm sú

sạch bệnh đồng thời cho ăn mô tôm sú không nhiễm IHHNV trong 5 ngày liên tục,

sau đó sẽ được cho ăn lại thức ăn viên.

Mỗi nhóm nghiệm thức lặp lại 3 lần, thời gian thí nghiệm kéo dài trong 28

ngày. Sau 7, 14, 21 và 28 ngày tiến hành thu mẫu chân bơi từng cá thể tôm sú và

kiểm tra bằng PCR, từ đó xác định mức độ nhiễm IHHNV (tỉ lệ % tôm nhiễm).

7.2. Lây nhiễm khác loài

Mục đích lây nhiễm khác loài nhằm đánh giá có sự lây lan giữa 2 quần đàn

tôm khác nhau như thế nào, có hay không sự lây virus từ một loài tôm khác đến tôm

sú. Theo các nghiên cứu Lightner và ctv. (1983b) cho rằng quần đàn tôm sú chỉ xảy

ra dịch bệnh khi nuôi đồng thời với tôm xanh P. stylirostris hoặc tôm thẻ P.

vannamei. Bên cạnh đó, các loài giáp xác như cua và tôm đất nuôi để làm nguồn lây

nhiễm rất khó vì cần một lượng lớn bệnh phẩm trong khi chưa biết tập tính của

chúng như thể nào để nuôi làm nguồn lây nhiễm. Chính vì vậy, chúng tôi chọn

nguồn lây nhiễm khác loài là tôm thẻ để xem có sự bùng phát bệnh ở tôm sú có xảy

ra không nếu như nguồn mẫu bệnh là tôm thẻ.

Trong nghiên cứu khác loài, chúng tôi sử dụng nguồn tôm thẻ chân trắng xem

như vật chủ mang virus thay thế cho giáp xác nhiễm virus để bố trí thí nghiệm. Vì

giáp xác như cua và tôm đất nhiễm IHHNV rất khó tìm trong tự nhiên và nuôi thuần

hóa trong điều kiện nuôi nhân tạo lâu dài. Thêm vào đó để tìm kích cỡ nguồn tôm tự

nhiên cũng tương đồng với đối tượng tôm sú để lây nhiễm (3-5g) rất khó. Chính vì

59

vậy, nguồn tôm thẻ chân trắng sạch bệnh và nhiễm IHHNV được xem như là nguồn

vật chủ mang virus để bố trí thí nghiệm khác loài.

- Thí nghiệm tiến hành tương tự như việc thí nghiệm đối với phương thức lan

truyền theo trục ngang cùng loài đã trình bày mục 7.1, với 3 nhóm nghiệm thức

khác nhau. Tuy nhiên, đối tượng sống chung và nguồn vật liệu cho ăn là tôm thẻ

chân trắng nhiễm IHHNV. Tôm được cho ăn 2 lần trong ngày sau đó nó sẽ được

cho ăn lại bằng thức ăn viên.

- Mỗi nhóm nghiệm thức lặp lại 3 lần, thời gian thí nghiệm kéo dài trong 28

ngày. Sau 7, 14, 21 và 28 ngày lây nhiễm sẽ tiến hành thu mẫu chân bơi tôm sú và

kiểm tra bằng PCR, từ đó xác định tỉ lệ nhiễm (tỉ lệ % tôm nhiễm).

Ngoài ra, trong quá trình thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang chúng tôi cũng

tiến hành quan sát và ghi nhận những biểu hiện về dấu hiệu lâm sàng ở nhóm tôm

lây nhiễm như sự thay đổi về tập tính cũng như màu sắc và hình dạng bên của tôm.

Tôm sau thí nghiệm được chuyển vào bể composite để nuôi và tiếp tục theo dõi.

8. Quan sát biểu hiện lâm sàng khi lây nhiễm

Trong suốt quá trình thí nghiệm chúng tôi sẽ được quan sát và ghi nhận

những thay đổi về trạng thái, hình dạng các bộ phận trên cơ thể (chủy, râu, ăng ten,

lớp vỏ trên lưng và nắp vỏ tiếp giáp giữa đầu và lưng…) cũng như những thay đổi

về màu sắc và tập tính của tôm. Qua đó, nhằm xem xét thời gian biểu hiện bệnh

cũng như củng cố thêm những kết quả phân tích bằng PCR. Những cá tôm sau khi

28 ngày kết thúc lây nhiễm sẽ chọn lựa một số con đã xác định nhiễm IHHNV bằng

PCR thu mẫu mang và cố định trong dung dịch Davidson gửi phòng chẩn đoán mô

học làm tiêu bảng để kiểm tra virus nhiễm trên những tôm này.

9. Phân tích dữ liệu

Mức độ nhiễm IHHNV của từng bể sẽ được thống kê và xử lý số liệu theo giá

trị trung bình và độ lệch chuẩn. Sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm với nhau sẽ

được kiểm tra cho sự khác biệt có ý nghĩa thống kê bằng phân tích t–test cho 2 giá

trị trung bình (mức độ nhiễm IHHNV của từng nhóm) độc lập và có phương sai

60

khác nhau, với độ tin cậy 95 %. Nếu kết quả giá trị p < 0,05 thì hai nhóm có sự khác

biết có ý nghĩa ở mức sai số α= 0.05. Phân tích thống kê được sử dụng có ở trên

Microsoft Excel 2013®. Tỉ lệ nhiễm IHHNV (%) của từng bể sẽ được tính theo công

thức ở dưới và sau đó, sẽ lấy giá trị trung bình của các bể trong nhóm thí nghiệm để

tiến hành xử lý số liệu.

61

NỘI DUNG IV: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ HIỆN DIỆN, TRUYỀN

LAN VÀ CÁC GIẢI PHÁP HẠN CHẾ IHHNV TRÊN TÔM SÚ

Mục đích: Xác định tỷ lệ nhiễm, ở tôm sú nuôi trên các mô hình nuôi khác nhau,

trong các trại giống ở các qui mô khác nhau và tôm bố mẹ. Xác định giai đoạn tôm

mẫn cảm với IHHNV và ảnh hưởng của IHHNV lên tôm nuôi

1. Thu thập thông tin và thu mẫu tôm trên các mô hình nuôi

Để xác định sự hiện diện của IHHNV type lây nhiễm trên tôm sú nuôi trên

các giai đoạn trên các mô hình nuôi khác nhau và trại giống ở ĐBSCL và Miền

Trung, chúng tôi tiến hành thu mẫu ở các địa điểm được thể hiện trên bảng đồ hình

6.5. Mẫu tôm sú nuôi được thu ngẫu nhiên ở các thời điểm khác nhau trong suốt chu

kỳ nuôi, vào thời điểm từ 15 ngày thả giống trở đi. Thông tin được lưu trữ và xử lý

bằng MS-Excel 2013. Số lượng các ao thu mẫu và theo dõi ở các mô hình nuôi tôm

sú được thực hiện trong 1 tháng/1lần, thu mẫu 4 lần trong suốt vụ nuôi theo bảng

6.7.

Địa điểm thu mẫu: Các vị trí thu mẫu tôm sú và tôm thẻ nuôi được thể hiện

trên sơ đồ hình 6.5. Thời gian thu mẫu trong 2 năm 2012-2013.

Hình 6.5. Vị trí là các vùng thu mẫu tôm sú nuôi trên các mô hình nuôi ở Đồng

Bằng Sông Cửu Long.

62

Đối với trại sản xuất giống, thu thập thông tin về trang trại và nguồn gốc tôm

bố mẹ. Mẫu tôm tại khu vực miền Trung tại tỉnh Ninh Thuận (trại có quy mô lớn,

01 trại có quy mô nhỏ hơn). Mẫu tôm được thu trong một vụ sản xuất chính trong

năm. Tại mỗi điểm nghiên cứu mẫu sẽ được thu nhiều đợt, tổng số tôm bố mẹ sẽ

được thu từ 30 cá thể và tôm giống sẽ được phân tích IHHNV qua nhiều giai đoạn

phát triển (50 bể x 4 giai đoạn phát triển Nauplli, Zoea, Mysis và Postlarvae). Tôm

mẹ và tôm giống sẽ được phân tích IHHNV bằng PCR. (Bảng 6.8)

Nguồn tôm bố mẹ được thu nhận từ các địa phương Đà Nẵng, Rạch Gốc, Phú

Yên và quần đàn tôm nhập nội là Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương sẽ được được

cắt chân bơi để sử dụng cho quy trình PCR phát hiện IHHNV.

Bảng 6.7. Số lượng mẫu ở các mô hình nuôi ở các khu vực thu mẫu

Vị trí Số lượng mẫu thu trên các mô hình

Quảng canh

(1-2 con/m2)

Bán thâm canh

(10-20 con/m2)

Thâm canh

(30-40

con/m2)

Trại giống

lớn

Trại giống

nhỏ

Cà Mau 20 ao - - - -

Bạc Liêu 20 ao 63 ao - - -

Trà Vinh - 34 ao - - -

Sóc Trăng - - 8 ao - -

Kiên

Giang

- - 12 ao - -

Miền

Nam

- - - - 50 bể và 30

con mẹ

Miền

Trung

- - - 68 bể và 30

con mẹ

45 bể và 30

con mẹ

63

Bảng 6.8. Phân loại quy mô trại sản xuất giống.

Các chỉ tiêu Quy mô nhỏ Quy mô lớn

Sở hữu và điều hành

hoạt động

Các thành viên trong gia

đình

Hợp tác lớn, cơ quan Nhà

nước, giống sản xuất

bán đại trà

Diện tích Tận dụng diện tích đất quanh

nhà

5.000m2– 1 ha

Sản lượng 1-5 triệu PL/ năm Trên 20 triệu PL/năm

Số công nhân, kỹ thuật 1 kỹ thuật, 2 công nhân

3-6 kỹ thuật, 6-10 công nhân

Tổng thể tích bể ương 20-100m3 Trên 1.000m3

Hệ thống an toàn sinh học Một người quản lý nhiều bể

ương. Không có xét nghiệm

con bố mẹ

Mỗi công nhân quản lý nhà

ương riêng biệt. Có xét

nghiệm con bố mẹ

Trại ương lớn ở Miền Nam sẽ dựa trên nên tản đề tài “Di truyền tôm sú” để

đánh giá sự hiện diện IHHNV trong quần đàn tôm sú trước và sau khi sinh sản như

thế nào. Đánh giá sự hiện diện IHHNV từ 117 đàn tôm Post từ 101 con bố, mẹ đã

xác định không mang virus bằng PCR. Và đàn tôm post này sau khi nuôi 2 tháng

trong 138 bể riêng lẻ. Kiểm tra sự hiện diện IHHNV trên mẫu tôm post và tôm nuôi

sau 2 tháng bằng PCR.

Để đánh giá sự hiện diện IHHNV trên đàn tôm bố mẹ tự nhiên, chúng tôi tiến

hành thu 555 mẫu tôm mẹ bố mẹ được đánh bắt từ các vùng khác khau Đà Nẵng,

Phú Yên, Rạch Gốc, Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Tiến hành phân tích PCR

để đánh giá tỷ lệ nhiễm của IHHNV trên đàn tôm bố mẹ này.

2. Xử lý kết quả phân tích thống kê ước lượng

Mẫu tôm sau khi thu nhận tại hiện trường sẽ được phân tích bằng qui trình PCR

định tính nêu trên. Vì vậy, sử dụng thuật toán ước lượng xác suất để thống kê kết

quả phân tích. Theo đó, giả sử tổng thể đang nghiên cứu gồm N phần tử. Trong đó

64

M phần tử có tính chất A nào đó. P = là tỷ lệ các phần tử có tính chất A của tổng

thể. Ở đây P chưa biết do vậy cần ước lượng P cũng chính là xác suất để lấy được

phần tử có tính chất A khi lấy ngẫu nhiên từ tổng thể. Đây là ước lượng xác suất.

Khoảng tin cậy của P được tính theo công thức:

Trong đó:

P: ước lượng tổng thể,

f: tỷ lệ mẫu nhiễm IHHNV,

n: số mẫu phân tích,

: giá trị tra Bảng (phụ lục 4)

3. Xác định tỷ lệ nhiễm IHHNV theo lứa tuổi

Thu các mẫu tôm sú tại các ao nuôi ở các mô hình khác nhau thuộc các tỉnh

Bạc Liêu, Kiên Giang và Trà Vinh, thu làm nhiều đợt trong suốt vụ, mỗi đợt cách

nhau 1 tháng. Các mẫu sau khi thu sẽ được chia làm 3 nhóm: dưới 1 tháng tuổi, từ

1-2 tháng tuổi và trên 2 tháng tuổi. Sử dụng quy trình multiplex PCR để phát hiện

IHHNV. Đánh giá tỷ lệ nhiễm IHHNV trên từng nhóm độ tuổi dựa vào phân tích

thống kê bằng phần mềm MS-EXCEL Microsoft Office 2010.

4. Ảnh hưởng của virus lên trọng lượng và hình thái của tôm sú

Thí nghiệm được dựa trên nền tản của đề tài “Ứng dụng di truyền số lượng

và di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tôm sú theo tính trạng

tăng trưởng”. Theo dõi 94 quần đàn tôm sú postlarvae PL12 từ những con mẹ đã

xác định âm tính với các virus trước đó (LSNV, YHV và WSSV). Mỗi đàn tôm

postlarvae gồm 1000 con trong 94 quần đàn được nuôi trong 94 bể nuôi (1000 lít)

trong các nhà nuôi ở Trung Tâm Giống Hải sản Vũng Tàu. Có hệ thống sục khí để

hành lượng oxi hòa tan 5-6 ppm và được cho ăn với thức ăn chuyên biệt của đề tài.

Hệ thống này được thiết kế an toàn sinh học, không cho các sinh vật mang mầm

bệnh vào trong bể và nước được xi phông mỗi ngày. Sau 2 tháng nuôi, 10 cá thể của

65

những quần đàn tôm này sẽ được đo về chiều dài, trọng lượng của chúng. Đồng thời

10 cá thể này được cắt 1 chân bơi để kiểm tra sự hiện diện virus IHHNV bằng PCR.

Sau khi có kết quả phân tích những đàn tôm sú không nhiễm và nhiễm được so sánh

thống kê bằng phần mềm Excel 2013. Nếu có sự khác biệt về trọng lượng và chiều

dài của nhóm tôm nhiễm và không nhiễm IHHNV giữa 2 nhóm khi (P<0,005).

5. Đề xuất các giải pháp hạn chế sự truyền lan của IHHNV trên tôm sú

Phiếu điều tra các ao nghiên cứu sẽ được thiết kế để thu thập thông tin trước

các lần thu mẫu và kết quả xét nghiệm mẫu tôm thu nhằm tìm ra các tác động gây

bệnh, biểu hiện của IHHNV trên tôm sú nuôi và từ đó đề xuất các biện pháp hạn chế

sự lây lan của virus này như:

+ Từ những nghiên cứu đạt được như cơ chế lây truyền dọc hay ngang của tôm

bố mẹ, tôm nuôi thương phầm và tôm giống. Sẽ chọn lựa các qui trình thuần ương,

sàn lọc tôm bố mẹ và con giống, cho đến quản lý ao nuôi trong suốt quá trình nuôi

tôm. Đảm bảo an toàn từ việc lựa chọn tôm bố mẹ cho đến sản xuất giống và nuôi

thành tôm thương phẩm.

+ Chuyển giao qui trình chẩn đoán đã tối ưu hóa mà đề tài đã đạt được cho các

trung tâm kiểm dịch thú y thủy sản và chi cục thủy sản địa phương.

+ Phối hợp với chi cục thủy sản các tỉnh khuyến cáo cho người sản xuất giống

và người nuôi về tác hại của virus này. Đồng thời tăng cường kiểm tra, kiểm dịch

nguồn giống trước khi xuất giống và thả giống nuôivà biện pháp phòng bệnh

IHHNV.

66

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

NỘI DUNG I: NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG DI TRUYỀN CỦA CHỦNG

IHHNV THU NHẬN Ở VIỆT NAM

1. Kết quả thu nhận và phân tích mẫu tôm sú sàng lọc bằng qui trình PCR

Mẫu tôm thu ở nhiều vùng ở ĐBSCL và Miền Trung tại bảng 7.1 nhằm để

phục vụ giải trình tự bộ gen IHHNV type lây nhiễm và type A/B. Ngoài ra mẫu tôm

thu ở tôm sú ở Kiên Giang và tôm bố mẹ ở Vũng tàu được sử dụng làm nguồn ly

trích virus để nhân sinh cho các bố trí thí nghiệm lây nhiễm. Các mẫu thu được

đánh số mã hóa để gửi giải trình tự. Đối với mẫu thu xác định nhiễm IHHNV type

lây nhiễm, chọn mỗi tỉnh ở ĐBSCL Tiền Giang, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang

và Bến Tre. Ninh Thuận 2 mẫu và Vũng Tàu 1 mẫu. Đối với mẫu tôm sú nhiễm

IHHNV type A/B, mỗi tỉnh Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang và Bến Tre

chọn 5 mẫu dương ngẫu nhiên. Ninh Thuận chọn 2 mẫu.

Bảng 7.1. Kết quả thu nhận mẫu tôm sú ở các khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long

và các tỉnh khác

Khu vực

thu mẫu

Số mẫu Mẫu nhiễm

IHHNV type lây

nhiễm

Mẫu nhiễm

IHHNV type

A/B

Loại mẫu

Tiền Giang 5 3 0 Tôm nuôi

Bạc Liêu 60 15 16 Tôm nuôi

Sóc Trăng 40 12 13 Tôm nuôi và post

Kiên Giang 50 14 8 Tôm nuôi

Trà Vinh 55 7 14 Tôm nuôi

Bến Tre 15 4 7 Tôm nuôi

Ninh thuận 40 4 15 Tôm post

Vũng tàu 40 12 12 Tôm bố mẹ

Tổng 305 71 85

67

2. Dòng hóa và giải trình tự IHHNV type A/B

2.1. Xác định mẫu nhiễm IHHNV type A/B

Mẫu tôm sú thu ở các tỉnh ĐBSCL và tôm giống ở Miền Trung về nuôi ở các

tỉnh ĐBSCL được thu nhận và sàng lọc, để xác định chủng IHHNV type lây nhiễm

hay type A/B chèn vào bộ gen của tôm. Sau khi có kết quả sàng lọc bằng các qui

trình PCR (OIE. 2009), mẫu tôm nhiễm IHHNV type A/B được khuếch đại một

đoạn gen trong bộ gen của chúng để giải trình tự. Các mẫu giải trình tự và nguồn

gốc IHHNV type A/B được trình bày trong phụ lục 6. Vì rất nhiều trình tự giống

nhau, nên đề tài chỉ trình bày 1 trình tự IHHNV type A/B ngẫu nhiên có nguồn gốc

từ tôm sú nuôi ở Sóc Trăng. Mẫu này có kí hiệu 6419 được kiểm trang bằng các qui

trình chẩn đoán type A/B của OIE (2009) với 2 cặp mồi cặp mồi MG 831F/R và

IHHNV ABF/R. Kết quả kiểm tra sau khi điện di trên gel agarose 1.5 %, mẫu (có

ký hiệu 6419) ở Sóc Trăng xuất hiện băng sản phẩm khuếch đại có kích thước đặc

trưng cho virus IHHN type A/B. Mẫu đối chứng dương của IHHNV type lây nhiễm

không có tín hiệu. Chúng tôi dự đoán đó là băng tín hiệu của trình tự nucleotide

IHHNV type A/B (hình 7.1 B). Để khẳng định mẫu này có phải là type lây nhiễm

hay không chúng tôi tiếp tục thử nghiệm mẫu này trên các qui trình chẩn đoán

IHHNV type lây nhiễm. Kết quả sàng lọc bằng quy trình PCR chẩn đoán IHHNV

type lây nhiễm của OIE (2009) với cặp mồi IHHNV 77012F/77353R, IHHNV

309F/R cùng quy trình của Saksmerprome và ctv (2010) với cặp mồi IHHNV

279F/940R, điện di trên gel agarose 1.5 % với các mẫu thu tại ĐBSCL. Mẫu (ký

hiệu 6419) của Sóc Trăng cho kết quả âm tính so với mẫu đối chứng dương của

IHHNV type lây nhiễm. Như vậy có thể khẳng định mẫu tôm 6419 nhiễm IHHNV

type A/B.

68

Hình 7.1. A. Kết quả điện di sàng lọc mẫu không nhiễm virus IHHNV type lây

nhiễm với quy trình của 3 cặp mồi 309F/309R, 77012F/77353R, 279F/940R. M:

thang DNA 100 bp; giếng 6419: mẫu nghi nhiễm IHHNV type A/B; giếng (+): mẫu

chứng dương DNA IHHNV type lây nhiễm; giếng (-): mẫu nước cất

Hình 7.1B. Kết quả sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B với 2 quy trình của 2 cặp

mồi MG831F/R, IHHNV ABF/R .M: thang DNA 100 bp; giếng 6419: mẫu nghi

nhiễm IHHNV type A/B; giếng (+): mẫu DNA IHHNV type lây nhiễm

Qua kết quả sàng lọc bằng các quy trình PCR đã được công bố với hóa chất

hiện có tại phòng thí nghiệm, chúng tôi đã sàng lọc và thu được mẫu (có ký hiệu

6419) ở Sóc Trăng đạt yêu cầu, mẫu này được chọn để nhân dòng và giải trình tự.

Tương tự những mẫu còn lại, cũng được nhân dòng và giải trình tự.

IHHNV 77012F/77353R

IHHNV 279F/940R IHHNV 309F/R

496bp 356bp

309bp

MG831F/R IHHNV ABF/R

831bp 1200bp

69

2.2. Dòng hóa và giải trình tự

Mẫu có kí hiệu 6419 ở Sóc Trăng được khuếch đại bằng phương pháp PCR sử

dụng cặp mồi IHHNV ABF/R và dòng hóa vào vector pGEM T-easy-DNA IHHNV

type A/B. Mẫu vector pGEM T-easy-DNA IHHNV type A/B sau khi tinh nhân sinh

bằng E.coli JM109 được tinh sạch và kiểm tra bằng cặp mồi đặc hiệu IHHNV

ABF/R. Kết quả sản phẩm tinh sạch plasmid có chứa đoạn gen có kích thước 1200

bp (hình 7.2)

Hình 7.2. Kết quả kiểm tra dòng tế bào JM109 chứa vector pGEM T-easy-DNA

IHHNV type A/B (1200 bp). M: thang DNA 100 bp; giếng 1, 2: khuẩn lạc; giếng

(+): mẫu DNA IHHNV type A/B.

Để khẳng định plasmid mang gen khuếch đại sau khi kiểm tra bằng cặp mồi

đặc hiệu, chúng tôi kiểm tra plasmid pGEM T-easy - IHHNV type A/B tinh sạch

bằng cách điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di theo hình 7.3.

1200 bp

70

Hình 7.3. Kết quả điện di kiểm tra plasmid sau khi tinh sạch. M: thang DNA 1 kb;

giếng 1: dịch plasmid pGEM T-easy-IHHNV type A/B sau khi tinh sạch.

Theo hình 7.3 sau khi điện di, plasmid mang đoạn gen type A/B cho tín hiệu

với kích thước tương đương 4215 bp so với thang DNA 1 kb, đúng với kích thước

plasmid pGEM T- easy - IHHNV type A/B. Vậy chúng tôi đã tạo dòng thành công

và thu được plasmid pGEM T-easy - IHHNV type A/B tinh sạch, plasmid vừa thu

nhận được giải trình tự bằng trên máy 3130xl Gennetic Analyzer với bộ kít

BigDye®Ternminator v3.1 Cycle Sequencing tại công ty Nam Khoa (Việt Nam).

Kết quả phân tích và giải trình tự đoạn gen của chủng IHHNV type A trên tôm

sú nuôi đại diện ở Sóc Trăng (hình 7.4)

Hình 7.4. Trình tự nucleotide một phần gen IHHNV type A từ mẫu thu nhận ở

ĐBSCL/Việt Nam

Sau khi giải trình tự, chúng tôi đem phân tích và đối chiếu trình tự gen IHHNV

type A/B vừa thu nhận với trình tự của IHHNV đã được công bố trên ngân hàng gen

4215 bp

71

bằng chương trình BLAST của NCBI. Kết quả phân tích cho thấy trình tự vừa thu

nhận được có trình tự tương đồng với chủng IHHNV type A (DQ228358).

Trình tự gen IHHNV type A/B nhiễm trên tôm sú nuôi đã được nhiều nhà

nghiên cứu phân tích và giải trình tự. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành so sánh

trình tự IHHNV type A vừa thu nhận với trình tự IHHNV type lây nhiễm và type

A/B ở các khu vực sau: type lây nhiễm của Ecuador (AY362548), Thái Lan

(AY362547), Phúc Kiến-Trung Quốc (EF633688), type B của Tanzania

(AY124937) và type A của Madagascar (DQ228358). Để làm rõ mối quan hệ di

truyền giữa chủng IHHNV type A ở Việt Nam và các type khác ở những khu vực đã

nói trên.

Sau khi so sánh trình tự IHHNV type A được thu nhận từ ĐBSCL với trình tự

IHHNV của các nước: Ecuador, Thái Lan, Phúc Kiến-Trung Quốc, TanZania và Úc,

Madagascar cho thấy trình tự IHHNV type A của Việt Nam có sự tương đồng khá

cao so với trình tự gen IHHNV type A ở Madagascar (DQ228358) do Tang và ctv

(2006) công bố có độ tương đồng cao nhất với trình tự IHHNV type A của Việt

Nam là 100%, sự tương đồng cao này có thể do IHHNV type A của Việt Nam có

nguồn gốc từ Úc, Madagascar vì tôm bố mẹ của Việt Nam được nhập từ nhiều nước

trong đó có Úc (EU675312) và Madagascar, bên cạnh đó thì trình tự IHHNV type A

của Việt Nam có độ tương đồng thấp với trình tự IHHNV type B của Tanzania

(86%). Ngoài ra chúng tôi thiết lập cây di truyền so sánh trình tự IHHNV type A tại

Việt nam với các khu vực trên ngân hàng gen như hình 7.5.

72

Hình 7.5. Kết quả cây di truyền IHHNV type A từ mẫu thu nhận ở ĐBSCL với các

chủng ở Ecuador (AY362548), Thái Lan (AY362547), Phúc Kiến-Trung Quốc

(EF633688), Tanzania (AY124937), Úc (EU675312), Madagascar (DQ228358)

Chúng tôi tiến hành phân tích những mẫu còn lại ở những vùng khác được

trình bày trong báo cáo sản phẩm của đề tài. Kết quả cho thấy trên tôm sú nuôi ở

Việt Nam chưa có sự hiện diện IHHNV type B, chỉ có sự hiện diện IHHNV type A.

Việc xác định được sự hiện diện của IHHNV type A ở Việt Nam, có ý nghĩa to lớn

trong việc chẩn đoán IHHNV nhiễm trên tôm nuôi. Khuyến cáo các trung tâm, các

phòng thí nghiệm nghiên cứu và chẩn đoán IHHNV tại Việt Nam cần cẩn trọng khi

xét nghiệm loại virus này, để tránh hiện tượng dương tính giả với chủng virus chèn

vào genome của tôm vì chủng virus này không có hại trên tôm.

3. Dòng hóa và giải trình tự bộ gen IHHNV type lây nhiễm

Mẫu tôm đang nuôi ở các tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, Tiền Giang, Bạc Liêu

và Bến Tre, Vũng Tàu và Ninh Thuận sẽ được thu nhận để sàn lọc có sự hiện diện

IHHNV chủng lây nhiễm hay không. Những mẫu tôm sau khi sàn lọc bằng các qui

trình PCR để xác định type lây nhiễm (OIE, 2009; Saksmerprome và ctv., 2010).

Mẫu sau khi sàng lọc đã xác định không mang trình tự IHHNV type A/B mà chỉ

mang IHHNV type lây nhiễm của 7 tỉnh trên sẽ được gửi cho công ty Nam Khoa

giải trình tự bằng các cặp mồi genome walking. Giải trình tự các đoạn DNA của

73

IHHNV đã tinh sạch trên máy giải trình tự 313xl Genetic Anzyzer với bộ kít

BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing. Sau khi giải trình tự dùng phần mềm

BioEdit nối các trình tự này lại thành bộ gen hoàn chỉnh. Kết quả phân tích bộ gen

đính kèm theo file fasta hoặc word.

3.1. Xác định mẫu nhiễm IHHNV type lây nhiễm

Kết quả sàng lọc các mẫu tôm thu thập từ ĐBSCL bằng quy trình PCR chẩn

đoán IHHNV type lây nhiễm của OIE với các cặp mồi 77012F/77353R; 279F/940R

và 309F/R. Sau đó, các mẫu nghi nhiễm IHHNV này sẽ được khẳng định không

nhiễm IHHNV type A/B bằng quy trình PCR của các cặp mồi MG831 F/R và

IHHNVF/R -AB. Trong các mẫu đã kiểm tra, các mẫu tôm mang virus IHHNV trên

các tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Tiền Giang, Ninh Thuận, Vũng Tàu và

Bạc Liêu có kí hiệu KG, ST, BT, TG, NT21, NT22, VT6 và BL cho kết quả âm tính

với qui trình PCR (OIE., 2009) kiểm tra IHHNV type A/B, đồng thời cho kết quả

dương tính với IHHNV type lây nhiễm. Kết quả điện di trên gel agarose 1,5 % mẫu

tôm mang virus IHHNV type lây nhiễm kí hiệu KG, ST, BT, TG, NT21, NT22,

VT6 và BL xuất hiện băng sản phẩm khuếch đại có kích thước đặc trưng với

IHHNV type lây nhiễm và rõ ràng (hình 7.6). Chúng tôi cho rằng đây chính là băng

tín hiệu của IHHNV type lây nhiễm.

Hình 7.6. Kết quả sàng lọc mẫu IHHNV type lây nhiễm với quy trình của 3 cặp

mồi: 77012F/77353R; 309F/R và 279F/940R. Giếng M: Thang DNA 100 bp; giếng

(+): Mẫu DNA của IHHNV type lây nhiễm; giếng (-): Mẫu có nước cất; giếng

(KG): Mẫu nghi nhiễm IHHNV type lây nhiễm

74

Từ những kết quả sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type lây nhiễm với các quy

trình PCR đã được công bố, chúng tôi tiến hành lưu giữ mẫu và chuyển mẫu cho

Công ty Nam Khoa để giải trình tự.

3.2. Phân tích cấu trúc vật liệu di truyền

Kết quả giải trình tự bộ gen chủng IHHNV ở Kiên Giang, Bạc Liêu, Sóc

Trăng, Tiền Giang, Ninh Thuận, Vũng Tàu và Bến Tre sẽ được phân tích bằng các

phần mềm đã trình bày ở phần phương pháp. Chi tiết trình tự từng bộ gen sẽ được

trình bày phần báo cáo sản phẩm của đề tài.

+ Chủng IHHNV thu nhận kí hiệu KG, chủng virus này có kích thước

khoảng 3824 bp. Trong đó A (36,17%), G (19,06%), T (20,87%), C (23,90%) và

A+T (57,03 %), C+G (42,97%). Chủng virus IHHNV thu nhận kí hiệu KG có thành

phần A+T rất cao, chúng lên đến 57,78% tương tự như virus IHHNV thu nhận

Hawaii 57,02 %, virus gây hoại tử gan tụy trên tôm (HPV 58,35%), virus nhiễm

trên muỗi brevidensoviruses (AaeDNV 62,5%) và (AalDNA 61,8%)

(Sukhumsirichart và ctv., 2006). Sau khi sử dụng chương trình MegAlign so sánh

các trình tự nucleotide của chủng IHHNV trên ngân hàng genbank, chủng này có

trình tương đồng với chủng phân lập ở Hawaii, Mexico, Ecuador và Trung Quốc.

+ Chủng IHHNV thu nhận có kí hiệu TG, chủng virus này có kích thước bộ

gen khoảng 3824 bp. Trong đó A (36,17%), G (19,43%), T (20,55%), C (23,85%)

và A+T (56,72 %), C+G (43,28%). Chủng virus IHHNV thu nhận có kí hiệu TG có

A+T có tỷ lệ rất cao lên đến 56,73% tương tự như virus IHHNV thu nhận có kí hiệu

ST (56,82%), gần như 2 chủng này có chung nguồn gốc vì độ tương đồng của 2 bộ

gen này lên đến 99,7%. Chủng IHHNV thu nhận có kí hiệu TG có trình tự tương

đồng rất cao với chủng IHHNV của Thái Lan (AY102034) 99,8%, Đài Loan B

(AY355307) 99,8% và chủng IHHNV thu nhận ở các tỉnh ĐBSCL lên đến 99,3%

ngoại trừ chủng IHHNV có kí hiệu KG 96,5%.

+ Chủng IHHNV thu nhận có kí hiệu ST, chủng virus này có kích thước

khoảng 3824 bp. Trong đó A (36,27%), G (19,35%), T (20,55%), C (23,82%) và

A+T (56,83 %), C+G (43,17%). Chủng virus IHHNV thu nhận có kí hiệu ST tương

75

đồng rất cao với A+T chúng lên đến 56,82% tương tự như virus IHHNV phân lập

Thái Lan (AY102034) 56,9 %. Chủng IHHNV thu nhận có kí hiệu ST cũng giống

như chủng thu nhận có kí hiệu TG, có trình tự tương đồng rất cao với chủng

IHHNV của Thái Lan (AY102034), Đài Loan (AY355306, AY355306).

+ Chủng IHHNV thu nhận có kí hiệu BT, chủng virus này có kích thước

khoảng 3824 bp. Trong đó A (36,22%), G (19,35%), T (20,53%), C (23,90%) và

A+T (56,75%), C+G (43,25%). Phân tích so sánh trình tự bộ gen này so với bộ gen

một số chủng thu nhận ở Việt Nam và thế giới kết quả cho thấy chủng này có độ

tương đồng rất cao với chủng IHHNV của Thái Lan (AY102034), Đài Loan

(AY355306, AY355307) trên 99,4%, và chủng thu nhận có kí hiệu ST và TG

(99,5%). So sánh với chủng này với chủng IHHNV type không gây bệnh cho thấy

độ tương đồng rất thấp (≤ 91,6%).

+ Chủng IHHNV thu nhận kí hiệu BL, chủng virus này có kích thước khoảng

3824 bp. Thành phần nucleotide A (36,11%), G (19,46%), T (20,48%), C (23,95%)

và A+T (56,59%), C+G (43,41%). Phân tích so sánh trình tự bộ gen này so với bộ

gen một số chủng thu nhận ở Việt Nam và thế giới. Kết quả cho thấy chủng này có

độ tương đồng rất cao với chủng IHHNV của Thái Lan (AY102034), Đài Loan

(AY355306, AY355307) trên 99,4%, và chủng thu nhận có kí hiệu ST và TG, BT

(99,1%), kế đến là chủng IHHNV phân lập ở Hawaii (AF28266), Mexico

(AF273215) 92,% và thấp với chủng phân lập ở Đông Phi và Úc DQ228358 và

EU675321 khoảng 86%

+ Chủng IHHNV thu nhận ở Ninh Thuận có kí hiệu NT21, chủng virus này

có kích thước khoảng 3443 bp. Thành phần nucleode A (36.83%), G (19,58%), T

(19,98%), C (23,61%) và A+T (56,81%), C+G (43,19%). Phân tích so sánh trình tự

bộ gen này so với bộ gen một số chủng thu nhận ở Việt Nam và thế giới kết quả cho

thấy chủng này có độ tương đồng rất cao với chủng IHHNV của Thái Lan

(AY102034) 98,4%, Đài Loan (AY355306, AY355307) trên 96,1%, và thấp hơn so

với chủng chủng phân lập có kí hiệu Hawaii (AF28266) ST và TG (92,5%). So sánh

với chủng này với chủng IHHNV type không gây bệnh DQ228358 và EU675321

cho thấy độ tương đồng rất thấp (84-86%).

76

Ở trong nghiên cứu này, trong 8 bộ gen thu nhận, có 5 bộ gen có trình tự

tương đồng cao với bộ gen đã thu nhận ở Việt Nam JN616415. Vì vậy, chỉ có bộ

gen IHHNV có kí hiệu KG có sự khác biệt với các chủng IHHNV ở Việt Nam đã

công bố trên Genbank nên chúng tôi xin trình bày trình tự và các vùng chức năng

của bộ gen IHHNV type lây nhiễm thu nhận trên tôm sú nuôi ở Kiên Giang.

