BIOTECNOLOGIA

5/24/2018 BIOTECNOLOGIA

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS

PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS

BIOTECNOLOGA


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MANUAL DE PRCTICAS DE BIOTECNOLOGA

COMPILADORES:

Principal: M. en C. Rocio Cortes Rodrguez

Colaboradores: M. en C. Rocio Cortes Rodrguez

Revisado por: Academia de Biologia 2011

Ciudad Jurez, Chihuahua

Universidad Autnoma de Ciudad Jurez

2009

p. 81


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M. en C. Emilio Clarke Crespo

Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias

Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez

Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco

Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011


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CONTENIDO

Practica 1. Preparacion de las soluciones madre para Medios de Cultivos paraplantas!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ....!3

Practica 2. Preparacion de los Agares para cultivo de plantas in vitro....!!!!!!.10Practica 3. Cutivo in vitro de plantas (semilla)!!!!!!!!!!!!...!..!!!.15

Practica 4: Cultivo in vitr de plantas (organos vegetales)!!!!!!!!...!!!!.19

Practica 5: Fermentaciones!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ..23

Practica 6: Glicolisis anaerobica y fermentacin !!..!!!!!!!!!!!!!!26

Practica 7: Fermentacion alcoholica!!!!!!!!!!!!.!!!!!!!!!..29

Practica 8. Fermentacion lactica!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ..34

Practica 9: Analisis de tecinicas para deteccion de alimentos OGM(documental)!!!!!!!!!..!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! .37

Practica 10: Extraccion de ADN eucariotico!!!!!!.!!!!!!!!!!!!.39

Practica 11: Extraccion de ADN procariotico!!!!!!!!!!!!!!!!!!.43

Practica 12:Electroforesis con geles de Agarosa!!!..!!!!!!!!!!!!..46

Practica 13: Reaccion en Cadena de la Polimerasa y sus variantes (PCR)

(Demostrativa y Documental)!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! .!.50

Practica 14. Secuenciacion de ADN (demostrativa, Documental)!!!!!!!!!.53

Practica 15. Prueba diagnosticos (ELISA)!!!!!!!!!!!.!!!!!!!!55

Practica 16: Bioinformatica y Biotecnologia!!!!!!!!!!!!!!!!!!...58

Practica 17. Biorremediacion (documental)!!!!!!!!...!!!!!!!!!!60

Practica 18. Fitorremediacion!!!!!..!!!!!!!!!!!..!!!!!!!..62

Practica 19. Biocombustibles!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ...64

Practica 20. Analisis de contaminacion del agua!!!!!!!!!!.!!!!!!.67


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Practica 1: Preparacin de soluciones madre para los medios de cultivo

Objetivo:

Que el alumno obtenga un conocimiento prctico sobre los diversos mtodos de

preparacin de medios de cultivo para propagar in vitro.

Introduccin:

Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro":por ejemplo, se encuentran las sales minerales que incluyan todos los elementosesenciales tanto micro como macronutrientes, las vitaminas tales como riboflavina,tiamina, piridoxina, cido nicotnico, cido pantotnico, biotina, y cido flico.

Aminocidos tales como L-glutamina, asparragina y cistena, los hexitoles como mio-inositol, hormonas y reguladores del crecimiento, una fuente de carbono y un agentegelificante.

Un mtodo de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que seconoce como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas solucionestienen una concentracin que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces superior a laconcentracin final del medio. Su ventaja no estriba slo en el hecho de que hay quepesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino tambin la exactitud de lapesada ya que algunos compuestos estn tan diluidos en la solucin final, que lapesada que habra que hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de lasbalanzas de precisin.

Las soluciones madre se conservan en frio y en bote color mbar durante algunosmeses, desechndose ante cualquier seal de precipitacin.

Se suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminocidos,hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agentegelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no seconservan bien en solucin.

En el caso de las hormonas es mejor preparar una solucin madre de cada una deellas y medir volmenes determinados y congelarlos.

Materiales:

Botes de cristal o de plstico (preferiblemente de los primeros por su

transparencia), que en algunos casos habrn de ser de color mbar para proteger de laluz determinados compuestos que son fotosensibles.

Balanza granataria

Balanza analtica

Esptulas de distinto tamao para pesar


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Embudos de pesar

Agitador magntico

Imanes

Vasos de precipitados

Probetas

Matraces aforados

Eppendorf

Compuestos qumicos

Agua destilada

Autoclave

Termoplato

Algodn

Gasas

Tape

Cajas petri estriles

Tubos de ensaye esmerilados con tapa

Procedimiento:

Se establecern 8 equipos de trabajo por cada grupo de prcticas (2 en cada lateral de

una mesa).

Normas generales a la hora de pesar

- Se debe comprobar los clculos. Y tener en cuenta que los valores de las

soluciones madre estn expresados para un litro

- Debe leer las caractersticas del reactivo que se va a pesar. Algunos son

txicos por inhalacin o en contacto con la piel y hay que mantener las debidasprecauciones.

- Para medidas desde 0.01 g se utilizar la balanza granataria. Para valores

inferiores la balanza analtica.

- Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se est haciendo la pesada.

Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza, favor de

colocar pesa sustancias.


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- Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que

asegurarse de que est limpia y seca. Es una precaucin que evita la

contaminacin de los reactivos.

- Hay que tener la precaucin de tomar del frasco de reactivo muy poca

cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frascoparte de lo que se tom.

Normas generales a la hora de preparar las disoluciones

- Si la disolucin se va a remover con un agitador mecnico el mejor recipiente

es un vaso de precipitados. Si la agitacin es manual, suele ser mejor un

erlenmeyer.

- Antes de empezar a aadir los solutos se deber poner un 70% del volumen

total de agua

- Cuando una disolucin incluya ms de un reactivo, estos se aadirn uno auno y teniendo la precaucin de no aadir uno hasta que el otro est

totalmente disuelto.

- Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta,

nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer.

- Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en

el que figuren los siguientes datos:

- Tipo de solucin. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc

- Grado de concentracin. Ej 100 X (100 veces ms concentrada que lasolucin final)

- Componentes con frmula y peso en g/l

- Fecha de preparacin

- Nombre de los integrantes del equipo

Equipo 1Preparar 250 ml de la solucin de macronutrientes del medio MS.

Equipo 2Preparar 250 ml de la solucin de Calcio MS y 250 ml de la solucin de

Hierro y EDTA MS. En este segundo caso, se deber poner en el recipientedonde se prepara la disolucin un volumen de agua de aproximadamente un

80% del final y adicionar la solucin de hierro. Cuando se haya disuelto,

adicionar poco a poco y en agitacin las sales de EDTA hasta su total disolucin.

Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en frasco

mbar y colocar en refrigeracin.


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Equipo 3 Preparar 250 ml de la solucin de micronutrientes del medio MS.

Equipo 4Preparar 250 ml de la solucin de vitaminas del medio MS.

Equipo 5 Preparar 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A, B, C y D

del medio DKW.Equipo 6Preparar 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las

hormonas del medio DKW.

- La solucin Hse prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde

se prepara la disolucin un volumen de agua de aproximadamente un 80% del

final y se adiciona la sal de hierro. Cuando se haya disuelto, se adicionan poco

a poco y en agitacin las sales de EDTA hasta su total disolucin. Si es

necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en frasco mbar

en refrigeracin.- Hormonas. Se prepararn 10 ml de cada una de las disoluciones.

Para cada una de ellas se proceder del siguiente modo: Se pesar la

hormona en el un tubo aforado. Se le aaden unas gotas de NaOH 1N y se

disuelve. A continuacin se va aadiendo poco a poco y agitando, agua

destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf.

Se rotulan cada uno de ellos y se guardan en el congelador.

