bioExperts

n3

Bulletin dinformation i

nternational pour le

s partenaires phar

maceutiques de

bioMrieux.

Mai 2006

Bienvenue pour ce troisime numro debioPharma, le bulletin d'information inter-national pour les professionnels de l'assurance qualit dans les industries pharmaceutiques, biotechnologiques et cosmtiques. Avec ce bulletin, noussouhaitons vous offrir un forum qui vouspermettra dtudier les questions lies l'assurance qualit dans un environnementde plus en plus complexe.

Dans ce numro, nous traitons des sujets lis la production pharmaceutique et au niveaulev dexpertise et de qualit que nous devonstous avoir pour protger la sant publique.

Comme vous, nous travaillons constamment lamlioration de la qualit de nos produits etl'innovation devient capitale dans le domainede la microbiologie. Dans ce numro, nous vousprsenterons deux innovations majeures : l'unersulte d'un partenariat avec la socit Copanspa, pour l'amlioration du contrle denviron-nement de production avec un nouveaudispositif d'couvillonnage rvolutionnaire; l'autreconcerne la biologie molculaire, nous prsen-tons nos nouvelles solutions automatises pourl'extraction d'ADN et ARN partir d'chantillons,permettant deffectuer ensuite des tests de biologie molculaire sur un micro-organisme.

Lorsque vous lirez ces pages, pensez aux sujets quevous souhaiteriez voir dvelopps dans les futursnumros de bioPharma et faites-nous en part. chaque dition, du Japon aux tats-Unis en passantpar l'Europe, des lecteurs comme vous partagentleurs expriences des technologies innovantes etexpliquent comment les solutions quils ont choisiespour le laboratoire contribuent amliorer leurapproche PAT.Vos ractions et commentaires permettront toujoursdamliorer bioPharma et en feront une ressourceutile pour vous-mme et vospartenaires industriels.

ditorial enjeux

bi Pharmabi Pharma

Alexandre MrieuxCorporate Vice-PrsidentMicrobiologie industrielle

INTERVIEW

NOM: GEERT VERDONKFONCTION: RESPONSABLE DE SECTION -

LABORATOIRE DE CONTRLEMICROBIOLOGIQUE

SOCIT : ORGANONPAYS : PAYS-BAS

bioPharma : Pouvez-vous vous prsenter et prsenter votre socit nos lecteurs ?Geert Verdonk: Je travaille chez Organon, labora-toire pharmaceutique nerlandais prsent dans lemonde entier. Je suis l'un des respon-sables de section du laboratoire decontrle microbiologique et je suis responsable de la slection des nouvellesmthodes microbiologiques et de leurvalidation sur nos process.bioPharma: pourquoi vous intressez-vous aux mthodes rapides?G. V.: Nous avons besoin de mthodesrapides pour le contrle en cours defabrication. Le dpannage des process de productionbiopharmaceutiques complexes est un point capital;si l'on souhaite avoir des informations et des actionscorrectives pendant le process, des rsultats microbio-logiques rapides sont indispensables, d'o notre intrt pour des mthodes rapides.bioPharma: Comment votre socit s'est-elle intresse aux mthodes rapides?G. V.: Ces dernires annes, les rglementations ontassoupli leur position vis--vis des mthodes rapideset elles sont de plus en plus prsentes dans les discussions, dans le monde entier (par exemplecongrs, articles). Je pense que la runion de l'EDQM Copenhague, en 2003, a t rellement le facteurdclenchant pour notre direction. Nous avons ralisqu'il y avait une opportunit pour nous et nous avonscommenc rflchir la manire dont ces nouvel-les mthodes pouvaient nous tre bnfiques.bioPharma: Donc, une fois que vous avez identifiun intrt en faveur des mthodes rapides,

comment avez-vous commenc? Avez-vous desrecommandations pour nos lecteurs?G. V.: Selon moi, le plus important est de crer unequipe au sein de la socit. Vous devez impliquerle personnel de la production, de l'AQ, des achats, de l'enregistrement et, bien sr, le laboratoire de microbiologie. Une fois l'quipe constitue, il est possible d'effectuer une analyse dtaille de tous lesprocessus pour identifier la(les) partie(s) critique(s)du processus o des rsultats microbiologiques rapides pourraient prsenter un intrt maximal. Cetteanalyse doit tre ralise dans l'atelier de production,

avec les experts de la production, car cesont eux qui connaissent le mieux lescontraintes du process.bioPharma: Quel est l'lment demotivation cl, pour un laboratoirepharmaceutique, dans la mise enuvre d'une mthode rapide?G. V. : pour nous, la matrise du processus est rellement le facteurdclenchant. Organon fabrique quatre

types de produits diffrents : des comprims, desproduits spciaux comme des implants contra-ceptifs, des produits injectables et des produitsbiotechnologiques (qui, dans la majorit des cas, sontdes produits injectables). La matrise des produitsbiotechnologiques tait notre objectif principal. Leprocess en lui-mme est trs complexe : lorsquevous savez que, dans l'industrie mondiale des biotechnologies, les taux de contamination peuventatteindre 30 % des lots, vous vous rendez compteque l'amlioration du processus est un aspect trsimportant. Bien entendu, la motivation suivante estla baisse des cots mais c'est une consquence vidente de ce que j'ai mentionn prcdemment.Imaginez les conomies ralisables si vous tescapable d'empcher la contamination d'un bio-racteur de 10000 litres rempli de milieux de cultured'une valeur de l'ordre de 50 par litre !bioPharma: il existe sur le march plusieurs solutions pour la microbiologie rapide.