77

78

79

Hình 7.7A. Trình tự nucleotide của bộ gen chủng IHHNV ở Kiên Giang. Trình tự

acid amin giả định được mã hóa bởi các ORF chính được chỉ ra dưới trình tự của

các ORF. Tín hiệu điều hòa phiên mã giả định (hộp TATA, hộp Inr, DPE, tín hiệu

polyA) và mã khởi đầu, mã kết thúc được gạch chân ở dưới. Trình tự protein bảo

tồn sao chép I và II, NTP binding và vùng helicase A, B, và C được chỉ ra

Cấu trúc bộ gen IHHNV có kí hiệu KG trên tôm sú ở Kiêng Giang

Tổ chức bộ gen của IHHNV có một sự chồng lấp giữa các gen mã hóa cho

protein không cấu trúc (NS1 và NS2) và gen mã hóa cho protein cấu trúc (VP).

Trình tự của ORF bắt đầu từ 5’ của mạch chứa ORF1 (gen mã hóa cho NS1), ORF2

(gen mã hóa cho NS2) và ORF3 (gen mã hóa cho VP). Cấu trúc này giống với

chủng IHHNV khác và các parovirus khác với trình tự gen được tổ chức như ORF

bên trái mả hóa cho protein 1 (NS1), ORF giữa mã hóa cho protein 2 (NS2) và ORF

bên phải mã hóa cho protein vỏ (VP) (Shike và ctv., 2000). Cấu trúc của bộ gen

được thể hiện ở hình 7.7B.

Cấu trúc của các khung đọc mở (ORF)

Trình tự bộ gen có kích thước 3824 bp của chủng KG được phân tích bằng

phần mềm trực tuyến ORF finder của NCBI, Mỹ. Cấu trúc của các trình tự mã hóa

của bộ gen IHHNV thu nhận ở KG (hình 7.7A) cũng gần tương tự như các chủng

phân lập ở Haiwaii (AF218266). Ngoài ra, phân tích trình tự nucleotide của bộ gen

IHHNV thu nhận ở KG cho thấy nó giống như các chủng IHHNV thu nhận từ nhiều

nơi trên thế giới cũng có 3 vùng mã hóa chính: ORF1 nằm bên trái ở vị trí nt 570 –

2570, có kích thước 2001 bp mã hóa cho protein giả định NS1 gồm 666 amino acid

(a.a); ORF2 nằm giữa ở vị trí nt 514 – 1605, có kích thước 1092 bp mã hóa cho

protein giả định NS2 gồm 363 a.a và vùng mã hóa cho protein vỏ ORF3 gồm 329

a.a nằm bên phải ở vị trí nt 2512 – 3501, có kích thươc 990 bp.

80

Hình 7.7B. Cấu trúc các ORF trên trình tự bộ gen của chủng IHHNV thu nhận ở

Kiên Giang. Ba khung đọc mở (ORF1, ORF2, ORF3)cùng với vị trí được chỉ ra

trong khung.

Promoter tiềm năng và các tín hiệu kiểm soát phiên mã

Promoter tiềm năng và các tín hiệu kiểm soát phiên mã được phân tích bởi

chương trình Neural Network (PPNN) software trực tuyến. Chương trình này sẽ tìm

kiếm các trình tự điều hòa phiên mã ở chiều xuôi và chiều ngược của các ORF bên

trái, ở giữa và bên phải cho thấy có một số promoter tiềm năng và các tín hiệu

polyadenylation (polyA). Chương trình PPNN chỉ ra mức điểm cao (0,99) cho vị trí

đầu tiên giống hộp TATA ở nt 42 (TATATAA – Hình 7.7A. ) theo chiều ngược của

ORF1. Tín hiệu khởi đầu phiên mã Inr (CCAGTC) ở vị trí nucleotide (nt) nt 71 – 76

theo chiều xuôi cũng được chỉ ra, kế tiếp là yếu tố điều hòa phiên mã theo chiều

xuôi – DPE (GAAGAGGCTA) ở vị trí nt 92 – 100. Do đó, vùng này giống như một

promoter có chức năng của ORF1.

Chương trình PPNN cũng cho thấy mức điểm cao (0,96) cho một promoter

tiềm năng ở vị trí nt 2369 – 2419, cách khoảng 100 nt chiều ngược so với đầu 5’ của

ORF3. Mặc dù trình tự này không chứa yếu tố giống hộp TATA đặc trưng, cho nên

vị trí của nó có lẽ phù hợp với yếu tố hoạt hóa phiên mã cis. Ngoài ra, một số yếu tố

giống TATA hiển diện trong các trình tự mã hóa của ORF1 nhưng bởi vì chúng

nằm ở vị trí xa so với đầu 5’ của ORF3, do đó không có yếu tố nào trong số chúng

có chức năng của một promoter.

Vị trí của các polyadenylation (polyA) liên quan đến sự hiện diện của RNA

thông tin ở trình tự IHHNV. Trình tự AATAAA thứ nhất nằm ở vị trí nt 1740 –

1745 (hình 7.7A), cách 135 nt chiều xuôi so với vị trí kết thúc của ORF2, cho nên

nó có thể có chức năng cho hoạt động của RNA thông tin. Vị trí thứ hai của trình tự

81

AATAAA nằm ở nt 3548 – 3553 (hình 7.7A), cách 47 nt theo chiều xuôi so với vị

trí kết thúc của ORF3, do đó nó có thể gần giống với vị trí polyA nhất cho RNA

thông tin của IHHNV.

Các vùng trình tự bảo tồn

Chương trình tìm kiếm trình tự kiểm soát phiên mã online của NCBI được sử

dụng để tìm kiếm những trình tự mã hóa NTP liên kết và enzyme helicase A, B và

C. Đây là những vùng trình tự chức năng có tính bảo tồn cao, thường được tìm thấy

ở các protein được mã hóa bởi ORF1 của các parvovirus (Shike và ctv., 2000).

Protein khởi đầu sao chép I Protein khởi đầu sao chép II

258 GDHWHITYS 266 - 306 LFYLIRYGI 315

NTP liên kết và enzyme helicase

A B C

485 -LVLQGPTGTGKSLTIGALLGKL-506 … 530–YALFEEPRIS-539…570-IPIFISIN-577

Hình 7.8. Trình tự a.a của các protein khởi đầu sao chép I và II cùng với các vùng

NTP liên kết và enzyme helicase A, B và C ở protein được mã hóa bởi ORF1

Một vùng trình tự nằm ở vị trí a.a 258 – 266 và a.a 306 – 315, lần lượt tương

ứng nt 1342 – 1369 và nt 1488 – 1515 trên trình tự IHHNV mã hóa cho protein khởi

đầu sao chép I và II (hình 7.8). Những vùng trình tự này liên quan đến sự khởi đầu

và kết thúc trong sao chép cuộn vòng.

Trình tự a.a của NTP liên kết và enzyme helicase ở vị trí a.a 485 – 577, chứa

đựng các trình tự có tính bảo tồn cao của họ parvovirus cũng được phát hiện (Shike

và ctv, 2000; Boublik và ctv., 1994). Vùng NTP liên kết và enzyme helicase A có vị

trí a.a 485 – 506, tương ứng với trình tự nt 2024 – 2088, kế tiếp là vùng NTB liên

kết và enzyme helicase B có vị trí a.a 530 – 539, tương ứng với trình tự nt 2158 –

2187 và cuối cùng là vùng NTB liên kết và enzyme helicase C nằm ở vị trí a.a 570 –

577, tương ứng với trình tự nt 2179 – 2301 trên bộ gen của IHHNV (hình 7.8). Do

82

đó, các vùng có tính bảo tồn cao của chủng IHHNV ở Kiên Giang cũng nằm ở vị trí

giống với chủng IHHNV đã được phân lập trước đó ở Hawaii (Shike và ctv., 2000).

3.3. So sánh chủng IHHNV-KG với các chủng IHHNV có trên Genbank

So sánh trình tự amino acid

Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành phân tích các trình tự được mã hóa cho

protein giả định ở các ORF của chủng IHHNV phân lập ở Kiên Giang. Sử dụng

phần mềm DNASTAR Lasergene V7.1.0, với chương trình phân tích đa trình tự

MegaAli (Clustal W) cho các ORF của các chủng IHHNV.

Bảng 7.2a. Mức độ tương đồng (%) giữa các trình tự acid amin giả định được mã

hóa bởi 3 ORF của chủng IHHNV ở Kiên Giang với các chủng khác trên Genbank.

Trình tự IHHNV-KG No. Genbank ORF 1 ORF 2 ORF 3

Hawaii (Mỹ) AF218266 98,8 99,2 98,8

Mexico AF273215 98,3 99,2 98,8

Ecuador AY362548 98,6 99,2 98,2

Ấn Độ GQ411199 91,3 95,0 95,5

Đài Loan A AY355306 98,6 98,9 99,3

Đài Loan B AY355307 96,1 96,1 96,7

Đài Loan C AY355308 98,6 98,9 98,8

Trung Quốc EF633688 98,5 98,9 98,5

Thái Lan 00 AY102034 95,8 95,6 96,7

Thái Lan 03 AY362547 96,1 96,7 96,4

Madagascar type A DQ228358 83,3 - 92,7

Tanzania AY124937 91,3 - 96,0

Úc type A EU675312 95,9 - 97,0

Các ORF của IHHNV ở KG có vị trí khởi đầu giống nhau và đều bắt đầu bằng

codon ATG. Ở bảng 7.2a. ORF1 bên trái chiếm 50 % bộ gen mã hóa cho protein

không cấu trúc 1 (NS1) của IHHNV bắt đầu ở vị trí nt 570 và kết thúc bằng đuôi

TAA ở vị trí nt 2570. ORF này mã hóa cho 1 protein có kích thước 666 aa. So sánh

83

trình tự amino acid giả định được mã hóa bởi ORF 1 cho thấy chủng IHHNV ở

Kiên Giang có sự tương đồng cao với các chủng IHHNV ở Hawaii (98,8 %), Đài

Loan A, C (98,6 %), Trung Quốc (98,5 %) và có độ tương đồng thấp so với chủng

IHHNV ở Madagasca (83,8 %), Tanzania (91,3 %) và Ấn Độ (92,7 %).

ORF2 nằm ở giữa của bộ gen chủng IHHNV phân lập ở KG có kích thước

1092 bp. Nó bắt đầu với codon ATG ở vị trí nt 514 và kết thúc bằng codon TAG ở

vị trí nt 1605. ORF này mã hóa cho protein có 363 aa. Trình tự amino acid được mã

hóa bởi ORF 2 có độ tương đồng cao với các chủng IHHNV ở Hawaii, Mỹ -

Mexico (99,2 %) và có độ tương đồng thấp với các chủng từ Úc, Tanzania.

ORF3 có kích thước nhỏ nhất (990 bp) trong số 3 ORF của bộ gen chủng

IHHNV ở KG. Nó bắt đầu ở với codon ATG ở vị trí nt 2512 và kết thúc bằng TAA

ở vị trí nt 3501. Nếu trình tự này được dịch mã, có lẽ nó sẽ mã hóa cho protein có

kích thước 329 aa. Khi so sánh trình tự amino acid được mã hóa bởi ORF này cho

thấy chúng có độ tương đồng cao với các chủng Đài Loan A (99,3 %) và Hawaii,

Đài Loan C (98,8 %) và có độ tương đồng thấp với các chủng ở Madagasca (92,7

%) và Ấn Độ (95,5 %).

Ngoài ra, những thay đổi trình tự nucleotide sẽ dẫn đến những thay đổi trên

trình tự acid amin được mã hóa bởi chúng. Mặc dù protein không cấu trúc được bảo

tồn, nhưng sự thay đổi nucleotide có thể xảy ra từ áp lực chọn lọc như là kết quả

của chức năng hoạt động enzyme (Tang và ctv., 2003). Những nghiên cứu của

Tijssen và ctv. (1995); Fox và ctv. (1999) cho rằng protein vỏ thường liên quan đến

độc lực của virus do đó sự thay đổi trong bệnh học của một số parvovirus được cho

là liên quan đến sự thay đổi trình tự trong protein vỏ, tuy nhiên nghiên cứu của

Gallinella và ctv., (1995) và Erdman và ctv. (1996) cho rằng một số trường hợp

khác không cho thấy mối liên hệ này. Để chứng minh khả năng này cho các chủng

IHHNV được thu nhận, chúng tôi so sánh các trình tự a.a được dịch mã từ ORF3

được phân lập từ tôm bị tử vong cao (chủng Hawaii) và các chủng khác trên tôm sú

từ nhiều vùng địa lý (Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan và Việt Nam), nhưng

chúng tôi không thể phát hiện được bất kỳ thành phần nào của sự thay đổi a.a liên

84

hệ tới động lực của virus. Đối với chủng Kiên Giang cho thấy chúng có cùng trình

tự với chủng Trung Quốc và Hawaii mà chỉ khác 4 a.a (thiamin, histimin,..) ở vị trí

a.a thứ 51, 188, 304 và 309 trên protein giả định được dịch mã từ ORF3 (Bảng 7.2b)

tuy nhiên chủng IHHNV ở Kiên Giang và Trung Quốc đều không phải là nguyên

nhân gây chết tôm.

Bảng 7.2b. Sự thay đổi a.a trong protein vỏ được dịch mã từ ORF3 của chủng

IHHNV ở Kiên Giang với các chủng IHHNV từ GenBank có sự tương đồng trình tự

gần nhất

Vị trí a.a Trình tự a.a bảo tồn Kiên Giang Hawaii Đài Loan C Trung Quốc

51 (2663) Q R - - -

188 (3073) A T - - -

304 (3424) A T - - -

309 (3468) Q H - - -

Vị trí a.a trên ORF3 được dịch mã; số trong ngoặc (): Vị trí nt trên trình tự IHHNV của Kiên Giang

Trình tự bảo tồn được thể hiện bằng gạch nối (-), trái lại những sai khác được thể hiện

3.4. So sánh trình tự các chủng virus IHHNV trên 8 mẫu tôm thu ở các tỉnh

ĐBSCL và các tỉnh khác

Sử dụng phần mềm DNASTAR Lasergene V7.1.0, với chương trình phân tích

đa trình tự MegaAli (Clustalw). Kết quả phân tích cho thấy ở hình 7.9.

Hình 7.9. Kết quả phân tích so sánh trình tự các chủng IHHNV thu nhận tại các

tỉnh ở ĐBSCL, Vũng tàu và các tỉnh khác ở Miền Trung.

Qua kết quả phân tích cho thấy chủng virus IHHNV thu nhận có kí hiệu TG

có trình tự của bộ gen tương đồng cao nhất lên đến hơn 99,8% với chủng thu nhận

có kí hiệu ST, kế đến là các chủng IHHNV thu nhận có kí hiệu BL (99,5%) và BT

85

(99,3%). Từ kết quả phân tích trên có thể chủng IHHNV thu nhận có kí hiệu ST và

TG là một chủng. Khi so sánh trình tự chủng virus IHHNV có kí hiệu KG với chủng

khác có kí hiệu trên thì có kết quả cho thấy trình tự tương đồng thấp nhất đối với

các chủng virus IHHNV có kí hiệu ST, TG và BT là 96,1 % và tương đồng cao hơn

đối với chủng thu nhận kí hiệu TG là 96,4%. Qua phân tích đa trình tự, chúng tôi

nhận thấy trình tự gen IHHNV – NT21 tương đồng nhiều nhất (99,6 %) với trình tự

gen IHHNV – NT22 và có mức độ tương đồng (khoảng 96 %) với chủng IHHNV –

VT6 và các chủng khác ở ĐBSCL như ST, TG, BL và BT. Tuy nhiên, chủng

IHHNV này lại có mức độ tương đồng rất thấp (92,9 %) với chủng IHHNV KG .

Khi chủng IHHNV – NT22 lại có trình tự tương đồng giống với trình tự chủng

IHHNV NT21 (96 %) với các chủng IHHNV ở ĐBSCL, chỉ thấp với chủng KG.

Trong khi đó, chủng IHHNV – VT6 có mức độ tương đồng cao (khoảng 96 %) với

các chủng IHHNV – NT1 và IHHNV – NT22 và có mức độ tương đồng thấp (93,8 -

94,2 %) với các chủng ở Đồng bằng sông Cửu Long như ST, TG, BL và BT và có

mức độ tương đồng (95,6 %) với chủng IHHNV ở KG.

Kích thước và trình tự sắp xếp vị trí nucleotide của chủng IHHNV thu nhận

từ các tỉnh ở ĐBSCL (ST, KG, TG, BL và BT) và chủng Ninh Thuận (NT21) cho

thấy tương đồng rất cao với các chủng IHHNV type lây nhiễm phân lập ở các khu

vực khác trên thế giới. Rõ nhất là trình tự nucleotide của ORF1 mã hóa cho protein

giả định NS1 chiếm rất lớn trong 3 đoạn đọc mở ORF chiếm khoảng 50% bộ gen

của virus với kích thước khoảng 2001 bp đối với chủng các phân lập được trên thế

giới. Tương tự trình tự nucleotide của ORF2 và ORF3 cũng tương tự như có kích

thước 1092 bp và 990 bp. Tuy nhiên có 2 chủng IHHNV kí hiệu NT22 và VT6 ở

tôm sú Ninh Thuận và Vũng Tàu có kích thước ORFs khác với các chủng trên.

Trình bày chi tiết 2 chủng này ở mục 3.6 phía dưới.

3.5. So sánh trình tự nucleotide các chủng thu nhận ở Việt Nam và các

chủng IHHNV khác trên thế giới

Trong rất nhiều nghiên cứu cho thấy rằng nghiên cứu về sự đa dạng di truyền

của virus rất quan trọng trong việc hiểu rõ bản chất cơ chế gây bệnh cũng như tương

tác của nó. Từ đó đề ra các giải pháp hạn chế và phòng trị. Trong nghiên cứu này,

86

trình tự có kích thước 2,9 kb bộ gen của virus (bao gồm 3 đoạn ORFs ) thu nhận ở

các tỉnh được phân tích so sánh trình tự của chúng. Kết quả phân tích thể hiện ở

bảng 7.2.

Bảng 7.2. Trình tự tương đồng nucleotide trên 2,9 kb của bộ gen của các chủng thu

nhận tại các tỉnh ở ĐBSCL, Vũng tàu và các tỉnh khác ở Miền Trung với một số

chủng ở các nước khác trên thế giới.

Độ tương đồng (%) đoạn 2,9 kb của bộ gen IHHNV type lây nhiễm

Chủng IHHNV BL BT KG ST TG VT6 NT21 NT22

Hawaii-AF218266 96,1 96 99,5 96,4 96,4 97,8 95,7 96

Mexico-AF273215 96 95,9 99,3 96,3 96,3 97,7 95,7 96

Thái Lan2000-AY102034 99,6 99,5 96 99,6 99,6 96,6 99 99,4

Đài Loan A-AY355306 99,6 99,5 96 99,5 99,6 96,6 99 99,4

Đài Loan B-AY355307 99,6 99,5 96 99,5 99,6 96,6 99 99,4

Đài Loan C-AY355308 96,1 96 99,5 96,4 96,4 97,9 95,7 96

Úc-GQ475529 94,4 94,3 94,3 94,7 94,7 92,7 92,3 94,6

Ấn Độ-GQ411199 96,7 96,7 95,3 96,8 96,8 95,9 95,9 96,3

Thái Lan 03-AY362547 98,3 98,2 96,2 98,3 98,5 96,8 97,8 98,2

Ecuador-AY362548 96 96 99,3 96,3 96,3 97,9 95,6 96

Trung Quốc-EF633688 96 95,9 99,3 96,3 96,3 97,7 95,6 95,9

Tanzania type B

AY124937 92 91,8 91,7 92,2 92,2 92,2 92,2 92

Úc type A-EU675312 86,7 86,7 86,8 86,9 87 87,8 87,4 86,8

Madagascar type A-

DQ228358 86 85,9 86 86,2 86,1 86,8 86,5 86,2

Phân tích so sánh các trình tự chủng IHHNV ở tôm sú nuôi ở Việt Nam và

các chủng trên thế giới, chủng IHHNV ở tôm ở Ninh Thuận, Vũng Tàu và các tỉnh

ở ĐBSCL có kí hiệu NT21, NT22, TG, BL, ST và BT có độ tương đồng rất cao

nhất với chủng phân lập ở Đài Loan A (AY355306), Đài Loan B (AY355307) và

Thái Lan 2000 (AY102034) (99-99.6%) kế đến là Thái Lan 2003 AY362547 (97-

87

98,3%), và có tương đồng tương đối cao với chủng của Hawaii, Đài Loan C,

Mexico, Ecuador, Ấn Độ và Trung Quốc (95,9-96,8%) và thấp hơn đối với chủng

IHHNV phân lập ở Úc GQ475529 (dưới 94,7%). Kết quả này cho thấy có thể chủng

IHHNV ở ĐBSCL có quan hệ gần với chủng ở Đài Loan A, B và Thái Lan 2003

(AY102034). Tuy nhiên, đối với chủng kí hiệu KG, mặc dù trình tự bộ gen của

chủng này không tương đồng cao với các chủng thu nhận ở các tỉnh ở Việt Nam và

các nước khác trên, nhưng khi so sánh trình tự của chủng này với các chủng khác

trên thế giới thì chủng này có trình tự nucleotide tương đồng cao so với chủng phân

lập ở Hawaii, Đài Loan C (99,5%), Mexico, Ecuador và Trung Quốc (99,3%). Có

trình độ tương đồng tương đối với các chủng của Đài Loan A, B và Thái Lan

(AY102034) trên 96%, và tương đối thấp với chủng ở Ấn Độ GQ411199 và Úc

GQ475529 (94,3-95,3%). Chứng tỏ trong chủng KG có nguồn gốc và có mối quan

hệ gần với nhóm Hawaii, Đài Loan C, Ecuador và Mexico Trong khi đó so sánh

chủng IHHNV ở Ninh Thuận, Vũng Tàu và ĐBSCL với các chủng chèn vào bộ gen

tôm Tanzania type B (AY124937), chủng IHHNV type A Madagascar (DQ228358),

Úc (EU675312), thì các chủng phân lập ở Việt Nam có độ tương đồng thấp với type

A (86,8%<) và có độ tương đồng cao hơn một ít so với type B 91-92%.

3.6. Phân tích chủng IHHNV đột biến thu nhận ở Vũng Tàu và Ninh Thuận

Trong quá trình phân tích các mẫu tôm thu tại các tỉnh Miền Trung và Miền

Nam, chúng tôi ghi nhận có một số mẫu chỉ cho kết quả dương tính với IHHNV với

mồi 309 F/R (OIE., 2009) mà không dương tính với mồi vnIHF/R. Đem những mẫu

này để nhân dòng và giải trình tự chúng tôi ghi nhận được 2 trình tự có kích thước

nhỏ hơn so với trình tự đã thu nhận trước đó trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL cũng như

trình tự có nguồn gốc từ Hawaii.

Sau khi giải trình tự, chúng tôi sẽ tiến hành phân tích vật liệu di truyền của

chủng IHHNV nhiễm trên 2 mẫu tôm sú poslarvae ở Miền Trung và một tôm bố mẹ

ở Vũng Tàu có kí hiệu NT22 và VT6. Sử dụng phần mềm DNASTAR Lasergene

V7.1.0, với chương trình phân tích cấu trúc di truyền cho thấy chủng IHHNV –

88

NT22 có kích thước 3172 bp, chủng IHHNV –VT6 có kích thước 3443 bp, trong đó

thành phần các bazơ nucleotide như sau trình bày ở bảng 7.3.

Bảng 7.3. Tóm tắt các thành phần nucleotide của trình tự bộ gen chủng IHHNV

Trình tự IHHNV

Thành phần nucleotide

% A % T % C % G % A + T % C + G

NT22 37,11 19,99 23,68 19,23 57,09 42,91

VT6 37,15 20,07 23,58 19,20 57,22 42,78

Cấu trúc của các ORF

Những nghiên cứu gần đây cho thấy, sự hiện diện virus IHHN type lây

nhiễm (còn gọi là IHHNV ngoại sinh) chèn vào gen tôm đã xác được phát hiện trên

tôm sú nuôi và tôm nước ngọt (Cherax quadricarinatus) của Châu Phi, Thái Lan và

Úc (Saksmerprome và ctv., 2011; Tang and Lightner, 2006; Rusaini và ctv., 2013)

và virus đốm trắng WSSV cũng được ghi nhận chèn vào gen tôm sú và tôm P.

japonicus (Huang và ctv., 2011) ; Dang và ctv., 2010; Koyama và ctv., 2010). Trên

tôm nước ngọt Úc, người ta nhận thấy có ít nhất 9 trình tự của nhân tố

Brevidensovirus-like ngoại sinh (EBreVE). Và xác định những trình tự chèn này có

độ tương đồng rất cao với đoạn mã hóa cho protein không cấu trúc (7-100%).

Bộ gen IHHNV – VT6 có cấu trúc gồm 3 ORF chính: ORF1 nằm ở bên trái

có chiều dài 2001 bp bắt đầu bằng codon ATG ở vị trí nt 189 và kết thúc ở mả

TAA ở vị trí 2189 mã hóa cho protein giả định (NS1) có chiều dài 666 a.a, ORF2

nằm ở giữa bao gồm 2 ORF nhỏ nằm gián đoạn với ORF nhỏ hơn dài 309 bp bắt

đầu ở vị trí nt 154 - 462 và ORF có kích thước dài hơn 681 bp bắt đầu ở vị trí nt 544

– 1224 mã hóa cho 2 protein giả định có kích thước là 226 a.a và 102 a.a, cuối cùng

là ORF3 có kích thước 990 bp bắt đầu ở vị trí nt 2131 - 3120. Mã hóa cho protein

vỏ (VP) có kích thước 329 a.a. Sự thay đổi 1 trình tự nucleotide (A) trong đoạn

ORF2 mã hóa cho protein giả định 2 (NS2) đã làm thay đổi cấu trúc đoạn ORF2 mã

hóa NS2. Khi so sánh một đoạn trình tự nucleotide trên đoạn ORF2 của chủng

IHHNV-VT6 với các chủng khác từ Hawaii và các chủng các nước châu Á trong

hình 7.12. Cho thấy có 1 trình tự nucleotide A đã bị thay thế cho nucleotid G và tạo

nên codon kết thúc TAG. Nếu lấy trình tự nucleotide của chủng virus lây nhiễm

89

JX840067 thu nhận từ Việt Nam làm chuẩn, thay thế nucleotide A ở vị trí nt 462

(hình 7.11) của bộ gen chủng IHHNV-VT6 bằng nucleotide G thì trình tự ORF2 sẽ

có độ tương đồng cao với ORF 2 với các chủng IHHNV lây nhiễm khác đã công bố.

Và kích thước protein giả định NS2 sẽ giống như các chủng đã công bố trước đó có

chiều dài 356 a.a. Trình tự của chủng IHHNV-VT6 sẽ có 3 ORF mã hóa cho protein

giả định NS1 là 666 a.a, NS2 là 356 a.a và protein VP 329 a.a. Kết quả này có thể là

do lỗi của giải trình tự hay sự đột biến của chủng này xảy ra. Tuy nhiên khi phân

tích kết quả giải trình tự đoạn gen có nucleotide này thì không có lỗi khi lắp ráp

contig của đoạn giải trình trình tự với mồi xuôi và mồi ngược. Chứng tỏ trình tự của

chủng VT6 có khả năng xảy ra đột biến cao. Kết quả này cũng giống như nghiên

cứu trước đó của Saksmerpromie và ctv (2010) cho rằng khi thay đổi một trình tự

nucleotide trong một trình tự sẽ làm thay đổi trình tự mã hóa cho các a.a và sẽ dẫn

đến sự biến đổi lớn trong các so sánh trình tự a.a. Tác giả cũng cho rằng chủng

IHHNV phân lập từ Ấn Độ GQ411199 có một trình tự chèn A vào vị trí 2442 so với

chủng tham chiếu chủng IHHNV mã số AF273215. Sự chèn này có thể chủng

IHHNV phân lập Ấn Độ có trình như một trình tự không chức năng của IHHNV

hoặc có thể sự sao chép bị lỗi. Vì vậy chủng IHHNV-VT6 cũng có thể sự sao chép

lỗi trong quá trình tổng hợp di truyền và cũng có thể chủng IHHNV này như một

chủng virus không hoàn chỉnh.

AY355306Taiwanb ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 1255

AF28266Hawaii ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 977

AY355308Taiwanc ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 811

AF273215Mexico ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 926

KienGiang ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAGCGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 897

GQ475529Ucnhiem ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 769

SocTrang ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 897

TienGiang ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 897

BacLieu ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGGACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 897

BenTre ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 897

AY355307Taiwanb ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 816

AY263547Tlan ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 809

EF633688Tquoc ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 809

GQ411199AnDo ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 975

NT222 ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 246

VT6 ACCTAGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAA 516

AY124937typeB ACCTGGGAATTCGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAAG 328

DQ228358typeA ACCTGGGAATACGAGAGGGAACAGGAAACGGAACAATTCAACTTGGAAGTGAATCAGAGG 328

****.*****:****************.***.**************************..

Hình 7.10. Trình tự thay đổi nucleotide (in đậm đỏ) ở vị trí nt 462 của bộ gen so

với các chủng IHHNV trong đoạn OFR2, vị trí A tô đậm trên nền vàng

90

Hình 7.11. Cấu trúc các ORF trên trình tự bộ gen của chủng IHHNV – VT6. Ba

khung đọc mở (ORF1, ORF2, ORF3) với vị trí và chiều dài của chúng.

Phân tích trình tự nucleotide của bộ gen của IHHNV – NT22 cũng có ít nhất 4

ORF chính, trong đó ORF1 trái nằm ở bên trái có chứa 2 ORF nhỏ nằm gián đoạn,

với ORF lớn dài 1035 bp bắt đầu ở vị trí nt 84 – 1118 mã hóa cho protein giả định

có kích thước 344 a.a; và ORF nhỏ hơn dài 654 bp nằm ở vị trí nt 1266 – 1919 mã

hóa cho protein giả định 217 a.a. ORF2 nằm ở giữa có chiều dài 681 bp bắt đầu ở vị

trí nt 274 – 954 mã hóa cho protein có kích thước 226 a.a, cuối cùng là ORF3 nằm ở

bên phải có chiều dài 990 bp nằm ở vị trí nt 1861– 2850 mã hóa cho protein vỏ có

kích thước 329 a.a hình 7.12.

Hình 7.12. Cấu trúc các ORF trên trình tự bộ gen của chủng IHHNV – NT22. Ba

khung đọc mở (ORF1, ORF2, ORF3) với vị trí và chiều dài của chúng

Theo nghiên cứu của Tang và ctv., (2003) khi phân tích trình tự so sánh giữa

các đoạn ORF thì không thấy sự thay đổi condon kết thúc mã hóa cho các protein

trên các đoạn ORF mà đã xác định. Cả ORF1 và ORF3 có cùng số amino acid trong

polypeptide giả định là 666 a.a được mã hóa từ đoạn OFR1 và protein vỏ có chiều

dài 329 a.a được mã hóa từ ORF3. Chiều dài 356 a.a của NS2 được mã hóa trên

ORF2 mà vùng này nằm chồng lắp trên đoạn ORF1. Tuy nhiên, khi phân tích so

sánh nucleotide với trình tự nucleotide OFR1 của các chủng IHHNV lây nhiễm

khác hình 7.13, chúng tôi nhận thấy chủng IHHNV-NT22 thấy, trình tự nucleotide

C đã thay đổi thành T ở vị trí nt 1118 và tạo thành mã kết thức TAG ở đoạn ORF1

91

của bộ gen IHHNV. Chính vì vậy đoạn ORF1 có 2 vùng mã hóa cho protein giả

định có kích thước 344 a.a và 217 a.a. Thêm vào đó, đoạn ORF2 mã hóa cho

protein giả định NS2 cũng có kích thước 226 a.a nhỏ hơn so với bộ gen thu nhận ở

ĐBSCL và Haiwaii 356 a.a. Chính vì vậy, chủng IHHNV đã có sự sự đột biến thay

thế trong trình tự nucleotide ở đoạn OFR1 dẫn đến thay đổi các trình tự a.a để mã

hóa cho các protein của chúng và chiều dài của chúng.

AY355306Taiwanb TCAATAAACTTGACGATGAAGAATATAAACAACTATGGACCCGTACCAGAGGACAATATA 2155

AF28266Hawaii TCAATAAACTTGACGATGAAGAATATAAACAACTATGGACCCGTACCAGAGGACAATATA 1877

AY355308Taiwanc TCAATAAACTTGACGATGAAGAATATAAACAACTATGGACCCGTACCAGAGGACAATATA 1711

AF273215Mexico TCAATAAACTTGACGATGAAGAATATAAACAACTATGGACCCGTACCAGAGGACAATATA 1826

KienGiang TCAATAAACTTGACGATGAAGAATATAAACAACTATGGACCCGTACCAGAGGACAATATA 1797

GQ475529Ucnhiem TCAATAAACTTGACGATGAAGAATACAAACAACTATGGACCCGTACCAGAGGACAATATA 1669

SocTrang TCAATAAACTTGACGATGAGGAATACAAACAGCTATGGACCCGCACCAGAGGACAATATA 1797

TienGiang TCAATAAACTTGACGATGAGGAATACAAACAGCTATGGACCCGCACCAGAGGACAATATA 1797

BacLieu TCAATAAACTTGACGATGAGGAATACAAACAGCTATGGACCCGCACCAGAGGACAATATA 1797

BenTre TCAATAAACTTGACGATGAGGAATACAAACAGCTATGGACCCGCACCAGAGGACAATATA 1797

AY355307Taiwanb TCAATAAACTTGACGATGAGGAATACAAACAGCTATGGACCCGCACCAGAGGACAATATA 1716

AY263547Tlan TCAATAAACTTGACGATGAAGAATACAAACAACTATGGACACGTACCAGAGGACAATATA 1709

EF633688Tquoc TCAATAAACTTGACGATGAAGAATACAAACAACTATGGACACGTACCAGAGGACAATATA 1709

GQ411199AnDo TCAATAAACTTGACGATGAGGAATACAAACAGCTATGGACCCGCACCAGAGGACAATATA 1875

NT222 TCAATAAACTTGACGATGAGGAATACAAATAGCTATGGACCCGCACCAGAGGACAATATA 1146

VT6 TCAATAAACTTGACGATGAAGAATACAAGCAACTATGGACCCGTACCAGAGGACAATATA 1416

AY124937typeB TCAATAAACTTGACGATGAAGAATACAAACAACTATGGACCCGTACTAGAGGACAATATA 1228

DQ228358typeA TTAATAAACTAGACGATGAAGAATACAAACAACTGTGGACACGTACAAGGGGACAATATA 1228

* ********:********.***** **. *.**.*****.** ** **.**********

Hình 7.13. Trình tự thay đổi nucleotide (in đậm đỏ) ở vị trí nt 1118 so với các

chủng IHHNV-NT22 trong đoạn OFR1.

Trong các nghiên cứu trước kia cho thấy, ít có sự biến động về trình tự bộ

gen trên các chủng IHHNV phân lập từ Châu Mỹ. Dựa trên trình tự phân tích

nucleotide đoạn gen của IHHNV có kích thước 2,9 kb (trình tự chứa tất cả 3 đoạn

ORF của IHHNV) của 14 chủng phân lập từ các khu vực Châu Mỹ không có sự đột

biến như mất hay chèn trình tự nào trong đoạn gen này của bộ gen. Trong 30

nucleotide thay đổi mã hóa cho protein được phát hiện trong ORFs của 14 chủng

này chỉ có 15 nucleotide thay đổi trình tự amino acid (7 trong trình tự ORF1, 1

trong trình tự ORF2 và 7 trong trình tự ORF3) nhưng chưa thấy sự thay đổi này đến

độc lực của virus (Tang và ctv., 2002). Điều này cho thấy có thể virus và tế bào chủ

đã đạt trạng thái cân bằng về gen liên quan đến độc lực mà không gây chết ở trên

tôm. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy các chủng IHHNV phân lập từ

Mexico, cho thấy có sự thay đổi lớn trình trình tự nucleotide bộ gen trong các các

quần thể virus ở nơi đây (Robles-Sikisaka và ctv., 2010). Mới đây, nghiên cứu về

đoạn gen mã hóa cho protein vỏ của IHHNV nhiễm trên tôm ở Philippine với các

92

chủng IHHNV phân lập trên tôm trước đó bằng phân tích phát sinh loài hơn. Chủng

IHHNV mới nằm trên một nhánh khác so với chủng đặc trưng trước ở nước này

(Caipang và ctv., 2011). Tương tự như nghiên cứu của Rusaini và ctv. (2013) trên

tôm nước ngọt (Cherax quadricarinatus) ở Úc cho thấy, những đoạn chèn của nhân

tố giống virus Brevidensovirus ngoại sinh có trình tự nucleotide có độ tương đồng

cao (70 - 100%) và tương đồng acid amin (34 - 100%) với IHHNV type lây nhiễm.