Equipo 7Preparar 250 ml de la solucin E

Equipo 8 Preparar 250 ml de la solucin F2. Primero se preparan 500 ml de la

solucin de biotina. De estos 500 ml, se toman 250ml y se les aade la cantidad

correspondiente a 250 ml del resto de las vitaminas.

Despus de la explicacin anterior, se prepararan las soluciones madre de las sales,

vitaminas, aminocidos y hormonas necesarias para los medios DKW y MS. Veamos la

composicin de cada uno de ellos:


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Sales mineralesMS (Murashige and Skoog,1962)

(g/l)

(NH4 )NO3 1.650

KNO3 1.900

CaCl2.2H2O 0.440

MgSO4.7H2O 0.370

KH2PO4 0.170

FeSO4.7H2O 0.0278

Na2EDTA. 2H2O 0.0372

MnSO4.H2O 0.0169

ZnSO4.7H2O 0.0086

H3BO3 0.0062

KI 0.00083

Na2MoO4.2H2O 0.00025

CuSO4.5H2O 0.000025

CoCl2.6H2O 0.000025

Mioinositol 0.100

Tiamina HCl 0.0001

Acido nicotnico 0.0005

Piridoxina HCl 0.0005

Glicina 0.002

Sales minerales DKW modificado

(g/l)

(NH4)NO3 1.416

Ca (NO3)23H2O 1.811

(1.960 si es 4 H2O)

CaCl22H2O 0.147

MgSO47H2O 0.74

KH2PO4 0.258

FeSO4 7H2O 0.00676

Na2EDTA 2H2O 0.0908

K2SO4 1.56

Mn SO4 H2O 0.0338

Zn SO47H2O 0.0212

BO3H3 0.0124

KI 0.00166

Na2MoO42H2O 0.0005

Cu SO45H2O 0.00005

Co Cl26H2O 0.00005

Mioinositol 0.1

Tiamina H Cl 0.001

c. nicotnico 0.001

Piridoxina. HCl 0.001

Biotina D(+) 0.00001

Glutamina (base libre ) 0.001

L-Cystena H Cl 0.001

Pantotenato de Ca 0.1


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Lo ms normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, demodo que la preparacin de la solucin final sea ms rpida y tenga menos margen deerror.

Veamos la composicin de cada una de las soluciones madre de ambos medios:Soluciones madre del medio MS (g/l)

MACRONUTRIENTES(10 X)

NH4NO3 16.5

KNO3 19

MgSO4.7H2O 3.7

KH2PO4 1.7

CALCIO,(10 X)

CaCl2.2H2O 4.4

MICRONUTRIENTES (100 X)

MnSO4.H2O 1.69

ZnSO4.7H2O 0.86

H3BO3 0.62

KI 0.083

Na2MoO4.2H2O 0.025

CuSO4.5H2O 0.0025

CoCl2.6H2O 0.0025

HIERRO Y EDTA (10 X)

FeSO4.7H2O 0.278

Na2EDTA.2H2O 0.372

VITAMINAS (20 X)

Mioinositol 2

Tiamina HCl 0.002

Acido nicotnico 0.01

Piridoxina HCl 0.01

Glicina 0.04

Soluciones madre del medio DKW modificado (g/l)

A (10 X)

NH4NO3 14.16

CaCl22 H2O 1.47

Ca (NO3)2 3 H2O 18.11 ( 19.60 g/l si es 4 H2O )

B (10 X)

KH2PO4 2.58

C(10 X)

K2SO4 15.6

D (10 X)

Mg SO47 H2O 7.4

E (50 X)

Mn SO4 7H2O 1.69

Zn SO47H2O 1.06

BO3H3 0.6.2

KI 0.083

Na2MoO42H2O 0.025

Cu SO45 H2O 0.0025

Co Cl26H2O 0.0025

F1(100 X)

Glutamina (base libre ) 0.1

L-Cistena HCl 0.1

F2(100 X)

Biotina D(+) 0.001

Tiamina H Cl 0.1

c. Nicotnico 0.1

Piridoxina 0.1

Pantotenato de Ca 0.1


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Referencias:

lvarez Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prcticas

de Biotecnologa Vegetal. Universidad de Extremadura (Badajoz)

Driver, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut

rootstock. Hort. Science, 19(4).

Murashige, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologa Plantarum, 15, 473-497.

Revilla Bahillo, ngeles y Ords, Ricardo. Guiones de prcticas de BiotecnologaVegetal. Universidad de Oviedo

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Conclusiones:

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Practica 2: Preparacin de los Agares para cultivar in vitro.

Objetivo:

El estudiante tendr conocimiento de la preparacin de los agares para cultivar plantas

in vitro a partir de las soluciones madre (practica 1), para con ello tenga mas claro elconcepto de micro propagacin de plantas para mejora biotecnolgica.

Introduccin:

El trmino cultivo de tejido vegetal implica una amplia gama de tcnicas de cultivotanto de rganos, como de tejidos y clulas e incluso plantas completas, entre las quese encuentra la micro propagacin; la recuperacin de embriones; la regeneracin deplantas a partir del callo y la suspensin de clulas, as como el cultivo de protoplasma,anteras y microsporas, que se utilizan sobre todo para la multiplicacin de plantas engran escala (Segretin, 2006).

Materiales:

Autoclave Sacarosa

Algodn Agar-Agar

Frascos gerber

Tubos de cultivo

LigasPapel aluminio

Matraz de 1000ml

Moscas magneticas

Termoplato

Campana de flujo laminar

Agua destiladaEtanol

Soluciones madre del MS


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Procedimiento:

Para la preparacin de los Agares para medio de cultivo para plantas:

El medio de cultivo es el Murashige & Skoogque que consta de una amplia cantidad de

nutrientes los cuales se muestra en la siguiente figura:

Para su preparacin en 1000 mL se pesan las cantidades de cada uno de los

compuestos o en su defecto si estos ya se tienen pre-pesados y en un frasco limpio porseparado solo se agrega la cantidad adecuada segn el volumen a preparar.

Agrega el agua destilada al matraz en que se preparara, disolver el medio ya pesado,agitar muy bien hasta observar cierto grado de solubilizacin. Agregar la sacarosa

Ajustar el pH a 5.8 y agregar el agar-agar.


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Someter a calentamiento con agitacin sin que llegue a la ebullicin. Proceda a vaciarel medio en frascos limpios y asegrese de llenarlos con aproximadamente 50 mL, 2/4del recipiente o segn vea necesario. Meter a la autoclave para su esterilizacin(250F, 15 lb, 15 min). Pasado este periodo de esterilizacin, se sacan de la autoclavey se dejan enfriar y se meten a refrigeracin o bien a una alacena limpia.

Resultados:

Pesado y calentado

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Esterilizado

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Vaciado

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Conclusiones:

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Referencias:

Krikoria, A. (1990). Medios de cultivo: generalidades, composicin y preparacin.Universidad de Nueva York. New York, E.U. 1-19

Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad deinvestigacin de Biotecnologa. Cali, Colombia. 1-22

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Practica 3: Cultivo in vitro de plantas (semillas)

Objetivo:

Que el estudiante se familiarice con la siembra de semillas in vitro, que aprenda las

tcnicas para cultivos de tejidos, rganos vegetales y la obtencin de callos a partir desecciones de zanahoria.

Introduccin:

La biotecnologa vegetal es el cultivo in vitro de las plantas, en recipientes de vidrio, ysupone mantener las plantas en laboratorio, fuera de su entorno natural, teniendo comosustrato un medio de cultivo. En la composicin del dicho medio se encuentranelementos minerales, agua, hormonas, sustancias orgnicas y vitaminas, siendo suporcentaje muy variable segn las especies vegetales y pudiendo faltar alguno de estoscomponentes. La biotecnologa actual se centra en la obtencin de frmaco y vacunasy sobre todo en la obtencin de nuevas especies y variedades con capacidad parasoportar ataque de microorganismos o situaciones de estrs (salino, hdrico, etc.). Esde destacar la obtencin de nuevos hbridos vegetales, por adicin de ADN forneo,obtenindose los conocidos organismos transgnicos.