Comment en choisissez-vous une en particulier?G. V.: le paramtre numro un est l'chantillon. Vousdevez dfinir prcisment la nature de votre chan-tillon: ses proprits, son mode de prlvement etla contamination prvue. Une fois l'chantillon dfini,vous pouvez rechercher la meilleure technologie. Par exemple, si vous avez un produit cellulaire ou unproduit visqueux, les technologies faisant appel lafiltration ne sont pas particulirement bien adaptes, l'inverse, si vous avez un chantillon trs riche enATP, l'ATPmtrie n'est pas pertinente. Une fois la technologie identifie, vous pouvez slectionner lesdiffrents instruments et enfin, le dernier point consiste choisir le bon fournisseur.bioPharma: En votre qualit d'expert des mthodes rapides, vous avez essay et travaillavec plusieurs mthodes diffrentes. Commentvoyez-vous l'avenir de la microbiologie rapide dans l'industrie pharmaceutique?G. V. : Au cours des cinq prochaines annes, je pense qu'il y aura une solution de remplacementrapide pour chaque mthode classique: soit commesolution de secours soit comme solution de rempla-cement. L'norme difficult laquelle nous sommesconfronts consiste convaincre les microbiologistesde rflchir des solutions en dehors du cadrehabituel. Lorsque vous utilisez une nouvelle techno-logie, vous devez avoir de nouveaux critres. Tout estrelatif et dpend de la mthode choisie. Cela est galement vrai pour certaines mthodes actuelles,par exemple, dans un test de strilit, aprs 2 semainesd'incubation de TSB, sil n'y a aucune croissance, leproduit est ensuite considr comme strile mais, si la mthode consistait incuber TSB pendant 4 semaines au lieu de 2, une croissance aurait peut-tre t observe et le lot aurait t rejet. Avec lesmthodes rapides, il faut commencer penser entermes de seuil ou d'units relatives et ne pas essayerde tout ramener aux classiques UFC. Je suis persuadque nous allons atteindre cet objectif, nous devonssimplement collecter davantage de donnes!

Une nouvelle vision pour la microbiologie pharmaceutique*

Geert Verdonk

* Traduit de langlais sous la responsabilit de bioMrieux.

innovation

Copan et bioMrieux signent un accord exclusifde distribution mondiale

avis de lexpert

INTERVIEW*

PERSONNE INTERVIEWE: MICHELA FERRARIFONCTION: BUSINESS DEVELOPMENT MANAGERSOCIT: COPAN S.P.A.PAYS: ITALIE

bioPharma: Madame Ferrari, pouvez-vous nousprsenter l'historique de votre socit, COPAN?Michela Ferrari : Copan a t cr en 1979,comme fabricant de produits de laboratoirejetables en plastique, puis s'est lanc peu aprsdans la R&D et la fabrication de dispositifs derecueil et de transport d'chantillons microbiolo-giques. Notre socit ralise toutes les tapes,de la R&D aux applications techniques et la production, notre objectif consiste amliorer laqualit de la phase pr-laboratoire en utilisantune approche quantitative de la collecte d'chan-tillons. Copan est le leader mondial de laproduction d'couvillons de collecte et de conservation: nous possdons une usine ultra-moderne de 9000 mtres carrs Brescia qui

produit chaque anne environ150 millions d'couvillonsde transport, 400 millionsde pipettes de transfert et250 millions de lancesd'inoculation en plastique.

bioPharma : Vous avezrcemment dvelopp unetechnologie rvolutionnairepour la production d'couvillons.Pouvez-vous nous expliquer leurmode de fonctionnement ?M.F.: Les couvillons classiques,fabriqus en coton, en Rayon ou en Dacron,sont fabriqus avec la mme technologie queles cotons-tiges classiques pour les oreilles : plusieurs kilomtres de microfibres sont enroulsautour de l'extrmit de la tige en plastique pourcrer la tte de l'couvillon. Notre innovation aconsist appliquer une technologie appeleflocage pour produire des couvillons de Nylon

floqu (brevet internationalCopan). Ce procd rvolution-naire implique la projection demicrofibres de Nylon sur uneextrmit en plastique colle,ce qui cre un revtementmince comme du velours surla tte de l'couvillon. C'est ce

revtement qui confre desperformances trs suprieures

celles d'couvillons classiques.

bioPharma: Comment en tes-vous venu dvelopper un

produit innovant de ce type?M. F.: Tous les investissements de dveloppe-ment et de production ont t raliss par Copan aprs des annes de recherche destines amliorer les performances des couvillonsde collecte, en particulier en termes de capacitde production. Nous avons galement form unpartenariat avec lindustrie pharmaceutique pour

dfinir ses exigences particulires, afin d'tre srs que nous allions dans la bonne direction etque le produit final appel QUANTISWABapportait un avantage maximal au client.

bioPharma: Quel est lintrt de ce produit pourl'industrie pharmaceutique?M. F. : La technologie de flocage avec du Nylon permet, pour la premire fois, d'avoir un contrle quantitatif de l'environnement, commeavec des botes de contact. Les indicationsqualitatives de contamination sont insuffisantesdans les environnements pharmaceutiques oil existe des niveaux d'alerte et d'action. Il s'agitd'une vritable perce et diffrentes validationset protocoles montrent que nos couvillons deNylon floqu sont plus performants et restituent 90 % de l'chantillon collect, alorsque les couvillons classiques en Dacron ou en Rayon torsad n'en restituent qu'entre15 et 20 %.