Chúng không thể tạo thành một bộ gen hoàn chỉnh của IHHNV bộ gen , nhưng có

thể được bắt nguồn từ một thành viên khác chưa xác định thuộc chi Brevidensovirus

nhưng có trình tự tương đồng nucleotide với IHHNV. Trình tự tích hợp lớn nhất của

virus vẫn còn giữ lại khung đọc mở của nó (ORF) với một số trình tự mã hóa

protein chức năng và codon khởi đầu nhưng không có codon kết thúc. Nổi bật nhất

tính năng của EBreVEs trong 9 trường hợp trên, đoạn (phần) trình tự của virus chèn

vào bộ gen vật chủ từ cùng một vùng của bộ gen của virus và hầu như nó bắt nguồn

từ vùng mã hóa cho protein không cấu trúc của virus tổ tiên, nhưng chúng không

thể được lắp ráp thành một bộ gen có trình tự bảo tồn. Điều này cho thấy chúng đã

trải qua 1 giai đoạn chèn hay mất đi trong suốt quá trình. Protein không cấu trúc có

thể đóng vai trò quan trọng trong DNA sao chép của virus và có nhiều khả năng

được bảo tồn hơn trong quá trình tiến hóa. Điều này cũng giống với chủng IHHNV

VT6 và IHHNV-NT22 , khi phân tích cho đoạn ORF1 với ORF lớn dài 1035 bp bắt

đầu ở vị trí nt 84 – 1118 mã hóa cho protein giả định có kích thước 344 a.a; và ORF

nhỏ hơn dài 654 bp nằm ở vị trí nt 1266 – 1919 mã hóa cho protein giả định 217 a.a.

Đây có điều thú vị, ngoài những chủng IHHNV thu nhận ở ĐBSCL, trình tự chủng

IHHNV-VT6, IHHNV-NT22 có sự khác biệt lớn về cấu trúc các đoạn ORF mã hóa

cho protein hình 7.13 và 7.14 và có thể chủng này là một virus chèn vào hay một

chủng khác mà trình tự tương đồng với chủng IHHNV lây nhiễm đã được biết. Và

cũng thể giải thích do quá trình tiến hóa và thích nghi của virus trên vật chủ ở

những vùng địa lý khác nhau.

93

3.7. Cây phát sinh chủng loài

Để xác định mối quan hệ di truyền giữa chủng IHHNV nhiễm trên tôm sú nuôi

ở Việt Nam và các trình tự đại diện khác trên thế giới. Chúng tôi sử dụng phần mềm

DNASTAR Lasergene V7.1.0, với chương trình phân tích đa trình tự MegaAli

(Clustal W). Kết quả phân tích khi so sánh được thể hiện ở hình 7.14.

Hình 7.14. Cây di truyền so sách trình tự nucleotide đoạn 2,9 kb của các chủng

IHHNV thu nhận tại các tỉnh ở ĐBSCL, Vũng Tàu, Ninh Thuận với các chủng

IHHNV trên ngân hàng gen thế giới bằng phần mềm MegAlign (DNASTAR

Lasergene V7.1.0). Tỷ lệ % của bootstrap từ 1000 lần.

Dựa trên cây di truyền sự biến động các trình tự nucleotide của các chủng

virus IHHNV hình 7.14 thì chủng IHHNV KG nằm trong nhánh của các chủng

Hawaii, Ecuador, Đài Loan C, Trung Quốc và Mexico. Trong khi đó một nhóm

khác IHHNV có kí hiệu ST, TG, BL và BT nằm cùng trong nhóm của chủng

IHHNV Thái Lan 2000, Đài Loan A và Đài Loan B. Đối với chủng IHHNV có kí

hiệu NT21, NT22 nằm giữa 2 nhóm IHHNV thu nhận ở ĐBSCL, Đài Loan A, B và

94

nhóm IHHNV phân lập trên tôm sú ở Thái Loan 2003 và Ấn Độ. Đối với chủng

VT6 nằm trong nhánh với nhóm IHHNV phân lập ở Nam Mỹ, Đài Loan C, Trung

Quốc và KG nhưng có trình tự tương đồng thấp 97,7% so với chủng IHHNV thu

nhận ở KG (>99%) .

Trong kết quả nghiên cứu này, đề tài đã phân lập nhiều bộ gen khác nhau ở các

khu vực khác nhau. Kết quả cho thấy, có ít nhất 3 type IHHNV khác nhau đã xác

định. Gồm IHHNV type A có độ tương đồng cao với type A phân lập ở

Madagascar. Nhóm IHHNV type lây nhiễm có kí hiệu ST, BL, BT, TG và NT21 có

độ tương đồng cao với type lây nhiễm 2 (gồm Đài Loan A, B và Thái Lan 2000) và

nhóm IHHNV type lây nhiễm KG, VT6 có độ tương đồng cao với type 1( gồm

Hawaii, Mexico, Ecuador, Trung Quốc và Đài Loan C).

95

NỘI DUNG II: LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU PHÁT HIỆN

IHHNV NHIỄM TRÊN TÔM SÚ NUÔI

1. Dòng hóa plasmid để tạo mẫu chứng dương

Sản phẩm khuếch đại DNA của IHHNV sau khi dòng hóa vào vector pGEM

T-easy và nhân lên trong vi khuẩn E. coli sẽ biểu hiện dưới dạng các khuẩn lạc mọc

trên môi trường agar LB, chọn 1 khuẩn lạc tiến hành phản ứng PCR nhằm mục đích

kiểm tra dòng tế bào E. coli JM 109 chứa vector pGEM T-easy-DNA IHHNV type

lây nhiễm. Theo hình 7.15 thì khuẩn lạc có sản phẩm khuếch đại đặc trưng IHHNV

type lây nhiễm (2589bp) và sáng rõ nhất.

Hình 7.15. Kiểm tra khuẩn lạc mang DNA IHHNV type lây nhiễm bằng PCR.

Giếng (+): Cặp mồi F1/77352R khuếch đại gen DNA IHHNV trên khuẩn lạc E.coli

mang plasmid có chứa đoạn gen IHHNV. M: thang DNA 100bp; (-): mẫu chứng âm

Dựa vào hình 7.15, chọn khuẩn lạc này nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có

bổ sung 100 μg/ml ampicilline để tăng sinh khối. Sau đó hút 815 μl dịch vi khuẩn

đã nuôi cấy trộn đều với 185 μl glycerol 80%, giữ chủng ở −80oC, phần còn lại tách

vector pGEM T-easy-IHHNV type lây nhiễm theo bộ kit Wizard®Plus SV

Minipreps của Promega, Mỹ.

Plasmid pGEM T- easy - DNA IHHNV type lây nhiễm được kiểm tra lại bằng

cách điện di trên gel agarose 1%. Theo hình 7.16 sau khi điện di trên gel agarose

1%, kết quả cho thấy plasmid tinh sạch cho tín hiệu với kích thước dự đoán 5605 bp

tương đương với kích thước plasmid và đoạn DNA IHHNV type lây nhiễm.

B A

2589 bp

96

Plasmid này được sử dụng cho khảo sát các qui trình LAMP và các phản ứng PCR

khác trong thí nghiệm sau.

Hình 7.16. Kết quả điện di plasmid sau khi tinh sạch. Giếng plasmid: Plasmid

pGEM T-easy - IHHNV type lây nhiễm sau khi tinh sạch có kích thước 5604 bp. M:

thang DNA 100 bp

2. Đo nồng độ plasmid mang gen DNA IHHNV type lây nhiễm

Để tính được số lượng copy trong 1 phản ứng chúng tôi tiến hành đo OD của

plasmid sau khi tinh sạch. Kết quả đo OD của plasmid pGEMT-easy-IHHNV type

lây nhiễm được thể hiện trong bảng 7.4 với OD 260/280= 1,9

Bảng 7.4. Kết quả đo OD của plasmid pGEMT-easy-IHHNV type lây nhiễm

Số lần đo Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5

OD (ng/ml) 4,54 x106 4,53 x106 4,54 x106 4,53 x106 4,52 x106

Chiều dài Plasmid L base (kể cả đoạn DNA chèn vào): (3015 + 437) = 5604

bp

Khối lượng plasmid với chiều dài 5604 bp là: (650 × 109 × 5604) ng

Theo định luật Avogadro, 1 mole sẽ có (6.022 × 1023)

Dung dịch plasmid DNA có nồng độ C = ([4,54 + 4,53 + 4,54 + 4,53 +

4,52]x 106) / 5 = 4,53 x 106ng/ml

Số bản sao plasmid DNA có trong dung dịch này sẽ là: N (bản sao/ml) =

((6.022 × 1023) × ,53 x 106) / (650 × 109 × 5604)= 75 × 109 (bản sao/ml)

Như vậy chúng tôi có 75× 106 (bản sao/µl).

B

5604 bp

97

3. Ứng dụng và phát triển phương pháp LAMP phát hiện virus IHHNV

3.1. Quy trình LAMP phát hiện IHHNV (He và Xu, 2011)

a. Thử nghiệm điều kiện tác giả công bố

Theo như công bố của tác giả He và Xu (2011), với đều kiện phản ứng tối ưu

như trên thì sẽ thu được sản phẩm khuếch đại dạng thang, nhiều băng vạch rõ ràng ở

mẫu nhiễm virus IHHNV. Tuy nhiên, kết quả thử nghiệm cho thấy ở giếng N và

giếng DNA tôm có băng khuếch đại chạy dài tạo nền phát sáng dưới đèn UV và chỉ

có 1 băng sản phẩm khuếch đại kí sinh nhỏ mà kích thước dưới 100 bp so với thang

chuẩn hình 7.17. Chứng tỏ có thể mồi tự bắt cặp khuếch đại trong mẫu nước khi

không có DNA đích. Tương tự ở chứng dương IHHNV, khi nhìn vào giếng IHHNV

thì không bất cứ sản phẩm khuếch đại nào cả chỉ có băng vạch giống như mẫu âm

(N), chỉ có giếng IHHNV chính giữa có sản phẩm khuếch đại, tuy nhiên không rõ

ràng. Lặp lại nhiều lần thí nghiệm như vậy trên mẫu nước, DNA tôm và DNA

IHHNV. Nhưng kết quả cũng cho ra những vạch sáng và băng vạch không rõ ràng

trên tất cả những mẫu này. Vì vậy chúng tôi cho rằng lặp lại phản ứng LAMP không

thành công giống như công bố.

Hình 7.17 Kết quả thử nghiệm điều kiện chuẩn quy trình LAMP phát hiện IHHNV

(He và Xu, 2011). Giếng IHHNV: thử nghiệm trên mẫu tôm sú nhiễm IHHNV được

cung cấp bởi Đại học Arizona, Mỹ, Giếng N: mẫu nước và Giếng DNA tôm: mẫu

DNA tôm sú không nhiễm IHHNV.

98

b. Khảo sát nồng độ MgSO4 và dNTPs

Nồng độ MgSO4 và dNTPs được cho là có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng

khuếch đại và độ nhạy của phản ứng trong qui trình LAMP. Theo nhiều nghiên cứu

của các tác giả thì dNTPs và MgSO4 có ảnh hưởng đến kết quả khuếch đại. Bốn loại

nucleotide của dNTPs là thành phần cấu thành chuổi DNA bởi sự tồng hợp

polymerase. Nồng độ dNTPs trong một phản ứng LAMP thường 1,4mM cho kết

quả khuếch đại tốt còn nồng độ 2,1mM trở lên thì ức chế phản ứng khuếch đại hoặc

nồng độ 0,2 mM thì sản phẩm thường có kết quả không rõ ràng hoặc không có sản

phẩm. Ion Mg2+ là nhân tố thiết yếu cho enzyme polymerase. Nồng độ Mg2+ cho

phản ứng LAMP có hiệu quả nhất là 6- 8mM. Nồng độ Mg2+ thì phản ứng sẽ bị ức

chế vì nó ức chế enzyme hoạt động, ngăn sự ổn định sợi đôi DNA và tách mạch

trong quá trình phản ứng. Do đó chúng tôi bố trí thí nghiệm thay đổi các nồng độ

dNTPs và Mg2+ có sự khác biệt nào không so với lần thử nghiệm lặp lại qui trình

của tác giả công bố. Kết quả thử nghiệm thể hiện ở hình 7.18 và 7.19.

Hình 7.18. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+. Giếng (+): Mẫu tôm nhiễm

IHHNV; Giếng (-): mẫu tôm không nhiễm IHHNV

Chúng tôi thử lặp lại thí nghiệm LAMP trên DNA của IHHNV và mẫu nước ở các

nồng độ Mg2+ và dNTP khác khau. Tuy nhiên, kết quả khảo sát không như mong

đợi. Tất cả đều âm tính không cho bất cứ một sản phẩm nào cả.

99

Hình 7.19. Kết quả thử nghiệm nồng độ dNTPs. Giếng (+): Mẫu tôm nhiễm

IHHNV; Giếng (-): mẫu tôm không nhiễm IHHNV

Theo kết quả hình 7.18 và 7.19, chúng tôi đã khảo sát nồng độ Mg2+ và dNTPs

thường được sử dụng, tuy nhiên chúng tôi không thu được băng khuếch đại đặc

trưng của qui trình LAMP ở bất kỳ nồng độ khảo sát nào. Kết quả trên cho thấy với

quy trình LAMP do tác giả He và Xu (2011) không hoạt động trên hóa chất ở phòng

thí nghiệm dù thay đổi thành phần ứng.

c. Thử nghiệm nhiệt độ và thời gian ủ

Theo nghiên cứu của tác giả thì nhiệt độ ủ để phản ứng có thể xảy ra là 55oC

đến 65oC và hoàn toàn không xảy ra khi nâng nhiệt độ lên 68oC. Nhiệt độ tối ưu mà

tác giả đã ghi nhận được là 64oC. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ và thời gian ủ được

nhóm nhiên cứu chúng tôi thực hiện lại trong hình 7.20 cho thấy phản ứng LAMP

không xảy ra nên không thu được băng sản phẩm đặc trưng như tác giả đã công bố.

Ở các phương pháp PCR truyền thống, quá trình để khuếch đại được tính theo

chu kỳ lặp lại quá trình nhân bản và thường từ 30-40 chu kỳ và quá trình này mất

khoảng 150-180 phút để có lượng sản phẩm khuếch đại tối đa nhằm đạt được độ

nhạy tốt nhất của phương pháp chẩn đoán. Trong phương pháp LAMP thời gian ủ

do các tác giả công bố khoảng thời gian tối thiểu cần thiết là 45 phút và kết quả có

thể quan sát tốt sau 75 phút thực hiện phản ứng. Tuy nhiên kết quả khảo sát thời

gian phản ứng của chúng tôi kéo dài đến 80 phút mà vẫn không thu được sản phẩm

khuếch đại đặc trưng.

100

Hình 7.20. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ phản ứng. Giếng (+): Mẫu DNA IHHNV;

Giếng (-): mẫu tôm không nhiễm IHHNV

Trong nghiên cứu này, mặc dù chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm giống với

tác giả công bố, lặp lại nhiều lần và thậm chí thay đổi nhiều thông số khuếch đại của

qui trình LAMP như thời gian, thành phần phản ứng thay đổi mới như Bst

polymerase, dNTP, Mg2+ và thay đổi mồi mới. Tuy nhiên, kết quả thu được phản

ứng LAMP của mẫu chứng dương là lúc cho âm tính lúc cho dương tính và mẫu đối

chứng âm cũng tương tự. Kết quả này cho thấy áp dụng qui trình LAMP theo He và

Xu không thành công.

3.2. Quy trình LAMP phát hiện IHHNV tự thiết kế

Trong nghiên cứu ứng dụng chúng tôi không thành công trong việc phát triển

qui trình để thử nghiệm trên hóa chất của Việt Nam chẩn đoán trên DNA của

IHHNV. Vì vậy chúng tôi tiến hành thiết kế các mồi mới của qui trình LAMP để

phát hiện qui trình này chẩn đoán IHHNV trên tôm sú nhằm mục đích bổ sung các

qui trình chẩn đoán mới trong việc phát hiện IHHNV.

Thông thường, bộ mồi của kỹ thuật LAMP gồm từ 4-6 cặp mồi. Bộ mồi gồm

có một cặp mồi dùng tách dòng gen, một bộ mồi trong và một bộ mồi ngoài. Những

cặp mồi này thường được thiết kế dựa trên phần mềm PrimerExplorer V4. Trong

nghiên cứu này, vùng khuếch đại của gen IHHNV type lây nhiễm (AF218266) là

101

106-318. Trình tự bắt cặp vị trí các mồi đã trình bày trong mục VI phương pháp,

Phần 2. Mục 2.2.

a. Thử nghiệm điều kiện chuẩn

Chúng tôi thiết kế mồi cho qui trình LAMP phát hiện IHHNV dựa trên trình

tự nucleotide của IHHNV trong ngân hàng gen (Genbank AF218266). Trình tự này

khuếch đại ở vùng ORF1 mã hóa cho protein giả định 1. Kết quả khuếch đại cho

thấy chạy trên mẫu dương IHHNV đều cho kết quả dương tính, mẫu âm không có

sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại.

Hình 7.21. Kết quả thử nghiệm điều kiện chuẩn quy trình LAMP thiết kế phát hiện

IHHNV, A: Giếng (+): thử nghiệm trên mẫu DNA IHHN, Giếng (-) mẫu tôm không

nhiễm IHHNV và mẫu nước; B: Kết quả lặp lại thí nghiệm A; Giếng M: Thang DNA

(100bp)

Ở hình 7.21 có thể quan sát thấy sự xuất hiện băng vạch sản phẩm khuếch

đại trên mẫu DNA của IHHNV, sản phẩm khuếch đại có kích thước nhỏ nhất theo

thiết kế là 200 bp. Tuy nhiên khi lặp lại thí nghiệm thì băng vạch sản phẩm khuếch

đại trên cả mẫu DNA tôm không bệnh và mẫu nước, băng vạch không đúng với

thiết kế ban đầu hiện tượng này thường xuyên xuất hiện trong thí nghiệm lặp lại

trên các mẫu không bệnh khác nhau.

b. Thử nghiệm nhiệt độ ủ

Nhiệt độ hoạt động của Enzyme Bst polymerase hoạt động tối ưu nhất từ

nhiệt độ 60-65oC (theo hướng dẫn nhà sản xuất). Vì vậy chúng tôi xem trong phản

A

B

102

ứng LAMP chúng tôi thiết kế hoạt động như thế nào. Dãy nhiệt độ được chọn trong

phản nứng này là 58, 60, 62, 64, 66 và 68 oC. Kết quả thu được hình 7.22.

Hình 7.22. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ ủ. Giếng (+): DNA của IHHNV; Giếng (-):

mẫu tôm không nhiễm IHHNV.

Kết quả thử nghiệm bộ mồi tự thiết kết cho thấy phản ứng cho kết quả ở

nhiệt độ 58-62 oC. Tuy nhiên, bắt đầu nhiệt độ 64 oC trở lên 68 oC thì phản ứng

không cho kết quả sản phẩm khuếch đại. Kết quả này có thể mồi hoạt động chưa tối

ưu hóa hoặc là không ổn định của phản ứng LAMP. Vì vậy chúng tôi lặp lại trên

các dãy nhiệt độ và thêm 2 dãy nhiệt độ 63 oC, 64 oC và 65 oC khác thì kết quả phản

ứng cho thấy ở nhiệt độ khảo sát trước và 2 nhiệt độ mới 63 oC và 64 oC phản ứng

vẫn cho sản phẩm khuếch đại và không khuếch đại ở 65 oC. Vì vậy chúng tôi chọn

nhiệt độ phản ứng LAMP của mồi thiết kế là 62 oC.

c. Thử nghiệm nồng độ MgSO4 và dNTPs

Sau khi có kết quả khảo sát nhiệt độ, chúng tôi chọn nhiệt độ thích hợp nhất

của phản ứng LAMP cho khảo sát các điều kiện phản ứng khác để tối ưu. Phản ứng

được giữ nguyên các thành phần phản ứng LAMP và chỉ thay đổi nồng độ dNTPs

khác nhau, 0.2mM, 0.4mM, 0.6mM, 0.8mM, 1mM, 1.2mM, 1.4mM và 1.6mM và

tiến hành trên 3 lần lặp lại trên mẫu dương và mẫu đối chứng âm (nước). Kết quả

hình 7.23 khảo sát cho thấy phản ứng LAMP có tín hiệu khuếch đại ở nồng độ

dNTPs là 1mM -1.6mM. Trong đó 1.2 mM có tín hiệu rõ nhất. Vì vậy chúng tôi

chọn nồng độ dNTPs 1.2 mM là nồng độ tối ưu cho phản ứng LAMP thiết kế.

103

Hình 7.23. Kết quả phản ứng LAMP khảo sát các nồng độ dNTPs (0.2 mM-1.6 mM)

khác nhau trên mẫu DNA của IHHNV và mẫu nước

Như đã nói trên Mg2+ là phân tử cần thiết cho enzyme Bst polymerase hoạt

động. Trong khảo sát này chúng tôi cũng lặp lại 3 lần trên mẫu dương và 1 đối

chứng âm với nồng độ Mg2+ là 4 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM và 12 mM. Kết quả

khảo sát cho thấy, phản ứng hoạt động tốt nhất ở nồng độ Mg là 8 mM hình 7.24.

Kết quả này phù hợp với rất nhiều nghiên cứu LAMP chẩn đoán IHHNV (Arunrus

và ctv., 2011)

Hình 7.24. Kết quả khảo sát Mg2+ (ở các nồng độ 4, 6, 8, 10 và 12 mM) trong phản

ứng LAMP trên DNA IHHNV (+) và mẫu nước (-). Thí nghiệm lặp lại 3 lần trên

mẫu chứng dương.

104

d. Thử nghiệm thời gian ủ

Các thử nghiệm thời gian ủ để phản ứng LAMP xảy ra đã được nghiên cứu

rất nhiều trên các loài virus gây bệnh trên tôm. Thời gian ủ thích hợp cho 1 phản

ứng xảy ra tối ưu ở khoảng 45-70 phút. Vì vậy chúng tôi chọn dãy thời gian rộng

hơn là 15, 30, 45, 60 và 75 phút. Kết quả thử nghiệm trên mẫu dương và mẫu nước

ở hình 7.25. Kết quả cho thấy thời gian cho sản phẩm là 45 phút và sản phẩm

khuếch đại rõ ràng ở 60 phút. Chính vì vậy chúng tôi chọn thời gian ủ là 60 phút

cho 1 phản ứng.

Hình 7.25. Kết quả thử nghiệm thời gian ủ (15, 30, 45, 60 và 75 phút). Giếng (+):

Mẫu DNA IHHNV; Giếng (-): nước .

e. Thử nghiệm qui trình sau khi khảo sát

c.

Hình 7.26. Kết quả thử nghiệm qui trình LAMP thiết kế sau khi tối ưu hóa. A: Lặp

lại trên mẫu DNA IHHNV và mẫu nước; Giếng (+): mẫu DNA IHHNV; Giếng (-):

mẫu nước. B: Kết quả phản ứng LAMP trên nồng độ DNA IHHNV pha loãng 10-1-

10-10

A

B

105

Sau khi khảo nghiệm các điều kiện phản ứng LAMP phát hiện IHHNV type

lây nhiễm, với qui trình như sau: phản ứng có tổng thể tích là 25 μl với 3 μl dNTPs

10 mM (Promega, Mỹ), 2.5 μl dung dịch đệm phản ứng 10X (200 mM Tris–HCl pH

8.8, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100), 1.5μl

MgSO4 (100 mM), 8U Bst DNA polymerase (Neb, Mỹ), 2.5 μl Betain 5M (Sigma,

Mỹ). Hút 1ul mẫu DNA IHHNV cho vào 24 ul hỗn hợp phản ứng nêu trên và ủ ở

62oC trong 60 phút. Được thực hiện lặp lại 2 lần trên nồng độ pha loãng DNA

IHHNV (10-1 - 10-10) và trên một loạt nước cất. Kết quả hình 7.26 A và 7.26 B. Ở

hình 7.26 A mẫu nước không có bản mẫu mà sau khi phản ứng vẫn cho ra 1 số mẫu

có băng vạch dương tính. Trong khi đó ngược lại mẫu DNA IHHNV pha loãng thì

kết quả không cho ra sản phẩm khuếch đại. Chứng tỏ mặc dù đã khảo sát tối ưu 1 số

điều kiện của phản ứng, phản ứng LAMP thiết kế cũng không ổn định và kết quả

không đủ tin cậy để áp dụng hoặc phát triển để chẩn đoán IHHNV nhiễm trên tôm.

Qua 2 bố trí thử nghiệm phương pháp LAMP (ứng dụng và phát triển) phát hiện

IHHNV type lây nhiễm cho thấy qui trình LAMP chẩn đoán IHHNV vẫn chưa ổn

định và không đủ tin cậy trong chẩn đoán IHHNV nhiễm trên tôm sú. Chính vì vậy,

chúng tôi tiến hành phát triển qui trình PCR để phát hiện IHHNV type lây nhiễm

trên tôm.

4. Thiết kế mồi cho qui trình multiplex PCR

Hiện nay có rất nhiều trình tự mồi được thiết kế trên trình tự bộ gen của chủng

IHHNV type lây nhiễm của các nhà khoa trên thế giới được công bố, trong đó

những cặp mồi do OIE công bố như mồi 392F/R, 389F/R, 77012F/77353R và

309F/R chẩn đoán IHHNV trên động vật thủy sản có giá trị hiệu lực chẩn đoán cao

nhất. Tuy nhiên, khi so sánh trình tự những mồi 392F/R, 389F/R, 77012F/77353R

với trình tự gen IHHNV type A/B cho thấy mồi 389F/R thì trình tự mồi xuôi và mồi

ngược đều bắt 100% với genome IHHNV type A/B, mồi 392 có mồi xuôi khác 2

nucleotidecleotide đối với genome type A và 1 nucleotide khác với genome type B.

Còn mồi ngược bắt cặp hoàn toàn tương đồng 100%. Cặp mồi 77012F/77353R, mồi

106

xuôi có 4 nucleotide khác và mồi ngược có chỉ có 1 nucleotide khác genome

IHHNV type A. Đối với type B, mồi ngược bắt cặp 100% và mồi xuôi chỉ có 1

nucleotide khác biệt. Vì vậy, những mồi này có thể khuếch đại được trình tự gen

của IHHNV type A/B và cả trình tự type lây nhiễm. Hơn nữa, có một vài nghiên

cứu cho rằng có sự chèn ngẫu nhiên của trình tự gen IHHNV type lây nhiễm vào bộ

gen của tôm. Những trình tự chèn này là trình tự đích của những cặp mồi được OIE

khuyến cáo (309F/R) sử dụng cũng như bộ kít thương mại đã có trên thị trường (IQ

kít 2000) dẫn đến kết quả chẩn đoán dương tính giả. Để phân biệt được những

IHHNV type lây nhiễm chèn ngẫu nhiên đoạn gen và IHHNV type lây nhiễm thật

thì sử dụng ít nhất 3 qui trình nested PCR để phát hiện 1 mẫu tôm nhiễm IHHNV

type lây bệnh thực (Saksmerprome và ctv., 2011). Từ những hạn chế về khả năng

phân biệt chủng IHHNV type lây nhiễm và type A/B của những mồi OIE công bố

và IHHNV type nhiễm chèn ngẫu nhiên, đề tài nghiên cứu qui trình multiplex PCR

có thể phân biệt và đặc hiệu cho IHHNV type lây nhiễm và IHHNV chèn vào gen

tôm.

Hình 7.27. So sánh trình tự mồi thiết kế với trình tự IHHNV type A và B bằng phần

mềm ClustalW2

So sánh mồi này với trình tự IHHNV type lây nhiễm cho thấy chúng bắt cặp

100% với trình tự của chúng. Trong khi đó so sánh với trình tự IHHNV type A/B,

với mồi vnIHF có ít nhất 5 trình tự nucleotide khác biệt đối với trình tự IHHNV

107

type A/B, mồi vnIHR có 12 trình tự nucleotide khác biệt với đối với type A/B (hình

7.27). Trình tự mồi thiết kế được trình bày ở bảng 6.4.

4.1. Thiết lập qui trình Multiplex PCR phát hiện IHHNV chủng lây nhiễm

Ở đây chúng tôi dựa trên trình tự của bộ gen IHHNV (JX840067) thu nhận

trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL chúng tôi thiết kết 1 phản ứng khuếch đại cùng một lúc

2 vùng của bộ gen IHHNV có ít nhất 2 sản phẩm. Một vùng có kích thước là 997 bp

từ vị trí 622-1618 nt và vùng 2 có kích thước là 309 bp từ vị trí 1936-2244 nt của

bộ gen IHHNV type lây nhiễm thật. Trong trường hợp nếu mật độ virus nhiễm cao,

phản ứng Multplex PCR có một sản phẩm có kích thước khoảng 1623 bp từ vị trí

622-2244. Như vậy qui trình Multiplex này có thể khuếch đại gần 2/3 trình tự bộ

gen của IHHNV type lây nhiễm. Dựa trên những thông số của các qui trình chẩn

đoán IHHNV nhiễm trên tôm và những thông số kỹ thuật mà phần mềm thiết kế cho

kết quả, chúng tôi thiết lập qui trình thử nghiệm PCR trên mồi vnIHF/R, kết quả 4

lần lặp lại đều cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 997 bp từ vị trí 622-1618 của

bộ gen JX840067 (hình 7.28A). Kết quả này phù hợp với dự đoán của thiết kế ban

đầu. Sau khi có kết quả mồi thiết kế hoạt động trong phản ứng, chúng tôi lồng ghép

hai mồi vnIHF/R và 309F/R (OIE, 2009) để phát triển thành quy trình Multiplex

PCR chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm. Mục đích sự lồng ghép này là nhằm nâng

cao khả năng chuyên biệt của phản ứng để phát hiện type virus chèn và type virus

thật. Thử nghiệm trên 3 loại mẫu: mẫu DNA của IHHNV, mẫu DNA tôm và mẫu

nước. Kết quả sau phản ứng, sản phẩm khuếch đại trên mẫu đối chứng dương có tín

hiệu rõ và kích thước tương ứng với 2 kích thước 997 bp và 309 bp so với thang

DNA. Mẫu DNA tôm không có tín hiệu nên không nhiễm IHHNV type lây nhiễm.

Mẫu âm (nước cất vô trùng) không khuếch đại. Chứng tỏ quy trình Multiplex PCR

hoạt động tốt trên DNA của IHHNV hình 7.28B.

108

Hình 7.28. Kết quả điện di khảo sát sự hoạt động của mồi thiết kế vnIHF/R và kết

hợp mồi vnIHF/R & 309F/R. Hình (A): Kết quả khảo sát trên cặp mồi thiết kế.

Giếng 2-5: mẫu DNA của IHHNV lặp lại 4 lần; giếng (-): mẫu nước; giếng 1: DNA

tôm nhiễm IHHNV type A/B; giếng M: thang DNA 100 bp. Hình (B): Kết quả sản

phẩm phản ứng kết hợp 2 mồi trong phản ứng Multiplex PCR; Giếng (-): mẫu nước,

giếng tôm: DNA tôm; giếng (+): DNA virus IHHN type lây nhiễm; giếng M: thang

DNA 100 bp.

4.2. Khảo sát các điều kiện phản ứng

Trong phản ứng PCR, nồng độ dNTP quá cao sẽ liên kết với Mg2+ sẽ làm phản

ứng giảm hiệu suất, ngược lại nồng độ dNTP quá thấp sẽ làm giảm hiệu quả nhân

bản dẫn đến lượng sản phẩm khuếch đại PCR. Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố

ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của quá trình PCR. Mg2+ là cofactor

cần cho sự hoạt động của enzyme polymerase. Theo hình 7.29A, sau khi điện di

trên gel agarose 1.5%, kết quả cho thấy cả 5 lô thí nghiệm đều phát hiện IHHNV

type lây nhiễm ở nồng độ pha loãng thấp nhất là 10-6, nhưng tại độ pha loãng này

thì lô có nồng độ 1mM cho tín hiệu rất yếu, lô có nồng độ 2,5 và 3mM thì có tín

hiệu sáng hơn lô có nồng độ 1mM nhưng vẫn mờ do nồng độ MgCl2 cao. Ở cả 3 lô

thí nghiệm có nồng độ 1,5 và 2 mM tín hiệu ở độ pha loãng 10-6 rõ như nhau. Phản

ứng xảy ra trong điều kiện tối ưu nhất, chúng tôi chọn nồng độ MgCl2 là 1,5 mM

làm nồng độ tối ưu sử dụng. Vậy nồng độ MgCl2 1,5 mM là thích hợp nhất với quy

trình mới. Thiết lập lại nồng độ MgCl2 cho quy trình PCR với cặp mồi thiết kế chẩn

A

A

997 bp 997 bp

309 bp

309 bp

109

đoán IHHNV type lây nhiễm là 1,5 mM. Áp dụng nồng độ này cho các nghiên cứu

tiếp theo qui trình này.

Hình 7.29. Kết quả tối ưu nồng độ dNTP và Mg2+ của phản ứng multiplex PCR

thiết kế chẩn đoán IHHNV type truyền nhiễm với cặp mồi vnIHF/R và 309F/R. Hình

(A): Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+, giếng 4-6: mẫu pha loãng 10−4→10−6, giếng

M: thang DNA 100bp, giếng (-): mẫu nước. Hình (B): Kết quả khảo sát nồng độ

dNTP, giếng 4-6: mẫu pha loãng 10−4→10−6,, giếng M: thang DNA 100bp; giếng

(−): mẫu nước.

Trong phản ứng PCR, nồng độ dNTP quá cao sẽ liên kết với Mg2+, Mg2+ là

một ion rất cần cho sự hoạt động của enzyme tổng hợp polymerase, nồng độ dNTP

quá thấp sẽ làm giảm hiệu quả nhân bản dẫn đến lượng sản phẩm khuếch đại PCR

thấp vì vậy mà sẽ ảnh hưởng tới phản ứng tổng hợp. Do đó để phát triển quy trình

chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm cần tối ưu nồng độ dNTPs (dATP, dCTP, dGTP,

dTTP). Theo hình 7.29B, sau khi điện di trên gel agarose 1.5 %, kết quả cho thấy

với cùng một lượng bản mẫu DNA đích trong các lô phản ứng nhưng ở lô nồng độ

dNTP 0.4 mM không cho tín hiệu do nồng độ dNTPs quá cao, 0.05, 0.1 và 0.2 mM

đều cho tín hiệu ở nồng độ pha loãng thấp nhất 10-6, nhưng riêng ở lô 0.2 mM sản

phẩm khuếch đại xuất hiện với băng chỉ thị rõ nhất. Vậy nồng độ dNTPs 0.2 mM là

thích hợp nhất với quy trình mới. Vậy nồng độ Mg2+ và dNTP thích hợp cho phản

ứng Multiplex PCR là 1,5 mM và 0,2mM.

4.3. Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện đóng vai trò quan trọng trong phát triển các quy trình PCR

chẩn đoán bệnh virus. Thông thường các kỹ thuật PCR một bước cho phép phát

997 bp

309 bp 997 bp

309 bp

110

hiện được trên 1000 bản sao/phản ứng. Vì vậy để khảo sát giới hạn phát hiện của

phản ứng PCR thiết kế. Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ nhạy của phản ứng

Multiplex PCR với dãy pha loãng Plasmid pGEM T-easy - IHHNV trong dung dịch

ly trích DNA tôm không mang virus IHHN đã xác định. Mục đích kết hợp DNA của

tôm và Plasmid pGEM T-easy – IHHNV như là mẫu tôm nhiễm được bao nhiêu

bản copy của virus sau khi ly trích DNA. Kết quả thể hiện ở hình 7.19. Sau điện di

cho thấy, sản phẩm khuếch đại xuất hiện băng đặc trưng cho sản phẩm khuếch đại

của IHHNV type lây nhiễm (997 bp và 309 bp), với độ sáng giảm dần tương ứng

với mức độ pha loãng dần từ 10−1 đến 10−15 tương ứng 75 × 105 bản sao/μl đến 7.5 ×

10-7 bản sao/μl của mẫu (mức độ phát hiện thấp nhất ở 75 bản sao/μl), các mẫu pha

loãng từ 10−8 đến 10−15 không có tín hiệu (hình 7.30).