Materiales:

Campana de flujo laminar

Estuche de diseccin; bistur, pinzas grandes, pinzas pequeas y tijeras.

Frascos gerber con agar para plantas

Tubos con agar para plantas

Vasos de precipitados (7)

Mecheros

Alcohol

Agua estril

Cloro

Probetas

Cajas petri


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Procedimiento 1: desinfeccin de semillas

Para nuestra practica con semillas, se dispondrn de diversos tipos de semillas decereales y frutos ctricos completos. Las semillas que se extraigan de los frutos yaestn estriles (luego no hay que desinfectarlas), pero las semillas aisladas si que hay

que esterilizarlas (con dos agentes: cloro y alcohol).

Los pasos a seguir para la desinfeccin son:

1. se deben envolver las semillas en paquetes para poder manipular con las pinzasy una vez hechos se procede a esterilizarlas.

2. Se sumergen en etanol durante 1 min3. Se sumergen en solucin de hipoclorito de sodio o cloro al 20% por 15 min.4. Se enjuagan en tres vasos de precipitados con agua estril, destilada,

desionizada durante un par de minutos por cada vaso (7).

Procedimiento 2: Siembra de semillas (rea estril)

Una vez que se tienen en el 7mo vaso de precipitado de agua estril, las semillas yaestn listas para su siembra en tubos de ensayo o en frascos gerber, que tiene mediode cultivo para plantas adecuado. Para sembrar las semillas en los medios de cultivose enciende el mechero, se lavan las manos hasta el medio brazo y despus seremojan en etanol al 10% hasta que se seque inician la manipulacin o bien utilizarguantes estriles. Despus de eso toman el paquete de material estril y las cajas depetri de vidrio, que nos servir como mesa de trabajo. Con la ayuda de unas pinzas, se

pone el paquete de semillas sobre una caja de precipitados y se abre, con las pinzas setoman las semillas para depositarlas en el medio de cultivo.

En el caso de los frutos de ctricos completos se procede a esterilizar el fruto enteropulverizando con alcohol y luego la flamea. En la campana de flujo laminar se abren losfrutos (limn, naranja o mandarina) y se extraen las semillas con unas pinzas. Trashacer una pequea incisin en la cubierta se siembran en tubos o frascos gerber con elmedio de cultivo adecuado.


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Resultados:

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Conclusiones:

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Referencias:

Serrano G.M, Biotecnologa vegetal, Madrid D.L

Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P

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Practica 4: Cultivo in vitro de plantas (rganos vegetales)

Objetivo:

El alumno aprender a realizar el montaje de un cultivo de tejidos vegetales a partir de

explantes nodales.Introduccin:

El trmino genrico cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes tcnicas decultivo de material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (clulas desprovistasde su pared celular), clulas, tejidos, rganos y plantas completas. Mediante stas yotras tcnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medionutritivo asptico (estril) en condiciones ambientales controladas. Tambin se loconoce como cultivo in vitro de plantas por realizarse en recipientes de vidrio (hoytambin de otros materiales). Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo detejidos vegetales se remontan a 1902, pero recin en 1922 se logr el primerexperimento exitoso: la germinacin in vitro de semillas de orqudeas. Luego de lagerminacin, las plntulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo encondiciones aspticas, y as se mantuvieron protegidas del ataque de patgenos(hongos, virus y bacterias).

Materiales:

Microscopio de diseccin

Microscopio compuestoMuestra de hongo desarrollado en la caja petri

Asa de platino Formol

Porta y cubre objetos Cutex

Azul o rojo colorantes

Fibra de vidrio

Etiquetas adheribles

Procedimiento:

Para la obtencin de explantos nodales, se deben de lavar los tallos seleccionados conabundante agua. Secar cuidadosamente con papel filtro. A continuacin se pasa aeliminar las hojas de los tallos, cuidado dejar 2 cm del peciolo unido al tallo. Igualmentedeben eliminarse las espinas (si las hubiera). Acto seguido se separa los entrenudos(que deben contener al menos una yema axilar) con ayuda de unas tijeras. Debemosconseguir porciones de tallo de unos 4-5 cm aproximadamente.


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Para la estilizacin de los explantos nodales, se envuelven en una gasa y se introduceen un bote que contenga 100 ml de la disolucin desinfectante (hipoclorito de sodio ocloro al 20%) durante 10 min (agitar espordicamente). Despus se lava 3 veces envasos de precipitado con agua estril, ayudndose de unas pinzas largas. Una vezdesinfectado el material vegetal se procede a la siembra en los frascos gerber o en

tubos de ensaye con medio de cultivo.Para la siembra de los explantos nodales se enciende el mechero (todo en esterilidad)y se abre el paquete del material estril y las cajas petri que nos servir como mesa detrabajo. Con ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de explantos nodales sobre lacaja petri, se abre y se toman con las pinzas, para depositarlas en el medio de cultivo.

La introduccin del material vegetal en los frasco gerber debe ser muy cerca de lallama y usando pinzas estriles.

Resultados:

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Conclusiones:

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Referencias:

Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P

Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de

investigacin de Biotecnologa. Cali, Colombia. 1-22Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp.


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Practica 5: Fermentaciones.

Objetivo:

El alumno entienda el concepto de fermentaciones, demostrar la formacin del acido

piruvico durante la fermentacin de la glucosa por levadura e identificarlo. .Introduccin:

La fermentacin es un tipo de catabolismo parcial, que se caracteriza por ser unproceso de oxidacin incompleta, tpico de los organismos anaerbicos. Se realiza,pues, sin la intervencin del oxgeno. Durante la fermentacin, la energa obtenidaprocede, igual que en la respiracin aerobia, de las reacciones de oxido-reduccinhabidas durante el catabolismo de la glucosa (gluclisis), pero en la fermentacin lascoenzimas reducidas no ceden sus electrones a una cadena cuyo aceptor final es eloxgeno, sino que los ceden directamente a un compuesto orgnico que se reduce y esel producto caracterstico de cada fermentacin (lctica, alcohlica...).

Materiales:

Tubos de ensaye de 13 x 100

Tubos de centrifuga

Tripie, rejilla, anillo, mechero.

Bao mara.Pipetas de 5 ml. graduadas.

Centrifuga.

Vasos de precipitados de 250 y 600 ml.

Pinzas para tubos de ensaye.

Solucin de glucosa a diversas concentraciones 0.5, 1.0, 2.0%

Suspensin de levadura al 5 % en Na2HPO4 y KH2PO4 (18 hrs de fermentacin antesde su utilizacin).

cido tricloroactico al 10%

Nitroprusiato de sodio.


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2,4 dinitrofenil-hidracina.

Hidrxido de amonio concentrado.

Hidrxido de sodio 0.1N

Sulfato de amonio slido.

Nota: un da antes de la prctica llevar su levadura para fermentarla

Procedimiento:

Formacin de Piruvato:

Se deben marcar dos series de tubos de 3 cada una y adicionar 3 ml. de las solucionesde glucosa a las diferentes concentraciones 0.5, 1.0, 2.0% a ambas series. A una de

las series de tubos adicionarles 3 ml. de suspensin de levadura con fosfatos desodio(0.213 g/100 ml) y marcarlos como A; y a la otra serie adicionarle 3 ml. de lasuspensin de levadura con fosfatos de potasio(0.09 g/100 ml) y marcarlos como B.Posteriormente se colocar todos los tubos en bao mara a 37.C por 30 minutos yaadir posteriormente a cada tubo 1 ml. de TCA al 10% mezclado vigorosamente ycentrifugar a 2500 r.p.m. por 10 minutos. Separar el sobrenadante y desechar elprecipitado.