Dr Gilberto Dalmaso, GlaxoSmithKline S.p.A.,Parme, Italie.

> RSUMLes couvillons sont utiliss grande chelle dansles programmes de contrle microbiologique del'environnement. L'objectif de cette tude tait la validation des performances d'un nouveautype de QUANTISWAB en Nylon floqu parrapport des couvillons classiques en Rayon.L'tude montre que les couvillons classiquesont un faible taux de rcupration de 20 % descontaminants des surfaces. En raison de sa capillarit hydraulique exceptionnelle, le QUANTISWAB en Nylon floqu prsente uneamlioration du pourcentage de rcupration des micro-organismes, comprise entre 20 % et60 %, par rapport aux couvillons classiques en Rayon, et possde une capacit restituerplus de 90 % des micro-organismes recueillis.Ces observations ont t confirmes par unevaluation de l'chantillonnage des surfaces del'environnement des zones de production deproduits pharmaceutiques.

> MATRIEL ET MTHODESInoculum: 100 l de chaque suspension ont tdirectement transfrs sur une bote de glosetrypcase soja, incubs 32 2 C pendant 5 jours et dnombrs comme rfrence.100 l de suspension bactrienne frachecontenant entre 50 et 150 UFC (inoculum)ont t pulvriss sur une surface en acierinoxydable. Un panel de micro-organismes at test, dont des souches de la pharmacope:S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, B. subtilis(spore), C. albicans, S. abony, A. niger(spore), M. luteus (isol de l'environnement),B. parabrevis (isol de l'environnement).Temps d'analyse: une limite de temps de 3 minutes a t observe entre la pulvrisa-

tion, l'couvillonnage et l'talement sur botes,afin de minimiser la mort des micro-organismes.Croissance des micro-organismes: une fois l'inoculum pulvris et chantillonn avec leQUANTISWAB ou l'couvillon en Rayon, lescouvillons ont t tals sur une glose trypcasesoja de 90 mm et incubs 32 2 C pendant5 jours. Tous les tests ont t raliss en doubleet sur trois lots diffrents d'couvillons.Trois types d'expriences ont t raliss pourvalider la capacit de rcupration et de restitu-tion des couvillons. Par la rcupration, nousdfinissons la capacit de l'couvillon collecteret rcuprer des micro-organismes viables dunesurface. La capacit de restitution est la capacitde l'couvillon restituer un chantillon collectdans une solution ou un milieu.

> RSULTATS ET DISCUSSION1- Capacit de rcupration:Cette exprience montre que la rcupration desmicro-organismes obtenus avec les couvillonsfloqus est de l'ordre de 60 %, alors que la rcupration avec les couvillons en Rayon estde l'ordre de 20 % (cf. figure 1).

2- Capacit maximale de rcupration:La rtention de l'chantillon par l'couvillon a ga-lement t tudie. Aprs talement de l'cou-villon sur une bote, l'extrmit de l'couvillon a t insre dans un tube contenant 10 ml desrum physiologique strile et agite au vortexpendant 30 secondes, afin de rcuprer tous lesmicro-organismes qui auraient pu tre retenusdans l'couvillon aprs talement sur la bote. Lasolution extraite a t filtre sur un filtre de0,2 m, la membrane a t place sur uneglose trypcase soja et incube pendant 5 jours 30-35 C. la fin de la priode d'incubation, les colonies ont t dnombres afin d'valuer larcupration supplmentaire.

La rcupration supplmentaire observe avecQUANTISWAB aprs talement sur une bote tait,en moyenne, infrieure 4 %, ce qui montre quela plupart des bactries avaient dj t libres parl'couvillon sur la boite. En revanche, la rcuprationsupplmentaire avec les couvillons standards enRayon aprs talement sur une bote n'tait quede l'ordre de 0,3 %, ce qui indique que les micro-organismes restants emprisonns dans la matricede fibres de Rayon pouvaient ne pas tre restitusaprs agitation des couvillons au vortex.

