BIOTECHNOL ÓGIA D MsC gyakorlat
description
Transcript of BIOTECHNOL ÓGIA D MsC gyakorlat
BIOTECHNOLÓGIA D MsC gyakorlat
Tervezési feladat
Ar1oriV
Ar1 oriV
vad típus mutáns poláris hatás ?
Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül
oriV: szűk gazdaspecificitás
oriT
oriT
Ar: antibiotikum rezisztencia
A FELADAT ÁLTALÁNOS MEGFOGALMAZÁSA
• A LEOLVASÁSI KERET MEGSÉRTÉSE NÉLKÜL KI KELL ÜTNI EGY GÉNT EGY BAKTÉRIUMBAN
• ÉS HELYETTE UGYANEBBEN A BAKTÉRIUMBAN KELL TERMELTETNI A KIÜTÖTT GÉN TERMÉKÉT FÚZIÓS FEHÉRJE FORMÁJÁBAN
MEGOLDÁSI SÉMA
• 1. A megadott célgént tartalmazó genomi lókusz letöltése, a célgén és a környező gének pozíciójának kijelölése
• Eszköz: internet, adatbankok• pl. NCBI, Genbank• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/gquery
complement(1934864..1936042)
Csak a 1 933 000 – 1 938 000 régió kell
Ekkor a gén 3 043 bp-nál kezdődik és 1 485 bp-nál ér végetComplement!
Ar1oriV
Ar1 oriV
vad típus mutáns poláris hatás ?
Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül
oriV: szűk gazdaspecificitás
oriT
oriT
Ar: antibiotikum rezisztencia
500-1000 bp 500-1000 bp
DE! A két szakasznak nagyjából egyforma hosszúnak kell lennie,Hogy azonos legyen a rekombinációs valószínűség
A VEKTOR KIVÁLASZTÁSA
Szempontok:
1.Az adott feladathoz szabad-e, kell-e replikálódnia a vektornak a célsejtben
2.Olyan antibiotikum rezisztenciát hordozzon, mely antibiotikumra a sejt érzékeny
3.Milyen módon lehet bejuttatni a célsejtbe DNS-t
NÉHÁNY HASZNÁLATOS ANTIBIOTIKUM
antibiotikum működési mód a rezisztencia módja koncentráció
(µg/ml)
ampicillin bakteriocid, sejt fal szintézis inhibitor
a laktamáz elhidrolizálja az ampicillin laktám gyűrűjét
50 -100
klóramfenikol bakteriosztikus, fehérje szintézis inhibitor, kölcsönhat az 50S
riboszoma alegységgel
klóramfenikol acetiltranszferáz (cat) acetilálja a klóramfenikolt
20
kanamicin bakteriocid, fehérje szintézis inhibitor
aminoglikozid foszfotranszferáz illetve nukleotidtranszferáz
foszforilálja vangy adenilálja a kanamicint
30 - 500
tetraciklin bakteriosztatikus, proteinszintézis inhibitor, gátolja az aminoacil-tRNS kötődését a riboszómához
a sejt permeabilitásának csökkentésével a tetraciklin nem tud
bejutni a sejtbe
15
PÉLDÁK PLAZMID REPLIKONOKRA PLAZMID INKOMPATIBILTÁSI CSOPORT KÓPIASZÁM GAZDASPECIFICITÁS
pBR322 ColE1 20 E. coli és még néhány
pUC19 ColE1 300 E. coli és még néhány
F plazmid FI 1-2 E. coli és még néhány
pRK356 (R1, R6)
FII 2 E. coli és még néhány
pRK2501 (RK2)
P 1-4 Gram-negatív
baktériumokban széles
RSF1010 Q 10 Gram-negatív
baktériumokban széles
pRK353 (R6K)
X 13-40 Gram-negatív
baktériumokban széles
P1 Y 1-2 Gram-negatív
baktériumokban széles
PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI
TT
-35 -10
SZF
-35 -10 SD kódoló szekvencia
Pr
TSZE
TTGACAN17TATAAT
5’ UAAGGAGGN(3-11)
START kodonAUGGUGUUG
STOP kodonUAAUUGAUAG
AR ORI
GS
Pr: promóterTT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia,
AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origoGS: gazdasejt
Fúziós partner