Identificacin de Piruvato:

Reaccin con nitroprusiato de sodio

En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y hervirlo. Se leadicionan 0.5 gr. de sulfato de amonio slido y agitar. Posteriormente agregar dosgotas del reactivo y mezclar vigorosamente y dejar deslizar por las paredes del tubounas gotas de hidrxido de amonio concentrado, hasta la formacin de dos capas. Laformacin de un anillo verde o azul en la interfase indica afirmativo para la prueba.Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series.

Reaccin con 2,4 dinitrofenil-hidracina.-

En un tubo de ensaye colocar 1 ml. del sobrenadante obtenido y adicionar 1 ml. del

reactivo, agitar con fuerza y pasar a otro tubo la mitad de la mezcla formada, yadicionar 1 ml. de NaOH 0.1N. La aparicin de un color rojo indica prueba afirmativa.

Repetir lo anterior para cada uno de los tubos de ambas series. Observar la coloracine intensidad de la misma en cada caso.


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Referencias:

Bamforth W. Charles. 2007. Alimentos, fermentacin y microorganismos. Editorial

Acribia S.A.Owen P. 1991. Biotecnologia de la fermentacin Principios, procesos y productos.Editorial Acribia.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 6: Glicolisis anaerobica y Fermentacion

Objetivo:

Observar los efectos en una situacion simulada de la fermentacion anerobia que en larealidad se efectua en los seres vivos y verificar la inhibicion ocasionada en la rutametabolica de la glicolisis por el NaF.

Introduccin:

De todos los organismos vivientes solo unas pocas especies son estrictamenteanaerobicas, esto es, que solamente pueden vivir en ausencia de oxigeno. La mayoriason microorganismos, en particular aquellas especies propias del amibiente que tienepoco oxigeno o que carece de el, es decir, en los intesitnos de los animales, en el suelo

profundo, en sedimientos que se encuentran bajo los lagos y oceanos o en pantanodonde el oxigeno esta casi totalmente ausente. Un ejemplo de estas bacterias del sueloClostridium perfringens, que causa la gangrena gaseosa en infecciones de heridas.

El producto de la fermentacoin varia de un tipo de celula o microorganismo a otro.Cuando se requiere concentracion repetida de celulas musculares, el suministro deoxigeno no tiene capacidad para mantener el paso de las demandas metabolicas de lacelula. En estas condiciones ciertos tipos celulas musculares esqueleticas regeneranNAD convirtiendo piruvato a lactato (fermentacion del acido lacatico). Las celulas delevaduras han enfrentado el desafio de la vida anaerobia con una solucion metabolica

diferente, convierten el piruvato a etanol (fermentacion alcoholica).

Materiales:

Tubos de ensayo

Beakers de 300 ml

Bao maria

1 hoja de papel milimetrico

Levadura (fresca 5 a 10%)

Glucosa (5 a 10%)

Fluoruro de sodio (5 a 10%)

Agua destilada


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Procedimiento:

Marcar tres tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera:

Tubo A:

Llene una tercera parte del tubo con suspesin de levadura y luego agregue aguadestilada hasta llenarlo totalmente.

Tubo B:

Llene una tercera parte del tubo con suspensin de levadura y agrege solucion deglucosa hasta llenarlo totalmente.

Tubo C:

Llene una tercera parte del tubo con suspensin de levadura, agregue otra terceraparte con solucion de glucosa y termine de llenarlo con solucion de fluoruro de sodio(NaF).

Tomar cada tubo y taparlo con un tapon de caucho (tenga cuidado que no quede muyapretado), invertir suavemente para mezclar. No debe quedar aire en la parte superiordel tubo.

Conectar por medio de la manguera del tapon al tuvo en U que contiene la columna del

liquido a desplazar.Colocar en bao maria a 37C. Si el procediemitno estubo bien hecho, solo quedara unacolumna de aire en la parte superior de la manguera.

Medir la altura del liquido en el tubo en U al conectar.

Examinar los tubos de la siguiente manera (si es posible durante 6 lecturas).

Tubo A: cada tres minuos

Tubo B: cada minuto

Tubbo C: cada 15 minutos

Anotar los resultados en el cuadro

Hacer una grafica con los datos anteriores, coocando en la ordenada el tiempo enminutos y en la abcisa la produccion de CO2 en mL. Hacer el analisis de la grafica(anovas).


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Referencias:

CORN Y STUMPF, Bioqumica Fundamental, Editorial Limusa, 1998

DEVORE G. y Muoz Mena, Qumica Orgnica, Editorial Publicaciones Culturales,Mxico 1992.

Resultados:

Tubo Contenido Desplazamiento del liquido (mL)

A Levadura y agua

B Levadura y glucosaC Levadura, glucosa y

NaF

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Realizar la grafica en papel milimetrico.

Cuestionario:

1. El ATP da el impulso iicial para inicial al glucolisis, fosforilando la glucosa. cules la reaccin?.

2. La fructosa 1-6 difosfato origina dos triosas que pueden convertirse una en otra.cules son estas?

3. Estas triosas en ultimo termino se convierten en acido pirvico o piruvato.Represente las reacciones respectivas en esta conversin.

4. Los dos productos de la glucolisis piruvato y NADH, se pueden metabolizarsiguiendo dos vas muy diferentes segn el tipo de clula en la cual se generan.cules son estas dos vas?

5. Escriba la reaccin de la fermentacin del acido lctico. Y diga dos ejemplos declulas que la realizan.

6. Escriba la reaccin de la fermentacin alcohlica y diga dos ejemplos de clulasque la realizan.

7. Escriba la reaccin general de la respiracin celular u oxidacin aerobia.


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8. En que lugar u organelo de las clulas procariotas y eucariotas se da lafermentacin (oxidacin anaerobia del NADH) y la respiracin celular (oxidacinaerobia) y bajo que condiciones se da cada una.

9. Qu influencia tiene el NaF en el proceso de la fermentacin y por medio deque mecanismo lo hace.

Practica 7: Fermentacion alcoholica

Objetivo:

El alumno debe utilizar el metabolismo de las levaduras para producir alcohol etlico(etanol), a partir de un jugo enriquecido con azcares fermentables.

Introduccin:

Para describir la palabra fermentacin se refiri originalmente al metabolismoanaerbico de los compuestos orgnicos mediante microorganismos o sus enzimas

para dar lugar a productos ms simples que la materia prima. La definicin actual es:Cualquier accin microbiana controlada por el hombre para obtener productos tiles.Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen, se reproducen y segreganalgunos compuestos bioqumicos de importancia para el hombre; estas son lascaractersticas en las que se ha basado el uso de los microorganismos comoproductores de fermentacin, la que de una manera esquemtica se puederepresentar as:

Microorganismos + Nutrientes + Condiciones Ambientales Adecuadas -------Microorganismos + CO2(g) + Productos intra y extracelurares.

La fermentacin se puede clasificar de la siguiente manera:

Fermentacin con base al substrato. Protenas, Grasas, Carbohidratos.

Fermentacin con base al producto. Alcohlica. Lctica, Acetonica, etc.