3- Capacit de restitution:Une hypothse serait que les couvillons enRayon ne soient pas efficaces pour capturer desorganismes sur une surface ou que les couvil-lons en Rayon ne soient pas en mesure de restituer les organismes qui ont t capturs parl'couvillon. Une troisime exprience a donc tralise afin de vrifier chacune de ces hypothses.100 l de chaque inoculum de dpart ont tinoculs directement sur l'couvillon puis talsdirectement sur des botes. La capacit de resti-tution est en moyenne suprieure 90 % pourle QUANTISWAB, contre 20 % pour les couvil-lons en Rayon, ce qui laisse penser que les couvillons classiques peuvent absorber desmicro-organismes mais ont des difficults restituer les micro-organismes viables (cf. figure 2).> CONCLUSIONCette tude dmontre que:- le nouvel couvillon QUANTISWAB enNylon floqu est capable de rcuprer 60 %des micro-organismes de surface, contre 20 %pour les couvillons classiques en Rayon;

- les rsultats des tests de restitution mettent envidence une trs faible rtention des chantil-lons pour lcouvillon QUANTISWAB, et doncune capacit de rcupration des couvillons trs

reproductible,- QUANTISWAB fait apparatre une restitutiondes chantillons de plus de 90 % d'un inoculum connu par le test d'inoculation directe,contre 20 % pour les couvillons en Rayon.

Le contrle microbiologique denvironnementde surfaces avec le nouvel couvillon floqu,est une mthode valide et qui est fortementrecommande. Elle amliore la rcuprationdes micro-organismes, en particulier dans les zones faible niveau de contamination(zones de production classes).

Validation du nouveau QUANTISWAB en Nylon floqu irradi pour la rcuprationquantitative des micro-organismes dans les environnements critiques de salles propres*

couvillon de Nylon floqu

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QUANTISWAB COUVILLONS TRADITIONNELS

Figure 1 : Test de capacit de rcupration avec chantillonnage classique.

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S. aureus C. albican A. niger E. coli P. aeruginosa B. subtili S. abony M. luteus B. parabrevis

QUANTISWAB COUVILLONS TRADITIONNELS

89,83% 89,52%92,41% 93,98% 92,39% 93,02% 90,82% 88,98% 94,44%

20,72% 23,33% 22,39% 19,80% 18,84% 21,43% 20,34% 21,01% 22,58%

Figure 2: Test de capacit de restitution des couvillons.

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Cet accord permet bioMrieux de commercia-liser un dispositif d'chantillonnage innovant avec la technologie dveloppe par Copan. Le dispositif d'chantillonnage permet deffectuer undnombrement quantitatif prcis l'aide d'un cou-

villon dans le contrle denvironnement. L'cou-villon peut tre utilis avec les milieux prts l'emploi de bioMrieux et est destin une utili-sation par l'industrie pharmaceutique, dans lessalles propres et environnements contrls de la

fabrication aseptique. Par cet accord, bioMrieuxpossde dsormais une gamme importante deproduits pour le contrle de l'environnement, dont l'chantillonneur d'air airIDEAL 3PTM et unegamme complte de milieux prts l'emploi.

actualits

Symposium bioMrieux Florence (Italie)Le 23 novembre 2006, un symposium consacr l'innovation technologique dans lescontrles microbiologiques de la production pharmaceutique s'est tenu Florence.Une centaine de personnes reprsentant plus de soixante-dix laboratoires pharmaceutiquesont particip ce symposium. Les sujets, la qualit et les connaissances des prsentateursainsi que la qualit des questions, associs l'ambiance du site, ont contribu la russiteexceptionnelle de cette manifestation. Un des participants du symposium a fait le commen-taire suivant: ce symposium constitue une tape importante dans l'histoire des confrenceset des manifestations pharmaceutiques.L'volution de la pharmacope a fait l'objet de discussions d'un point de vue global. Desreprsentants nationaux et internationaux se sont concentrs sur le dtail de la situationactuelle ainsi quaux perspectives venir.

Le sujet dintgration du process analytique a t au cur de la deuxime partie du symposium. VITEK 2 CompactTM, airIDEAL 3PTM et les solutions Count-TactTM 3PTM et Unidatrixont apport une preuve concrte de la force dune solution globale bioMrieux destine aulaboratoire de microbiologie pharmaceutique moderne.

Dans la partie finale du symposium, les technologies PAT et les solutions de biologie mol-culaire de bioMrieux ont captiv le public et ont donn un aperu des technologies futures.

Symposium EDQM Strasbourg (France)L'European Directorate for the Quality of Medicine (EDQM) a tenu un symposium internatio-nal en octobre 2006 Strasbourg. Ce symposium a port sur les nouveaux chapitres demicrobiologie publis par la pharmacope europenne. Deux thmes essentiels ont t abordspar les intervenants: les textes harmoniss relatifs au contrle des produits pharmaceutiquesnon striles ont t dbattus la premire journe, alors que l'importance des mthodesmicrobiologiques alternatives dans le contrle microbien des produits pharmaceutiques taitprsente lors de la deuxime journe. Parmi les diffrentes prsentations internationales,deux ont port sur BacT/ALERT, mthode alternative de contrle rapide de la strilit des produits biopharmaceutiques. Pendant ce temps, le docteur Jonquires (bioMrieux) aeffectu une prsentation sur l'approche validation pour les fabricants de milieux de culturepour atteindre les critres de performances fixs par les nouveaux chapitres harmoniss(2.6.12 et 2.6.13 de la pharmacope europenne). Plus de 200 personnes venues dumonde entier ont assist ce symposium, pour des discussions extrmement fructueuses.Toutes les prsentations sont disponibles sur le site: http://www.edqm.eu/site/page_601.php

Confrence PharMIG 2006En novembre 2006, des microbiologistes pharma-ceutiques du Royaume Uni et d'Irlande ont particip la confrence annuelle de PharMIG qui s'est tenue l'htel Nottingham Belfry. Cette confrence a runiprs de 100 dlgus et 24 exposants.