Hình 7.30. Kết quả khảo sát độ nhạy lần 1 của quy trình multiplex PCR với cặp mồi

thiết kế chẩn đoán virus IHHN type lây nhiễm dựa trên cặp mồi vnIHF/R và 309F/R

với dãy pha loãng bậc 10 trên DNA tôm không nhiễm IHHNV. Giếng (-): mẫu nước.

Giếng 1-15: dãy pha loãng 10−1→10−15. Giếng M: thang DNA 100 bp

4.4. Kết hợp mồi nội trong phản ứng Multiplex PCR

Trong chẩn đoán virus, các phương pháp chẩn đoán PCR thường sử dụng các

mồi thiết kế một cặp mồi để khuếch đại một trình tự DNA của vật chủ. Nhằm để

khắc phục kết quả âm tính giả do sai xót trong quá trình phân tích. Vì vậy, thí

nghiệm được thực hiện trong phản ứng Multiplex PCR kết hợp với cặp mồi deca-

20a2, deca-20s9 phát hiện gen của nhóm giáp xác mười chân (CSIRO, 2008) ở bảng

6.4. Kết quả khảo sát trên mẫu DNA tôm có chứa plasmid pGEM T-easy – IHHNV

cho thấy phản ứng sau khi điện di gel agarose 1,5% xuất hiện băng đặc trưng cho

997 bp

309 bp

111

sản phẩm khuếch đại của IHHNV (997 bp và 309 bp), đồng thời sản phẩm khuếch

đại của DNA tôm cũng xuất hiện với sản phẩm có kích thước 240 bp, với mẫu

dương tính thì không xuất hiện sản phẩm mồi nội, mẫu nhiễm nhẹ hoặc chỉ có DNA

tôm thì mồi nội xuất hiện vạch rõ (hình 7.31).

Hình 7.31. Kết quả khảo sát độ nhạy lần 2 của quy trình multiplex PCR mới chẩn

đoán virus IHHN dựa trên cặp mồi vnIHF/R và 309F/R, kết hợp mồi đối chứng nội

với dãy pha loãng bậc 10 trên DNA tôm không nhiễm IHHNV. Giếng (-): mẫu nước.

Giếng 1-15: dãy pha loãng 10−1→10−15. Giếng M: thang DNA 100 bp.

4.5. So sánh qui trình Multiplex PCR với các qui trình khác

Để đánh giá độ nhạy của quy trình multiplex PCR với mồi tự thiết kế vnIHF/R,

chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu DNA của IHHNV hoặc plasmid DNA IHHNV

type lây nhiễm theo bậc 10 và tiến hành bố trí thí nghiệm phản ứng PCR song song

với quy trình OIE (2012) đã công bố với cặp mồi 77012F/77353R và quy trình

nested IQ 2000 (Đài Loan). Kết quả hình 7.32 cho thấy quy trình thiết kế với quy

trình OIE (2012) đều cho băng vạch trên gel sau khi điện di ở nồng độ DNA

IHHNV pha loãng ở 10-7 hình 7.32 A và 7.32 B. Do đó, quy trình của chúng tôi

thiết kế có độ nhạy tương đương với quy trình OIE đã công bố.

997 bp

309 bp

240 bp

112

Hình 7.32. Kết quả so sánh độ nhạy của quy trình multiplex PCR. Hình A: Quy

trình mulplex PCR chẩn đoán virus IHHN dựa trên cặp mồi tự thiết kế vnIHF/R và

309F/R với dãy pha loãng bậc 10, giếng 1-15: dãy pha loãng10-1→10-15; M: thang

DNA 100bp; giếng (-): mẫu nước. Hình B: Quy trình chẩn đoán virus IHHN dựa

trên cặp mồi 77012F/77353R của OIE, (2009) với dãy pha loãng bậc 10, từ 10-

1→10-12 là dãy pha loãng; M: thang DNA 100bp; giếng (-): mẫu nước.

Khảo sát trên DNA plasmid IHHNV pha loãng trong dịch ly trích DNA tôm

không mang virus, kết quả cho thấy quy trình thiết kế có độ nhạy tương đương với

quy trình nested IQ 2000 (Đài Loan) (hình 7.33A; 7.33B). Giới hạn phát hiện của

hai quy trình này ở độ pha loãng DNA IHHNV là 10-5 thì cho tín hiệu sản phẩm

khuếch đại trên bảng gel sau khi điện di. Từ kết quả này cho thấy, quy trình mới

thiết kế có độ nhạy tương đương với quy trình IQ 2000 (Đài Loan).

Hình 7.33. Kết quả so sánh độ nhạy của quy trình multiplex PCR. Hình A: Quy

trình mới chẩn đoán virus IHHN dựa trên bộ kít nested IQ 2000 (Đài Loan) với dãy

pha loãng bậc trong dịch ly trích DNA tôm, Giếng 1-5: dãy pha loãng từ 10-6→10-2;

M: thang DNA 100bp; giếng (+): mẫu chứng dương. Hình B: Quy trình multiplex

chẩn đoán virus IHHN dựa trên cặp mồi tự thiết kế vnIHF/R và 309F/R có mồi đối

A

B

B

997 bp

309 bp 240 bp

356 bp

848 bp

560 bp

286 bp

997 bp

309 bp 240 bp

B

A B

113

chứng nội trên dãy pha loãng bậc trong dịch ly trích DNA tôm, Giếng 1-6 độ pha

loãng từ 10-7→10-2; M: thang DNA 100bp; giếng (-): mẫu nước.

4.6. Độ đặc hiệu của phản ứng

Tính đặc hiệu của quy trình đóng vai trò quan trọng trong xét nghiệm, quy

trình càng đặc hiệu càng có độ tin cậy cao và làm tăng độ nhạy của phản ứng do

không có hiện tượng phản ứng cạnh tranh. Trên tôm sú nuôi ngoài nhiễm IHHNV

thì còn bị nhiễm rất nhiều loại virus, vi khuẩn. Vì vậy để quy trình thiết kế có độ tin

cậy cao, chúng tôi khảo sát quy trình trên một số virus, vi khuẩn thường gặp trên

tôm sú nuôi như HPV, MBV, NHP, WSSV, Vibrio sp., IHHNV type A/B đã xác

định ở Việt Nam. Nhằm đảm bảo không có hiện tượng dương tính giả xảy ra.

Kết quả điện di cho thấy chỉ có mẫu tôm nhiễm virus IHHN là có tín hiệu với

băng chỉ thị sản phẩm đặc trưng cho virus IHHN type lây nhiễm có kích thước (997

bp và 309 bp) (hình 7.34). Các mẫu khác không có tín hiệu chứng tỏ quy trình mới

với cặp mồi thiết kế phản ứng đặc hiệu cho virus IHHN, không khuếch đại bộ gen

của các virus HPV, MBV, NHP, WSSV, Vibrio Sp và IHHNV type A đã xác định

được ở trên. Vậy quy trình hoàn toàn đặc hiệu với IHHNV type lây nhiễm.

Hình 7.34. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc

hiệu của quy trình multiplex PCR đã tối ưu. Giếng (-): mẫu nước; giếng WSSV:

DNA WSSV; giếng MBV: DNA MBV; giếng NHP: DNA vi khuẩn NHP; giếng

typeA: mẫu tôm nhiễm IHHNV type A; giếng HPV: DNA HPV; giếng Tôm: tôm

997bp

309 bp

240bp

114

nhiễm Vibrio sp, giếng S: mẫu tôm nhiễm IHHNV; giếng (+): DNA virus IHHN.

Giếng M: thang DNA 100 bp.

Kết quả đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu qui trình Mutiplex cho kết quả như sau:

Mẫu tôm Dương tính Âm tính Tổng

Qui trình

Multiplex

PCR

Dương

tính 10 0

10

Âm tính 0 10 10

Tổng cộng 10 10 20

Độ nhạy của qui trình Mutiplex PCR có độ nhạy 10/10 (100%) và độ đặc hiệu

10/10 (100%). Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có gới hạn phát hiện, độ

nhạy, độ đặc hiệu phù hợp với yêu cầu xét nghiệm.

4.7. Ứng dụng kiểm tra IHHNV type lây nhiễm trên mẫu thực

Tiến hành áp dụng quy trình trên 90 mẫu tôm thương phẩm, 20 mẫu tôm

giống, 130 mẫu tôm bố mẹ. Trong số 90 mẫu tôm thương phẩm trên có 26 mẫu cho

kết quả dương tính với IHHNV type lây nhiễm, 20 mẫu tôm giống thì cho kết quả

dương tính 7 mẫu. Trên tôm bố mẹ thì 130 trong tổng số 46 mẫu cho kết quả dương

tính với IHHNV type lây nhiễm.

115

NỘI DUNG III: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PHƯƠNG THỨC TRUYỀN

LAN THEO TRỤC DỌC VÀ TRỤC NGANG CỦA IHHNV TRÊN TÔM

SÚ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

LÂY NHIỄM THEO TRỤC DỌC

Sự truyền lây của virus IHHN trong quần đàn tôm he cả được biết lan truyền

ngang (lây truyền giữa các cá thể của cùng quần đàn tiếp xúc trực tiếp, hoặc gián

tiếp, bằng cách ăn của các sinh vật bị nhiễm bệnh) và theo chiều dọc (virus truyền

từ con mẹ bị nhiễm sang con con của chúng) (Lightner và ctv., 1983a,b; Motte và

ctv, 2003). Nghiên cứu trước trên tôm thẻ chân trắng và tôm he Trung Quốc

(Fenneropeneaus chinesis), khi tôm bố mẹ mang virus IHHV thì phôi, trứng và các

giai đoạn ấu trùng con của chúng điều mang virus. Ở nghiên cứu này, để đánh giá

có sự lây truyền IHHNV từ mẹ sang con con của tôm sú như thế nào. Chúng tôi tiến

hành phân tích trứng và các giai đoạn phát triển ấu trùng của chúng để phân tích kết

quả PCR. Kết quả phân tích PCR (hình 7.35) cho thấy ở nhóm lây nhiễm, tất cả các

trường hợp tôm mẹ nhiễm IHHNV đều truyền IHHNV cho trứng và các giai đoạn

phát triển ấu trùng của chúng (Nauplii 1-3; Zoea 1-3 Mysis 1-3 và Postlarvae 1-6).

Ở nhóm đối chứng tôm mẹ không nhiễm IHHNV sẽ cho kết quả trứng và các giai

đoạn sau đó của nó không bị nhiễm IHHNV.

Hình 7.35. Kết quả phân tích multiplex PCR các mẫu trứng và các giai đoạn ấu

trùng của tôm mẹ. Giếng (1) Trứng; giếng (2-3) Nauplii 1-2; giếng (4-6): Zoae 1-3;

giếng (7-9): Mysis 1-3; giếng (10-15): PL 1-6; giếng (-): Mẫu chứng âm (nước cất);

giếng (+): Mẫu chứng dương IHHNV; giếng M: Thang DNA kích thước 100 bp

116

Sự lan truyền IHHNV từ mẹ sang con của thông qua các cá thể tôm sú mẹ

không nhiễm IHHNV và bị nhiễm IHHNV đã được chứng minh trong nghiên cứu

này. Trong đó, 3 cá thể tôm mẹ (kí hiệu 1-3) không nhiễm IHHNV làm thành nhóm

đối chứng và 6 cá thể tôm mẹ (kí hiệu 4-9) nhiễm ỊHHNV sẽ được xếp vào nhóm

lây nhiễm. Sau khi tôm mẹ đẻ, trứng và các giai đoạn ấu trùng của chúng sẽ được

thu và phân tích bằng phương pháp PCR. Kết quả thể hiện ở bảng 7.5.

Bảng 7.5 . Kết quả phân tích multiplex PCR các mẫu trứng và giai đoạn ấu trùng

thu từ các cá thể tôm mẹ nhiễm và không nhiễm IHHNV

Giai đoạn

Đối chứng Nhóm lây nhiễm

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Trứng (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

Nauplii 1-3 (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

Zoea 1-3 (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

Mysis 1-3 (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

PL 1-6 (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+) (+) (+)

Kí hiệu: (+): dương tính với IHHNV; (-): âm tính với IHHNV

Kết quả phân tích PCR cho thấy ở nhóm lây nhiễm, tất cả các trường hợp tôm

mẹ nhiễm IHHNV đều truyền IHHNV cho trứng và các giai đoạn sau của chúng. Ở

nhóm đối chứng tôm mẹ không nhiễm IHHNV sẽ cho kết quả trứng và các giai

đoạn sau đó của nó không bị nhiễm IHHNV. Kết quả này cho thấy, đối với nhóm

đối chứng, không có sự tạp nhiễm giữa các nghiệm thức thí nghiệm. Sự lây truyền

của IHHNV từ bố mẹ sang thế hệ con trên tôm thẻ chân trắng và P. chinesis đã

được nghiên cứu và chứng minh, IHHNV lan truyền từ mẹ sang con (Motte và ctv.,

2003; Zhag và ctv., 1997). Tuy nhiên ở Việt Nam, trên tôm sú nuôi chưa thấy có

báo cáo nào về sự tác động lớn của IHHNV, các nghiên cứu chủ yếu tập trung trên

bệnh đốm trắng, bệnh còi. Đồng thời, chưa có nghiên cứu cơ bản nào về việc truyền

lan của IHHNV trên tôm sú nuôi ở Việt Nam. Để làm rõ hơn sự lây truyền của virus

này trên tôm sú nuôi từ đó đưa ra các giải pháp hạn chế sự lan truyền của chúng

trong tôm nuôi ở nước ta. Ở nghiên cứu này, ở nhóm tôm mẹ đã giao vĩ bị nhiễm

IHHNV cho đẻ, trứng của chúng và các giai đoạn ấu trùng khi được kiểm tra bằng

117

PCR. Kết quả cho thấy có sự lây truyền từ IHHNV trên tôm sú mẹ mang IHHNV

sang con con thông qua trứng và các giai đoạn phát triển của ấu trùng potlavae 6 ở

bảng 7.6 đã được chứng minh. Ở nhóm mẹ âm tính IHHNV khi phân tích bằng

PCR, trứng và con con của chúng đều âm. Kết quả này cho thấy, nguồn nước bể

ương và quá trình cho sinh sản và ương nuôi không có sự lây truyền ngang IHHNV.

Lây truyền theo chiều dọc có thể đã góp phần đáng kể vào sự lây lan nhanh chóng

của IHHNV trong hệ thống nuôi trồng thuỷ sản và đóng một vai trò quan trọng gây

bùng phát dịch do IHHNV ở đàn tôm hoang dã trong tự nhiên. Lây truyền từ mẹ

sang con làm gia tăng tỷ lệ nhiễm ở giai đoạn ấu trùng, do virus phát tán trong hệ

thống ương hoặc virus nhiễm từ trứng, sau đó lây nhiễm sang ấu trùng khi chúng

bắt đầu ăn những cá thể nhiễm virus (Lotz, 1997). Ở kết quả bảng 7.5, đã xác định

được khi tôm sú mẹ nhiễm thì thế hệ con của chúng cũng bị nhiễm. Kết quả này

cũng giống như kết quả nghiên cứu trước đó ở tôm sú, tôm thẻ chân trắng và tôm

Fenneropeneaus chinesis chứng minh rằng IHHNV lây truyền theo chiều dọc có thể

được truyền từ bố mẹ cho con cháu của chúng thông qua sự hiện diện của virus trên

buồng trứng, đến trứng và các thế hệ con (Withuyachumnarnkul và ctv., 2006;

Motte và ctv., 2003; Zhang và Sun., 1997).

Bảng 7.6. So sánh thống kê số lượng Nauplii nở ra từ tôm mẹ nhiễm và không

nhiễm IHHNV

t-Test: Paired Two Sample for Means

Tôm mẹ Nhóm đối chứng Nhóm tôm nhiễm IHHNV

Trung bình số lượng

trứng nở (x104) 125,33±62,4 130,11±3,0

Trong một nghiên cứu sự lây nhiễm từ mẹ sang con trên tôm thẻ chân trắng P.

vanamei cho thấy, khi tôm mẹ nhiễm IHHNV sẽ làm giảm tỉ lệ nở của trứng. Số

lượng Nauplii từ con mẹ nhiễm IHHNV (99.000 Nauplii) thấp hơn con mẹ không

nhiễm IHHNV (102.000 Nauplii) (Motte và ctv., 2003). Tuy nhiên, theo nghiên cứu

của Withyachumnarnkul và ctv. (2006) trên tôm sú P. monodon cho thấy tôm sú bị

nhiễm IHHNV không làm giảm số lượng trứng và nauplii hoặc không bị tác động

lên quá trình phát triển con con của chúng. Trong thí nghiệm này chúng tôi cũng

118

tiến hành đếm số lượng trứng và số lượng nauplii nở ra (bảng 7.6). Kết quả phân

tích t-test cho thấy không có sự khác biệt (p>0,05) giữa nhóm tôm mẹ bị nhiễm

virus với số lượng Nauplii nở 130,11±3,0 x 104 với nhóm tôi mẹ không nhiễm virus

125,33±62,4 x 104. Điều này cho thấy tôm sú mẹ nhiễm IHHNV không làm ảnh

hưởng đến số lượng trứng và nauplii nở ra, tương tự với báo cáo của

Withyachumnarnkul và ctv. (2006) đã đề nghị trước đó. Trong nghiên cứu này đã

chứng minh rằng có sự truyền lây của virus trên tôm sú bố mẹ sang con con thông

qua trứng và các giai đoạn phát triển ấu trùng, nhưng không có không có sự ảnh

hưởng đến tỷ lệ Nauplii nở từ mẹ nhiễm và con mẹ không mang virus IHHNV.

LÂY TRUYỀN THEO TRỤC NGANG

4.8. Kết quả sàng lọc tôm sú và tôm thẻ cho IHHNV cho thí nghiệm

Sau 2 tuần tiêm dịch huyền phù có chứa virus (30 – 50 µl/cá thể tôm), chúng

tôi tiến hành kiểm tra sự hiện diện của virus trên những cá thể tôm sú và tôm thẻ

bằng quy trình Multiplex PCR. Kết quả sàng lọc các cá thể nhiễm virus sau khi điện

di trên gel agarose 1,5 % cho thấy xuất hiện các băng sản phẩm khuếch đại có kích

thước đặc trưng với IHHNV type lây nhiễm (hình 7.36).

Hình 7.36. Kết quả sàng lọc tôm sú và tôm thẻ nhiễm IHHNV với quy trình

multiplex PCR của các cặp mồi IHHNV 309F/R và IHHNV F/R. Giếng M: Thang

DNA 100 bp; giếng (1 – 3): Mẫu tôm sú tiêm virus; giếng (4 – 6): Mẫu tôm thẻ tiêm

virus; giếng (-): Mẫu chứng âm(nước cất); giếng (+): Mẫu chứng dương IHHNV;

giếng M: Thang DNA kích thước 100 bp

119

Qua đó, các cá thể tôm sú và tôm thẻ được sử dụng với mục đích cảm nhiễm

IHHNV bằng phương thức tiêm virus đều cho kết quả dương tính với virus này. Vì

vậy, chúng sẽ được lựa chọn cho thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang.

4.9. Lây truyền ngang cùng loài

Để đánh giá sự hiện diện của virus thông qua lây truyền ngang ở cùng 1 quần

đàn tôm sú như thế nào, chúng tôi tiến hành 3 nghiệm thức: cho ăn, sống chung và

kết hợp sống chung cho ăn mẫu tôm sú nhiễm virus. Sau 7, 14, 21 và 28 ngày lây

nhiễm chân bơi từng cá thể được thu nhận và kiểm tra hiện diện IHHNV trên những

mẫu tôm này bằng PCR thể hiện ở hình 7.37. Trong các nghiệm thức lây nhiễm

không có hiện tượng tôm chết ở cả nghiệm thức lây nhiễm lẫn đối chứng do virus

IHHNV. Ở nghiệm thức đối chứng phân tích PCR trên mẫu chân bơi thu ở các thời

điểm 7, 14, 21 và 28 ngày lây nhiễm, kết quả phân tích đều âm tính. Vì vậy, khẳng

định trong bố trí thí không có sự lây nhiễm từ bể gây nhiễm sang bể đối chứng. Đối

với các bể lây nhiễm sau 7 ngày, số lượng và tỷ lệ nhiễm IHHNV trung bình trên 3

nghiệm thức khác nhau ở biểu đồ 7.38 và phụ lục 1. Ở nhóm cho ăn và sống chung

với tôm bệnh chiếm 40%, kế đến là nghiệm thức sống chung chiếm 53,33% sau đó

là nghiệm thức cho ăn chiếm 30%. Kết quả cho thấy, tôm sau khi cho ăn và sống

chung ở các nhóm thí nghiệm đã có sự hiện diện virus với tỷ lệ từ 30-50%. Tuy

nhiên không có sự khác biệt giữa các nhóm cho ăn và sống chung hay giữa 2 nhóm

này với nhóm kết hợp sống chung và cho ăn. Phân tích các mẫu chân bơi ở tôm ở

Hình 7.37. Bể bố trí thí nghiệm trong lây nhiễm cùng loài và khác loài

120

ngày thứ 14 và thứ 21 sau lây nhiễm, tỷ lệ nhiễm trung bình ở các nhóm lần lược ở

nhóm 1 sống chung tỷ nhiễm IHHNV là 60% và 63%, nhóm 2 cho ăn là 46,67 % và

56,67% và nhóm 3 cho ăn và sống chung là 66,67% và 70%. Khi so sánh tỷ lệ

nhiễm giữa các nghiệm thức này cũng không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê. Khi

phân tích PCR trên mẫu tôm sau 28 ngày lây nhiễm tỷ lệ nhiễm các nghiệm thức

tăng ở nhóm sống chung là 86,67%, nhóm cho ăn tôm nhiễm bệnh là 60% và nhóm

cho ăn kết hợp với sống chung là 76,6%. Khi so sánh thì thấy nhóm sống chung có

tỷ lệ nhiễm cao nhất so với 2 nhóm còn lại, tuy nhiên khi so sánh thống kê thì

không có sự khác biệt ý nghĩa. Đối với nhóm đối chứng của từng nghiệm thức

không ghi nhận được bất kỳ cá thể tôm sú nào nhiễm IHHNV.

Hình 7.38. Biểu đồ kết quả lây nhiễm trên tôm sú cùng loài sau 7, 14, 21 và 28

ngày.

Phân tích PCR (hình 7.39) và ở biễu đồ 7.38 cho thấy tỷ lệ nhiễm IHHNV

sau 28 ngày lây nhiễm cho thấy tỷ lệ nhiễm ở các nghiệm thức điều tăng lên rõ rệt.

Ở nghiệm thức sống chung và cho tôm ăn bệnh phẩm 5 ngày tỷ lệ nhiễm ở ngày thứ

7 là 53,33% đạt lên đến 76,67%. Ở nhóm 1 cho tôm sống chung mặc dù ở 7 ngày

kiểm tra sự hiện diện virus trong tôm lây nhiễm IHHNV thấp (40%), nhưng ở 28

ngày tỷ lệ nhiễm lên đến 86,67 %. Tương tự kết quả nhóm 2 cho ăn tỷ lệ nhiễm của

121

tăng lên đáng kể từ ngày thứ 7 lây nhiễm là 30% đến ngày thứ 28 là 60 %. Những

nghiên cứu trước đây về IHNNV trên tôm xanh nuôi thâm canh ở Hawaii cho thấy

tôm xanh có tỷ lệ chết lên 90% sau 14 ngày lây nhiễm virus (Lightner và ctv.,

1983b). Và một vài nghiên cứu về IHNNV nhân sinh của virus bằng cách tiêm, sự

nhân sinh của virus rất chậm trên tôm lây nhiễm, còn tùy thuộc vào điều kiện nhiệt

độ cũng như thời gian (Montgomery-Brock và ctv., 2007; Galván-Alvarez và ctv.,

2012). Ở nhiệt độ thường 28-300C, thời gian nhân sinh virus trong tôm thẻ chân

trắng cao nhất khoảng 17-21 ngày. Vì vậy, trong thí nghiệm lây nhiễm này, nhiệt độ

trong các lô thí nghiệm được duy trì ở 28 0C nên tỷ lệ phát hiện của IHHNV trong

trong 28 ngày cao hơn ngày thứ 7, 14 ngày ở tất cả các nghiệm thức là điều phù hợp

với nghiên cứu trước đó. Điều này cho thấy khi lây nhiễm bằng con đường ăn và

sống chung với tôm mang virus, virus cần phải có một thời gian để thích nghi và

tương tác với tế bào chủ. Chúng phải có thời gian vượt qua hệ thống miễn dịch của

tôm, đồng thời tăng cường sự nhân lên bộ gen của virus trong tế bào chủ. Vì vậy,

trong giai đoạn 7 ngày lây nhiễm tỷ lệ nhiễm virus tùy thuộc vào mức độ virus đưa

vào và sự ổn định của chúng khi xâm nhiễm vào tế bào chủ.

Hình 7.38: Kết quả phân tích multiplex PCR trên mẫu tôm lây nhiễm. Sản phẩm

sau khi khuếch đại có kích thước 997 và 309 bp. (1): Mẫu tôm đối nghiệm thức 1;

(2 – 4): Mẫu tôm nghiệm thức 1; (5): Mẫu tôm đối chứng nghiệm thức 2. (6 – 8):

Mẫu tôm nghiệm thức 2; (9): Mẫu tôm nhóm đối chứng nghiệm thức 3; (10 – 13):

Mẫu tôm nhiễm nghiệm thức 3; (-): Mẫu chứng âm; (+): Mẫu chứng dương DNA

IHHNV; M: Thang DNA kích thước 50 bp.

997bp

309bp

122

Qua thí nghiệm xác định sự lan truyền theo trục ngang cùng loài, cho thấy tôm

sú P. monodon được cho ăn hoặc và sống chung với tôm sú nhiễm IHHNV đã được

kiểm tra bằng PCR thì đều có sự hiện diện của virus này sau 7, 14 và 21 và tỉ lệ

nhiễm virus này cũng tăng lên sau 28 ngày lây nhiễm. Lightner và ctv. (1983a) đã

báo cáo IHHNV là nguyên nhân gây chết đối với tôm P. stylirostris, nhưng không

gây tử vong với tôm P. vanamei và tôm sú P. monodon. Do dó, thí nghiệm này củng

cố thêm một điều IHHNV không là nguyên nhân gây chết trên tôm sú, trái lại virus

này còn tồn tại trong suốt thời gian sống của tôm mà sau đó những các thể tôm sú

mang mầm bệnh này còn có khả năng truyền lại virus này sang các cá thể tôm sú

khỏe mạnh khác.

Ngoài ra, thí nghiệm này cũng cho thấy tôm sú có thể bị nhiễm IHHNV ở cả

con đường ăn lẫn sống chung với tôm bị nhiễm virus. Không có sự khác có ý nghĩa

giữa nhóm nghiệm thức cho ăn tôm nhiễm virus và nhóm nghiệm thức cho sống

chung với tôm nhiễm virus (p > 0,05). Điều này có thể thấy cho ăn mô tôm nhiễm

virus cũng như cho sống chung với tôm bị nhiễm virus trước đó đều cho hiệu quả

như nhau trong việc làm lây lan virus này. Qua thí nghiệm này có thể minh chứng

rằng ở quần thể tôm sú trong môi trường tự nhiên hay trong các trang trại nuôi tôm,

IHHNV có thể được truyền từ các tôm sú nhiễm bệnh cho các cá thể tôm sú khỏe

mạnh thông qua tập tính ăn thịt các cá thể yếu hoặc bị chết, các xác bã của tôm hay

sự tiếp xúc giữa các cá thể trong môi trường (sống chung và thông qua nguồn nước

nhiễm virus).

4.10. Kết quả thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang khác loài

Thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang khác loài, cách thức cũng được tiến

hành tương tự thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang cùng loài nhưng nguồn bệnh

mang virus là tôm thẻ chân trắng. Mẫu chân tôm sau khi ly trích virus và thực hiện

phản ứng PCR để phát hiện. Kết quả phát hiện PCR ở hình 7.40. Kết quả số tôm

nhiễm và tỉ lệ nhiễm IHHNV của từng nhóm thí nghiệm sau thời gian 7, 14, 21 và

28 ngày lây nhiễm được thể hiện trong biểu đồ 7.41 và phụ lục 2

123

Hình 7.40. Kiểm tra IHHNV bằng multiplex PCR với các mẫu tôm trong thí nghiệm

lây nhiễm khác loài. Giếng (1 – 4): Mẫu tôm nhóm 1; (5): Mẫu tôm đối chứng nhóm

1; (6 – 9): Mẫu tôm nhóm 2;; (10): Mẫu tôm đối chứng nhóm 2; (11 – 14): Mẫu tôm

nhóm 3; (15): Mẫu tôm nhóm đối chứng 3; (-): Mẫu chứng âm; (+): Mẫu chứng

dương; M: Thang DNA kích thước 100 bp

Sau khi tiến hành phân tích bằng PCR trên tôm sú để xác định tỉ lệ nhiễm

IHHNV cho thấy ở các nhóm. Nhóm sống chung với tôm thẻ nhiễm IHHNV có tỉ lệ

nhiễm IHHNV là 30,0%, 33,33%, 36,67 và 67,67% sau 7, 14, 21 và 28 ngày lây

nhiễm. Tương tự nhóm chăn ăn tôm thẻ nhiễm IHHNV tỷ lệ nhiễm lần lược là

20,0%, 26,67%, 26,67 % và 40%. Và cuối cùng ở nhóm sống chung và cho ăn tôm

thẻ nhiễm IHHNV liên tục trong 5 ngày tỷ lệ nhiễm lần lược 23,33 %, 30,0%,

56,67% và 80,0% sau 7, 14, 21 và 28 ngày lây nhiễm. Ngoài ra, kết quả phân tích

PCR cho thấy không có bất kỳ cá thể tôm sú nào nhiễm IHHNV ở các nghiệm thức

của nhóm đối chứng.

So với thí nghiệm lây nhiễm cùng loài, thì tỷ lệ nhiễm ở các ngày đầu từ ngày

thứ 14 trở về trước lây nhiễm tỷ lệ nhiễm virus IHHNV trên tôm sú tăng lên không

đáng kể. Ở nhóm thứ 1, sau thời gian 7 ngày sống chung tôm thẻ bệnh nhiễm

IHHNV cho thấy có 9/30 cá thể tôm sú dương tính với IHHNV, mức độ nhiễm

virus chiếm 30%. Sau 14 ngày số lượng cá thể nhiễm với IHHNV không tăng nhiều,

chỉ tăng thêm 2 cá thể, tổng cá thể nhiễm IHHNV là 10/30 (chiếm 33,33 %). Tuy

nhiên, ở nhóm thí nghiệm cho ăn tôm bệnh, phân tích PCR trên những mẫu tôm sú

lây nhiễm tỷ lệ là 6/30 cá thể nhiễm IHHNV (tương ứng với 20 %) trong 7 ngày

đầu, đến ngày thứ 14 tỷ lệ này tăng lên cao 8/30 chiếm 26,67 % tỷ lệ nhiễm

997 bp

309 bp

124

IHHNV. Khi đó, mức độ nhiễm IHHNV trong nghiệm thức sống chung và cho ăn,

tỷ lệ nhiễm 7 ngày đầu chiếm 7/30 (23,33%), đến ngày thứ 14 tỷ lệ nhiễm IHHNV

còn 9/30 (30%). Trong nhóm này, có 1 bể có số lượng nhiễm giảm, xuống từ 5 con

nhiễm xuống còn 4 con nhiễm ở ngày 14. Kết quả này có thể trong quá trình thao

tác có sự nhiễm chéo khi cắt mẫu ở bể này vào ngày thứ 7. Tuy nhiên ở các bể khác

có sự tăng lên dẫn đến tổng số tôm nhiễm virus ở ngày thứ 14 nhóm này là 30%. Ở

ngày thứ 21, nghiệm thức cho ăn tỷ lệ nhiễm vẫn duy trì là 26,67%, không có sự

tăng lên số lượng tôm nhiễm. Trong khi đó nghiệm thức cho ăn và sống chung là

56,67% và nghiệm thức sống chung là 36,67%. Trong thời gian này, virus đã thích

nghi và có sự nhân sinh bắt đầu tăng lên. Mặc dù ở nghiệm thức cho ăn tỷ lệ nhiễm

virus không đổi, vì khi cho ăn một lượng virus nhất định trong 5 ngày ăn tôm thẻ

bệnh sau đó ăn thức ăn công nghiệp. Chính vì, vậy tôm sú ở nhóm này có tỷ lệ virus

chưa tăng cao. Điều này cho thấy khi lây nhiễm bằng con đường ăn với tôm mang

virus, virus cần phải có một thời gian để thích nghi và tương tác với tế bào chủ sau

khi hấp thu qua hệ tiêu hóa. Chúng phải có thời gian vượt qua hệ thống miễn dịch

của tôm, đồng thời tăng cường sự nhân lên bộ gen của virus trong tế bào chủ. Vì

vậy, trong giai đoạn 14 ngày đầu tỷ lệ nhiễm virus tùy thuộc vào mức độ virus đưa

vào và sự ổn định của chúng khi xâm nhiễm vào tế bào chủ nên tỷ lệ nhiễm chưa

cao. Trong một số loài tôm he và các loài tôm khác, có thể có khả năng kháng virus

khi nhiễm dạng nhẹ và chúng có thể loại virus ra khỏi cơ thể (Longyant và ctv.,

2006).

Nhìn biểu đồ so sánh các nhóm nghiệm thức lây nhiễm với nhau cho thấy sự

khác biệt giữa nhóm cho ăn và nhóm sống chung với tôm nhiễm virus (hình 7.41).

Tuy nhiên, kết quả phân tích t – student khi so sánh sự khác biệt giữa các nhóm

nghiệm thức lây nhiễm này với nhau cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa

(p>0,05) giữa nhóm cho ăn và nhóm sống chung với tôm nhiễm virus, cũng như

nhóm cho ăn với nhóm sống chung đồng thời cho ăn tôm nhiễm virus sau 7 và 14

ngày lây nhiễm. Kết quả phân tích sau 28 ngày cho thấy tỉ lệ nhiễm virus ở 3 nhóm

lây nhiễm đều tăng lên, trong đó nhóm cho sống chung đồng thời cho ăn có sự gia

tăng cao 80%. Phân tích thống kê t –student cho thấy chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa

125

(p<0,05) giữa nhóm sống chung đồng thời cho ăn với nhóm cho ăn mô tôm nhiễm

virus và không có sự khác biệt nào khác giữa các nhóm lây nhiễm còn lại (p>0,05).

Hơn nữa, khi tiến hành so sánh trên cùng một nhóm nghiệm thức lây nhiễm chúng

tôi chỉ thấy có sự khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05) ở nhóm sống chung đồng thời cho

ăn tôm nhiễm virus và nhóm sống chung sau 14 ngày và 28 ngày lây nhiễm; và

không có sự khác biệt có ý nghĩa (p>0,05) ở nhóm còn lại. Kết quả này cho thấy, về

mặt thời gian sau khi tôm sú ăn và sống chung với tôm thẻ nhiễm virus càng lâu thì

sẽ làm gia tăng tỉ lệ nhiễm trong quần thể tôm. Như vậy, cách thức virus tồn tại

trong cơ thể tôm để gia tăng số lượng bản sao hay tồn tại trong nước để qua đó xâm

nhập vào cơ thể vật chủ khác thông qua việc tiếp xúc với tôm nhiễm virus, nguồn

nước hoặc ăn vào các xác bã chứa các thể virus cũng đều làm tăng số lượng tôm

nhiễm virus này.