Materiales:

1 Agitador de vidrio 100 grs. Azcar

1 Anillo de Fierro 250 grs. Cscara de Pia

1 Cuchillo 200 ml de Jugo de Pia

1 Coladera grande 250 grs. de Piloncillo o azucar

1 Matraz de destilacin 100 ml de solucin de Hidrxido de Bario al 2%

1 Mechero Bunsen 6 ml de reactivo de Fehling A y B


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2 Pipetas graduadas de 5 ml 2 lts. De Agua

1 Pipeta graduada de 10 ml

1 Pinzas para tubo de ensayo

3 Pinzas universales

1 Pinzas Hoffman

1 Franela

1 Mortero con pistilo

1 Tela de alambre con asbesto

2 Tapones monohoradados

3 Tubos de ensayo de 16x150mm

1 Termmetro

1 Vaso de precipitado de 250 ml

45 cm de Manguera de ltex de 4mm de dimetro

1 Refrigerante

2 Soportes universales

1 Frasco claro con tapa, de 3 a 5 litros, de boca ancha.

1 Frasco claro sin tapa de 200 a 300 m

Procedimiento:

DESARROLLO DE LA PRACTICA

Nota. Esta prctica se llevara a cabo en 3 sesiones de laboratorio.

Primera Sesin

1. Lavar, pelar y hacer trocitos de 2.5 cm aproximadamente de la cscara y de la pulpade la pia.

2. Se comprime la pulpa de la pia hasta obtener un volumen aproximado de 200 mlde jugo.

3. Lavar perfectamente 1 frasco claro de 3.5 lts. de boca ancha.


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4. Efectuar en el frasco anterior la siguiente mezcla: 200 ml de jugo de pia, toda lacscara de la pia en cuadritos, 250 grs. de piloncillo, 100 grs. de azcar y 2 litros deagua.

5. A la tapa del frasco anterior que har las veces de un fermentador se le har un

orificio para adaptar un tramo de 45 cm de manguera de ltex de 4 mm de dimetro ala cual se le coloca una pinza de Hoffman para evitar que escapen los gases que seforman.

6. Agitar vigorosamente la mezcla anterior y del sobrenadante se extraen con la pipeta6 ml, de los cuales se depositan 3 ml en un tubo de ensayo y los otros 3 ml en otro tubode ensayo.

7. Al primer tubo de ensayo se introduce una tira de papel ph, con el fin de determinarel pH de la mezcla. pH= .

8. Al segundo tubo se le agregan 1.5 ml de reactivo de Fehling A y 1.5 ml de reactivode Fehling B.

9. Agitar, el segundo tubo.

10. Calentar suavemente con el fin de detectar la presencia de azucares reductores(precipitado de color rojo ladrillo). Reportar positivo o negativo.

11. Tapar el frasco y cerrar la pinza de Hoffman.

12. Dejar fermentar durante 24 hrs.

Segunda Sesin

1. Transcurridas las 24 hrs. Sumergir la manguera de ltex del frasco en 100 ml desolucin de hidrxido de Bario al 2%, dispuesta en un frasco de 200 a 300 ml de colorclaro.

2. Se abre lentamente la pinza de Hoffman, con el objeto de que el gas producidoentre en contacto con la solucin.

3. Anotar observaciones.

4. Se contina la fermentacin durante otros 6 das.

Tercera Sesin

1. Transcurridos los 6 das, se decanta el sobrenadante en un vaso de precipitado.

2. Se filtra el sobrenadante con una franela colocada en la coladera.


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3. El lquido obtenido contiene de 6.7 a 12 grados de alcohol etlico (tepache).

4. Se efecta nuevamente la determinacin de pH y azucares reductores (repetir lospasos 7,8,9, y 10 de la primera sesin. PH = ; Azucares Reductores ( + o -)=

5. Para separar el alcohol del jugo fermentado se lleva a cabo una destilacin (conayuda de tu maestro armar el dispositivo de destilacin.

6. Desechar las primeras y las ltimas gotas del destilado (cabeza y cola deldestilado).

Nota. El alcohol destila por encima de los 78 grados centgrados.

Referencias:


DEVORE G. y Muoz Mena, Qumica Orgnica, Editorial Publicaciones Culturales,Mxico 1992.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 8: Fermentacion lctica

Objetivo:

Obtener el yogur por medio de la fermentacin lctica y observar las bacteriascausantes de dicha fermentacin..

Introduccin:

Las fermentaciones son procesos de respiracin anaerobia realizados por ciertasbacterias y levaduras. En ellos, el aceptor de H+ y electrones cedidos por una molculaorgnica no es el oxgeno sino otra molcula. Dependiendo de cul sea esta molcula

se obtendrn distintos productos finales. En el caso de la fermentacin lctica, lamolcula aceptora es el cido pirvico y el producto resultante es el cido lctico. Estafermentacin se emplea en la industria alimentaria para obtener derivados lcteoscomo el yogur. El yogur es un producto producido por la fermentacin natural de laleche. A escala industrial se realiza la fermentacin aadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociacin de dos cepas bacterianas. El Streptococcus thermophilus, pocoproductor de cido, pero muy aromtico, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante.En esta preparacin se podrn, por tanto, observar dos morfologas bacterianasdistintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupacin (estreptococos, cocos en cadenasarrosariadas). Adems, el tamao del lactobacilo (unos 30 ym de longitud) facilita la

observacin aunque no se tenga mucha prctica con el enfoque del microscopio.

Materiales:

Microscopio

Portaobjetos

Asa de platino

Mechero Bunsen

Estufa de cultivo o cuarto de cultivo

Yogurtera

Matraz de 250 mL,

Pipeta de 5 mL,


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Varilla de vidrio

Papel indicador de pH

Xileno

Cristal violeta (o azul de metileno)

Frutos de hueso sanos y enfermos

Procedimiento 1: obtencin del yogur por la fermentacin lctica.

1. Se colocan 100 mL de leche en el matraz y aade 1 mL de yogur.

2. Se deja incubar el matraz en la estufa durante 24 horas a 37 C.

3. Saca el matraz y observa el contenido.

4. Mueve con la varilla para homogeneizarlo e introduce una tipa de papel indicador depH.

5. Describe lo observado en el matraz y en el papel indicador.

Para realizar este experimento tambin puedes utilizar un yogurtera domstica.

Procedimiento 2: Observacin de las bacterias causantes de la fermentacin.

1. Con el asa de siembra toma una gota de yogur y depostala sobre un portaobjetoslimpio. Aade una gota de xileno para desengrasar y mzclala con el yogur.

2. Extiende la mezcla y djala secar completamente. Luego pasa el portaobjetos por lallama del mechero 4 o 5 veces para fijar la preparacin.

3. Aplica el colorante cristal violeta durante 2 minutos.

4. Lava despus con abundante agua destilada hasta que el lquido no salga teido ydeposita sobre ella un cubre cuidando que no se formen burbujas.

5. Observa al microscopio con el objetivo adecuado (utiliza los mayores aumentos)

6. Dibuja lo que has observado.

Referencias:

Murray, R. 1994. BIOQUIMICA DE HARPER. Manual Moreno S.A. de C.V



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Resultados:

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Conclusiones:


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Practica 9. Analisis de tcnicas para deteccin de alimentos genticamentemodificados (practica documental)

Objetivo:

Conocer las diferentes tcnicas para determinar que un alimento ha sido modificado.

Introduccin:

El muestreo y la preparacin de la muestra son pasos cruciales en el proceso dedeteccin de OGM. La inspeccin de una muestra es menos costosa que la inspeccinde todo un lote; sin embargo, el contenido de una muestra no siempre refleja elcontenido del lote de muestreo. El procedimiento de muestreo determina larepresentatividad de un resultado mientras que la cantidad y calidad de los analitospuede variar dependiendo de la preparacin de la muestra. Una muestra al azar esaquella seleccionada en el proceso en la cual cada posible muestra de un lote demuestreo tiene la misma posibilidad de ser seleccionada. Esto significa que unamuestra al azar produce un estimado imparcial de la medida de inters. En la prcticauna muestra al azar no es siempre fcil de obtener a partir de un lote de muestreo (Asif,

2004).