Pour la troisime anne conscutive, bioMrieux aorganis une runion de groupes d'utilisateurs de VITEK 2 CompactTM la veille du dbut de la confrence. Un total de quarante utilisateurs actuels et potentiels a t invit une soire de dgustation Colwick Hall, autrefois demeure familiale de Lord Byron.

Bien entendu, la runion des groupes d'utilisateurs s'est galement concentre sur des sujetstrs importants pour un laboratoire de microbiologie qui effectue des tests d'identification.

Jeffrey Anthony de LGC Promochem a prsent les techniques utilises par lATCC pour laconservation et la caractrisation des cultures microbiennes. Jeffrey a, par ailleurs, donn desconseils utiles sur le maintien des cultures dans les laboratoires de microbiologie de routine.

Cindy Somogye (Corporate Product Manager de bioMrieux pour l'identification) a prsentles donnes de performances de la prochaine carte d'identification pour les anarobies quicomprend un ensemble de corynformes dans la liste des espces dtectes.

Chris Wells (directeur des ventes et du marketing de bioMrieux pour le Royaume-Uni) a cltur la srie de prsentations en donnant une vue globale des nouvelles fonctions qui seront mises en uvre dans les futures mises jour du logiciel en2007.

Les participants pendant un expos

Des progrs technologiques rcents, en parti-culier dans le domaine de la biologie molcu-laire, ont permis des avances significativesdans la dtection des microbes. La dtectionmolculaire ncessite l'extraction d'acides nucliques de nombreux types diffrentsd'chantillons. La qualit des acides nucliquesextraits peut avoir des rpercussions impor-tantes sur la qualit des rsultats de test obtenus. Les inhibiteurs de la raction d'amplification prsents dans l'chantillon doivent tre totalement limins avant l'ampli-fication. Par consquent, les performances del'tape d'extraction sont essentielles au succsde la dtection molculaire. Dans le mmetemps, l'extraction nuclique est une tche quicomporte des tapes rptitives et possdeune faible valeur ajoute. Par consquent, l'extraction est la premire tape qui doit treaborde pour contribuer amliorer la produc-tivit du laboratoire de biologie molculaire.

bioMrieux a dvelopp deux solutions destines augmenter les performances etla productivit de l'extraction des acides nucliques et rpondre aux diffrents besoins de solutions automatises. Nucli-SENS easyMAG est un systme entirementautomatis pour l'extraction/la purification desacides nucliques, alors que NucliSENS miniMAG est une solution semi-automatique.

Atteindre les performancesLes solutions bioMrieux reposent sur notretechnologie brevete BOOM. Dveloppedans les annes 1980, la technologie BOOMs'appuie sur la capacit de la silice fixer l'ADNet l'ARN de fortes concentrations de sel.Aprs plusieurs tapes de lavage destines liminer tout dbris, les acides nucliques sontrcuprs par lution dans un tampon dontla concentration en sel est infrieure. Il y a plusieurs annes, bioMrieux a introduit la si-lice magntique. Un aimant permet de sparer le complexe d'acides nucliques desmatrices chaque tape, ce qui facilite l'auto-matisation et rend le procd plus convivial.La technologie BOOM est reconnue commela mthode la plus efficace pour l'extraction

des acides nucliques et fait l'objet de conces-sion de licences par bioMrieux pour une utilisation dans de nombreuses solutions ducommerce. Rcemment, bioMrieux a dve-lopp un nouveau type de silice qui fixe 20 fois plus d'acides nucliques que les versions prcdentes. De plus, les tampons delyse, de lavage et d'lution ont t amliors.

Les rsultats obtenus par diffrentes valua-tions dmontrent les excellentes performancesdu systme. Par exemple, la puret del'ADN/ARN extrait est trs bonne: le rapportOD260/OD 280 est infrieur 1,8 pour l'ADN.La quantit d'ADN rcupre est galementtrs satisfaisante : le rendement total est suprieur 90 % pour de nombreux paramtres. Enfin, l'intgrit des grosses molcules d'ADN est garantie et l'analyse gnomique est ainsi facilite avec easyMAG.

Ces performances ont t values en comparaison avec d'autres solutions du commerce et reconnues dans de nombreuxarticles. Par exemple, Rutjes et al. ont montrque, avec miniMAG les concentrations d'ARNont augment d'au moins 100 500 fois(Rutjes et al, AEM,(71), 7, 2005, pp 3734-3740). Tang etal. ont montr que miniMAG produit la plusgrande quantit d'acides nucliques et la meilleure prcision, sur les trois systmes[tests]. (Tang and al, JCM, (43), 9, 2005, pp4830-4833).

