Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008 Referent: Marcell Louis...
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Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008
Referent: Marcell Louis
Ergebnispräsentation:
„Klonierung von Cytohesin-Mutanten“
Klonierung von Cytohesin-Mutanten:
E157K R281K V. a. zur Strukturaufklärungvon Proteinen
Einführung von Punktmutation in Cyh-1
PCR-Mutagense:
1. Schritt:
2. Schritt:
E157K 471bp 723bp
R281K 843bp 351bp
1,194 kb
(Splicing by Overlap-Extension)
Gelbilder der PCR-Mutagenese und SOEing-PCR:
E157K
351bp
R281K
843bp
723bp
471bp
Mutagenese:
SOEing:
E157K R281K
1194bp 1194bp
Daraufhin: Reinigung (CHCl3/Phenol) + Fällung
Marker
Marker
831947
564 1375
947
Verdau:
Restriktionsenzyme:MluI A/CGCGTNotI GC/GGCCGC
Cyh-1 (mutiert)
MluI NotI Kontrolle des Verdaus
Marker Verdaukontrollen
~ 1,2 kb
4,7 kb
Nach Verdau: Dephosphorylierung der 5‘-Enden verringert Religationswahrscheinlichkeit
Verdau-Kontrolle des Plamids:
Marker
Verdau-Kontrollen der Vektoren
Low-Melting-Gel erleichtert Isolierung der DNAIsolierung durch Exzision unter UV-Licht
4,2-4,9kb
Unverdauter Vektor
Vektor (verdaut)
4,7 kb
Ligation/Transformation/‘Minipräp‘:
Isolierte Insert- und Verktorstränge:
HitzeschockT4-DNA-Ligase
Ampicillin
Minipräparation
Testverdau der ‚Minipräp‘:
Verdau
~ 1,2 kb
4,7 kb
4,7 kb
~ 1,2 kb
Marker Ansätze/ Klone
Klone erfolgreich
4268
4973 DB
941
1375
Testverau/‚Minipräp‘:
Erfolgreiche Klone werden in größerem Maßstab angezüchtet
Aus der sog. Maxipräparation reinigt man die Plamide auf (CsCl-Gradient)
Zum Schluss: DNA-Konzentrationsbestimmung im Fotometer:
(Ergebnis leider sehr niedrig, also kein Paradebeispiel)