Material:

Revistas cientficas de alimentos

Revistas cientficas de Biotecnologa

Acceso a internet para accesar a las bases de datos

Procedimiento:

Leer y hacer ensayo de la importancia de realizar anlisis a los alimentos transgnicos,y dar cuenta del bien o del mal que hacen no solo a la sociedad, sino tambin alecosistema.


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Leer y describir cada uno de los procedimientos biotecnolgicos para la formacin deun alimento transgnico.

Leer y describir los fundamentos para el anlisis molecular de OGM.

Leer y describir los protocolos para la deteccin molecular de OGM.

Referencias:

Asif M. 2004. Sampling for Detection of GMO. In: NIBGE-FAO Workshop on GMODetection. Capacity and Building in Biosafety of Genetically Modified Crops: GMOsDetection.

Zafar Y. y Asif M. (ed). National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering.

Pakistan.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 10: Extraccin de ADN eucariotico

Objetivo:

Utilizar tcnicas sencillas para poder extraer el ADN de un tejido animal y por elaspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar y confirmar que en el ncleo el

ADN se encuentra replegado.

Introduccin:

El bioqumico suizo Friedrich Miesches fue el primero en descubrir sustancia, cidosasociados con las protenas del ncleo celular. Al estudiarlas mejor, Mieschescomprendi que estas sustancias son bastante diferentes de las protenas y de otroscompuestos conocidos. La unidad bsica de un cido nucleico es el nucletido, cadamolcula de cido nucletido se forma como una larga cadena de 4 clases denucletidos, a su vez lo nucletidos pueden ser fragmentados en 3 partes; una de esaspartes es siempre un azcar de 5 carbonos y que son la ribosa y la desoxirribosa, loscidos nucleicos que contienen ribosa se denomina cido ribonucleico o ARN y los

cidos nucleicos que contienendesoxirribosa se denominan cido desoxirribonucleicoso ADN.

Materiales:

Hgado de pollo

Probeta

Varilla de vidrio

Alcohol de 96Mortero

Cloruro sdico 2M

Vasos de precipitado

SDS


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Pipeta

Arena

Portaobjeto

Trozo de tela para filtrar

Colorante bsico

Procedimiento:

1. Triturar medio higado de pollo en un mortero. Aadir arena para que al triturar sepuedan romper las membranas de y queden los ncleos sueltos.

2. Aadir al triturado, 50 centmetros cbicos de agua. Remover hasta hacer unaespecie de papilla.

3. Filtrar varias veces sobre una tela para separar los restos de tejidos que hayanquedado por romper.

4. Medir el volumen del filtrado con una probeta.

5. Aadir al filtrado un volumen igual de cloruro sdico 2M. Con esto conseguimosproducir el estallido de los ncleos para que queden libres las fibras de cromatina.

6. A continuacin se aade 1 centmetro cbico de SDS. (Nota: Si no se dispone deeste producto puede sustituirse por un detergente de vajillas. La accin de este

detergente es formar un complejo con las protenas y separarlas del ADN. As nosquedar el ADN libre de las protenas que tiene asociadas.

7. Aadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol de 96. Hay que hacerlo de forma que elalcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas. En la interfase,precipita el ADN.

8. Introducir una varilla de vidrio e ir removiendo en la misma direccin. Sobre la varillase van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de laagrupacin de muchas fibras de ADN.

9. Esta prctica puede completarse con una tincin especfica de ADN.

Tenemos que tomar una muestra de las fibras que se van depositando sobre la varillade vidrio y depositarlas sobre un portaobjeto.

10. Teir durante unos minutos con un colorante bsico.

11. Observar al microscopio.


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Referencias:

Griffith. 2002. Genetica. Mc. Graw-Hill.

Carey, J., Bamshad M., Jorde L. 2010. Gentica medica. Elsevier Espaa S.A.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 11: Extraccin de ADN procariotico.

Objetivo:

Que el alumno aprenda el fundamento para la obtencin del ADN procariotico de latcnica ms sencilla.

Introduccin:

Existen diferentes mtodos para la obtencin de ADN bacteriano que varan en

duracin y complejidad del procedimiento en funcin de la calidad del ADN quequeramos obtener.

Materiales:

MTODO DE HERVIDO

Cultivo bacteriano en placa de agar

Asa de platino

Estufa a 37 C

Eppendorf de 1.5 mL esteriles

Pipetas y puntillas desechables esteriles

Temoplato con capacidad de alcanzar 100 C

Centrifuga

Soluciones

Agua molecular esteril

Procedimiento:

Preparar un eppendorf esteril por cada muestra al que se anaden 100 microlitros deagua molecular estril


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Tomar con un asa de platino unas colonias de la placa de agar e introducirlas en eleppendorf, utilizando posteriormente la pipeta para obtener una suspensinhomognea

Calentar a 100 C durante 15 min.

Anadir 900 microlitros de agua molecular estril a cada eppendorf y homogenizar.

Centrifugar durante 5 min a 12000 rpm

Recoger el sobrenadante en un eppendorf estril.

Referencias:

Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular.

Ediciones Pri.

Griffith. 2002. Genetica. Mc. Graw-Hill.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 12:Electroforesis en geles de agarosa.

Objetivo:

Que el estudiante se familiarice con la tcnica de electroforesis en geles de agarosapara la lectura de los cidos nucreicos.

Introduccin:

La electroforesis es el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico. Adiferencia de las protenas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, loscidos nucleicos estn cargados de forma negativa debido a su esqueleto de gruposfosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia el polopositivo, es decir, el nodo. La concentracin de agarosa tpicamente utilizada paraelectroforesis est entre el 0.5 % y el 2%. La concentracin a usar se escoge segn eltamao del cido nucleico a analizar. Esto porque la concentracin de agarosa defineel tamao de los poros de la matriz, a mayor concentracin, menor el tamao de losporos y viceversa. Durante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un altopeso molecular migrarn al nodo ms lentamente que cidos nucleicos lineales con

un menor peso molecular. La razn de esto es que los cidos nucleicos de alto pesotardan ms tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de cidos nucleicosno linealizados, como plsmidos circulares en conformacin nativa, la migracin nosolo depender del peso molecular sino tambin de otros aspectos como el grado desuperenrrollamiento que ste poseea. Generalmente en una preparacin de plsmidose pueden observar distintas conformaciones de la misma molcula, la formasuperenrrollada, la forma semi relajada y una relajada. Dependiendo de lascondiciones externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solouna (s).

Materiales:

Marcador de peso molecular.

Cmara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte, peines, tabla niveladora,burbuja niveladora, etc.


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Solucin amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). La solucin se prepara 5X y seutiliza 0.5X. Para preparar 1 l de una solucin 5X TBE mezclar: 54 g de Tris Base, 27.5g de cido brico, 4.7 g de EDTA sdico, llevar a 1 l con agua y autoclavar.

Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. Precaucin: el bromuro de etidio

es un agente mutagnico, utilice guantes para manipular cualquier material o solucinque contenga este qumico.

Amortiguador de muestra con azul de bromofenol

Tubos de 1.5 ml

Beaker o erlenmeyer de 125 ml

Micropipeta de 20 "l con sus respectivas puntas

Lmpara de UV. Precaucin: la luz ultravioleta puede daar sus ojos. NUNCA observe

un gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz.

Guantes

Procedimiento:Pesar la cantidad de agarosa requerida para obtener un gel de agarosa al 1%. Elvolumen final es de 30 ml.

Disolver la agarosa en 30 ml de amortiguador TBE 0.5x. Calentar en el microondas por45 s, luego se agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas laspartculas de agarosa translcidas. Se debe tener precaucin con los recipientes

calientes ya que pueden causar quemaduras.