Utilisation facileeasyMAG peut traiter jusqu' 24 chantillonspar srie et, du fait qu'il est entirement automatique, il ne ncessite que 15 minutesd'intervention de la part de l'oprateur. Toutesles 45 minutes, l'oprateur peut lancer unenouvelle srie, ce qui signifie qu'il est possible d'extraire jusqu' 240 chantillonsau cours d'une journe de travail moyenne.

easyMAG peut effectuer une analyse sur unvolume d'chantillon qui peut aller jusqu' 1 ml, ce qui permet une dtection sensible.Cet chantillon peut tre ensuite concentrpour obtenir un luat correspondant approxi-mativement une concentration de 80 fois.

INTERVIEW

PERSONNE INTERVIEWEE: DR A. CARLOTTIFONCTION: PDGSOCIT: IDMYKPAYS: FRANCE

bioPharma : Dans quel cadre utilisez-vousNucliSENS miniMAG?Dr A. Carlotti: Nous utilisons depuis plus dedeux ans le miniMAG dans le cadre de nosactivits de Recherche et Dveloppement. Eneffet, nous souhaitons proposer nos clientsindustriels, des services de dtection de micro-organismes (bactries, champignons, virus)dans les matires premires et les produitsfinis par PCR en temps rel. Une tape cruciale de ces tests est lobtention des acidesnucliques de bonne qualit, dbarrasss desventuels agents inhibiteurs prsents dans lesmatrices analyser, avec une excellente

sensibilit et dont la stabilit est assure, enparticulier dans le cas des cibles ARN.

bioPharma: Quelles sont les utilisations sp-cifiques du miniMAG dans votre entreprise?A. C. : Nous utilisons le miniMAG pour lextraction des ADN et des ARN partir decultures cellulaires et de matrices plus oumoins complexes (produits finis trs purs trs chargs).

bioPharma: Est-il adapt aux problmatiquesde microbiologie pharmaceutique?A. C. : Aprs des tests prliminaires de diffrentes solutions dextraction bases surdes principes trs diffrents, le miniMAG estle seul systme qui sest avr performantpour lever les inhibitions rencontres dans lesmatrices les plus complexes (mme partielle-ment). En outre les performances obtenues

en ce qui concerne la qualit (intgrit) desacides nucliques, le rendement dextractionet leur stabilit taient trs satisfaisants. En ce sens, il nous est apparu particulirementadapt aux problmatiques de microbiologiepharmaceutique.

bioPharma: Quels travaux de validation avez-vous d raliser pour tablir les performances?A. C.: Les tests que nous voulons proposersont des tests qualitatifs (prsence-absence).Nous avons donc entrepris les tudes de vali-dation prconises par les diffrents rfrentiels(Pharmacope, PDA Technical report, ICH,etc) telles que spcificit, reproductibilit,limite de dtection, robustesse et bio-quiva-lence. Les performances du miniMAG,obtenues dans les tests de dtermination deslimites de dtection (LOD: limit of detection)sont particulirement satisfaisantes puisque

des LOD de lordre de 20 quivalents gnome pour les cibles ADN et de 200quivalents gnome pour les cibles ARN,dans le milieu ractionnel, sont courammentobtenues. La trs bonne reproductibilit a galement t note dans ce cadre.

bioPharma: Finalement tes-vous satisfait del'outil?A. C.: Nous sommes trs satisfaits de loutilcar il nous permet datteindre des performancesque les autres solutions ne permettent pas.Nous avons galement not lexcellente stabi-lit des ARN, lie aux agents chaotropiquesutiliss. Enfin, la robustesse de la technique etsa simplicit de mise en uvre, nous donnenttoute satisfaction. Cette solution nous permet-tra de proposer des services performants etfiables nos clients dans un proche futur.

SystmeNucliSENS easyMAG

Extraction des acidesnucliques dans le laboratoirede biologie molculaire

avis de lexpert

innovation

produits et services

bioPharma est une publication internationale debioMrieux Industrie Directeur de la publication : Alexandre Mrieux Rdacteur en chef : Pascal CruveillerOnt contribu ce numro:Anne Barnes, Karen Mullen,

Michele Storrs-Mabilat, Koren Wolman-Tardy,Antonio Caturani, Joseph Jammal, RenaudJonquires, Olivier Martinez, Arnaud Paris, Olivier Pasquier, Chris Wells.Remerciements particuliers : Michela Ferrari (Copanspa), Arnaud Carlotti (IDMYK), Geert Verdonk

(Organon), Dr Gilberto Dalmaso (Glaxo Smithklinespa), Dr Hirotsugu Yasuda (Oxygenix). CatherineFerguson and Scott Jenkins (ATCC)Mise en page et conception :

ISSN : 1951-2848

bioMrieux S.A69280 Marcy lEtoile - FranceTl. 33 (0) 4 78 87 20 00Fax. 33 (0) 4 78 87 20 90www.biomerieux.com

Nhsitez pas nous crire pour nous fairepart de vos commentaires et suggestions ou nous proposer des articles publier:biopharma@eu.biomerieux.com

applications bioMrieux

Leader mondial dans le contrle microbiologique, bioMrieux propose une gamme unique de tests dassurance qualit en microbiologie couvrant le contrledenvironnement, les tests de strilit des produits ou lidentification microbienne. Nous nous sommes engags aider nos partenaires des industries phar-maceutique et cosmtique ainsi que les banques de sang, les banques de tissus et les socits de biotechnologies fournir des produits srs en toute confiance.