Hình 7.41. Biểu đồ so sánh tỉ lệ nhiễm IHHNV (%) giữa các nhóm thí nghiệm sau 7

14, 21 và 28 ngày lây nhiễm. Dữ liệu được thể hiện bằng mức độ nhiễm virus với độ

lệch chuẩn (M ± SD)

Qua những kết quả ghi nhận được ở nhóm sống chung với tôm nhiễm bệnh

cho thấy có tỉ lệ nhiễm IHHNV khá cao. Điều này có thể cho thấy IHHNV không

những có thể lan truyền cho các cá thể tôm khỏe mạnh khác bằng con đường cho ăn

126

mà còn có khả năng lan truyền nhanh chóng bằng cách thức sống chung với nguồn

bệnh thông qua việc tiếp xúc hay ăn cặn bã thải ra từ những cá thể mang bệnh sang

các cá thể khỏe mạnh khác. Mặt khác, thí nghiệm này có thể cho thấy hiệu quả của

nguồn thức ăn (mô tôm nhiễm IHHNV) chưa cao, lượng virus có lẽ còn quá thấp

hay thời gian cho ăn ngắn do đó bản sao virus nhân lên không nhiều nên các kết quả

phân tích bằng PCR sau 21 ngày đã phản ánh điều đó. Mặc dù, nghiên cứu của Tang

và Lightner (2001) cho thấy thời gian để IHHNV nhân đôi bản sao ở tôm thiếu

trùng P. vannamei là khoảng 22h trong khi báo cáo của Tang và Lightner, (2000)

trước đó cho thấy thời gian nhân đôi của WSSV khá ngắn chỉ mất 1,9 h. Do đó, họ

cho rằng điều này có thể liên quan đến các parvovirus có kích thước khá nhỏ với

thông tin di truyền giới hạn và do đó chúng phụ thuộc nhiều vào các tế bào vật chủ

cho sự sao chép của mình. Hơn nữa, những cá thể tôm thẻ nhiễm virus bị tress, lột

xác, yếu dần và sau đó bị các cá thể tôm sú khác ăn thịt cũng là nguyên nhân làm

tăng mức độ nhiễm virus ở nhóm sống chung với tôm nhiễm virus. Tuy nhiên,

không có sự khác biệt giữa các nhóm thí nghiệm khi phân tích bằng thống kê t-

student.

Kết quả của thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang cho thấy, tôm sú và tôm

thẻ bị nhiễm virus, chúng lại truyền virus cho những cá thể tôm sú khỏe mạnh thông

qua cách thức cho ăn mô tôm nhiễm bệnh hay cách thức sống chung trong cùng một

môi trường so với lây nhiễm cùng loài. Mặc dù, thí nghiệm của chúng tôi được tiến

hành trong bể kính với thể tích nhỏ (70 L) chứa nước biển đã qua xử lý để loại bỏ

các thành phần không mong muốn có trong đó, do đó kết quả không thể đánh giá

chính xác và đầy đủ những gì có thể xảy ra trong môi trường tự nhiên (ao nuôi) khi

các ao nuôi này còn rất nhiều nhân tố khác có thể góp phần làm tăng khả năng lan

truyền virus cho tôm như phiêu sinh động vật, phiêu sinh thực vật và các ấu trùng,

giáp xác… Thêm vào đó, sự nhân lên của IHHNV còn phụ thuộc vào độ tuổi, kích

cỡ tôm cũng như liều lượng cho ăn và loài lây nhiễm (Lightner, 1996)…. Do đó,

trọng lượng và kích thước của tôm cũng được tính toán để có cùng kích cỡ như

nhau trước khi đưa vào thí nghiệm. Tuy nhiên, kết quả này cũng cho thấy những vật

127

mang IHHNV (tôm sú hay tôm thẻ nhiễm virus) có thể là vật mang virus tiềm tàng

do chúng không bị chết sau khi bị virus này xâm nhiễm nên chúng có thể truyền lại

virus cho quần thể tôm nuôi. Sự lan truyền nhanh chóng trong thí nghiệm của

IHHNV cho thấy các loài tôm sú và tôm thẻ nhiễm bệnh ở trong môi trường các

trang trại có thể là mối đe dọa nghiêm trọng đối với tôm sú được nuôi ở ĐBSCL.

Xa hơn nữa, mối đe dọa tiềm ẩn này có thể nguy hiểm cho hầu hết các loài tôm

được nuôi vì IHHNV có thể cảm nhiễm với rất nhiều loài tôm he được nuôi khác

như P. stylirostris ở Châu Mỹ và P. monodon ở Châu Á.

4.11. Biểu hiện lâm sàng của tôm lây nhiễm

Một số nghiên cứu trước đây cho rằng, khi tôm sú nhiễm IHHNV thì có hiện

tượng dị dạng còi cọc (RDS) và có hiện tượng chậm lớn (Rai và ctv., 2012). Tuy

nhiên theo Flegel (1997), tôm sú có khả năng chịu đựng cao khi nhiễm IHHNV, ông

quan sát tôm sú lây nhiễm trong phòng thí nghiệm thì thấy biểu hiện bình thường.

Trong thí nghiệm này, ghi nhận đầu tiên sau 2 ngày cho ăn đầu tiên cho thấy, tôm

thường biếng ăn, bơi chậm thỉnh thoảng lại ngoi lên mặt nước. Không có sự thay

đổi về màu sắc, hình dạng nào được ghi nhận. Thay vào đó những thay đổi về hình

dạng và màu sắc lại được ghi nhận vào ngày thứ 14 khi tôm có màu xanh nhạt, ban

đầu có xuất hiện một số chấm màu vàng và trắng trên nắp vỏ và phần tiếp giáp giữa

bụng và lưng. Số lượng cá thể được ghi nhận còn ít, chủ yếu ở nhóm thí nghiệm cho

ăn và kết hợp cho ăn với sống chung. Do đó rất khó để quan sát hình dạng, màu sắc

bên ngoài để phân biệt tôm nhiễm bệnh và tôm khỏe. Ngày thứ 21 và ngày thứ 28

ghi nhận số lượng nhiều tôm có xuât hiện các đốm trắng và vàng trên nắp vỏ, ở giữa

phần tiếp giáp giữa lưng và bụng của tôm, một số cá thể có màu sắc xanh đậm, hiện

tượng lột xác được ghi nhận ở nhiều bể. Tuy nhiên khi quan sát so sánh với lô đối

chứng, thì khó đánh giá sự khác biệt về biểu hiện lâm sàng khi quan sát bằng mắt

thường hình 7.42.

128

Hình 7.42. Quan sát, biểu hiện hình thái của tôm sau khi lây nhiễm 14 ngày. (A)

Tôm trong bể lây nhiễm (mũi tên) và trong bể đối chứng; (B) Tôm trong bể lây

nhiễm nuôi sau 28 ngày.

Bệnh lý bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô ở dạng vi thể

mô học trên tôm, đã được xác định có những thể vùi dạng Crowdry typeA ưa eosin.

Nhân của tế bào bệnh bị phồng to với thể vùi trung tâm bắt màu Eosin đôi khi bị

tách ra từ chất nhiễm sắc có viền bằng một vòng không bắt màu, được lưu giữ bằng

các chất cố định có chứa axit acetic (Lightner., 1996). Trong nghiên cứu này, trên

kết quả phân tích từ Phòng mô bệnh học-Viện thủy sản II, những mẫu tôm sau 28

ngày ngày lây nhiễm (hình 7.43) ngoài những biểu hiện đặc trưng về lâm sàng

không rõ rệt của tôm nhiễm IHHNV, đồng thời kiểm tra mô bệnh học chỉ thấy rất ít

thể vùi, xuất hiện trương nhân không rõ ràng hình (a). Tuy nhiên, khi kiểm tra về

mô học trên tôm lây nhiễm sau 120 ngày chúng tôi nhận thấy, ở tôm sú khi nhiễm

IHHNV thì mô bệnh học nghi nhận trên biểu bì của lớp cắt mang có những thể

trương nhân nhân bắt màu rõ, các thể vùi tuy ít nhưng rõ và đặc trưng của virus

nhiễm trên mô này ở hình (c) và (b).

129

Hình 7.43. Lát cắt mô học trên phần mang tôm sú đối chứng và nhiễm IHHNV sau

28 và sau 128 ngày. Mẫu nhuộm với H& E, (a): tôm gây nhiễm sau 28 ngày, rất khó

để phân biệt tế bào nhiễm IHHNV với các tế bào bình thường; hình (b, (c): tôm lây

nhiễm sau 120 ngày lây nhiễm, tế bào có trương nhân phình to, thể vùi bắt màu

eosin (mũi tên) đặc trưng cho IHHNV. Hình d: tế bào tôm bình thường ở lô đối

chứng. Quan sát hình (a, c, d) ở X40, (b) ở X100

Kết quả lây nhiễm cho thấy, qui trình lây nhiễm trên tôm sú nuôi đã thành

công trong phòng thí nghiệm với tôm sú ăn và sông sống chung với tôm sú (tôm

thẻ) nhiễm virus. Sự biểu hiện lâm sàng khó phát hiện ở tôm sú khi nhiễm, và chỉ

quan sát được bệnh lý ở vi thể mô học sau 28 ngày lây nhiễm rất khó phát hiện.

Bệnh tích mô học rõ và đặc trưng nhất của IHHNV khi nhiễm trên tôm sau 120

ngày lây nhiễm.

130

NỘI DUNG IV: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ HIỆN DIỆN, TRUYỀN

LAN VÀ CÁC GIẢI PHÁP HẠN CHẾ IHHNV TRÊN TÔM SÚ

1. THÔNG TIN VỀ CÁC AO NUÔI TÔM Ở CÁC MÔ HÌNH

Qua điều tra, thông tin chi tiết về diện tích, mật độ, nguồn gốc giống và kiểm

tra mầm bệnh của các mô hình nuôi ở các tỉnh được thể hiện trong bảng 7.7. Diện

tích ở mô hình quản canh ở Cà Mau và Bạc Liêu cho thấy nhỏ nhất là 0.4 ha và lớn

nhất là 2,6 ha, đa số con giống không xét nghiệm và giống địa phương mật độ thấp

1-2con/m2. Trong khi đó ở mô hình bán thâm canh và thâm canh có diện tích nhỏ

hơn, ở mô hình nuôi bán thâm canh chủ yếu là nông hộ nuôi nhỏ lẻ, 2-3 ao/hộ nuôi,

ao có diện tích cao nhất là 5.000 m2 và nhỏ nhất là 1.000 m2, mật độ thả giống dưới

20 con/ m2. Trong khi đó, ở mô hình thâm canh mất diện tích lớn hơn bán thâm

canh, đa số là do các tư nhân và danh nghiệp có vốn nhiều và diện tích lớn. Mật độ

thả cũng cao hơn 30-40 con/m2, hệ thống ao nuôi có đầu từ máy móc và nguồn lực

cao hơn. Ở mô hình nuôi bán thâm canh và thâm canh, con giống có nguồn gốc rõ

ràng và đều xét nghiệm các chỉ tiêu virus gây bệnh nguy hiểm ở bảng 7.7.

Bảng 7.7. Thông tin chi tiết của các mô hình nuôi.

Mô

hình

Tỉnh Diện

tích

trung

bình

Diện

tích

lớn

nhất

Diện

tích

nhỏ

nhất

Mật độ

thả

giống

(con/m2)

Nguồn

gốc

Xét

nghiệm

mầm

bệnh

Sản lượng

thu hoạch

Quảng

canh

Bạc

Liêu

2,6 ha 5 ha 1,5 ha 1-2 Không

rõ

Không 25

kg/ha/tháng

Cà

Mau

1,4 ha 3 ha 4.000m2 0,5-1 ʺ ʺ “

Bán

thâm

canh

Bạc

Liêu

2.500

m2

5.000

m2

1.000

m2

19 Miền

Trung,

Địa

phương

WSSV,

MBV,

HPV,

YHV

5-7 tấn/ha

Trà

Vinh

- - - 15-20 ʺ ʺ 5-7 tấn/ha

131

Thâm

Canh

Kiên

Giang,

Sóc

Trăng

6.000

m2

8.700

m2

2.500

m2

30-40 Miền

Trung

WSSV,

MBV,

HPV,

YHV

5-6 tấn/ha

2. SỰ HIỆN DIỆN CỦA IHHNV TRÊN TÔM NUÔI Ở CÁC MÔ HÌNH NUÔI

1.1. Mô hình quảng canh Bạc Liêu và Cà Mau

Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm IHHNV trên nuôi ở các ao nuôi quảng canh

(bảng 7.8) ở 2 tỉnh cho thấy, trong tổng số mẫu tôm thu được ở Cà Mau là 88 mẫu

tôm sú, ở Bạc Liêu là 83 mẫu tôm sú, tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm nuôi ở các ao

nuôi mô hình quảng canh ở Cà mau cao khoảng 46,59±10,52%, trong khi đó tôm

nuôi ở mô hình nuôi ở Bạc Liêu tỷ lệ nhiễm IHHNV thấp hơn khoảng

32,53±10,07%. Phân tích từng đợt mẫu tôm thu ở đồ thị hình 7.44, đợt thu mẫu

tháng 8 tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm nuôi ở tỉnh Cà Mau cao nhất cao nhất lên đến

86,36% và ở Bạc Liêu là 59,09%. Tỷ lệ nhiễm trung bình ở Cà Mau ghi nhận được

là 46,59%, trong khi đó ở Bạc Liêu có tỷ lệ nhiễm thấp hơn khoảng 32,53%. Chỉ

đợt 1 và 2 tỷ lệ nhiễm gần như đồng đều nhau khoảng 10%, còn lại các đợt về sau

tăng dần và cao nhất là đợt 4 đạt 59,09 %. Phân tích PCR theo từng đợt thu mẫu,

những mẫu tôm thu trong đợt 4 có tỷ lệ nhiễm IHHNV cao nhất so với các tháng

khác ở cả hai tỉnh Bạc Liêu và Cà Mau, tỷ lệ lần lượt là 59,09% và 86,36%.

Virus lây truyền và phát triển nhanh do điều kiện địa lý, biến đổi khi hậu và

biến động điều kiện môi trường nuôi tôm (Jimenez và ctv., 1999). Theo nghiên cứu

Montgomery-Brock và ctv. (2007), khi tiêm virus trên tôm nuôi ở nhiệt độ thấp

240C, thì sau 6 ngày thì virus bắt đầu nhân sinh mạnh, trong khi đó ở nhiệt độ 300C

trở lên thì virus nhân sinh mạnh bắt đầu từ ngày thứ 17. Chính vì vậy nhiệt độ nhân

sinh virus trong thời gian cũng là một nhân tố làm gia tăng virus trong ao nuôi tại

thời điểm thu mẫu này. Thêm vào đó, một nghiên cứu khác trên virus đốm trắng

WSSV của Hảo và ctv (2007), đã chỉ ra rằng tỷ lệ WSSV nhiễm trên tôm nuôi ở mô

quảng canh trong mùa mưa ở ĐBSCL (tháng 9 dương lịch) rất lớn, chiếm 30% ao

132

nuôi trong mùa do sự thay đổi đột ngột môi trường về nhiệt độ cũng như độ mặn.

Kết quả điều tra trên tôm sú nuôi ở mô hình này cho thấy, tỷ lệ nhiễm IHHNV tăng

dần trong các tháng và tăng cao nhất trong tháng thu mẫu, tháng 8 (59-80%). Thời

gian này do sư thay đổi đột ngột của môi trường như lượng mưa, nhiệt độ, đặc biệt

trong các ao nuôi độ mặn thấp. Một trong nguyên nhân có thể gây bùng phát virus

cao ở tháng này là do sự độ mặn thay lớn, giảm mạnh dẫn đến thay đổi áp xuất thẩm

thấu trên cơ thể tôm tạo điều kiện cho sự bùng phát virus trên những con tôm mang

mầm bệnh. Chính vì vậy, IHHNV hiện diện cao ở các đợt mẫu tôm thu tháng 7 và

tháng 8 cao hơn tháng 5 tháng 6 do thời điểm thu mẫu bắt đầu cuối mùa khô và kết

thúc vào giữa mùa mưa. Khi đó nhiệt độ ở mùa mưa thấp hơn dẫn đến bùng phát

virus mạnh hơn nên tỷ lệ nhiễm virus có thể cao hơn ở đợt thu mẫu vào tháng 7 và

tháng 8 (hình 7.44).

Hình 7.44. Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV trên mô hình tôm sú nuôi quảng canh ở Cà

Mau và Bạc Liêu

Để kiểm tra sự sai khác giữa cùng một mô hình nuôi ở 2 vùng nuôi khác nhau

mà tỷ lệ nhiễm không tương đồng giữa Cà Mau và Bạc Liêu, chúng tôi đã phân tích

thông kê dựa theo hàm CHITEST và ghi nhận giá trị P = 0,06, như vậy không có sự

133

khác nhau có ý nghĩa giữa hai tỷ lệ này (p > 0,05). Từ đó, chúng tôi kết luận không

có mối tương quan giữa tỷ lệ nhiễm và khu vực nuôi Cà Mau, Bạc Liêu.

Bảng 7.8. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên các mẫu tôm nuôi ở mô hình Quảng canh ở Cà

Mau và Bạc Liêu

Đợt thu mẫu

tôm

Mẫu tôm thu ở các tỉnh (mẫu nhiễm IHHNV/tổng số mẫu thu)

Cà Mau Tỷ lệ (%) Bạc Liêu Tỷ lệ (%)

Đợt 1 (tháng 5) 2/22 9,09 ± 12,0 2/19 10,53 ± 13,8

Đợt 2(tháng 6) 9/22 40,91 ± 20,5 2/20 10,0 ± 13,1

Đợt 3 (tháng 7) 11/22 50,0 ± 20,9 10/22 45,45 ± 20,8

Đợt 4 (tháng 8) 19/22 86,36 ± 14,3 13/22 59,09 ± 20,5

Tổng số 41/88 46,59 ± 10,4 27/83 32,53 ± 10,1

Tỷ lệ nhiễm virus còn tùy thuộc vào nhiều yếu tố như cách quản lý, con giống

có mang mầm bệnh hay không, điều kiện thổ nhưỡng và chất lượng môi trường

nước ao trong vùng nuôi... Theo như kết quả điều tra về thông tin ao nuôi chúng tôi

thu nhận được và đặc tính mô hình nuôi quảng canh, mô hình nuôi này là mô hình

mở, nguồn nước lấy theo thủy triều và không qua xử lý, con giống không được

kiểm tra mầm bệnh, điều kiện nuôi phụ thuộc vào môi trường tự nhiên mà không có

yếu tố kiểm soát, nên có thể thấy tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm sú ở các ao nuôi theo

hình thức quảng canh có tỷ lệ khá cao (46,59% ở Cà Mau và 32,53% ở Bạc Liêu).

1.2. Mô hình nuôi bán thâm canh ở Bạc Liêu và Trà Vinh.

Trong 2 năm 2012 và 2013, tổng số mẫu thu trên các nông hộ được phỏng vấn

ở mô hình nuôi tôm sú bán thâm canh ở Bạc Liêu là 93 và 52 mẫu tôm sú (1 mẫu

tôm/ 1 ao tôm), Trà Vinh 45 và 56 mẫu tôm sú. Kết quả phân tích IHHNV bằng

PCR cho thấy tỷ lệ nhiễm IHHNV ở các năm là Trà Vinh là 42.22 ±14,4% và

78,57± 9,4% và Bạc Liêu là 33.33±9,6% và 50 ±13,6% (hình 7.45)

134

Hình 7.45. Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV trên mô hình tôm nuôi bán thâm canh ở Trà

Vinh và Bạc Liêu trong 2 năm 2012 và 2013.

Tỷ lệ nhiễm các đợt thu mẫu năm 2012 thể hiện ở hình 7.46, những mẫu tôm

sú ở Bạc Liêu thu đợt 1 trên 48 ao (1 mẫu/ao) cho thấy có 18,75 % sự hiện diện

IHHNV, trong khi đó trên 29 mẫu tôm sú trên những ao của tỉnh Trà Vinh tỷ lệ

nhiễm IHHNV là 34,48%. Ở đợt 2, số lượng mẫu thu đã giảm xuống, như đã đề cập

trên, hiện tượng tôm chết do bệnh hoại tử gan tụy xảy ra trên diện rộng ở Trà Vinh,

chính vì vậy mẫu thu đợt 2 chỉ có 2 ao củ của đợt 1 và thu mới thêm 9 mẫu mới

(tổng số là 11 mẫu). Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên 11 mẫu này là 45,45 %. Mẫu tôm

nuôi ở Bạc Liêu cũng giảm đáng kể, tổng số mẫu đợt 2 thu lại trên các ao là 29 mẫu

với tỷ lệ nhiễm IHHNV là 41,38%. Ở đợt 3, các mẫu ở đợt 2 của Trà Vinh hầu như

bị bệnh gan tụy và chết hoàn toàn, không thu mẫu được. Tiến hành thu thêm 5 mẫu

mới ở các ao khác, kết quả phân tích là 4/5 mẫu dương tính IHHNV (chiếm 80%).

Riêng các ao nuôi ở Bạc Liêu, có những ao tôm phát triển tốt, nhưng một số ao có

hiện tượng chết do đốm trắng nên đã thu hoạch sớm, có 6 ao trong ba hộ vì tôm lớn

nên chủ nuôi tôm không cho thu mẫu. Vì vậy, tổng số mẫu đợt 3 thu được là 21

mẫu, tỷ lệ nhiễm là 7/21 (33,33%). Ở đợt 4, chỉ thu được những ao ở Bạc Liêu và số

ao còn thu được mẫu là 7 ao, phân tích trên những mẫu tôm thu ở ao này có 3/7 mẫu

dương IHHNV (42,86%).

135

Hình 7.46. Tỷ lệ nhiễm IHHNV ở tôm nuôi trên các ao nuôi bán thâm canh ở Bạc

Liêu và Trà Vinh năm 2012.

Năm 2013 tiếp tục thu mẫu tôm sú trên hai tỉnh này với 2 địa điểm có mô hình

nuôi tôm sú bán thâm canh ở Xã Vĩnh Thạnh, Huyện đông Hải, tỉnh Bạc Liêu và ở

xã Mỹ Long Nam, huyện Cầu Ngang, tỉnh Trà Vinh. Tiến hành điều tra, thu mẫu

tôm nuôi sau khi thả, nhỏ nhất là 20 ngày tuổi và lớn nhất là 60 ngày tuổi. Các

thông tin ao nuôi và thu mẫu định kỳ theo hàng tháng. Kết quả phân tích tỷ lệ nhiễm

IHHNV trên các mẫu tôm được thể hiện ở hình 7.47.

Hình 7.47. Tỷ lệ nhiễm IHHNV ở tôm nuôi trên các ao nuôi bán thâm canh ở Bạc

Liêu và Trà Vinh năm 2013.

136

Mẫu tôm sau khi đem về được ly trích DNA tổng số và được kiểm tra sự hiện

diện IHHNV bằng phương pháp PCR. Kết quả sau khi phân tích trên bảng 7.9,

những mẫu tôm ở Bạc Liêu thu đợt 1 trên 15 ao cho thấy có 5/15 mẫu hiện diện

IHHNV chiếm 33,33 %. Những ao này có độ tuổi chủ yếu dưới 30 ngày thả nuôi,

trong khi đó trên 15 ao của tỉnh Trà Vinh tỷ lệ nhiễm IHHNV là 53,33%. Ở đợt 2,

có 5 ao bị chết do gan tụy, chỉ còn 10 củ của đợt 1, và thu mới thêm 5 mẫu mới

(tổng số là 15 mẫu). Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên 15 mẫu tôm này có đến 80,0 % tôm

nhiễm IHHNV. Mẫu tôm nuôi ở Bạc Liêu cũng giảm đi một ít ở đợt thu mẫu lần 2

do có 2 ao tôm chết, tổng số mẫu đợt 2 trên các ao cũ là 13 mẫu với tỷ lệ nhiễm

IHHNV là 30,77 %. Ở đợt 3, có 2 ao bị bệnh gan tụy và chết ở Trà Vình, chỉ thu

mẫu được 13 ao. Tiến hành quả phân tích PCR trên những mẫu này có 12/13 mẫu

dương tính IHHNV (chiếm 92,31%). Riêng các ao nuôi ở Bạc Liêu, có những ao

tôm phát triển tốt, đề tài triển khai thu mẫu thêm 1 ao mới. Vì vậy, tổng số mẫu đợt

3 thu được ở Bạc Liêu là 14 mẫu, với tỷ lệ nhiễm là 8/14 (60,28%). Ở đợt 4, phân

tích trên 13 mẫu tôm ở Trà Vinh có 12/13 mẫu nhiễm IHHNV 92,31%. Trên ao

nuôi ở Bạc Liêu, 3 ao có dấu hiệu chết do gan tụy và đã thu hoạch ở đợt này, lúc

này tôm đã hơn 3 tháng tuổi. Còn lại 10 ao nuôi sú phát triển bình thường, phân tích

sự hiện diện IHHNV trên những mẫu tôm này cho thấy có đến 80% tôm nhiễm

IHHNV. Qua 4 đợt thu mẫu trong 2 mô hình nuôi bán thâm canh ở 2 tỉnh trên cho

thấy, tỷ lệ tôm sú nuôi ở giai đoạn đều có sự hiện diện của virus và tỷ lệ này tăng

theo thời gian. Điều này cho thấy, sự tồn lưu của virus suốt vụ nuôi, có thể virus từ

nguồn nước bị ô nhiễm hay từ con giống hoặc có thể truyền lây giữa những cá thể

mang mầm bệnh do môi trường ô nhiễm, cách quản lý của từng nông hộ. Mặc dù

hiện diện của virus cao trong các ao nuôi này, tuy nhiên, khi chúng tôi theo dõi và

phỏng vấn các nông hộ nuôi thì năng suất của những ao thu bị nhiễm IHHNV và

không nhiễm thì năng suất không có chênh lệch nhiều (5-7 tấn/ha).

137

Bảng 7.9. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên các ao tôm nuôi sú ở mô hình bán thâm canh ở

Trà Vinh và Bạc Liêu năm 2013.

Đợt thu mẫu Mẫu thu ở các tỉnh (mẫu dương/tổng số mẫu thu)

Trà Vinh Tỷ lệ (%) Bạc Liêu Tỷ lệ (%)

Đợt 1 (tháng 4) 8/15 53,33 ± 25,2 5/15 33,33 ± 23,9

Đợt 2(tháng 5) 12/15 80,0 ± 20,2 4/13 30,77 ± 25,1

Đợt 3 (tháng 6) 12/13 92,31 ± 14,5 9/14 60,28 ± 25,1

Đợt 4 (tháng 7) 12/13 92,31 ± 10,7 8/10 80,0 ± 24,8

Tổng số 44/56 78,57 ± 9,4 26/52 50,0 ± 13,6

Qua 2 năm thực hiện thu mẫu định kỳ trên các ao nuôi tôm sú bán thâm canh ở

2 tỉnh Trà Vinh và Bạc Liêu cho thấy, tỷ lệ nhiễm ở Trà vinh luôn cao hơn ở Bạc

Liêu, năm 2012 ở Bạc Liêu là 33,33±9,6% và ở Trà Vinh là 42,22±14,4%. Năm

2013 tỷ lệ nhiễm là 50 ±13,6% và 78,57±10,7%. Kết quả này cho thấy sự hiện diện

của virus ở tôm sú nuôi Trà Vinh cao hơn có thể đặc thù của vùng địa lý thổ nhưỡng

và tập quán canh tác ở vùng. Điều này cũng đã được chứng minh trên tôm xanh ở

vịnh California. Sự phân bố và hiện diện IHHNV trên tôm xanh P. stylirostris ở

Vịnh California, Mỹ và vịnh Sonora của Mexico. Vùng này có nguồn nước bị ô

nhiễm trong những khu vực bị ảnh hưởng đến sản xuất nông nghiệp, hoạt động nuôi

trồng thủy sản bị ô nhiễm, thì tỷ lệ nhiễm IHHNV của tôm thẻ chân trắng và tôm

xanh cao hơn các vùng khác (Pantoja và ctv., 1999).

1.3. Điều tra và thu mẫu tôm thẻ chân trắng nuôi bán thâm canh ở

Bến Tre

Trong năm 2013, hầu hết các nông hộ nuôi tôm ở Bến Tre chuyển đổi vật nuôi

từ tôm sú qua nuôi tôm thẻ chân trắng. Đa số các nông hộ nuôi dạng bán thâm canh,

mật độ thả dao động 60-80/m2, có một số hộ có mật độ rất cao, 100-120 con/ m2.

Tuy nhiên, ao nuôi ở các nông hộ này nhỏ có diện tích khoảng 1500-3000 m2. Hệ

thống cung cấp oxi cho ao nuôi rất ít, chỉ 1-2 quạt nước trong ao. Tất cả hệ thống ao

trước kia nuôi sú được chuyển qua nuôi thẻ, chính vì vậy, hệ thống và kỹ thuật xử lý

ao nuôi cũng như cách chăm sóc không có thay đổi nhiều. Thời gian thu hoạch ở

các hộ nuôi tôm thẻ chân trắng sớm hơn so với mô mình thâm canh, thời gian thu

138

hoạch thường dưới 3 tháng. Kích cở tôm 50-70 con/kg. Sản lượng thu hoạch trung

bình một ao khoảng 1,3-1,6 tấn/ ao (2000m2 ).

Hình 7.48. Tôm thẻ chân trắng bị nhiễm IHHNV ở mô hình nuôi bán thâm canh tại

Bến Tre. Tôm 45 ngày tuổi, bị dị dạng giống đốt tre (mũi tên), chậm lớn và có hiện

tượng chết do lột không được.

Phân tích mẫu tôm (bảng 7.10) trên các ao nuôi cho thấy, đợt 1 có 7/19 mẫu

tôm có nhiễm IHHNV chiếm 36,84%. Trên những ao nuôi ao có kết quả dương tính

IHHNV, có đến 6 ao đã chết trước đợt thu mẫu lần 2 hoặc thu sớm. Theo ghi nhận

những hộ dân có ao tôm bị bệnh, do bệnh hoại tử gan tụy chết. Tỷ lệ chết sớm ở các

ao nuôi tôm thẻ nghi nhận trên dưới 1 tháng tuổi. Riêng có 2 ao trong số 7 ao có

tôm nhiễm IHHNV (hình 7.48) thì vẫn còn sống, tuy nhiên có sự hao hụt 30% quần

đàn trong ao. Những ao khi nhiễm này mặc dù không chết hết ao, nhưng sau khoảng

1 tháng thì những ao này cũng thu hoạch. Ở đợt 2, trong số 19 ao ở đợt thu mẫu lần

1 chỉ còn lại 12 ao nuôi, có 7 ao phải thu sớm, khi phân tích các ao sống còn lại chỉ

có 1 ao trong tổng số 12 ao điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm 8,33%.

Bảng 7.10. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm thẻ ở mô hình bán thâm canh ở Bến Tre.

Đợt thu mẫu Mẫu nhiễm IHHNV(mẫu

dương/tổng số mẫu thu)

Tỷ lệ nhiễm (%)

Đợt 1 (25/5) 7/19 36,84±21,7

Đợt 2(15/6) 1/12 8,33±15,6

Đợt 3 (5/7) 1/10 10,0±18,6

Đợt 4 (25/7) 4/10 40,0±30,4

Tổng số 13/51 25,49±12,0%

139

Trong đợt 3 hình 7.49, có 2 ao đã thu hoạch sớm và chỉ còn 10 ao nuôi, phân

tích IHHNV trên những mẫu tôm trên những ao này này có 1 mẫu tôm bị nhiễm

IHHNV. Tôm của ao nhiễm IHHNV này có mật độ cao khoảng 130 con/ m2, ghi

nhận tôm có hiện tượng tôm lột bị dính vào thân, dị hình và hao hụt khoảng 30%.

Trong đợt thu mẫu lần 4, các ao tôm đều đều phát triển bình thường và có thể thu

hoạch, phân tích những mẫu này cho thấy có 4/10 ao nhiễm IHHNV chiếm tỷ lệ

40%, trong đó 1 ao cũ nhiễm IHHNV trước đó và 3 ao tôm trước đó không nhiễm

virus giờ đã nhiễm IHHNV. Nhìn chung ở mô hình bán thâm canh nuôi tôm thẻ

chân trắng tỷ lệ nhiễm trung bình khoảng 25,49±12,0%, mặc dù tỷ lệ nhiễm IHHNV

không cao như tôm sú, tuy nhiên ở tôm thẻ chân trắng khi nhiễm virus này có tỷ lệ

hệ hao hụt, dị hình và thu hoạch sớm hơn so với tôm sú. Qua kết quả nghiên cứu

cho thấy, tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm thẻ cao ở cuối vụ nuôi, có thể con giống

không sàng lọc mầm bệnh trước khi thả nuôi, dẫn đến nguồn bệnh duy trì trong hệ

thống nuôi. Đồng thời ở cuối vụ nuôi, sinh khối trong ao cao dẫn đến nhiễm môi

trường, tôm dễ bùng phát dịch bệnh. Điều này cũng đã được nhiều nghiên cứu

chứng minh (Flegel và ctv., 2012). Sự hiện diện tiềm tàng ở con giống, khi mật độ

cao và nguồn nước bị ô nhiễm thì giai đoạn tôm lớn thường dễ nhiễm IHHNV so

với tôm có độ tuổi nhỏ. Chính vì vậy, trong thời gian tới, người nuôi tôm thẻ chân

trắng cần phải xét nghiệm IHHNV trên con giống trước khi thả và cần phải quản lý

nước trong những tháng cuối vụ thu hoạch để tránh tình trạng lây nhiễm giữa các cá

thể trong quần đàn nuôi.

140

Hình 7.49. Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm thẻ nuôi trên mô hình bán thâm

canh ở Bến Tre

1.4. Mô hình nuôi thâm canh

Kết quả phân tích sự hiện diện IHHNV trên tôm sú và thẻ nuôi ở mô hình

thâm canh ở Bến Tre, Sóc Trăng và Kiên Giang.

- Đối với ao nuôi tôm sú

Năm 2012, đã khảo sát và thu mẫu trên những ao nuôi tôm sú của 3 trang trại

nuôi, một trang trại nuôi ở Sóc Trăng và 2 trang trại nuôi tôm ở tỉnh Kiên Giang. Ở

Sóc Trăng đợt 1 chúng tôi thu được 8 mẫu tôm sú nuôi ở các độ tuổi khác nhau từ

1-2 tháng tuổi. Sau phi phân tích PCR có 3/8 mẫu dương tính (37,5%). Đợt thu mẫu

lần 2, tôm ở các ao này đã chết vì vậy chúng tôi không thu mẫu được các lần tiếp

theo như kế hoạch mà thu thêm 8 ao khác, kết quả phân tích IHHNV trên các mẫu

này có 2/8 mẫu dương tính IHHNV chiếm 25%. Riêng ở Kiên Giang, chúng tôi thu

được mẫu hai trang trại, một trang trại 8 ao và thu được 4 đợt (1 tháng thu 1 đợt)

trong suốt vụ nuôi và 4 ao một trang trại khác và thu được 3 đợt, đợt thứ 4 tôm chết

không thu được. Kết quả phân tích nhiễm IHHNV được thể hiện ở bảng 7.11.

141

Hình 7.50. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm sú nuôi ở mô hình thâm canh năm 2012 ở

Kiên Giang và Sóc Trăng

Qua phân tích PCR cho thấy, mẫu tôm nhiễm IHHNV ở Kiên Giang có sự

biến động tùy theo độ tuổi, tôm khoảng 1 tháng tuổi thì tỷ lệ nhiễm rất thấp ở cả hai

trang trại. Tỷ lệ nhiễm (hình 7.50 ) tăng lên đáng kể ở trang trại 1 và 2, lên đến 50

% ở tháng thứ 2 (lúc này tôm hơn 2 tháng tuổi). Tới tháng thứ 3 tôm nhiễm (37,5%)

ít hơn so với tháng thứ 2 và tháng thứ 4 (62,5%). Vì tôm thu ngẫu nhiên nên đợt thu

mẫu này, có thể những cá thể không mang virus trong một số ao, nên khi phân tích

PCR kết quả âm tính dẫn đến tỷ lệ nhiễm thấp so với 2 đợt thu mẫu thứ 2 và thứ 4.

Trên tôm xanh người ta cũng nghi nhận ở độ tuổi nhạy cảm và nhiễm virus cao nhất

là tôm khoảng 35 ngày nuôi (Lightner và ctv., 1996). Vì tôm sú nuôi có độ tuổi 2

tháng có thể dễ mẫn cảm hơn so tôm nhỏ hơn 1 tháng hoặc lớn hơn 3 tháng nuôi đối

với virus, nên tỷ lệ nhiễm IHHNV cao hơn ở đợt thu mẫu lần 2. Thêm vào đó có thể

do yếu tố bất lợi như ô nhiễm môi trường dẫn đến tôm bị street tạo điều kiện cho

virus chúng lây lan mạnh ở giai đoạn này. Năm 2012, trên những mẫu thu tôm này

cho thấy tỷ lệ nhiễm IHHNV ở Kiên Giang ở 2 trang trại nuôi tôm sú là trại nuôi 1

là 40,6 ± 17% và trại nuôi 2 là 33,3±26,7%. Ở Sóc Trăng, tỷ lệ nhiễm IHHNV là

31,25± 22,7%.