Incorporar 1.25 l de bromuro de etidio a 10 mg/ml en la solucin caliente de agarosa yagitando con movimientos circulares. Precaucin: El bromuro de etilo es uncarcingeno y debe manejarse con cuidado. Hay que evitar que se derrame ladisolucin o tener contacto directo con esta. La punta que contiene bromuro de etidiodebe ser descartada en un recipiente especial para descartar material contaminado conbromuro de etidio.

El soporte para vaciar el gel debe estar limpio y seco, se ajusta en el molde portagel o

tabla niveladora y se colocan los peines que generarn los pozos para aplicar lasmuestras.

Cuando la agarosa alcanza los 5060 C aproximadamente se vierte en el centro de labandeja para gel evitando la formacin de burbujas.

Se deja reposar, el gel tarda de 2040 minutos para solidificar a temperatura ambiente.


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Una vez solidificado el gel se quitan los peines, sujetndolo con ambas manos yjalando cuidadosamente hacia arriba.

Posteriormente se translada el soporte para el gel hasta la cmara de electroforesis,colocando los pozos mas cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro)

debido a que las muestras migrarn hacia el nodo (de color rojo) durante laelectroforesis. Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm.

Para preparar las muestras aada en un tubo de 1.5 ml:

5 l de agua destilada desionizada

5 l de su preparacin de plsmido

2 l de amortiguador de la muestraPara preparar el marcador del peso molecular, aada en un tubo de 1.5 ml:

7 l de agua destilada desionizada

3 l del marcador de peso molecular (MPM)

2 l de buffer de la muestra

Con una micropipeta de 20 "l con punta aspirar la muestra preparada previamente.Colocar la micropipeta en forma perpendicular al gel de agarosa, e introducirla hasta el

fondo del pozo liberando su contenido mientras se va sacando lentamente la punta delpozo. Tome nota del orden en que se colocaron las muestras y el marcador de pesomolecular.

Para iniciar la corrida electrofortica, colocar la tapa, asegurndose que los electrodosestn en contacto y conectados a la fuente de poder. Encienda la fuente de poder. LaSe electroforesis se realiza a 100 V, 50 miliamperios durante 30 minutosaproximadamente.

Finalizada la electroforesis, apagar la fuente de poder, se destapa la cmara y se retira

el soporte para gel de la cmara, sosteniendo con los dedos los bordes para evitar queel gel se caiga. Examine el gel bajo la lmpara de luz ultravioleta para determinar laposicin de las bandas en el gel.

Referencias:

BioRad. Manual de instrucciones de la cmara mini sub cell para electroforesis engeles de agarosa. Rev A


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Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular.Ediciones Pri.

Resultados:

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Conclusiones:


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Practica 13: Reaccin en Cadena de la Polimerasa (demostrativo)

Objetivo:

Que el estudiante comprenda el fundamento y aplique los conceptos tericos en loscuales se basa la reaccin en cadena de la polimerasa.

Introduccin:

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls) fue descrita porprimera vez en 1985 por Kary B. Mullis. Esta invencin lo hizo acreedor en 1993 delPremio Nobel en Qumica, debido al gran impacto que ha tenido esta tcnica en el reade la bioqumica. Su objetivo y funcin es la de obtener mediante amplificacin invitro cantidades masivas de ADN incluso a partir de muestras de ADN muy pequeas.Para realizar el PCR ms sencillo, se requiere conocer las secuencias que rodean laregin a amplificar, luego se producen oligonucletidos complementarios a estassecuencias mediante sntesis qumica automatizada y estos son utilizados como

cebadores (primers) en una reaccin de polimerizacin cclica catalizada por la ADNpolimerasa.

Material:

Gradilla para tubos de 0.5ml y un tubo de 0.5ml

Muestra que contenga ADN

Micropipetas de 10 "l y 100 "l con sus respectivas puntas

Mezcla maestra que contenga: amortiguador de reaccin en cadena de la polimerasa,

mezcla de nucletidos (dNTPs), Taq polimerasa y cebadores.

Agua libre de ADNasas

Termociclador

Procedimiento:


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En un tubo de 0.5 ml, agregue las siguientes cantidades en el orden indicado (volumenfinal de reaccin: 50 "l):

1. Agua libre de ADNasas: 18.9 "l

2. Muestra: 5 "l (sobrenadante del lisado de colonias de Escherichia coli, muestras deADN obtenido en prcticas anteriores.).

3. Mezcla maestra (Fermentas buffer + primers): 27"l

Con la ayuda de su instructor, programe el termociclador segn las condicionesrequeridas.

Cuando la reaccin haya finalizado, analice el producto obtenido medianteelectroforesis en un gel de agarosa al 2%.

Referencias:

Mathews, C.K, Van Holde, K.E y Ahern, K.G. Bioqumica. Pearson Educacin. Terceraedicin, Espaa, 2003.


Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 14. Secuenciador ADN (documental).

Objetivo:

Describir el uso del secuenciador para fines prcticos de la biotecnologa en lamedicina.

Introduccin:

La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuyafinalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en unoligonucletido de ADN. La secuencia de ADN constituye la informacin genticaheredable del ncleo celular, los plsmidos, la mitocondria y cloroplastos (En plantas)que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. As pues,

determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de losprocesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como lainvestigacin forense.

Material:

Acceso a internet

Acceso a bases de datos

Acceso a Journals

Procedimiento:

Describir y desarrollar la utilizacin del secuenciador para anlisis.

Describir y analizar la utilizacin del mismo en la actualidad.


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Referencias:

Tagu D., Moussard C. 2006. Fundamentos de las tcnicas de biologa molecular.

Ediciones Pri.Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.

Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 15. Pruebas diagnostico, ELISAS

Objetivo:

Que el estudiante se familiarice con una tcnica bsica en los estudios de inmunologay que con ella se ha dado pauta a los avances biotecnolgicos en la medicina comoensayo de prueba.

Introduccin:

Los ensayos inmunoenzimaticos, por su especificidad, sensibilidad y sencillez demanipulacin, son una tcnica muy habitual en los laboratorios de investigacin y deanlisis clnicos. En este ensayo, el anticuerpo que reconoce al antgeno esta unido auna enzima con capacidad para catalizar una reaccin que da un producto coloreado.

La tcnica ELISA (enzyme linked immunodsorbent assay) en el ensayo se utiliza,generalmente una membrana de nitrocelulosa sobre la que se fija el antgeno.Posteriormente se anade sobre la membrana el anticuerpo que reconoceespecficamente a ese antgeno. Este anticuerpo tiene unida una enzima que al anadirsu sustrato generara un producto coloreado. Este procedimiento se denomina mtododirecto de deteccin.

Material:

Cajas de elisa. Soporte solido

Anticuerpo anti-albumina bovina

Ovoalbumina

Tampn fosfato salino

Sustrato cromgeno (4-cloro-1-naftol)


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Cubeta de lavado

Micropipetas

Puntillas

Frasco lavador

Control positivo de albumina bovina

Control negativo de albumina ovina

Muestras m1, m2. M3

Procedimiento:

Tomar la caja de ELISA, aplicaar sobre cada pocillo una muestra de 2 microlitros de

muestra y de control positivo y negativo. Uno por cada divisin. Dejar secar de 5 a 10min.

Durante ese tiempo se prepara la solucin de bloqueo. Para ello anadir 2.5 gr deovoalbmina en 100ml de tampn salino. Aguitar la mezcla hasta conseguir unadilucin homognea 5%

Una vez pasado el tiempo de la solucin de los pocillos, introducir la solucin debloqueo y se deja durante 15 min.

Retirar la solucin de bloqueo y lavar la caja elisa con agua destilada.

Anador sobre cada punto 20 microlitos de anticuerpo anti-albumina bovina conjugandocon peroxidasa, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.

Lavar con agua destilada.

Anadir sobre cada pocillo 10 microlitros del sustrato cromgeno y dejar desarrollar elcolor.