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INTERVIEW*PERSONNE INTERVIEWE:HIROTSUGU YASUDAFONCTION: MANAGER, ANALYTICALCHEMISTRY LAB. KYOTO RESEARCH CENTERSOCIT: OXYGENIXPAYS: JAPON

OXIGENIX est un laboratoire pharmaceutique"joint venture" qui dveloppe un produit exclu-sif driv de technologies dveloppes par les universits de Keio et de Waseda. Ce produit est un systme innovant de dlivrance de mdicaments constitu de liposomes fortementbiocompatibles qui peuvent encapsuler des protines thrapeutiques et d'autres mdicaments macromolculaires.Notre prochain produit commercial est un trans-porteur d'oxygne de type cellulaire galementconnu sous le nom de sang artificiel qui sera unmdicament biotechnologique rvolutionnaire pourla transfusion. Il est vident qu'OXYGENIX doit exiger le niveau maximal de contrle qualit car ils'agit d'un mdicament injectable.

Lorsque nous avons dvelopp notre produit, notretablissement n'tait pas quip de salles blanches conformes aux BPF. Ces installations sonten effet coteuses et n'taient pas la ported'une socit biotechnologique comme la ntre,au stade de la R&D. Nous recherchions alors unetechnologie conviviale pour des tests rapides destrilit qui seraient utilisables dans un local demicrobiologie. Nous connaissions dj bioMrieuxpour son savoir-faire dans le domaine de l'identi-fication automatique car nous travaillons avec unappareil VITEK 2 CompactTM. Nous avons choisiBacT/ALERT 3D pour diffrentes raisons:1- Rsultats automatiss fiables,2- Si le rsultat devient positif, l'chantillon peut

tre mis en culture partir du flacon et

identifi par VITEK 2 CompactTM,3- Cette solution tait parfaitement acceptable pour

les manipulations ralises dans un local descurit.

BacT/ALERT nous permet de raliser facilementdes tests de strilit dans un local de scurit bio-logique. Nous sommes en outre parvenus rduirele dlai de ralisation des tests, de 14 jours avecla mthode de la pharmacope japonaise 7 jours.Ce gain de temps important nous permet de dve-lopper le contrle en cours de fabrication, ce quitait impossible auparavant en raison du dlai.Nous pensons que BacT/ALERT 3D correspondrellement au principe PAT de la FDA ; c'est le systme le mieux adapt nos tests en cours defabrication.

Le docteur Hirotsugu Yasuda et les membres de son quipede laboratoire

Catherine Ferguson, biologiste charge du contrle qualit chez ATCC, avec ScottJenkins, rdacteur scientifique d'ATCC.ATCC est le plus important centre mondial deressources biologiques but non lucratif, avecplus de 80 ans d'exprience dans le domainede la croissance et de la conservation des cultures. Les cultures des collections de l'ATCC

reprsentent une large plage de lignes cellu-laires, de micro-organismes et de virus. Lacollection biologique de cellules de l'ATCC estla collection la plus complte dans sondomaine, elle se compose de plus de 3600lignes cellulaires issues de plus de 80 espcesdiffrentes. Elle comprend plus de 950 lignescellulaires cancreuses, plus de 1000 hybri-domes, ainsi que diverses collections spciales.Le systme de conservation ATCC du stock desouches et du stock de distribution (avec desoprations de contrle qualit (CQ) tout aulong du processus) garantitque les matires sont authen-tiques et les plus prochespossible de la culture d'origine,avec des transferts minimaux.Les contrles de strilit bactrienne et fongique fontpartie des tests de CQ rali-ss chez ATCC sur les lignescellulaires, les cellules sou-ches, les milieux de culture,les virus et les protistes, afin de garantir que les clients reoivent des produits de grandequalit. ATCC a valu le systmeBacT/ALERT de bioMrieux comme outil pour les tests de strilit en ralisant une comparaison avec la mthode de test de strilit qu'ATCC utilise en routine. Cettemthode implique l'inoculation de plusieursbouillons et botes de sang et l'incubation desmilieux en conditions arobies et anarobies diffrentes tempratures.La mthode de strilit classique prsente plu-sieurs limites. La plus importante est lasubjectivit dans l'interprtation des rsultatsde test: chaque biologiste qui lit les tubes dter-mine s'il y a eu ou non prolifration bactrienne.