142

Bảng 7.11. Kết quả phân tích IHHNV nhiễm trên mẫu tôm nuôi ở Kiên Giang và

Sóc Trăng năm 2012

Đợt thu mẫu Tỷ lệ nhiễm IHHNV (mẫu nhiễm/tổng mẫu thu)

Sóc Trăng Kiên Giang

Trang trại 1 Trang Trại 2

Đợt 1 3/8 (37,5 ± 33,5%) 1/8 (12,5 ± 22,9%) 1/4(25±42,4 %)

Đợt 2 2/8 (25 ± 30 %) 4/8 (50,0 ± 50,0%) 2/4(50,0 ± 49%)

Đợt 3 0 3/8 (37,5 ± 33,5%) 1/4(25± 42,4%)

Đợt 4 0 5/8 (62,5 ± 33,5%) 0

Tổng 5/16 (31,25± 22,7%) 13/32(40,6 ± 17%) 4/12(33,3±26,7%)

Đối với ao nuôi tôm thẻ

Năm 2013 do các trang trại nuôi tôm sú đã chuyển gần như 100% qua nuôi

tôm thẻ ở các tỉnh ở ĐBSCL. Vì vậy, chúng tôi đã chuyển qua thu tôm thẻ chân

trắng nuôi thâm canh của 4 trang trại trên 3 tỉnh ở Bến Tre, Sóc Trăng và Kiên

Giang (2 trang trại) nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của IHHNV trên tôm thẻ chân

trắng nuôi trên mô hình này như thế nào. Ở Sóc Trăng: đợt 1 chúng tôi thu được 15

mẫu tôm thẻ nuôi ở độ tuổi dưới 1 tháng tuổi. Sau phi phân tích PCR có 0/15 mẫu

dương tính. Đợt thu mẫu lần 2, tôm ở các ao này đã chết do bệnh hoại tử gan tụy vì

vậy mẫu không thu được theo các lần kế tiếp như trong kế hoạch, chỉ có 4 ao cũ thu

được đợt 2. Phân tích những mẫu tôm này đều cho kết quả có 2/4 mẫu có kết quả

dương IHHNV (50%). Trong đợt này, thu thêm 13 ao mới và phân tích PCR cho

thấy có 3/13 mẫu dương tính (27,07%). Ở Kiên Giang, thu mẫu tôm thẻ nuôi ở một

trang trại 1 là 10 ao và thu được 4 đợt (20-25 ngày tuổi thu 1 đợt) trong suốt vụ

nuôi. Và một trang trại khác (Trại 2) 11 ao, trại này chỉ thu mẫu ở giai đoạn tôm ấu

trùng khi thả và tôm sau khi thu hoạch, kết quả phân tích trên IHHNV trên tôm nuôi

ở trại này đều âm tính IHHNV. Riêng kết quả phân tích IHHNV ở trại 1 cho thấy

(bảng 7.12), các mẫu tôm thẻ ở các đợt thu 1, 2 và 3 đều cho kết quả âm tính với

IHHNV trên ao trại 1. Riêng ở đợt thu thứ 4 cuối vụ thu hoạch, tôm lúc này hơn 3

tháng tuổi, kết quả phân tích PCR những mẫu này có 2/10 mẫu nhiễm IHHNV

(20%). Phân tích IHHNV trên tôm thẻ ở ao nuôi Bến Tre, tất cả 5 ao nuôi đều

không phát hiện IHHNV.

143

Bảng 7.12. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên các ao tôm nuôi thẻ ở mô hình thâm canh ở

Bến Tre, Sóc Trăng và Kiên Giang

Đợt thu

mẫu

Mẫu thu ở các tỉnh (mẫu dương/tổng số mẫu thu)

Sóc Trăng Kiên Giang Bến Tre

Số mẫu

nhiễm

Tỷ lệ (%) Trại 1 Tỷ lệ

(%)

Trại 2 Tỷ lệ

(%)

Số

mẫu

nhiễm

Tỷ

lệ

(%)

Đợt 1 0/15 0 0/10 0 11 0 0/5 0

Đợt 2 5/17 29,41% 0/10 0 - 0 0/5 0

Đợt 3 - - 0/10 0 - 0 0/5 0

Đợt 4 - - 2/10 20,0 0/11 0 0/5 0

Tổng số 5/32 15,63±12,6 2/40 5,0±6,8 0/11 0 0/20 0

Kết quả phân tích trên những mẫu tôm thẻ nuôi ở Sóc Trăng cho thấy, có một

số ao bị nhiễm IHHNV trong quần đàn tôm thẻ nuôi có thể từ nguồn gốc từ giống

trước khi nuôi vì con giống trước khi thả nuôi mặc dù có xét nghiệm các loại virus

nguy hiểm khác nhưng không có xét nghiệm IHHNV. Thêm vào đó, có thể do tôm

bị ảnh hưởng của vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy dẫn đến tôm yếu đi và khi tôm

đã có mầm bệnh dễ nhiễm IHHNV trên tôm ở giai đoạn sớm hơn và gây chết nhanh

trên các ao thu. Điều này cũng đã được chứng minh khi tôm thẻ nhiễm WSSV kết

và vi khuẩn lây nhiễm trên tôm đã làm gia tăng tỷ lệ chết trong quần đàn tôm

nghiên cứu (Phước và ctv., 2008). Ở kết quả phân tích IHHNV trên tôm nuôi ở Kiên

Giang, ở các đợt thu mẫu trên trại 2, ở giai đoạn đầu con giống đã được xét nghiệm

IHHNV và quá trình quản lý, theo dõi và chăm sóc kỹ hơn. Tôm thu mẫu định kì

khi xét nghiệm và nguồn nước được đo sự biến động hằng ngày thì ở những ao này,

tôm thu hoạch xét nghiệm các ao nuôi trong 11 ao này đều không mang mầm bệnh

virus. Ngược lại, ở trại 1 thu mẫu ở các đợt 1, 2 và 3, tôm lúc này đã hơn 2,5 tháng

không có sự hiện diện IHHNV. Tuy nhiên tôm trên 3 tháng tuổi, phân tích PCR cho

thấy có sự hiện diện IHHNV 2/10 ao nhễm virus. Có thể lúc này tôm lớn, do đó các

nguồn lây nhiễm trung gian nhiều trong ao và nguồn nước trong ao tích tụ chất hữu

cơ dẫn đến tôm stress và tạo điều kiện cho IHHNV lây lan mạnh ở trong quần đàn

của tôm thẻ nuôi. Tuy nhiên, về năng suất các ao nuôi bị nhiễm và không nhiễm ở

trại 1 không có sự khác biệt lớn. Vì lúc này tôm không chết nhiều và đã ở giai đoạn

thu hoạch.

144

IHHNV đã được nghi nhận hiện diện trên nhiều trang trại nuôi tôm của nhiều

quốc gia như Đông Bắc Mỹ, Mexico, Ecuador, Peru, Brazil, Caribbean và các Quốc

gia Trung Mỹ, Hawaii, Guam, Tahiti và New Caledonia. IHHNV là nguyên nhân

gây thiệt hại về sản lượng trên tôm thẻ và tôm xanh Thái Bình Dương. Lightner và

ctv (1997) cho rằng IHHNV là tác nhân gây bệnh không đáng kể trên các trang trại

nuôi tôm sú ở Châu Á. Có những bằng chứng cho thấy tôm sú là loài dễ mẫn cảm

với virus này và dịch bệnh IHHN trong các quần đàn tôm sú nuôi chỉ xảy ra nếu

chúng tiếp xúc tương đối lớn với số lượng của virus. Trong thực tế, dịch bệnh xảy

ra trên quần đàn tôm sú khi được thả nuôi với tôm xanh và tôm thẻ chân trắng

(Lightner và ctv., 1983). Hiện nay, các ao nuôi ở ĐBSCL đang chuyển đổi đa số từ

tôm sú nuôi tôm thẻ chân trắng, một số trang trại đang nuôi đang xen giữa hai loài

này với nhau. Đó là mối nguy tiềm tàng mà chúng có thể mang virus suốt đời và

truyền cho tôm thẻ chân trắng, nếu hai loài này thả nuôi gần nhau dù bất kỳ giai

đoạn nào trong vòng đời của chúng. Chính vì vậy, cần phải thận trọng một khi virus

lây truyền từ tôm sú qua tôm thẻ chân trắng hoặc từ tôm chân trắng lây sang tôm sú,

mà tôm thẻ chân trắng là vật chủ dễ bị bệnh dị dạng và còi cọc dẫn đến bị giảm

năng suất thu hoạch.

1.5. Trang trại sản xuất giống

Nhằm đánh giá và theo dõi sự hiện diện IHHNV ở các quy mô trại sản xuất

giống, chúng tôi dựa trên đánh giá phân loại qui mô trang trại theo bảng 7.13.

Bảng 7.13. Phân loại qui mô trại sản xuất giống.

Các chỉ tiêu Qui mô nhỏ Qui mô lớn

Sở hữu và điều hành

hoạt động

Các thành viên trong gia

đình

Hợp tác lớn, cơ quan Nhà

nước, giống sản xuất

bán đại trà

Diện tích Tận dụng diện tích đất quanh

nhà

5.000m2– 1 ha

Sản lượng 1-5 triệu PL/ năm Trên 20 triệu PL/năm

Số công nhân, kỹ thuật 1 kỹ thuật, 2 công nhân

3-6 kỹ thuật, 6-10 công nhân

Tổng thể tích bể ương 20-100m3 Trên 1000m3

Hệ thống an toàn sinh

học

Một người quản lý nhiều bể

ương. Không có xét nghiệm

Mỗi công nhân quản lý nhà

ương riêng biệt. Có xét

145

con bố mẹ nghiệm con bố mẹ

Có rất nhiều thống kê cho thấy tỷ lệ nhiễm IHHNV rất cao trong các quần đàn

tôm bố mẹ, đặc biệt trên tôm thẻ chân trắng. Theo Motte và ctv. (2003) tỷ nhiễm

IHHNV trên quần đàn tôm bố mẹ rất cao 63% ở Ecuador, trên 95% IHHNV nhiễm

trên quần đàn tôm bố mẹ ở Panama. Tỷ lệ nhiễm virus cao và nhanh chóng lan

truyền truyền dọc cho thế hệ con trong hệ thống nuôi trồng thủy sản mở đã được

chứng minh (Pantoja và ctv., 1999). Bên cạnh đó một số tôm mẹ nhiễm IHHNV

không có biểu hiện lâm sàn về bệnh do virus này, nhưng chúng có thể truyền virus

qua thế hệ con của chúng.

Hình 7.51. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm IHHNV trên các giai đoạn ấu trùng và mẹ từ các

trại ương khác nhau ở Miền Nam và Miền Trung

Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu được 68 bể ương tôm con của trại giống

lớn và 45 bể ương tôm con của trại giống nhỏ ở Miền Trung, phân tích PCR trên

những mẫu này cho thấy (hình 7.51) tỷ lệ nhiễm ở trại ương giống quy mô lớn

Nauplii là 2,94±4,0%, Zoea là 8,82±6,7%, Mysis là 14,70±8,4% và Postlarvae là

26,47±10,5%. Ở trại giống qui mô nhỏ tỷ lệ nhiễm IHHNV ở Nauplii là

47,83±14,4%, Zoea 67,39±13,5%, Mysis 80,43±11,5% và Postlarve 80,43±11,5%.

Riêng con mẹ tham gia sinh sản ở trại giống lớn của đàn ấu trùng này là 53 con mẹ

có 19 con mẹ bị nhiễm IHHNV, tỷ lệ con mẹ nhiễm 45,3±13,4% và tôm mẹ của trại

nhỏ là 73,33±15,8% (22/30 con dương tính IHHNV). Trong khi đó, ở trại ương

146

giống nhỏ ở Miền Nam tỷ lệ nhiễm IHHNV ở ấu trùng và con mẹ tham gia sinh sản

lần lược là Nauplii là 37,25±13,3%, Zoea là 39,22±13,4%, Mysis là 47,06±13,7%

và Postlarvae là 39,53±14,6% và mẹ là 51,43±16,6%. Kết quả trên cho thấy tỷ lệ

nhiễm IHHNV ở con mẹ tham gia sinh sản ở trại giống lớn 45,3±13,4%, trại giống

nhỏ ở 2 vùng đều cao hơn so với các giai đoạn ấu trùng. Kết quả này cho thấy tỷ lệ

nhiễm IHHNV có tỷ lệ thuận với sự phát triển giai đoạn của trùng trong các bể

ương theo dõi ở tất cả các trang trại. Giai đoạn Naupli có tỷ lệ nhiễm 2,94±4,0%

nhưng đến giai đoạn postlarvae tỷ lệ nhiễm IHHNV tăng lên 26,47±10,5% ở trại

ương giống lớn. Và cũng tương tự với trại nhỏ trong bảng 7.14. Kết quả này cho

thấy tỷ lệ nhiễm IHHNV có thể cao hay thấp tùy thuộc vào con bố mẹ tham gia sinh

sản. Những con bố mẹ nhiễm nhẹ thì trứng của chúng nhiễm nhẹ, hoặc chưa nhiễm

cho nên tỷ lệ nhiễm ở các đàn ấu trùng giai đoạn đầu thấp. Tuy nhiên, lên giai đoạn

Mysis và Postlavae thì tỷ lệ nhiễm rất cao điều này cho thấy, trong quần đàn ấu

trùng có sự lây nhiễm truyền ngang giữa những con đã mang virus trước đó, đây là

quá trình truyền ngang giữa những ấu trùng mang mầm bệnh với nhau như ăn thịt

lẫn nhau hay ăn chất thải của con mang mầm bệnh hay virus có có trong nguồn

nước, hoặc ấu trùng bị nhiễm từ hệ thống ương nuôi. Điều này cũng đã được chứng

minh trên những trại ương tôm sú và tôm thẻ chân trắng (Motte và ctv., 2003;

Withyachumnarnkul và ctv., 2006).

Bảng 7.14. Kết quả phân tích PCR trên mẫu tôm thu ở trại giống lớn và nhỏ ở Miền

Trung và Miền Nam

Tỷ lệ nhiễm IHHNV(%) trên giai đoạn tôm ương tôm ương ước lượng P<0.05

Địa điểm Nauplii Zoea Mysis Postlarvae Tôm mẹ

Miền Trung

Trại lớn 2,94±4,0 8,82±6,7 14,70±8,4 26,47±10,5 45,3±13,4

Miền Trung

Trại nhỏ 47,83±14,4 67,39±13,5 80,43±11,5 80,43±11,5 73,33±15,8

Miền Nam

Trại nhỏ 37,25±13,3 39.22±13,4 47,06±13,7 39,53±14,6 51,43±16,6

Khi phân tích tỷ lệ nhiễm ở các trại ương giống, cho thấy tỷ lệ nhiễm của mỗi

trại ương có tỷ lệ nhiễm khác nhau bảng 7.14. Ở những trại ương nhỏ, tỷ lệ nhiễm

IHHNV ở ấu trùng cao hơn so với trại ương lớn. Với tỷ lệ nhiễm IHHNV ở trại nhỏ

147

Miền Trung có nauplii là 47,83±14,4% và các giai đoạn ấu trùng Zoea

67,39±13,5%, Mysis 80,43±11,5%, Postlarve 80,43±11,5%. Trại giống nhỏ Miền

Nam, Nauplii là 37,25±13,3%, Zoea là 39,22±13,4%, Mysis là 47,06±13,7% và

Postlarvae là 39,53±14,6%. Ngược lại trại giống lớn ở Miền Nam có tỷ lệ nhiễm ở

ấu trùng cao nhất là postlarvae 26,47±10,5%. Kết quả này cho thấy, quản lý trại

ương cũng như qui mô trại ương rất lớn trong tỷ lệ nhiễm IHHNV. Trong một

nghiên cứu của Motte và ctv (2003), khi phân tích tỷ lệ nhiễm virus tăng lên của

con tôm cái gia hóa theo số lần đẻ. Chính vì điều này cũng giống như nghiên cứu

này, thường các trại giống nhỏ trong khảo sát thường sử dụng con mẹ cho sinh sản

nhiều lần (2-3 lần) dẫn đến tỷ lệ nhiễm ở quần đàn ương nuôi cao hơn so với trại

giống lớn (chỉ sử dụng con mẹ đẻ 1-2 lần là thải. Thêm vào đó, trại giống nhỏ ở

Miền Trung và Miền Nam thường sử dụng những đàn tôm bố mẹ nội địa, mà những

con tôm mẹ đánh bắt ở tự nhiên nhiễm IHHNV rất cao trên 50% quần đàn (số liệu

được trình bày trong mục 2). Số con mẹ được cho đẻ trong trại giống ương này chỉ

tối đa chưa tới 10 con. Và sau khi đẻ trứng của nhiều con mẹ dồn lại và cho ấp trong

từng bể ương khác nhau. Chính vì vậy, sự hiện diện của mầm bệnh từ con mẹ nhiễm

IHHNV và không nhiễm ở trại này rất cao. Ngược lại tôm sú ở trại giống lớn ở

Miền Trung, tất cả các con mẹ trước khi đưa vào sinh sản đều xét nghiệm, con mẹ

chủ yếu nhập ngoại đã qua xét nghiệm. Con bố và mẹ không nhiễm các mầm bệnh

virus YHV, WSSV, LSNV và IHHNV được chọn nuôi và cho sinh sản, nên tỷ lệ

nhiễm IHHNV ở trại giống này thấp hơn.

Theo dõi trên trại giống ở Trung Tâm Hải Sản Vũng Tàu (nơi có hệ thống

ương rất nghiêm ngặt về an toàn sinh học). Kết quả theo dõi 69 quần quần đàn từ

101 con tôm bố mẹ đã xác định âm tính với các virus (IHHNV, YHV, WSSV và

LSNV). Những con này cho sinh sản và ương nuôi được 117 quần đàn tôm

postlavae. Kết quả kiểm tra những 117 mẫu post này từ gia đình bố mẹ sạch bệnh

chỉ có 4/117 mẫu nhiễm IHHNV 3,42±3,3%. Kết quả này cho thấy, ở có 4 đàn con

nhiễm IHHNV được sinh ra từ một số con mẹ nhiễm rất nhẹ mà kỹ thuật PCR

không đã mang IHHNV và truyền cho 4 đàn tôm post này. Và kết quả đã chứng

minh rằng nếu trong quần đàn có con nhiễm virus IHHN có thể từ những cá thể mẹ

148

nhiễm virus. Điều này phù hợp với nghiên cứu trước đó của Withyachumnarnkul và

ctv. (2006). Ông cho rằng có 20% tôm Postlarvae có sự hiện diện IHHNV được

sinh ra từ con mẹ nhiễm IHHNV nhẹ hoặc tinh trùng của con bố mang virus.

Theo dõi 117 đàn postlarvae này được tách và nuôi riêng trong các nhà nuôi

riêng biệt trong 138 bể. Sau 60 ngày ngày nuôi, tôm này được cắt chân bơi và kiểm

tra ngẫu nhiên 10 cá thể/bể nuôi. Kết quả phân tích PCR có 72/138 (52,17±8,3%)

mẫu nhiễm IHHNV, ngoài những bể nuôi có tôm post nhiễm IHHNV thì những bể

khác trước đó âm tính IHHNV cũng nhiễm virus. Kết quả này cho thấy, những đàn

tôm sú postlarvae không nhiễm IHHNV trước đó mà bị nhiễm sau này 60 ngày nuôi

có thể virus từ nguồn tôm Postlarvae mang virus mức độ nhẹ mà PCR không phát

hiện được hay virus kí sinh trên những kí chủ khác trong hệ thống sau đó phát tán ra

bên ngoài môi trường nước, hay từ một nguyên nhân khác như quản lý và hiện

tượng lây chéo xảy ra giữa các bể nuôi, hay virus có thể từ trạng thái chèn vào bộ

gen tôm gặp điều kiện thuận lợi sẽ kích hoạt và trở lại hoạt động như 1 virus ngoại

sinh. Theo các nghiên cứu trước các parvovirus khác được biết đến như nguyên

nhân lây nhiễm tiềm tàng, đôi khi chúng liên quan đến sự chèn vào bộ gene và có

thể có hoạt tính trở lại dưới tác động của nhân tố môi trường hoặc sự xâm nhiễm

cùng với các virus DNA không có họ hàng với chúng (Tattersall và ctv., 2005;

Geoffroy và ctv., 2006). Vì vậy, ngoài sự truyền ngang trong quần đàn tôm sú này,

có thể đàn tôm postlarvae có thể mang virus type không lây nhiễm đã trở thành

virus type lây nhiễm trong đàn tôm sú 60 ngày tuổi này. Đây có thể là một trong

những nguyên nhân ban đầu gây nên tỷ lệ nhiễm cao trong đàn tôm nuôi, nên cần có

thêm nghiên cứu để chứng minh điều này.

2. Sự hiện diện IHHNV trên tôm bố mẹ tự nhiên

Tôm bố mẹ thu được thu nhận từ tháng 3 đến tháng 10/2013 ở các vùng đánh

bắt tôm sú ở Việt Nam và nhập từ nước ngoài về bảng 7.15. Trong đó tổng số có

555 con mẹ tôm đánh bắt tự nhiện đã được phân tích bằng PCR. Tất cả những con

mẹ được cắt chân bơi để sàn lọc sự hiện diện IHHNV trước khi đưa vào cho sinh

149

sản. Kết quả phân tích cho thấy, IHHNV hiện diện trên tôm bố mẹ ở các địa phương

trong Việt Nam rất cao bảng 7.15.

Bảng 7.15. . Tỷ lệ nhiễm IHHNV trong quần đàn tôm sú ở Việt Nam và nhập từ Ấn

Độ Dương và Thái Bình Dương được phát hiện bằng Mutiplex PCR trên chân bơi

của tôm sú

Nguồn tôm bố mẹ Số tôm phân

tích

Số tôm nhiễm

IHHNV

Tỷ lệ nhiễm

(%)

Ấn Độ Dương 134 13 9,70±5,0

Đà Nẵng 113 52 46,01±9,2

Phú Yên 47 30 63,83±13,7

Rạch Gốc 135 79 58,51±8,3

Thái Bình Dương 126 15 11,90±5,7

Tỷ lệ nhiệm tôm bố mẹ ở Phú Yên có tỷ lệ nhiễm IHHNV cao nhất là 63,83%,

kế đến là tôm bố mẹ Rạch Gốc với tỷ lệ nhiễm IHHNV là 58,51±8,3% và Đà Nẵng

là 46,01±9,2%. Tôm nhập ngoại có tỷ lệ thấp nhất là Ấn Độ Dương 9,70±5,0% và

Thái Bình Dương là 11,9±5,7%. Trung bình tỷ lệ nhiễm tôm mẹ ở Việt Nam là

56,12±5,7%. Tỷ lệ này cho thấy mức độ hiện diện IHHNV trong quần đàn tôm sú

bố mẹ tự nhiên dao động từ 46-63%. Tỷ lệ này gần với tỷ lệ tôm sú nhiễm IHHNV

trong các ao nuôi tôm sú mà Hùng và ctv, 2009 đã thống kê cho thấy trên 52%.

Những nghiên cứu trước đây cho thấy sự hiện diện trong quần đàn tôm bố mẹ tự

nhiên và trong quần đàn tôm nuôi có mối liên hệ mất thiết với nhau trong việc lan

truyền của virus từ trại giống đến các ao nuôi (Motte và ctv., 2003). Sự lan truyền

IHHNV cao trong quần đàn tôm sú ở Phú Yên cao hơn so với Rạch Gốc và Đà nẵng

vì vùng này có địa lý gần với các tỉnh (Ninh Thuận, Bình Thuận và Khánh Hòa).

Những tỉnh này có mật độ trại sản xuất tôm giống rất cao. Nhiều trại giống sản xuất

tôm giống, sau khi đã cho đẻ, những con bố mẹ (không có xét nghiệm IHHNV) đã

hết khả năng sinh sản sẽ được thả lại ra ngoài biển. Chính vì vậy, điều này có thể đã

tạo điều kiện cho những con tôm mẹ yếu này mang mầm bệnh phát tán ra quần đàn

tôm bố mẹ tự nhiên dễ dàng hơn. Sự thay đổi về địa lý vùng cũng đã được Pantoja

và ctv. (1999) chứng minh về sự thay đổi điều kiện địa lý như độ sâu của nước, sự

bay hơi, hay lưu lượng luân chuyển giữa vùng nông và vùng sâu dẫn đến sự hiện

diện IHHNV trong quần tôm xanh ở Vùng Gulf nằm giữa sông Colorado đến đảo

150

Angel de la Guarda và Tiburón của Mexico. Sự hoạt động nuôi trồng tôm sú và tôm

thẻ ở các vùng ven biển ở Việt Nam cũng là một nguyên nhân chính trong việc phát

tán IHHNV ra môi trường bên ngoài tự nhiên. Còn một nguyên nhân khác nữa là sự

đánh bắt và bảo quản tôm bố mẹ tự nhiên sau khi đánh bắt của các ngư dân không

tốt, người ta nuôi dưỡng lâu ngày trong thời gian dài trước khi bán cho các trại sản

xuất giống dẫn đến sự lây truyền lẫn nhau giữa những con mang virus và con không

mang virus.

3. Xác định tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm sú theo độ tuổi

Để đánh giá tôm ở giai đoạn nào dễ mẫn cảm với bệnh hoại tử cơ quan tạo

máu và lập biểu mô (IHHNV) trên tôm sú nhắt. Chúng tôi tiến hành phân tích mẫu

theo từng nhóm độ tuổi ở tất cả các mô hình nuôi. Mẫu sau khi phân tích bằng

multiplex PCR kết quả thu nhận được như sau:

- Nhóm dưới 1 tháng tuổi: Phân tích tổng cộng 18 mẫu, có 6 mẫu nhiễm

IHHNV và 12 mẫu không nhiễm, tỷ lệ nhiễm ở nhóm tuổi này là 33.33%.

- Nhóm từ 1 đến 2 tháng tuổi: Phân tích tổng cộng 14 mẫu, trong đó có 11

mẫu nhiễm IHHNV và 3 mẫu không nhiễm, tỷ lệ nhiễm ở nhóm tuổi này là 78.57%.

- Nhóm 2 tháng tuổi trở lên: Phân tích tổng cộng 15 mẫu, trong đó có 9 mẫu

nhiễm IHHNV và 6 mẫu không nhiễm, tỷ lệ nhiễm ở nhóm tuổi này là 60.00%

Phân tích kết quả thu được với hàm CHITEST chỉ ra rằng sự khác biệt về tỷ lệ

nhiễm ở các nhóm tuổi so sánh là có ý nghĩa (p < 0.05), nói cách khác là tỷ lệ nhiễm

IHHNV trên tôm sú sẽ khác nhau theo từng độ tuổi khác nhau, tỷ lệ nhiễm này phụ

thuộc vào độ tuổi của tôm. Kết quả được thể hiện qua biểu đồ sau:

151

Hình 7.52. Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm IHHNV (%) giữa các nhóm tuổi

Dựa vào kết quả phân tích PCR và biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm IHHNV giữa

các nhóm tuổi, có thể thấy ở độ tuổi từ 1 đến 2 tháng tuổi, tôm sú có tỷ lệ nhiễm

IHHNV cao nhất (78.57%), độ tuổi trên 2 tháng có tỷ lệ nhiễm thấp hơn (60%) và

dưới 1 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm thấp nhất (33.33%).

Điều này phù hợp với các nghiên cứu về độ tuổi dễ lây nhiễm nhất của các loài

virus trên tôm là giai đoạn từ 1-2 tháng tuổi. Trên đối tượng tôm sú, hai loài virus

được đánh giá nguy hiểm nhất là virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) và virus gây

bệnh đầu vàng (YHV), trong đó tất cả các kích cỡ hay giai đoạn tôm đều dễ nhiễm

bệnh đốm trắng, nhưng tỷ lệ phát bệnh diễn ra mạnh nhất từ giai đoạn tôm 1-2 tháng

tuổi sau khi thả nuôi, (Kasornchandra và ctv, 1998), còn bệnh đầu vàng có thể xuất

hiện sau khi thả giống 20 ngày, thường gặp nhất 50-70 ngày ở các ao nuôi tôm sú

thâm canh (Bùi Quang Tề, 2004). Ngoài ra, trong các nghiên cứu trước đó cũng chỉ

ra rằng tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng và tôm chưa trưởng thành dễ bị nhiễm IHHNV

hơn tôm trưởng thành do sự hiện diện của các tế bào có tính phân chia mạnh (Bell

và ctv., 1984; Kalagayan và ctv.,1991). Bên cạnh đó, ở giai đoạn từ tôm từ 1-2

tháng tuổi, sau một thời gian nuôi, môi trường ao nuôi xuống cấp, lượng thức ăn dư

thừa trong ao có sự tồn đọng khiến môi trường trong ao chứa nhiều tạp khuẩn, tôm

152

dễ nhiễm các bệnh làm giảm sức đề kháng, tạo điều kiện cho virus lây nhiễm tôm

dễ dàng hơn, nhất là sau các lần lột xác tôm dễ mẫn cảm với tác nhân gây bệnh.

Trong khi đó ở giai đoạn nhỏ hơn, tôm chưa tiếp xúc nhiều với môi trường tự nhiên,

khả năng lây nhiễm loài sang loài hay từ các loài khác mang mầm bệnh đến còn

thấp. Còn khi tôm trên 2 tháng tuổi, tôm đã quen thuộc với các điều kiện của môi

trường nuôi và khả năng miễn dịch phòng chống các tác nhân gây bệnh đã cao hơn.

Theo kết quả phân tích này, IHHNV cũng lây nhiễm nhiều nhất trên tôm ở giai đoạn

từ 1-2 tháng tuổi như một số loại virus gây bệnh trên tôm khác, nên giai đoạn này

cần tăng cường các điều kiện môi trường thích hợp, cho tôm ăn các loại thức ăn

giúp tăng khả năng đề kháng và hạn chế các nguồn lây nhiễm virus từ ngoài bên

ngoài vào ao nuôi.

4. Đánh giá sự ảnh hưởng của IHHNV lên trọng lượng và kích thước

Kết quả theo dõi trọng lượng, chiều dài thân của tôm sú có liên quan đến tôm

nhiễm hay không nhiễm IHHNV được thể hiện trong bảng 7.16. Trong nghiên cứu

này, do các nhóm tôm nuôi không cùng thời gian thả nuôi, nên tôm được phân

nhóm theo độ tuổi từ dưới 50-60 ngày tuổi; nhóm từ 60-70 ngày tuổi và nhóm lớn

70 ngày tuổi. Kết quả phân tích cho thấy ở nhóm tôm từ 50-60 ngày tuổi, tôm

không nhiễm IHHNV có trọng lượng và chiều dài thân tương ứng là 0,61±0,26 và

4,55±0,66. Đối với tôm nhiễm ở nhóm này có trọng lượng và chiều dài thân

0,66±0,15 và 4,64±0,39. Nhóm tôm có độ tuổi từ 60-70 trọng lượng thân và chiều

dài ở nhóm không nhiễm và nhiễm IHHNV lần lược là 0,81±0,18 và 5,00±0,36;

0,90±0,21 và 5,14±0,44. Đối với nhóm tôm trên 70 ngày tuổi thì trọng lượng thân

và chiều dài thân trên nhóm không nhiễm là 1,10±0,31 và 5,56±0,54, trên nhóm

nhiễm IHHNV là 1,03±0,24 và 5,44±0,43.

153

Bảng 7.16. Kết quả theo dõi tôm sú phát triển trọng lượng và kích thước ở nhóm

tôm nhiễm và không nhiễm IHHNV theo ngày tuổi.

Ngày

tuổi

Kết quả

PCR

Số lượng bể

theo dõi

Trọng lượng

trung bình ±SD

Kích thước

trung bình±SD

50-60 (-) 4 0,61±0,26 4,55±0,66

(+) 7 0,66±0,15 4,64±0,39

60-70 (-) 16 0,81±0,18 5,00±0,36

(+) 30 0,90±0,21 5,14±0,44

Trên 70 (-) 12 1,10±0,31 5,56±0,54

(+) 25 1,03±0,24 5,44±0,43

Sự tác động của virus lên sự tăng trưởng của tôm sú, một nghiên cứu cho

thấy, trên tôm sú nuôi ở Philipine có hiện tượng dị dạng còi cọc, phát triển có kích

thước không đều khi nhiễm IHHNV (Primavera & Quinitio., 2000), trên tôm sú

nuôi ở Ấn Độ có hiện tượng tôm chậm lớn khi nhiễm IHHNV. Theo Rai và ctv.

(2009) ngoài những virus MBV, HPV và LSNV gây hội chứng chậm lớn, thì

IHHNV cũng có mối liên hệ đến sự chậm phát triển ở tôm sú. Trong các trại giống,

khi ấu trùng tôm nhiễm IHHNV thì kích thước của chúng có sự thay đổi rất rõ. Khi

so sánh kích thước hai quần thể tôm postlarvae ở quần thể tôm sú postlarvae

(≥PL15) nhiễm IHHNV thì chiều dài của tôm ≤12 mm, trong khi đó quần thể tôm

postlarvae không nhiễm thì chiều dài của tôm >12 mm. Tuy nhiên, các nghiên cứu

khác cho rằng việc nhiễm IHHNV không có tác động lớn về sự phát triển của tôm

nuôi. Theo Withyachumnarnkul và ctv. (2006) nghiên cứu về ảnh hưởng của virus

đến tăng trưởng của tôm, số lượng trứng được đẻ và tỷ lệ nở trứng cho thấy không

có sự ảnh hưởng lớn nào đến sự phát triển của tôm sú cũng như đến sinh sản khi

tôm mẹ nhiễm nhẹ IHNNV. Một nghiên cứu khác ở Barazil mới đây trên tôm thẻ

chân trắng cho thấy, mặc dù sự hiện diện của IHHNV với tỷ lệ rất cao nhưng khi

phân tích thống kê thì thấy không có mối tương quan nào giữa sự nhiễm IHHNV và

dấu hiệu RDS hay trọng lượng cơ thể tôm cũng như thời gian nuôi trong ao (Braz

và ctv., 2009).

154

Hình 7.53. Sơ đồ thể hiện sự tương quang giữa nhóm không nhiễm (-) và nhiễm

IHHNV (+) lên trung bình trọng lượng và chiều dài tôm ở các độ tuổi khác nhau

(M±SD).

Trong nghiên cứu này, khi so sánh thống kê ở nhóm tôm nhiễm IHHNV và

không nhiễm ở các nhóm tôm có độ tuổi khác nhau thì không có sự khác biệt có ý

nghĩa về chiều dài cũng như trọng lượng thân của các nhóm tôm hình 7.50. Vì vậy,

có thể nói IHHNV nhiễm trên tôm sú không có sự tác động lớn đến trọng lượng và

chiều dài thân.

5. Đề xuất giải pháp hạn chế sự lây lan

Hiện nay chưa có giải pháp chiến lược hiệu quả nào để điều trị hoặc phòng

ngừa sự hiện diện hoặc lây lan của virus này. Trong nghiên cứu này, đề tài đã thành

công trong phương pháp chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm với độ nhạy và đặc hiệu

cao. Vì vậy, nên đưa qui trình này vào trong sàng lọc IHHNV trên tôm sú và thẻ

nuôi ở Việt Nam.

Trong thí nghiệm lây nhiễm truyền ngang và truyền dọc, kết quả của nghiên

cứu đã chứng minh IHHNV lây nhiễm từ mẹ sang con, và lây truyền ngang giữa các

cá thể cùng loài và khác loài. Chính vì vậy cần phải qui hoạch vùng nuôi một cách

khoa học, để trách hiện tượng nhiễm chéo giữa hai đối tượng này.

155

Sự lây truyền trong quần đàn tôm sú ương ở trại giống cũng đã được chứng

minh tỷ lệ nhiễm cao hay thấp tùy thuộc vào độ tuổi (1-2 tháng). Chính vì vậy để

phòng trị bệnh một cách hiệu quả, giai đoạn này cần tăng cường các điều kiện môi

trường thích hợp, cho tôm ăn các loại thức ăn giúp tăng khả năng đề kháng và hạn

chế các nguồn lây nhiễm virus từ ngoài bên ngoài vào ao nuôi.