Referencias:


Griffith. 2002. Genetica. McGraw-Hill.


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Resultados:

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Conclusiones:

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Practica 16.Bioinformatica y Biotecnologa.

Objetivo:

Introducir las bases de datos accesibles a travs de Internet de importancia en el reabiolgica. Comprender la utilidad de las mismas como herramientas de acceso ainformacin y programas de cmputo actualizados.

Introduccin:

En las ltimas dcadas, cientficos alrededor del mundo se han dedicado a obtener lassecuencias tanto protenas como de cidos nucleicos. Aunque en sus inicios estosesfuerzos fueron aislados, poco a poco la cantidad de datos generada se hizo excesivapara ser manejada por laboratorios aislados. Adems, con el advenimiento de nuevas

tecnologas de secuenciacin, se generaron proyectos conjuntos entre laboratorioscuyo objetivo nico era la secuenciacin de un genoma en particular. Se hizoentonces necesaria la organizacin de bancos de datos donde las secuenciasgeneradas pudieran ser depositadas. Desde el inicio, la comunidad cientfica estuvo deacuerdo en que estos bancos de datos deberan tener acceso libre a nivel mundial.Mucho antes de que el genoma humano se completara en el ao 2003,(http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml), existan yadecenas de este tipo de bancos de datos. Actualmente, existen bancos de datosdefinidos, sumamente extensos de los cuales se derivan secciones donde se puede

tener acceso a informacin ms especfica.Materiales:

Acceso a internet

Acceso a las bases de datos geneticos


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Procedimiento:

Se visitarn diferentes sitios en Internet y su instructor le indicar las principalescaractersticas de los mismos. Dependiendo del tiempo y el acceso a Internet, serevisarn los siguientes sitios:

Direccin de la pgina web Descripcin

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed

Base de datos general, no solode secuencias demacromolculas sino tambinacceso a libros y revistas en elrea de ciencias de la salud.

Adems, acceso a programasde cmputo para anlisis desecuencias de protenas, geneso genomas.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ Programa de cmputo queencuentra secuencias similaresen protenas y cidos nucleicos

http://www.genome.jp/kegg/ Base de datos de Japnhttp://www.ebi.ac.uk/embl/ Base de datos Europeohttp://www.webact.org/WebACT/home Banco de datos de comparacin

de genomas de procariotas, quepermite la visualizacin online de hasta cinco genomas deforma simultnea, utilizando elherramienta de comparacin

Artemis, desarrollada por elInstituto Sanger.

http://www.sanger.ac.uk/Software/ACT/ Herramienta de comparacin deADN Artemis

Referencias:

Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in


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fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 RomeroC.S. 1968. Hongos fitopatogenos. Universidad Autnoma de Chapingo. 345 pp.

Conclusiones:

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Practica 17.Fundamentos de la Biorremediacion (documental)

Objetivo:

Que el estudiante comprenda las bases teoricas y practicas de la Biorremediacion.

Que el estudiante explore las posibilidades de la biorremediacion, que se familiarizecon los aspectos quimicos y bioquimicos y que escriba y ejecute en manera de lasposibilidades una propuesta basica de biorremedicaion de suelo y agua.

Introduccin:

La biorremediacin es el uso de seres vivos para restaurar ambientes contaminados.Es un concepto que no se debe de confundir con depuracin. La depuracin es la

eliminacin, ya sea por mtodos fsico/qumicos o biolgicos, de un contaminante antesde que ste alcance el medio ambiente. Cuando la contaminacin ya se ha producido,se precisa restaurar el ecosistema contaminado, para lo que se pueden utilizar diversasestrategias. Una de ellas es la biorremediacin. Se pueden emplear diversosorganismos en los procesos de biorremediacin. Los ms usados son losmicroorganismos (tanto bacterias, como algas y hongos) y las plantas (en procesosllamados fitorremediacin), pero tambin se pueden utilizar otros seres vivos talescomo los nemtodos (vermiremediacin). Entre los microorganismos destacanespecialmente las bacterias, los seres vivos con mayor capacidad metablica del

planeta. Las bacterias pueden degradar prcticamente cualquier sustancia orgnica. Sila sustancia se degrada completamente se habla de mineralizacin; este es el procesoideal, pero no siempre ocurre. Algunas sustancias no son degradadas sinotransformadas en otras (biotransformacin). La biotransformacin puede ser peligrosa,ya que la nueva sustancia formada puede ser tan nociva o ms que la de partida.Finalmente hay sustancias que no son degradadas y se las denomina recalcitrantes.stas se acumulan durante mucho en el medio ambiente, especialmente si adems son


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resistentes a procesos fsico/qumicos como la radiacin ultravioleta o la oxidacin. Lasbacterias adems pueden eliminar los contaminantes en ambientes donde hay oxgeno(llamados aerbicos), pero tambin en ambientes sin oxgeno (llamados anaerbicos),ya que pueden respirar otras sustancias diferentes al oxgeno (aceptores deelectrones), como por ejemplo el nitrato, el sulfato, el hierro (III), el manganeso, elselenio y un largo etctera.

Materiales:

Arituclos cientificos acerca dela Biorremediacion.

Acceso a las bases de datos.

Acceso a internet.

Trabajo en equipo.

Procedimiento:

La practica se llevara a cabo en equipo de 3 personas, las cuales se organizaran parala busqueda de informacion y genracion de un miniproyecto.

Se utilizara el uso de las bases de datos donde los estudiantes elegiran 4 articulosdeacuerdo al tema (sin repetir). Se discutiran los articulos en clase y posteriormenterealizaran el proyecto escrito y una presentacion.

Referencias:

Breedveld, G.D and Sparrevik, M. 2001. Nutrient!limited biodegradation of PAH invarious soil strata at a creosote contaminated site. Biodegradation 11: 391 !399

Garca H D, Sosa A, CR y Snchez!Yez, 2007. Biorremediacin de agua domesticacontaminada con aceite residual automotriz. Revista Ingeniera Hidrulica de Mxico.17:208!219

Snchez!Yaez, JM et al., 2008. Biorremediacin (Antologa). Secretara de DifusinCultural y Extensin Universitaria. Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo,Centro de Investigacin y Desarrollo del Estado de Michoacan, Bionutra, SA de CV.Morelia, Mich, Mxico. ISBN:978!970!95424!2!4.

Resultados:

Ensayos de los articulos.

Proyecto escrito.

Presentacion del proyecto.


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Conclusiones:

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Practica 18. Fitorremediacion (documental).

Objetivo:

Que el estudiante comprenda las bases teoricas y practicas de la Fitorremediacion.Que el estudiante explore las posibilidades de la fitorremediacion, que se familiarizecon los aspectos quimicos y bioquimicos y que escriba y ejecute una propuesta basicaa medida de sus posibilidades.

Introduccin:

La fitorremediacin podra ser definida como el conjunto de mtodos para degradar,asimilar, metabolizar o detoxificar metales pesados, compuestos orgnicos,

radioactivos y petroderivados por medio de la utilizacin de plantas que tengan lacapacidad fisiolgica y bioqumica para absorber, retener, degradar o transformardichas sustancias a formas menos txicas. Asimismo, podra definirsela como lacapacidad de ciertas plantas (terrestres, acuticas, leosas, etc.) y los cultivos in vitroderivados de ellas con el fin de remover, contener o transformar productoscontaminantes del entorno. Las bases conceptuales de la fitorremediacin provienende la identificacin de plantas que hiperacumulan metales. Existen vegetales quetienen esta capacidad intrnseca pero tambin pueden obtenerse plantas con estascapacidades por tcnicas propias de la Ingeniera Gentica. Promisoriamente, lasplantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar

suelos y aguas contaminadas, adems, algunos procesos degradativos o

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