Cela ncessite souvent un examen microsco-pique suivi d'une mise en culture pour identifierle contenu des tubes observ comme des cellules eucaryotes, des rsidus de milieu deculture, une prolifration bactrienne ou autrechose.Une autre limite de la mthode de test de strilit est la dure ncessaire pour la prpa-ration et pour l'obtention du rsultat final. Laprparation implique la collecte et l'tiquetagede milieux (8 tubes de bouillon et 2 botes par chantillon fourni). Par exemple, pour tester 20 chantillons, des centaines de tubeset de botes de culture sont consommes pourles tests. De plus, il faut faire bouillir du thiogly-colate pendant 10 minutes et le refroidir avantinoculation et il faut sceller toutes les botes deculture arobie avec du parafilm pour emp-cher leur dessiccation. Le dlai d'excution decette mthode est long, avec des contrles

quotidiens de la turbidit etde la croissance, les rsul-tats finaux n'tant obtenusqu'aprs 21 jours suivantl'inoculation.Le systme BacT/ALERT

3D offre une mthode detest de strilit plus rapide etplus efficace qui demandemoins de temps et prsenteun risque moindre d'inter-

prtations subjectives des rsultats de test. Pourl'valuation initiale de l'appareil par l'ATCC, diffrents organismes ont t choisis, reprsen-tant diffrentes tempratures de croissance(24 C 37 C), diffrentes dures de crois-sance (24-72 heures) et diffrentes conditionsde croissance (arobie, anarobie et atmos-phre contenant 5 % de CO2 ). Six espces debactries (reprsentant des organismes faculta-tifs, non entriques, anarobies et exigeants) ontt utilises avec une espce de moisissure etune espce de levure. Organismes utiliss :ATCC 25922 (Escherichia coli)ATCC 53416 (Neisseria meningitidis)ATCC 12743 (Bordetella pertussis)ATCC 23745 (Bacteroides fragilis)

ATCC 11325 (Rhizobium rhizogenes)ATCC 17909 (Acinetobacter johnsonii)ATCC MYA-905 (Candida albicans)ATCC 201971 (Aspergillus flavipus).Afin de comparer l'efficacit de la dtection deBacT/ALERT par rapport la mthode classi-que des botes, les organismes ont fait l'objetd'une premire dilution en srie dans un tampon de phosphate (10-15 fois) ( l'excep-tion d'ATCC 23745, qui a t dilu dans unmilieu clostridial renforc). Un ml de chaquedilution a t ajout un flacon arobie (iAST)et un flacon anarobie (iNST) et incub 32 C pendant 14 jours. Un volume de 0,1 mlde chaque dilution a t galement tal sur le milieu de culture adapt et incub latemprature recommande pour l'organisme.La moisissure et la levure n'ont pas t comprises dans cette srie de tests.Trois des six souches bactriennes ont tdtectes une dilution numrique plus leve (c'est--dire 10-5 contre 10-3, par cons-quent une concentration infrieure de cellulesbactriennes) par BacT/ALERT que par l'ob-servation macroscopique des botes ; unesouche tait dans la fourchette d'une dilution et deux souches ont t dtectes surBacT/ALERT des dilutions considrablementinfrieures (dtection 10-1 sur BacT/ALERT

contre 10-4 et 10-7 sur les botes) (concentra-tion suprieure) par rapport la mthodeclassique d'talement sur les botes. Il est noter que les deux souches associes unedtection considrablement infrieure surBacT/ALERT par rapport aux botes sont desorganismes exigeants, Neisseria meningitidiset Bordetella pertussis.Dans une deuxime phase de tests, le proto-cole dcrit ci-dessus a t modifi par leremplacement du tampon phosphate par unchantillon dilu de DMEM contenant ATCC

CCL-2, cellules HeLa. tant donn que leDMEM est un milieu couramment utilis pourles chantillons de biologie cellulaire, il taitimportant de dterminer si le milieu favorise-rait ou freinerait la croissance et/ou la dtectionbactrienne. L'chantillon d'E. coli n'a pas t

retest mais la moisissure et la levure ont t ajoutes au test. Sur les cinq souches bactriennes testes, deux ont t dtectes des dilutions suprieures, dont Neisseriameningitidis. Bordetella pertussis a t dtect une dilution plus leve que lorsqu'il est diludans un tampon phosphate (10-3 dans leDMEM contre 10-1 dans le tampon phosphate)mais encore plusieurs dilutions en dessous dela mthode des botes. La moisissure a tdtecte une dilution de 10-6 dans le flaconarobie et la levure a t dtecte une dilution de 10-10 dans les flacons arobies etanarobies. Il est noter que tous les rsultats positifs pour tous les organismes ontt dtects en moins de 7 jours.Une fois les tests de dilution termins, nousavons ralis une comparaison plus tenduede BacT/ALERT par rapport la mthode detest classique avec 49 organismes. 47 ontdonn des rsultats identiques la fois avecBacT/ALERT et avec la mthode classique,indiquant une bonne sensibilit du systme.Les deux autres ont produit des faux positifs.Nous avons recommenc les tests sur cesorganismes, les nouveaux rsultats ont tngatifs.Sur la base des donnes obtenues, lATCC aconclu que BacT/ALERT offre aux utilisateursune dure de prparation rduite, des rsultats plus rapides et, ce qui est plus impor-tant, supprime le facteur humain de subjectivit.LATCC inclut maintenant BacT/ALERT dansla production et le contrle qualit des cultu-res cellulaires, des chantillons de cellulessouches et des chantillons de milieu et nousestimons que cet appareil nous aide mieuxservir nos clients.

BacT/ALERT 3D, des utilisateurs partagent leur exprience

Principe de lecture

valuation, par l'ATCC, du systme BacT/ALERT 3D pour les tests de strilit*

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