Kiểm soát được nguồn tôm bố mẹ sạch bệnh bằng cách sàng lọc con mẹ nhiễm

IHHNV bằng PCR. Cần phải nâng cao an toàn sinh học trong các trại ương để giảm

sự lây truyền và phát tán virus trong quần đàn tôm sú ương. Sau khi đẻ trứng nên

được rửa và khử trùng bề mặc để tránh hiện tượng lây nhiễm kí sinh IHHNV từ

nước vào trứng

Cần phải xét nghiệm mầm bệnh IHHNV ở con giống trước khi thả nuôi và hệ

thống ao nuôi phải có thêm ao lắng để cung cấp nước nếu dịch bệnh xảy ra.

Đối với tôm thẻ, tôm giống mật độ thả hợp lý, không nên thả giống mật độ cao

và quản lý chất lượng nước trong suốt quá trình nuôi và nên xét nghiệm định kì để

có biện pháp xử lý kịp thời.

Sự chèn ngẫu nhiên của IHHNV type lây nhiễm vào bộ gen tôm sú đã được

phát hiện ở Thái Lan. Ở tôm sú nuôi ở Việt Nam cũng phát hiện chủng IHHNV type

lây nhiễm đột biến (thay thế nucleotide) và IHHNV type A. Chính vì vậy có thể dựa

vào đặc tính này, để chọn lọc tôm nhiễm virus chèn vào gen tôm để làm nguồn tôm

bố mẹ.

Mặc dù ít thấy sự ảnh hưởng của virus nhiễm trên tôm sú về chiều dài và trọng

lượng cho thấy tôm nhiễm IHHNV và không nhiễm IHHNV không có sự khác biệt

về chiều dài và trọng lượng sau 60 ngày nuôi từ postlarvae. Cũng như không thấy

sự khác biệt về số lượng ấu trùng nauplii nở giữa con nhiễm và con không nhiễm.

Tuy nhiên, trong quá trình ương giống nên sử dụng con mẹ không mang virus là cần

thiết.

156

Những nghiên cứu gần đây cho thấy, ứng dụng sợi dsRNAi tương ứng với

protein capsid của IHHNV (CP) đã được ứng dụng trên dế nhà (Acheta domesticus)

sau khi lây nhiễm. Kết quả khi tiêm sợi dsRNAi cho thấy sợi dsRNAi có hiệu quả

khi làm giảm sự nhân lên của virus. Kết quả này có thể gợi mở một hướng mới

trong phòng trị virus nhiễm trên giáp xác khi sử dụng sợi đặc hiệu dsRNAi.

Bên cạnh đó, người nuôi cần phải cập nhật những kiến thức cơ bản cũng như

ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào nghề nuôi tôm. Cần phải có sự chia sẽ giữa

các nhà khoa học về các nghiên cứu mới về virus này với người nuôi. Từ đó để có

những giải pháp kịp thời trong việc phòng ngừa và xử lý dịch bệnh do virus.

VIII. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết Luận

Nội dung 1: Nghiên cứu đặc trưng di truyền của chủng IHHNV thu nhận ở

Việt Nam

Trong nghiên cứu này đã xác định chủng virus IHHNV type A/B hiện diện ở

tôm sú nuôi ở ĐBSCL và Miền Trung. Độ tương đồng rất cao với chủng IHHNV

type A ở Madagascar và Úc (100%) và tương đồng thấp với các chủng IHHNV lây

nhiễm 86%.

Thu nhận và giải trình tự 8 bộ gen của chủng IHHNV type lây nhiễm trên

tôm sú nuôi ở các tỉnh ở ĐBSCL Đã đăng kí 2 bộ gen IHHNV thu nhận ở ĐBSCL

lên ngân hàng gen thế giới với mã số genbank: JX840067 và KC513422.

Chủng IHHNV thu nhận có kí hiệu BL, BT, TG ST có độ tương đồng rất cao

lên đến gần 100 % và có họ hàng gần với chủng có Đài Loan A, B và Thái Lan

2000 trên 99,4%. Chủng IHHNV thu nhận có kí giệu KG có trình tự tương đồng cao

và có họ hàng gần với chủng ở Hawai và Mexico, Đài Loan C và Ecuador, độ tương

đồng bộ gen trên 99,3%. Có độ tương đồng thấp với type A ở Madagascar

(DQ228358) và Úc (EU675312) (86,8%<), Tanzania type B (AY124937) 91-92%.

Đã xác định IHHNV có sự đột biến trong số những chủng IHHNV thu nhận được

Nội dung 2: Lựa chọn phương pháp tối ưu phát hiện IHHNV trên tôm sú nuôi

157

Áp dụng qui trình LAMP và qui trình LAMP thiết kế không thành công.

Nghiên cứu đã phát triển thành công quy trình Multiplex PCR chẩn đoán IHHNV

đặc hiệu cho type lây nhiễm thực trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL bằng hóa chất hiện có

tại phòng thí nghiệm. Quy trình có thể phát hiện 75 bản sao DNA IHHNV type lây

nhiễm trong một phản ứng khuếch đại.

Nội dung 3: Nghiên cứu xác định phương thức truyền lan theo trục dọc và trục

ngang của IHHNV trên tôm sú trong phòng thí nghiệm

Trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy sự truyền lây từ mẹ sang con trên tôm

sú đã được nghi nhận. Một khi con mẹ nhiễm, trứng và các giai đoạn con con của

chúng cũng mang mầm bệnh virus. Số lượng nauplii từ con mẹ không nhiễm và con

mẹ nhiễm IHHNV không có sự khác biệt ý nghĩa.

Tôm sú bị nhiễm IHHNV khi sống chung và ăn mẫu tôm bệnh cùng loài và

khác loài. Tỷ lệ nhiễm trung bình ở các nhóm lần lược ở nhóm 1 sống chung tỷ

nhiễm IHHNV là 60% và 63%, nhóm 2 cho ăn là 46,67 % và 56,67% và nhóm 3

cho ăn và sống chung là 66,67% và 70 ở ngày thứ 14 và thứ 21 sau lây nhiễm.

Nội dung 4: Nghiên cứu đánh giá sự hiện diện, truyền lan và đề xuất các giải

pháp hạn chế IHHNV trên tôm sú

Tôm thẻ chân trắng nhiễm IHHNV, tỷ lệ hao hụt 30% quần đàn, khi tôm thẻ

nhiễm ở giai đoạn nhỏ, có khả năng thu hoạch sớm. Tôm lớn gần thu hoạch có tỷ lệ

nhiễm IHHNV cao so với tôm nhỏ hơn 2,5 tháng tỷ lệ nhiễm cao nhất 40%.

Sự hiện diện của IHHNV ở tất cả mô hình nuôi tôm sú bán thâm canh cũng

được ghi nhận ở Trà Vinh và Bạc Liêu ở năm 2012-2013 đều sự hiện diện IHHNV,

với tỷ lệ nhiễm IHHNV thấp nhất là 10% và cao nhất là 90%.

Ở những trại giống nhỏ cả hai miền Nam và Trung đều có tỷ lệ nhiễm IHHNV

cao hơn trại giống qui mô lớn. Tỷ lệ nhiễm ở giai đoạn Nauplii thấp và tăng dần ở

từng giai đoạn phát triển của ấu trùng.

Tôm sú từ 1-2 tháng tuổi được xác định dễ nhiễm IHHNV nhất với tỷ lệ nhiễm

78,57%, kế đến là trên 2 tháng tuổi nhiễm 60% và thấp nhất là nhóm dưới 1 tháng

tuổi nhiễm 33,33 %.

158

Năng suất thu hoạch giữa quần đàn tôm sú nhiễm và không nhiễm IHHNV ở

các mô hình không có sự khác biệt rõ rệt. Nghiên cứu nuôi tôm sú trong nuôi bể

ương, chưa thấy sự khác biệt (P>0.05) giữa chiều dài thân và trọng lượng trong

quần đàn tôm sú nhiễm và không nhiễm IHHNV ở các nhóm tuổi khác nhau từ 50-

60 ngày, 60-70 và trên 70 ngày.

Giải pháp hạn chế sự lây lan nên xét nghiệm con mẹ và con giống trước khi

đưa vào sản xuất; tôm nuôi giai đoạn 1-2 tháng nên tăng sức đề kháng và giữ môi

trường ổn định để hạn chế sự lây lan virus. Nên đưa qui trình multiplex PCR vào

trong chẩn đoán IHHNV type lây nhiễm trên tôm nuôi ở Việt Nam.

5.2. Đề nghị

Dựa vào kết quả trên nên áp dụng quy trình PCR mới phát triển trong nghiên

cứu này để kiểm soát tôm sú nhiễm IHHNV tại ĐBSCL.

Đề nghị bộ hổ trợ dự án để phát triển bộ Kít và thương mại hóa để phục vụ

cho công tác phòng chống dịch bệnh trên tôm nuôi ở Việt Nam

159

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004. Bệnh học

Thuỷ Sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp

Bùi Thị Bích Hằng và Flegel TW. (2008), Nghiên Cứu Tạo Kháng Thể Đơn Dòng

Virus Gây Bệnh Hoại Tử Cơ Quan Tạo Máu Và Dưới Vỏ (IHHNV) Ở Tôm

Penaeid. Tạp chí Khoa học 1. 170-175.

Cao Thành Trung, Nguyễn Thị Kim Mỹ và Nguyễn Viết Dũng (2013a). Phát triển

quy trình đặc hiệu PCR chẩn đoán IHHNV cho type lây nhiễm trên tôm sú

nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, số 2, 106-117. Tạp chí Nghề cá Sông Cửu

Long.

Cao Thành Trung, Nguyễn Viết Dũng, Nguyễn Thị Hồng Vân và Nguyễn Văn Hảo

(2013b). Phát triển quy trình multiplex PCR chẩn đoán ihhnv đặc hiệu cho

chủng lây nhiễm trên tôm sú nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Hội nghị

khoa học công nghệ sinh học toàn quốc. 2013. Quyển 1, trang 250-255.

Phạm Văn Hùng, Nguyễn Tẫn Bình, Nguyễn Đăng Ninh, Phạm Hùng Vân, Phạm

Thành Hổ (2009). Sự phổ Biến của Virus Gây Bệnh Hoại Tử Dưới Vỏ Và Cơ

Quan Tạo Máu Trên Tôm Sú Nuôi Tại Việt Nam. Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí

Minh. Tập 13 (2). Trang 234-238

Phan Đặng Thiên An, Phạm Văn Hùng; Hoàng Hiếu Ngọc, Phạm Hùng Vân (2009).

Giải TìnhTự Bộ Gen Infectious Hypodermal And Haematopoietic Necrosis

Virus (IHHNV) Gây Bệnh Hoại Tử Trên Tôm. Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí

Minh. Tập 13 (2). Trang 129-137.

CSIRO, 2008. Phương pháp PCR phát hiện ADN của các giáp xác mười chân theo

OIE, sử dụng các mồi của CSIRO. Hội thảo về PCR phát hiện WSSV, Cần

Thơ, trang 18

160

Tài liệu tiếng Anh

Arunruta N, Prombunb P, Saksmerpromea V, Flegel TW, Kiatpathomchai V (2011).

Rapid and sensitive detection of infectious hypodermal and hematopoietic

necrosis virus by loop-mediated isothermal amplification combined with a

lateral flow dipstick. Journal of Virological Methods 171, 21–25

Bell TA and Lightner DV (1984). IHHN virus: infectivity and pathogenicity studies

in Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei. Aquaculture, 38, 185–194.

Bell TA, Lightner DV and Brock JA (1990). A biopsy procedure for the non-

destructive determination of IHHN virus infection in Penaeus vannamei. J.

Aquat. Anim. Health, 2, 151–153.

Bonami JR, Trumper B, Mari J, Brehelin M, Lightner DV. (1990). Purification and

characterization of the infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus

of penaeid shrimps. J Gen Virol 71, 2657–2664

Bonnichon V, Bonami JR and Lightner DV (2006). Viral interference between

infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and white

spot syndrome virus in Litopenaeus vannamei. Dis. Aquat. Org 72, 179–184.

Boublik Y., Jousset F.X., Bergoin M., (1994). Complete nucleotide sequence and

genome organization of theAedes albopictusparvovirus (AaPV) pathogenic for

Aedes aegyptilarvae. Virology 200, 752–763

Bray WA, Lawrancer AL and Leung-Trujillo JR (1994). The effect of salinity on

growth and survival of Penaeus vannamei, with observations on the

interaction of IHHN virus and salinity. Aquaculture 122, 133–146.

Caipang, C.M.A., Sibonga M.F.J., Geduspan J.S. and Apines-Amar M.J.S., (2011).

Sequence diversity of the Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis

Virus (IHHNV) in cultured shrimp populations in the Philippines. AES

Bioflux, 3: 3, 272-279

161

Claydon K, Tahir RAH , Said HM, Lakim MH, Tamat W (2010). Prevalence of

shrimp viruses in wild Penaeus monodon from Brunei Darussalam.

Aquaculture 308, 71-74

Coelho MGL, Silva ACG, Vila Nova CMV, Neto JMO, Lima ACN, Feijo RG,

Apolinario DF, Maggioni R, Gesteira TCV. (2009) Susceptibility of the wild

southern brown shrimp (Farfantepenaeus subtilis) to infectious hypodermal

and hematopoietic necrosis (IHHN) and infectious myonecrosis (IMN).

Aquaculture. 294: 1–4

Corre V.Jr, Faisan S.Jr, Carton-Kawagoshi R.J., Elle J., Traifalgar R.F. and Caipang

CM. (2012). Evidence of WSSV transmission from the rotifer (Brachionus

plicatilis) to the black tiger shrimp (Penaeus monodon) postlarvae and means

to control rotifer resting eggs using industrial disinfectants. Aquaculture,

Aquarium, Conservation & Legislation, International Journal of the Bioflux

Society. 5(2), 64-68

Chayaburakul K, Lightner DV, Sriurairattana S, Nelson TK, Withyachumnarnkul B

(2005). Different responses to infectious hypodermal and hematopoietic

necrosis virus (IHHNV) in Penaeus monodon and P. vannamei. Aquat Org.

67, 191–200.

Chayaburakul K, Pratanpipat G, Sriurairatana P, Withyachumnarnkul SB, (2004).

Multiple pathogens found in growth-retarded black tiger shrimp Penaeus

monodon cultivated in Thailand. Dis. Aquat. Org. 60: 89–96.

Dang, L.T., Koyama, T., Shitara, A., Kondo, H., Aoki, T., Hirono, I., 2010.

Involvement of WSSV–shrimp homologs in WSSV infectivity in kuruma

shrimp: Marsupenaeus japonicus. Antiviral Res. 88, 217-226.

Erdman DD, Durigon EL, Wang QY, Anderson LJ (1996) Genetic diversity of

human parvovirus B19: sequence analysis of the vp1/vp2 gene from multiple

isolates. J Gen Virol. 77, 2767–2774

162

Flegel TW (2006). Detection of major penaeid shrimp viruses in Asia, a historical

perspective with emphasis on Thailand. Aquaculture 258 1–33.

Flegel TW (2009). Hypothesis for heritable, anti-viral immunity in crustaceans and

Insects. Biology Direct. 4: 32, 1-8

Flegel TW. (1997). Special Topic Review: Major viral diseases of the black

tiger prawn (Penaeus monodon) in Thailand. World Journal of Microbiology and

Biotechnology 13: 433-442.

Flegel TW. (2012) Minireview: Historic emergence, impact and current status

of shrimp pathogens in Asia, J Invertebr Pathol. 110: 166-73

Flegel, TW., Nielsen L., Thamavit V., Kongtim S., and Pasharawipas T. (2004)

Presence of multiple viruses in non-diseased, cultivated shrimp at harvest.

Aquaculture, 240:55-68

Fox JM, McCrackin Stevenson MA, Bloom ME (1999) Replication of Aleutian

mink disease parvoviruses in vitro is influenced by residues in the VP2

protein. J Virol 73: 8713–8719

Gallinella G, Venturoli S, Gentilomi M, Musiani M, Zerbini M (1995) Extent of

sequence variability in a genomic region coding for capsid proteins of B19

parvovirus. Arch Virol 140:1119–1125

Geoffroy MC, Chadeuf G, Orr A, Salvetti A, Everett RD (2006) Impact of the

interaction between herpes simplex virus type 1 regulatory protein ICP0 and

ubiquitin-specific protease USP7 on activation of adeno-associated virus type

2 rep gene expression. Journal of Virology 80: 3650–3654

Hazreen-Nita MK, Kua BC, Bhassu S, Othman RY. (2012) Detection and genetic

profiling of infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus

163

(IHHNV) infections in wild berried freshwater prawn, Macrobrachium

rosenbergii collected for hatchery production. Mol Biol Rep. 39:3785–90

He L. and Xu H.S. (2011). Development of a multiplex loop-mediated isothermal

amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of white spot

syndrome virus and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in

penaeid shrimp. Aquaculture 311, 94–99

Hernández-Rodriguez A., Alceste-Oliviero C., Sanchez R., Jory D., Vidal L. and

Constain-Franco L.F., (2001). Aquaculture development trends in Latin America

and the Caribbean, In: Subasinghe, R.P., P. Bueno, M.J. Phillips, C. Hough, S.E.

McGladdery and J.R. Arthur (Eds.). Aquaculture in the Third Millenium.

Technical Proceedings of the Conference on Aquaculture in the Third Millenium.

Bangkok, Thailand, 20-25 February 2000, NACA, Bangkok and FAO, Rome, pp:

317-340

Hemauer A, Poblotzki A, Gigler A, Cassinotti P, Siegl G, Wolf H, Modrow S

(1996) Sequence variability among different parvovirus B19 isolates. J Gen

Virol 77:1781–1785

Hizer SE, Dhar AK, Klimpel KR, Garcia DK (2002). RAPD markers as predictors

of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV)

resistance in shrimp (Litopenaeus stylirostris). Genome, 45(1): 1-7.

Hsieh, C.Y., Chuang P.C., Chen L.C., Tu C., Chien M.S., Huang K.C., Kao H.F.,

Tung M.C. and Tsai S.S., (2006). Infectious hypodermal and hematopoietic

necrosis virus (IHHNV) infections in giant freshwater prawn, Macrobrachium

rosenbergii. Aquaculture, 258: 73-79

Huang, S.W., Lin, Y.Y., You, E.M., Liu, T.T., Shu, H.Y., Wu, K.M., Tsai, S.F., Lo,

C.F., Kou, G.H., Ma, G.C., Chen, M., Wu, D., Aoki, T., Hirono, I., Yu, H.T.,

(2011). Fosmid library end sequencing reveals a rarely known genome

structure of marine shrimp Penaeus monodon. BMC Genomics 12, 242

164

Jimenez R, Barniol R, De Barniol L, and Machuca M (1999). Infection of IHHN

virus in two species species of cultured penaeoid shrimp Litopenaeus

vannamei (Boone) and Liopenaeus stylirostris (Stimpson) in Ecuador during

El Nino 1997-98. Aquaculture Research 30, 695-705

Kalagayan G, Godin D, Kanna R, Hagino G, Sweeney J,Wyban J, Brock J (1991)

IHHN virus as an etiologicalfactor in runt-deformity syndrome of juvenile

Penaeus vannamei cultured in Hawaii. J World Aquacult Soc 22, 235–243

Kasornchandra J., Boonyaratpalin S., Itami T., (1998). Detection of white spot

syndrome in cultured penaeid shrimp in Asia: microscopic observation and

polymerase chain reaction. Aquaculture, 164, 243-251

Kim JH, Kim HK, NguyenVG, Park BK, Choresca CH, Shin SP, Han JE, Jun JW,

Park SC (2011). Genomic sequence of infectious hypodermal and

hematopoietic necrosis virus (IHHNV) KLV-2010-01 originating from the

first Korean outbreak in cultured Litopenaeus vannamei. Arch Virol. DOI

10.1007/s00705-011-1155-0.

Koyama, T., Asakawa, S., Katagiri, T., Shimizu, A., Fagutao, F., Mavichak,

R., Santos, M., Fuji, K., Sakamoto, T., Kitakado, T., Kondo, H., Shimizu, N.,

Aoki, T., Hirono, I., 2010. Hyper-expansion of large DNA segments in the

genome of kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus. BMC Genomics 11,

141.

Krabsetsve K, Cullen BR, Owens L (2004). Rediscovery of the Australian strain of

infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus. Dis. Aquat. Organ

61, 153–158.

Khawsak P, Deesukon W, Chaivisuthangkura P, Sukhumsirichart W (2008).

Multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of six viruses of penaeid

Shrimp. Molecular and Cellular Probes 22, 177–183.

Laoaroon S, Boonnat A.T, Poltana P, (2005). Infectivity of White spot virus

(WSSV) to the Polycharte Pereneis nuntia and a posibilitu of WSSV

165

transmission from the polychaete to the black tiger shrimp Penaeus monodon.

Diseases in Asian Aquaculture V, 353 – 361

Lightner DV (1996). A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures

for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Baton

Rouge, Louisiana, USA.

Lightner DV and Redman RM (1998). Shrimp diseases and current diagnostic

methods. Aquaculture 164, 201–220.

Lightner DV, Bell TA, Redman RM & Perez LA (1992). A collection of case

histories documenting the introduction and spread of the virus disease IHHN

in penaeid shrimp culture facilities in Northwestern Mexico. ICES Marine

Science Symposia, 194, 97–105.

Lightner DV, Redman RM, Poulos BT, Tang-Nelson KFJ, Pantoja CR, Nunan

LM, Navarro SA, Noble BL and Mohney LL (2005). The current shrimp

disease situation in the Americas with emphasis on WSSV, TSV, NHP-B and

the emerging disease IMN, Special Presentation on Biosecurity, Oceanic

Institute, Waimanalo, Hawaii, USA

Lightner DV, Redman RM, Williams RR, Mohney LL, Clerx JPM, Bell TA and

Brock JA (1985). Recent advances in penaeid virus disease investigations.

Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis a newly recognized virus

disease of penaeid shrimp. J. World Aquaculture. Soc; 16, 267–274.

Lightner, D.V., Redman, R.M., Bell, T.A. (1983b), Infectious hypodermal and

hematopoietic necrosis, a newly recognized virus disease of Penaeid Shrimp,

Journal of Invertebrate Pathology 42, 62-70.

Lightner, D.V., Redman, R.M., Bell, T.A., Brock, J.A. (1983a), Detection of IHHN

virus in Penaeus stylirostris and P. vannamei imported into Hawaii, J. World

Maricult Soc. 14, 212–225

166

Lotz JM (1997). Special topic review: viruses, biosecurity and specific pathogen-

free stocks in shrimp aquaculture. World J. Microbiol. Biotechnol 13, 405–

413.

Mari, J; Bonami, J.R; Lightner, D.V (1993). Partial cloning of the genome of

infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, an unusual

parvovirus pathogenic for penaeid shrimps; diagnosis of the disease using a

specific probe. J. Gen. Viro, 74, 2637–2643.

Martinez-Cordova LR (1992). Cultured blue shrimp (Penaeus stylirostris) infected

with infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in Northwestern

Mexico. The Progressive Fish Culturist, 54, 265–266.

Martorelli SR, Overstreet RM, Jovanovich-Alvillar JA. (2010) First report of viral

pathogens WSSV and IHHNV in Argentine crustaceans. Bull Mar Sci.

86:117–31

Molthathong S. Jitrakorn S, Joyjinda Y, Boonchird C, Witchayachamnarnkul B,

Pongtippatee P, Flegel T and Saksmerprome V. (2013). Persistence of

Penaeus stylirostrisdensovirus delays mortality caused by white spot

syndrome virus infection in black tiger shrimp (Penaeus monodon). BMC

Veterinary Research 9:33

Montgomery-Brock D, Tacon AGJ, Poulos B and Lightner DV (2007). Reduced

replication of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus

(IHHNV) in Litopenaeus vannamei held in warm water. Aquaculture 265, 41–

48.

Morales-Covarrubias MS, Nunan LM, Lightner DV, Mota-Urbina JC, Garza-

Aguirre MC, Chavez-Sanchez MC (1999). Prevalence of infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in wild adult blue

shrimp Penaeus stylirostris from the northern Gulf of California, Mexico. J.

Aquat. Anim.Health 11, 296–301.

167

Motte YE, Luzardo E, Castro J, Leclercq F, Rodrı´fuez G, Miranda P, Borja

Serrano O, Terreros J, Montalvo M, Narva´ez K, Tenorio A, Cedenˇo N,

Mialhe M, Boulo EV (2003). Prevention of IHHNV vertical transmission in

the white shrimp Litopenaeus vannamei. Aquaculture 219, 57–70.

Notomi, T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase

T, (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids

Res. 28, e63.

Nunan LM, Poulos BT, Lightner DV (2000). Use of polymerase chain reaction for

the detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in

penaeid shrimp. Mar. Biotechnol. 2 (4), 319–328.

Nunan LM, Arce SM, Staha RJ and Lightner DV (2001). Prevalence of Infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and White spot

syndrome virus (WSSV) in Litopenaeus vannamei in the Pacific Ocean off the

coast of Panama. J. World Aquaculture Soc. 32, 330–334.

OIE (2009) Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases 6th Edition. Office

International des Epizooties (OIE), Paris. Chapter 2.2.2. Infectious

Hypodermal and Hematopoietic Necrosis. pp. 78-95

Pantoja Lightner D.V and Holtschmit K.H. 1999. Prevalence and Geographic

Distribution of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus

(IHHNV) in Wild Blue Shrimp Penaeus stylirostris from the Gulf of

California, Mexico. Journal of Aquatic Animal Health. 1, 23-34

Primavera H and Quinitio ET (2000). Runt-deformity syndrome in cultured giant

tiger prawn Penaeus monodon. Journal of crustacean biology, 20(4): 796-802.

Phuoc L.H, M. Corteel, H. J. Nauwynck, M. B. Pensaert, V. Alday-Sanz, W. Van

den Broeck, P. Sorgeloos and P. Bossier. 2008. Increased susceptibility of

white spot syndrome virus infected Litopenaeus vannamei to Vibrio

campbellii. Environmental Microbiology 10, 2718–2727

168

Rai P, Safeena MP, Karunasagar I, Karunasagar I (2009). Simultaneous presence of

infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and Type A

virus-related sequence in Penaeus monodon from India. Aquaculture, 295,

168–174.

Rai P, Safeena MP, Karunasagar I, Karunasagar I (2011). Complete nucleic acid

sequence of Penaeus stylirostris densovirus (PstDNV) from India.Virus

Research 158, 37-45.

Rai P., Safeena M.P., Krabsetsve k., Fauce K.L., Owens L., Krunasagar I.

(2012) Genomics, Molecular Epidemiology and Diagnostics of Infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus. Indian J. Virol. 23(2):203–214

Robles-Sikisaka R, Bohonak AJ, McClenaghan LR, Dhar AK. (2010) Genetic

signature of rapid IHHNV (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis

virus) expansion in wild Penaeus shrimp populations. PLoS One. 5:e11799.

Roekring S, Nielsen L, Owens L, Pattanakitsakul SN, Malasit P, Flegel TW (2002).

Comparison of penaeid shrimp and insect parvoviruses suggests that viral

transfers may occur between two distantly related arthropod groups. Virus

Research, 87, 79–87.

Rusaini, La Fauce KA., Elliman J,. Bowater R.O, Owens L. (2013). Endogenous

Brevidensovirus-like elements in Cherax quadricarinatus: Friend or foe.

doi:10.1016/j.aquaculture.2013.02.034.

Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T.,

Mullis, K. B., and Erlich, H. A. (1988). Primer-directed enzymatic

amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239,

487-491

Saksmerprome V, Puiprom O., Noonin C., Flegel T.W. (2010). Detection of

infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) in farmed

169

Australian Penaeus monodon by PCR analysis and DNA sequencing.

Aquaculture, 298, 190–193

Saksmerpromea V, Jitrakorna S, Chayaburakul K, Laiphromd S, Boonsuad K,

Flegel TW (2011). Additional random, single to multiple genome fragments of

Penaeus stylirostris densovirus in the giant tiger shrimp genome have

implications for viral disease diagnosis. Virus Research, 160, 180–190.

Savan R, Kono T, Itami T, Sakai M (2005). Loop-mediated isothermal

amplification: An emerging technology for detection of fish and shellfish

pathogens. Journal of Fish Diseases, 28, 573–581

Shi CY, Huang J, Yang B, Song XL, Xu HSH (2003). The detection of four shrimp

viruses using PCR and RT-PCR. Mar. Fish. Res. 24

Shike H, Dhar AK, Burns JC, Shimizu C, Jousset FX, Klimpel KR, Bergoin M

(2000). Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of shrimp is

related to mosquito brevidensoviruses. Virology 277, 167–177.

Sithigorngul P, Hajimasalaeh W, Longyant S, Sridulyakul P, Rukpratanporn S,

Chaivisuthangkura P (2009). Simple immunoblot and immunohistochemical

detection of Penaeus stylirostris densovirus using monoclonal antibodies to

viral capsid protein expressed heterologously. Journal of Virological Methods.

162(1-2): 126-32

Sudhakaran R, Ishaq Ahmed V.P, Haribabu P, Mukherjee S.C, Sri Widada J,

Bonami J.R, Sahul Hameed A.S, (2007). Experimental vertical transmission of

Macrobranchium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV)

from brooders to progeny in Macrobranchium rosenbergii and Artemia.

Journal of fish Diseases, 30, 27 – 35.

Sukhumsirichart W, Attasart P, Boonsaeng V, Panyim S (2006). Complete

nucleotide sequence and genomic organization of hepatopancreatic parvovirus

(HPV) of Penaeus monodon. Virology, 346, 266 – 277.

170

Sun F, Chao HQ, Chun RH, Qi S (2006). Sensitive and rapid detection of infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-

mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods, 131, 41–

46.

Tang KFJ and Lightner DV (2001). Detection and quantification of infectious

hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp by real-time

PCR. Dis. Aquat. Org. 44, 79–85.

Tang KFJ and Lightner DV (2002). Low sequence variation among isolates of

infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) originating

from Hawaii and the Americas. Dis Aquat Org, 49:93–97

Tang KFJ and Lightner DV (2006). Infectious hypodermal and hernatopoietic

necrosis virus (IHHNV)-related sequences in the genome of the black tiger

prawn Penaeus monodon from Africa and Australia. Virus Research, 118:185-

191

Tang KFJ, Durand SV, White BL, Redman RM, Pantoja CR and Lightner DV

(2000). Postlarvae and juveniles of a selected line of Penaeus stylirostris are

resistant to infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus infection.

Aquaculture, 190, 203–210.

Tang KFJ, Navarro SA and Lightner DV (2007). A PCR assay for discriminating

between infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV)

and the virus-related sequences in the genome of Penaeus monodon. Dis.

Aquat. Org, 74, 165–170.

Tang KFJ, Poulos BT, Wang J, Redman RM, Shih HH, Lightner DV (2003).

Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic

necrosis virus (IHHNV) isolates and characteristics of their infection. Dis.

Aquat. Org. 53, 91–99.

171

Tattersall P, Bergoin M, Bloom ME, Brown KE, Linden RM, Muzyczka Net al.

(2005) Family Parvoviridae. In: Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J,

Desselberger U, Ball LA (eds) Virus Taxonomy, VIIIth Report of the

International Committee on Taxonomy of Viruses, pp. 353–369. Elsevier,

Academic Press, Amsterdam.

Tijssen P, Bergeron J, Dubuc R, Hebert B (1995) Minor genetic changes among

porcine parvovirus groups are responsible for major distinguishing biological

properties Semin Virol 6, 319–328

Vijayan K.K., Stalin Raj V., Balasubramanian C.P., Alavandi S.V., Thillai Sekhar

V. & Santiago T.C. (2005). Polychaete worms – a vector for white spot

syndrome virus (WSSV). Dis. Aquat. Org., 63, 107–111

Weppe M (1992). Demonstration dealtas cuaidades de la cepa de P. stylirostris

(AQUACOP SPR 43) resistente al virus IHHN. Proceeding of the Ecuadorian

Aquaculture Congress, Cenaim, Guayaquil, Ecuador, 229–232.

Withyachumnarnkul B., Chayaburakul K., Supak L.A., Plodpai P.,

Sritunyalucksana K., Nash G., (2006). Low impact of infectious hypodermal

and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) on growth and reproductive

performance of Penaeus monodon, Dis. Aquat. Org. 69:129–136

Yang B, Xiao-Ling S, Jie H, Yin SC, Li L (2007). Evidence of existence of

infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp

cultured in China. Veterinary Microbiology 120, 63–70.

Yue Z.Q, Liu H, Wang WJ, Lei WZ, Liang CZ and Jiang YL. (2006) Development

of Real-Time PCR Assay for the Quantitative Detection of IHHNV from

Shrimps with Taqman Probe. Journal of AOAC International. 89(1), 240-244

Các webside tham khảo

http://www.vsmmb.com/data/upload_file/File/PCR book 1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=clustalw2

172

http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html (Promoter Prediction by Neural

Network)

http://web.expasy.org/translate/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

http://primer3.wi.mit.edu

http://hoinongdan.cantho.gov.vn/DesktopModules/CMSP/DinhKem/273_CN.SXG.1

1_Cong-nghe-SX-giong-tom-su-dien-hinh.pdf

I

MỤC LỤC

Mở đầu ........................................................................................................................ 1

TỔNG QUAN tài liệu ................................................................................................. 4

2.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở Đồng bằng Sông Cửu Long ..................... 4

2.1.1 Tình hình nuôi tôm ...................................................................................... 4

2.1.2 Tình hình dịch bệnh ..................................................................................... 5

2.2. Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious

hypothermal and hemotopoietic necrosis) ............................................................... 6

2.3. Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (infectious

hypothermal and hemotopoietic necrosis virus – IHHNV) ..................................... 7

2.3.1. Tên khoa học và phân loại .......................................................................... 7

2.3.2. Bộ gen và chức năng của các protein ......................................................... 7

2.3.3. Sự đa dạng di truyền của IHHVN .............................................................. 8

2.3.3.1 Phân loại kiểu gen ................................................................................. 8

2.3.3.2. Đa dạng di truyền ............................................................................... 10

2.3.4. Sự lan truyền của IHHNV ........................................................................ 11

2.3.5 Sự phân bố và lây nhiễm ........................................................................... 14

2.4. Các nghiên cứu IHHNV trên tôm nuôi ở Việt Nam ....................................... 16

2.5. Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh IHHNV hiện nay ............................................. 17

2.5.1. Dựa trên dấu hiệu lâm sàng ...................................................................... 17

2.5.2. Phương pháp mô học ................................................................................ 18

2.5.3. Lai Dot Blot .............................................................................................. 19

2.5.4. Real−time PCR ......................................................................................... 19

2.5.5. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) ........................................ 20

2.5.6. Phương pháp kháng thể đơn dòng ............................................................ 20

II

2.5.7. Phương pháp khuyếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop−mediated isotheral

amplification) ..................................................................................................... 21

2.5.8 Phương pháp PCR .................................................................................... 21

2.5.9 Các nghiên cứu PCR về chẩn đoán IHHNV lây nhiễm trên tôm nuôi

ở Việt Nam ........................................................................................................ 22

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI .................................................................................................. 23

CÁCH TIẾP CẬN ..................................................................................................... 23

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 25

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 26

1.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ........................................................ 26

1.2. Vật liệu ........................................................................................................ 26

1.2.1. Mẫu tôm ................................................................................................... 26

1.2.2. Thu và bảo quản mẫu ............................................................................... 26

1.2.3. Mồi sử dụng đã được thiết kế và công bố trên các tạp chí của thế giới ... 26

NỘI DUNG I: NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG DI TRUYỀN CỦA CHỦNG IHHNV

THU NHẬN Ở VIỆT NAM ...................................................................................... 28

1. Khảo sát thu mẫu ............................................................................................... 28

2. Sàng lọc mẫu tôm nhiễm IHHNV type lây nhiễm và không lây nhiễm .......... 28

3.

Dòng hóa và giải trình tự ............................................................................. 30

3.1. Đối với IHHNV type A/B .......................................................................... 30

3.2. Đối với IHHNV type lây nhiễm ................................................................ 30

3.2.1. Phân tích cấu trúc di truyền các type IHHNV .................................. 31

3.2.2. Phân tích mối quan hệ và cây tiến hóa di truyền .............................. 32

NỘI DUNG II: LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU PHÁT HIỆN IHHNV

TRÊN TÔM SÚ NUÔI ............................................................................................. 34

III

1. Ly trích DNA virus từ tôm ....................................................................... 34

2. Dòng hóa .................................................................................................. 35

3. Phương pháp đo nồng độ DNA ................................................................ 36

4. Phương pháp tính số bản sao plasmid DNA ............................................ 36

5. Phương pháp pha loãng nồng độ DNA .................................................... 36

6. Phương pháp điện di trên gel agarose ...................................................... 37

PHẦN 1: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PCR

PHÁT HIỆN IHHNV TYPE LÂY NHIỄM ............................................................. 38

I. Phát triển qui trình Multiplex PCR phát hiện IHHNV type lây nhiễm ................. 38

1.1. Thiết kế mồi cho phản ứng Multiplex PCR chẩn đoán IHHNV type lây

nhiễm 38

1.2. Kiểm tra sự hoạt động của mồi .................................................................... 39

1.3. Khảo sát các điều kiện của phản ứng Multiplex PCR ................................. 40

1.3.1. Khảo sát nồng độ dNTPs .......................................................................... 40

1.3.2. Khảo sát nồng độ Mg+2 ............................................................................ 41

1.3.3. Khảo sát nhiệt độ lai ................................................................................. 42

1.4. Giới hạn phát hiện ....................................................................................... 43

1.5. Độ đặc hiệu của quy trình ............................................................................ 43

1.6. Ứng dụng kiểm tra IHHNV type lây nhiễm trên mẫu thực ......................... 44

PHẦN 2: ỨNG DỤNG VÀ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP LOOP-

MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION (LAMP) CHẨN ĐOÁN IHHNV

TYPE LÂY NHIỄM ................................................................................................. 44

2.1. Ứng dụng quy trình LAMP phát hiện IHHNV (He và Xu, 2011) ........... 46

2.1.1. Thử nghiệm phản ứng LAMP theo công bố .................................. 46

2.1.2. Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng (dNTPs, Mg2+, nhiệt độ ủ, thời

gian và độ nhạy) .......................................................................................... 46

IV

2.2. Quy trình LAMP tự thiết kế phát hiện IHHNV ......................................... 46

2.2.1. Thiết lập điều kiện phản ứng .......................................................... 47

2.2.2. Thử nghiệm các điều kiện phản ứng .............................................. 48

NỘI DUNG III: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PHƯƠNG THỨC TRUYỀN LAN

THEO TRỤC DỌC VÀ TRỤC NGANG CỦA IHHNV TRÊN TÔM SÚ TRONG

PHÒNG THÍ NGHIỆM ............................................................................................ 51

1. Vật liệu sinh học ....................................................................................... 51

2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 51

3. Phương pháp ly trích nguồn virus ............................................................ 52

4. Phương pháp nhân sinh virus trong tôm sú, tôm thẻ chân trắng .............. 52

5. Kiểm tra sự hiện diện IHHNV bằng phản ứng PCR ................................ 52

6. Xác định phương thức lan truyền theo trục dọc ....................................... 53

7. Lây nhiễm theo trục ngang ....................................................................... 55

7.1. Lây nhiễm cùng loài .......................................................................... 57

7.2. Lây nhiễm khác loài .......................................................................... 58

8. Quan sát biểu hiện lâm sàng khi lây nhiễm ............................................. 59

9. Phân tích dữ liệu ....................................................................................... 59

NỘI DUNG IV: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ HIỆN DIỆN, TRUYỀN LAN VÀ

CÁC GIẢI PHÁP HẠN CHẾ IHHNV TRÊN TÔM SÚ .......................................... 61

1. Thu thập thông tin và thu mẫu tôm trên các mô hình nuôi ......................... 61

2. Xử lý kết quả phân tích thống kê ước lượng ............................................... 63

3. Xác định tỷ lệ nhiễm IHHNV theo lứa tuổi ................................................ 64

4. Ảnh hưởng của virus lên trọng lượng và hình thái của tôm sú ................... 64

5. Đề xuất các giải pháp hạn chế sự truyền lan của IHHNV trên tôm sú ........ 65

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 66

V

NỘI DUNG I: NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƯNG DI TRUYỀN CỦA CHỦNG IHHNV

THU NHẬN Ở VIỆT NAM ...................................................................................... 66

1. Kết quả thu nhận và phân tích mẫu tôm sú sàng lọc bằng qui trình PCR ... 66

2. Dòng hóa và giải trình tự IHHNV type A/B ............................................... 67

2.1. Xác định mẫu nhiễm IHHNV type A/B ...................................................... 67

2.2. Dòng hóa và giải trình tự ............................................................................. 69

3. Dòng hóa và giải trình tự bộ gen IHHNV type lây nhiễm .......................... 72

3.1. Xác định mẫu nhiễm IHHNV type lây nhiễm ............................................. 73

3.2. Phân tích cấu trúc vật liệu di truyền ............................................................ 74

3.3. So sánh chủng IHHNV-KG với các chủng IHHNV có trên Genbank ..... 82

3.4. So sánh trình tự các chủng virus IHHNV trên 8 mẫu tôm thu ở các tỉnh

ĐBSCL và các tỉnh khác .................................................................................... 84

3.5. So sánh trình tự nucleotide các chủng thu nhận ở Việt Nam và các chủng

IHHNV khác trên thế giới .................................................................................. 85

3.6. Phân tích chủng IHHNV đột biến thu nhận ở Vũng Tàu và Ninh Thuận 87

3.7. Cây phát sinh chủng loài .......................................................................... 93

NỘI DUNG II: LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU PHÁT HIỆN IHHNV

NHIỄM TRÊN TÔM SÚ NUÔI ............................................................................... 95

1. Dòng hóa plasmid để tạo mẫu chứng dương ............................................... 95

2. Đo nồng độ plasmid mang gen DNA IHHNV type lây nhiễm ................... 96

3. Ứng dụng và phát triển phương pháp LAMP phát hiện virus IHHNV ....... 97

3.1. Quy trình LAMP phát hiện IHHNV (He và Xu, 2011) ............................... 97

a. Thử nghiệm điều kiện tác giả công bố ........................................................ 97

b. Khảo sát nồng độ MgSO4 và dNTPs........................................................... 98

c. Thử nghiệm nhiệt độ và thời gian ủ ............................................................ 99

3.2. Quy trình LAMP phát hiện IHHNV tự thiết kế ......................................... 100

VI

a. Thử nghiệm điều kiện chuẩn ..................................................................... 101

b. Thử nghiệm nhiệt độ ủ .............................................................................. 101

c. Thử nghiệm nồng độ MgSO4 và dNTPs ................................................... 102

d. Thử nghiệm thời gian ủ ............................................................................. 104

e. Thử nghiệm qui trình sau khi khảo sát ...................................................... 104

4. Thiết kế mồi cho qui trình multiplex PCR ................................................ 105

4.1. Thiết lập qui trình Multiplex PCR phát hiện IHHNV chủng lây nhiễm ... 107

4.2. Khảo sát các điều kiện phản ứng ............................................................... 108

4.3. Giới hạn phát hiện ..................................................................................... 109

4.4. Kết hợp mồi nội trong phản ứng Multiplex PCR ...................................... 110

4.5. So sánh qui trình Multiplex PCR với các qui trình khác ........................... 111

4.6. Độ đặc hiệu của phản ứng ......................................................................... 113

4.7. Ứng dụng kiểm tra IHHNV type lây nhiễm trên mẫu thực ....................... 114

NỘI DUNG III: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PHƯƠNG THỨC TRUYỀN LAN

THEO TRỤC DỌC VÀ TRỤC NGANG CỦA IHHNV TRÊN TÔM SÚ TRONG

PHÒNG THÍ NGHIỆM .......................................................................................... 115

Lây nhiễm theo trục dọc .......................................................................................... 115

Lây truyền theo trục ngang ..................................................................................... 118

4.8. Kết quả sàng lọc tôm sú và tôm thẻ cho IHHNV cho thí nghiệm ............. 118

4.9. Lây truyền ngang cùng loài ....................................................................... 119

4.10. Kết quả thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang khác loài .......................... 122

4.11. Biểu hiện lâm sàng của tôm lây nhiễm ...................................................... 127

NỘI DUNG IV: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ HIỆN DIỆN, TRUYỀN LAN VÀ

CÁC GIẢI PHÁP HẠN CHẾ IHHNV TRÊN TÔM SÚ ........................................ 130

1. Thông tin về các ao nuôi tôm ở các mô hình ................................................... 130

2. Sự hiện diện của IHHNV trên tôm nuôi ở các mô hình nuôi .............................. 131

VII

1.1. Mô hình quảng canh Bạc Liêu và Cà Mau ............................................. 131

1.2. Mô hình nuôi bán thâm canh ở Bạc Liêu và Trà Vinh. .......................... 133

1.3. Điều tra và thu mẫu tôm thẻ chân trắng nuôi bán thâm canh ở Bến Tre137

1.4. Mô hình nuôi thâm canh ........................................................................ 140

1.5. Trang trại sản xuất giống ........................................................................ 144

2. Sự hiện diện IHHNV trên tôm bố mẹ tự nhiên.......................................... 148

3. Xác định tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm sú theo độ tuổi ............................ 150

4. Đánh giá sự ảnh hưởng của IHHNV lên trọng lượng và kích thước ......... 152

5. Đề xuất giải pháp hạn chế sự lây lan ......................................................... 154

VIII. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 156

5.1. Kết Luận ....................................................................................................... 156

5.2. Đề nghị .......................................................................................................... 158

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 159

VIII

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của chủng IHHNV phân lập ở Mỹ (AF273215,

Shike và ctv., 2000). .................................................................................................... 7

Hình 2.2. Tôm sú (P. monodon) 50 ngày tuổi bị nhiễm IHHNV với các kích thước

khác nhau (Rai và ctv., 2009).. .................................................................................. 18

Hình 2.3. Một lát cắt mô học trên tôm sú nhiễm IHHNV nhuộm với H& E ............ 19

Hình 6.1. Sơ đồ vị trí thiết kế mồi trên genome của IHHNV type lây nhiễm thu nhận

ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. .................................................................................. 39

Hình 6.2. Cấu trúc mồi khuếch đại trong phương pháp LAMP (Eiken Genome) .... 45

Hình 6.3. Cấu trúc sản phẩm của phương pháp LAMP (Eiken Genome) ................ 45

Hình 6.4. Sơ đồ vị trí nucleotide mồi thiết kế bắt trên genome của IHHNV type lây

nhiễm ......................................................................................................................... 47

Hình 6.5. Vị trí là các vùng thu mẫu tôm sú nuôi trên các mô hình nuôi ở Đồng

Bằng Sông Cửu Long. ............................................................................................... 61

Hình 7.1. A. Kết quả điện di sàng lọc mẫu không nhiễm virus IHHNV type lây

nhiễm ......................................................................................................................... 68

Hình 7.1B. Kết quả sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B với 2 quy trình của 2 cặp

mồi MG831F/R, IHHNV ABF/R .............................................................................. 68

Hình 7.2. Kết quả kiểm tra dòng tế bào JM109 chứa vector pGEM T-easy-DNA

IHHNV type A/B (1200 bp).. .................................................................................... 69

Hình 7.3. Kết quả điện di kiểm tra plasmid sau khi tinh sạch.. ................................ 70

Hình 7.4. Trình tự nucleotide một phần gen IHHNV type A từ mẫu thu nhận ở

ĐBSCL/Việt Nam ..................................................................................................... 70

Hình 7.5. Kết quả cây di truyền IHHNV type A từ mẫu thu nhận ở ĐBSCL .......... 72

Hình 7.6. Kết quả sàng lọc mẫu IHHNV type lây nhiễm với quy trình của 3 cặp

mồi: 77012F/77353R; 309F/R và 279F/940R. ......................................................... 73

Hình 7.8. Trình tự a.a của các protein khởi đầu sao chép I và II cùng với các vùng

NTP liên kết và enzyme helicase A, B và C ở protein được mã hóa bởi ORF1 ....... 81

IX

Hình 7.9. Kết quả phân tích so sánh trình tự các chủng IHHNV thu nhận tại các

tỉnh ở ĐBSCL, Vũng tàu và các tỉnh khác ở Miền Trung. ....................................... 84

Hình 7.10. Trình tự thay đổi nucleotide (in đậm đỏ) ở vị trí nt 462 của bộ gen so với

các chủng IHHNV trong đoạn OFR2, vị trí A tô đậm trên nền vàng ....................... 89

Hình 7.11. Cấu trúc các ORF trên trình tự bộ gen của chủng IHHNV – VT6. Ba

khung đọc mở (ORF1, ORF2, ORF3) với vị trí và chiều dài của chúng. ................. 90

Hình 7.12. Cấu trúc các ORF trên trình tự bộ gen của chủng IHHNV – NT22. Ba

khung đọc mở (ORF1, ORF2, ORF3) với vị trí và chiều dài của chúng .................. 90

Hình 7.13. Trình tự thay đổi nucleotide (in đậm đỏ) ở vị trí nt 1118 so với các

chủng IHHNV-NT22 trong đoạn OFR1. .................................................................. 91

Hình 7.14. Cây di truyền so sách trình tự nucleotide đoạn 2,9 kb của các chủng

IHHNV thu nhận tại các tỉnh ở ĐBSCL, Vũng Tàu, Ninh Thuận với các chủng

IHHNV. ..................................................................................................................... 93

Hình 7.15. Kiểm tra khuẩn lạc mang DNA IHHNV type lây nhiễm bằng PCR. ..... 95

Hình 7.16. Kết quả điện di plasmid sau khi tinh sạch. Giếng plasmid: Plasmid

pGEM T-easy - IHHNV type lây nhiễm sau khi tinh sạch có kích thước 5604 bp. M:

thang DNA 100 bp .................................................................................................... 96

Hình 7.17 Kết quả thử nghiệm điều kiện chuẩn quy trình LAMP phát hiện IHHNV

(He và Xu, 2011).. ..................................................................................................... 97

Hình 7.18. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+. Giếng (+): Mẫu tôm nhiễm IHHNV;

Giếng (-): mẫu tôm không nhiễm IHHNV ................................................................ 98

Hình 7.19. Kết quả thử nghiệm nồng độ dNTPs. ..................................................... 99

Hình 7.20. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ phản ứng. Giếng (+): Mẫu DNA IHHNV;

Giếng (-): mẫu tôm không nhiễm IHHNV .............................................................. 100

Hình 7.21. Kết quả thử nghiệm điều kiện chuẩn quy trình LAMP thiết kế phát hiện

IHHNV .................................................................................................................... 101

Hình 7.22. Kết quả thử nghiệm nhiệt độ ủ. Giếng (+): DNA của IHHNV; Giếng (-):

mẫu tôm không nhiễm IHHNV. .............................................................................. 102

Hình 7.23. Kết quả phản ứng LAMP khảo sát các nồng độ dNTPs ....................... 103

X

Hình 7.24. Kết quả khảo sát Mg2+ trong phản ứng LAMP trên DNA IHHNV (+) và

mẫu nước (-). ........................................................................................................... 103

Hình 7.25. Kết quả thử nghiệm thời gian ủ (15, 30, 45, 60 và 75 phút). Giếng (+):

Mẫu DNA IHHNV; Giếng (-): nước . ..................................................................... 104

Hình 7.26. Kết quả thử nghiệm qui trình LAMP thiết kế sau khi tối ưu hóa. ........ 104

Hình 7.27. So sánh trình tự mồi thiết kế với trình tự IHHNV type A và B bằng phần

mềm ClustalW2 ....................................................................................................... 106

Hình 7.28. Kết quả điện di khảo sát sự hoạt động của mồi thiết kế vnIHF/R và kết

hợp mồi vnIHF/R & 309F/R.. ................................................................................. 108

Hình 7.29. Kết quả tối ưu nồng độ dNTP và Mg2+ của phản ứng multiplex PCR.. 109

Hình 7.30. Kết quả khảo sát độ nhạy lần 1 của quy trình multiplex PCR .............. 110

Hình 7.31. Kết quả khảo sát độ nhạy lần 2 của quy trình multiplex PCR mới chẩn

đoán virus IHHN.. ................................................................................................... 111

Hình 7.32. Kết quả so sánh độ nhạy của quy trình multiplex PCR.. ...................... 112

Hình 7.33. Kết quả so sánh độ nhạy của quy trình multiplex PCR. ...................... 112

Hình 7.34. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc

hiệu của quy trình multiplex PCR đã tối ưu.. .......................................................... 113

Hình 7.35. Kết quả phân tích multiplex PCR các mẫu trứng và các giai đoạn ấu

trùng của tôm mẹ. ................................................................................................... 115

Hình 7.36. Kết quả sàng lọc tôm sú và tôm thẻ nhiễm IHHNV với quy trình

multiplex PCR. ........................................................................................................ 118

Hình 7.37. Bể bố trí thí nghiệm trong lây nhiễm cùng loài và khác loài ................ 119

Hình 7.38. Biểu đồ kết quả lây nhiễm trên tôm sú cùng loài sau 7, 14, 21 và 28

ngày. ........................................................................................................................ 120

Hình 7.38: Kết quả phân tích multiplex PCR trên mẫu tôm lây nhiễm. Sản phẩm sau

khi khuếch đại có kích thước 997 và 309 bp........................................................... 121

Hình 7.40. Kiểm tra IHHNV bằng multiplex PCR với các mẫu tôm trong thí nghiệm

lây nhiễm khác loài. ................................................................................................ 123

XI

Hình 7.41. Biểu đồ so sánh tỉ lệ nhiễm IHHNV (%) giữa các nhóm thí nghiệm sau 7

14, 21 và 28 ngày lây nhiễm. .................................................................................. 125

Hình 7.42. Quan sát, biểu hiện hình thái của tôm sau khi lây nhiễm 14 ngày.. ...... 128

Hình 7.43. Lát cắt mô học trên phần mang tôm sú đối chứng và nhiễm IHHNV sau

28 và sau 128 ngày. ................................................................................................. 129

Hình 7.44. Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV trên mô hình tôm sú nuôi quảng canh ở Cà

Mau và Bạc Liêu ..................................................................................................... 132

Hình 7.45. Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV trên mô hình tôm nuôi bán thâm canh ở Trà

Vinh và Bạc Liêu. ................................................................................................... 134

Hình 7.46. Tỷ lệ nhiễm IHHNV ở tôm nuôi trên các ao nuôi bán thâm canh ở Bạc

Liêu và Trà Vinh năm 2012. ................................................................................... 135

Hình 7.47. Tỷ lệ nhiễm IHHNV ở tôm nuôi trên các ao nuôi bán thâm canh ở Bạc

Liêu và Trà Vinh năm 2013. ................................................................................... 135

Hình 7.48. Tôm thẻ chân trắng bị nhiễm IHHNV ở mô hình nuôi bán thâm canh tại

Bến Tre.. .................................................................................................................. 138

Hình 7.49. Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm thẻ nuôi trên mô hình bán thâm canh

ở Bến Tre ................................................................................................................. 140

Hình 7.50. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm sú nuôi ở mô hình thâm canh năm 2012 ở

Kiên Giang và Sóc Trăng ........................................................................................ 141

Hình 7.51. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm IHHNV trên các giai đoạn ấu trùng và mẹ từ các trại

ương khác nhau ở Miền Nam và Miền Trung ......................................................... 145

Hình 7.52. Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm IHHNV (%) giữa các nhóm tuổi.............. 151

Hình 7.53. Sơ đồ thể hiện sự tương quang giữa nhóm không nhiễm (-) và nhiễm

IHHNV (+) lên trung bình trọng lượng và chiều dài tôm ở các độ tuổi khác nhau

(M±SD). .................................................................................................................. 154

XII

DANH MỤC BẢNG

Bảng 6.1. Mồi được thiết kế và công bố trên các tạp chí của thế giới ..................... 27

Bảng 6.2 Giả định kết quả sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B .......................... 29

Bảng 6.3. Trình tự từng cặp mồi để khuếch đại gen IHHNV type lây nhiễm để giải

trình tự do Công ty Nam Khoa cung cấp. ................................................................. 31

Bảng 6.4. Mồi sử dụng trong nghiên cứu này .......................................................... 39

Bảng 6.5. Trình tự mồi thiết kế để khuếch đại gen IHHNV type lây nhiễm ............ 47

Bảng 6.6. Phương pháp lây nhiễu IHHNV trên tôm sú với mẫu bệnh phẩm là tôm

sú nhiễm IHHNV và tôm thẻ nhiễm IHHNV ........................................................... 57

Bảng 6.7. Số lượng mẫu ở các mô hình nuôi ở các khu vực thu mẫu ...................... 62

Bảng 6.8. Phân loại quy mô trại sản xuất giống. ...................................................... 63

Bảng 7.1. Kết quả thu nhận mẫu tôm sú ở các khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long

và các tỉnh khác ......................................................................................................... 66

Bảng 7.2a. Mức độ tương đồng (%) giữa các trình tự acid amin giả định được mã

hóa bởi 3 ORF của chủng IHHNV ở Kiên Giang với các chủng khác trên Genbank.

................................................................................................................................... 82

Bảng 7.2b. Sự thay đổi a.a trong protein vỏ được dịch mã từ ORF3 của chủng

IHHNV ở Kiên Giang với các chủng IHHNV từ GenBank có sự tương đồng trình tự

gần nhất ..................................................................................................................... 84

Bảng 7.2. Trình tự tương đồng nucleotide trên 2,9 kb của bộ gen của các chủng thu

nhận tại các tỉnh ở ĐBSCL, Vũng tàu và các tỉnh khác ở Miền Trung với một số

chủng ở các nước khác trên thế giới. ........................................................................ 86

Bảng 7.3. Tóm tắt các thành phần nucleotide của trình tự bộ gen chủng IHHNV ... 88

Bảng 7.4. Kết quả đo OD của plasmid pGEMT-easy-IHHNV type lây nhiễm ....... 96

Bảng 7.5 . Kết quả phân tích multiplex PCR các mẫu trứng và giai đoạn ấu trùng

thu từ các cá thể tôm mẹ nhiễm và không nhiễm IHHNV ...................................... 116

Bảng 7.6. So sánh thống kê số lượng Nauplii nở ra từ tôm mẹ nhiễm và không

nhiễm IHHNV ......................................................................................................... 117

Bảng 7.7. Thông tin chi tiết của các mô hình nuôi. ............................................... 130

XIII

Bảng 7.8. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên các mẫu tôm nuôi ở mô hình Quảng canh ở Cà

Mau và Bạc Liêu ..................................................................................................... 133

Bảng 7.9. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên các ao tôm nuôi sú ở mô hình bán thâm canh ở

Trà Vinh và Bạc Liêu năm 2013. ............................................................................ 137

Bảng 7.10. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm thẻ ở mô hình bán thâm canh ở Bến Tre.

................................................................................................................................. 138

Bảng 7.11. Kết quả phân tích IHHNV nhiễm trên mẫu tôm nuôi ở Kiên Giang và

Sóc Trăng năm 2012 ............................................................................................... 142

Bảng 7.12. Tỷ lệ nhiễm IHHNV trên các ao tôm nuôi thẻ ở mô hình thâm canh ở

Bến Tre, Sóc Trăng và Kiên Giang ......................................................................... 143

Bảng 7.13. Phân loại qui mô trại sản xuất giống. ................................................... 144

Bảng 7.14. Kết quả phân tích PCR trên mẫu tôm thu ở trại giống lớn và nhỏ ở Miền

Trung và Miền Nam ................................................................................................ 146

Bảng 7.15. . Tỷ lệ nhiễm IHHNV trong quần đàn tôm sú ở Việt Nam và nhập từ Ấn

Độ Dương và Thái Bình Dương được phát hiện bằng Mutiplex PCR trên chân bơi

của tôm sú................................................................................................................ 149

Bảng 7.16. Kết quả theo dõi tôm sú phát triển trọng lượng và kích thước ở nhóm

tôm nhiễm và không nhiễm IHHNV theo ngày tuổi. .............................................. 153

XIV

DANH MỤC VIẾT TẮT

Aa: Acid amin

Bp: Base pair

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

DNA: Deoxynucleotide acid

MrNV và XSV: Macrobrachium rosenbergii Nodavirus và Extra small virus

NS protein: Non-structural protein: Protein không cấu trúc

Nt: Nucleotide

NTP – binding: Nucleoside triphosphate

OIE: Office Internationnal des Epizooties

ORF: Operon reading frame

Peneaus sp.: Penaeus sp.

PCR: Polymerase Chain Reaction

PL: Postlarvae: Hậu ấu trùng

RCR – motifs: Rolling circle replication – motifs: Motifs khởi đầu sao chép cuộn

vòng

RDS: Runt deformity syndrome: Hội chứng dị dạng còi

RT – PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction: PCR phiên mã

ngược

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacralamide gel electrophoresis: Điện di

trên gel polyacralamide

UMSFP: Chương trình trang trại nuôi tôm nước mặn của Hoa Kỳ

WSSV: White spot symdrome virus: Virus gây hội chứng đốm trắng

Ppt: parts per thousand: phần ngàn

XV

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Kết quả kiểm tra sự hiện diện IHHNV trên tôm lây nhiễm vào ngày thứ

7, 14, 21 và 28 ngày cùng loài

Nghiệm thức

Số bể thí nghiệm

Số tôm nhiễm sau 7 ngày Số tôm nhiễm sau 14 ngày

Bể 1 Bể 2 Bể 3

Trung bình

(%)± SD Bể 1 Bể 2 Bể 3

Trung bình

(%)± SD

Nhóm 1 4 4 8 40,0±10,0 5 7 8 60,0±15,28

Nhóm 2 6 2 1 30,0±26,46 7 3 4 46,67±20,82

Nhóm 3 3 4 5 53,33±23,09 4 7 7 66,67±17,32

Số tôm nhiễm sau 21 ngày Số tôm nhiễm sau 28 ngày

Nhóm 1 5 7 9 63,33±11,55 5 8 10 86,67±25,17

Nhóm 2 8 3 6 56,67±25,17 6 4 8 60,0±20,0

Nhóm 3 5 7 7 70,0±20,0 8 9 9 76,67±5,8

Đối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0

Nhóm 1: tôm sống chung tôm bệnh; Nhóm 2: cho ăn tôm bệnh 5 ngày liên tục;

Nhóm 3: tôm sống chung tôm bệnh và cho ăn tôm bệnh 5 ngày liên tục. Đối chứng:

là 3 nghiệm thức tương tự như nghiệm thức gây nhiễm nhưng sử dụng khỏe để cho

ăn và sống chung.

Phụ lục 2. Kết quả kiểm tra sự hiện diện IHHNV trên tôm lây nhiễm vào ngày thứ

7, 14, 21 và 28 ngày.

Nghiệm thức

Số bể thí nghiệm

Số tôm nhiễm sau 7 ngày Số tôm nhiễm sau 14 ngày

Bể 1 Bể 2 Bể 3

Trung bình

(%)± SD Bể 1 Bể 2 Bể 3

Trung bình

(%)± SD

Nhóm 1 1 3 5 30,0±20,0 3 3 4 33,33±5,77

Nhóm 2 4 2 0 20,0±20,0 2 2 4 26,67±11,55

Nhóm 3 1 4 2 23,33±15,28 3 4 2 30,00±10,0

Số tôm nhiễm sau 21 ngày Số tôm nhiễm sau 28 ngày

Nhóm 1 3 4 4 36,67±5,77 6 7 7 66,67±5,77

Nhóm 2 2 2 4 26,67±11,55 4 4 4 40,00±0,0

Nhóm 3 6 5 6 56,67±5,77 10 8 6 80,00±20,0

Đối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0

XVI

Phụ lục 3. Bảng tổng hợp tỷ lệ nhiễm IHHNV trên tôm sú và tôm thẻ ở các mô hình

nuôi và trại giống

Khu vực Loại

tôm Năm

Hình

thức

nuôi

Đợt

Mẫu

phân

tích

Mẫu

nhiễm

Tỉ lệ

nhiễm (%)

(P≤0,005)

Cà mau Sú 2012 Quảng

canh

1 22 2 9,09±12,0%

2 22 9 40,9±120,5%

3 22 11 50,00±20,9%

4 22 19 86,36±14,3%

Tổng 88 41 46,59±10,4%

Bạc Liêu Sú 2012 Quảng

canh

1 19 2 10,53±13,8%

2 20 2 10,00±13,1%

3 22 10 45,45±20,8%

4 22 13 59,09±20,5%

Tổng 83 27 32,53±10,1%

Trà Vinh Sú

2012 Bán thâm

canh

1 29 10 34,48±17,3%

2 11 5 45,45±29,4%

3 5 4 80,00±35,1%

4 0 0.00 0,00%

Tổng 45 19 42,22±14,4%

2013 Bán thâm

canh

1 15 8 53,33±25,2%

2 15 12 80,00±20,2%

3 13 12 92,31±14,5%

4 13 12 92,31±14,5%

Tổng 56 44 78,57±10,7%

Tổng 101 63 62,38±9,4%

Bạc Liêu Sú

2012 Bán thâm

canh

1 48 9 18,75±11,0%

2 29 12 41,38±17,9%

3 19 7 36,84±21,7%

4 7 3 42,86±36,7%

Tổng 93 31 33,33±9,6%

2013 Bán thâm

canh

1 15 5 33,33±23,9%

2 13 4 30,77±25,1%

3 14 9 64,29±25,1%

4 10 8 80,00±24,8%

Tổng 52 26 50,00±13,6%

Kiên Giang

trại 1 Sú 2012

Thâm

canh

1 8 1 12,50±22,9%

2 8 4 50,00±34,6%

3 8 3 37,50±33,5%

4 8 5 62,50±%

Tổng 32 13 40,63±17,02%

Kiên Giang

trại 2 Sú 2012

Thâm

canh

1 4 1 25,00±42,4%

2 4 2 50,00±49,0%

XVII

3 4 1 25,00±42,4%

4 0 0.00 0,00%

Tổng 12 4 33,33±26,7%

Sóc Trăng Sú 2012 Thâm

canh

1 8 3 37,50±33,5%

2 8 2 25,00±22,7%

Tổng 16 5 31,25±%

Bến Tre Thẻ 2013 Bán thâm

canh

1 19 7 36,84±21,7%

2 12 1 8,33±15,6%

3 10 1 10,00±18,6%

4 10 4 40,00±30,4%

Tổng 51 13 25,49±12,0%

Sóc Trăng Thẻ 2013 Thâm

canh

1 15 0 0,00%

2 17 5 29,41±21,7%

Tổng 32 5 15,63±12,6%

Kiên Giang

trại 1 Thẻ 2013

Thâm

canh

1 10 0 0,00%

2 10 0 0,00%

3 10 0 0,00%

4 10 2 20,00±24,8%

Tổng 40 2 5,00±6,8%

Kiên Giang

trại 2 Thẻ 2013

Thâm

canh

1 11 0 0,00%

2 0 0 0,00%

3 0 0 0,00%

4 11 0 0,00%

Tổng 22 0 0,00%

Bến Tre Thẻ 2012 Thâm

canh 20 0 0,00%

Trại giống

lớn Miền

Trung

Tôm

sú

giống

2013

N 68 2 2,94±4,0%

Z 68 6 8,82±6,7%

M 68 10 14,71±8,4%

P 68 18 26,47±10,5%

Mẹ 53 24 45,28±13,4%

Trại giống

nhỏ Miền

Trung

Tôm

sú

giống

2013-

2014

N 46 22 47,83±14,4%

Z 46 31 67,39±13,5%

M 46 37 80,43±11,5%

P 46 37 80,43±11,5%

Mẹ 30 22 73,33±15,8%

Trại giống

nhỏ Miền

Nam

Tôm

sú

giống

2013-

2014

N 51 19 37,25±13,3%

Z 51 20 39,22±13,4%

M 51 24 47,06±13,7%

P 43 17 39,53±14,6%

Mẹ 35 18 51,43±16,6%

Ấn Độ

Dương Sú 2013 Bố mẹ 134 13 9,70±5,0%

XVIII

Đà Nẵng 2013 Bố mẹ 113 52 46,02±%

Phú Yên 2013 Bố mẹ 47 30 63,83±%

Rạch Gốc 2013 Bố mẹ 135 79 58,52±8,3%

Thái Bình

Dương 2013 Bố mẹ 126 15 11,90±5,7%

Vũng Tàu Sú

2013-

2014 Tôm Post 117 4 3,42±3,3%

Tổng 3

nhà 138 72 52,17±8,3%

XIX

Phụ lục 4. Bảng phân phối student

Bảng Giá trị

0.0005 3.29048 0.0155 2.157067 0.0305 1.8734954

0.001 3.09024 0.016 2.144407 0.031 1.8662922

0.0015 2.96772 0.0165 2.132083 0.0315 1.8591891

0.002 2.87815 0.017 2.120069 0.032 1.8521769

0.0025 2.80706 0.0175 2.108354 0.0325 1.8452556

0.003 2.74777 0.018 2.096931 0.033 1.8384253

0.0035 2.69683 0.0185 2.085762 0.0335 1.8316769

0.004 2.65209 0.019 2.074848 0.034 1.8250057

0.0045 2.61207 0.0195 2.064189 0.0345 1.8184164

0.005 2.576 0.02 2.054 0.035 1.812

0.0055 2.54269 0.0205 2.043525 0.0355 1.8054743

0.006 2.51213 0.021 2.033521 0.036 1.7991169

0.0065 2.48376 0.0215 2.023708 0.0365 1.7928323

0.007 2.45727 0.022 2.014094 0.037 1.7866114

0.0075 2.43239 0.0225 2.004654 0.0375 1.7804632

0.008 2.40892 0.023 1.995395 0.038 1.7743787

0.0085 2.3867 0.0235 1.9863 0.0385 1.7683669

0.009 2.36561 0.024 1.977369 0.039 1.7624097

0.0095 2.34553 0.0245 1.968592 0.0395 1.7565162

0.01 2.326 0.025 1.96 0.04 1.751

0.0105 2.30799 0.0255 1.951475 0.0405 1.7449111

0.011 2.29036 0.026 1.943135 0.041 1.7391994

0.0115 2.27343 0.0265 1.934923 0.0415 1.7335378

0.012 2.25713 0.027 1.926837 0.042 1.7279308

0.0125 2.2414 0.0275 1.918879 0.0425 1.7223829

0.013 2.22621 0.028 1.91103 0.043 1.716885

0.0135 2.21151 0.0285 1.903309 0.0435 1.7114417

0.014 2.19728 0.029 1.895696 0.044 1.7060438

0.0145 2.18348 0.0295 1.888193 0.0445 1.700696

0.015 2.17 0.03 1.88 0.045 1.695

0.05 1.645 0.2 0.842 0.35 0.385

0.055 1.59819 0.205 0.823893 0.355 0.371856

XX

0.06 1.55477 0.21 0.806422 0.36 0.3584591

0.065 1.5141 0.215 0.789191 0.365 0.345126

0.07 1.47579 0.22 0.772193 0.37 0.3318542

0.075 1.43953 0.225 0.755415 0.375 0.3186392

0.08 1.40507 0.23 0.738846 0.38 0.3054811

0.085 1.3722 0.235 0.722479 0.385 0.2923753

0.09 1.34075 0.24 0.706302 0.39 0.2793195

0.095 1.31058 0.245 0.690309 0.395 0.2663114

0.1 1.282 0.25 0.675 0.4 0.253

0.105 1.25357 0.255 0.658838 0.405 0.2404261

0.11 1.22653 0.26 0.643345 0.41 0.2275453

0.115 1.20036 0.265 0.628006 0.415 0.2147021

0.12 1.17499 0.27 0.612813 0.42 0.2018942

0.125 1.15035 0.275 0.597761 0.425 0.1891181

0.13 1.12639 0.28 0.582841 0.43 0.1763738

0.135 1.10306 0.285 0.568052 0.435 0.163659

0.14 1.08032 0.29 0.553384 0.44 0.1509693

0.145 1.05812 0.295 0.538836 0.445 0.1383046

0.15 1.036 0.3 0.524 0.45 0.126

0.155 1.01522 0.305 0.510074 0.455 0.1130388

0.16 0.99446 0.31 0.49585 0.46 0.1004332

0.165 0.97411 0.315 0.481728 0.465 0.0878447

0.17 0.95416 0.32 0.467699 0.47 0.0752698

0.175 0.93459 0.325 0.453763 0.475 0.0627062

0.18 0.91537 0.33 0.439913 0.48 0.0501541

0.185 0.89647 0.335 0.426148 0.485 0.0376076

0.19 0.8779 0.34 0.412463 0.49 0.0250691

0.195 0.85962 0.345 0.398855 0.495 0.0125328