Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov
Biologické membrány - Univerzita Pavla Jozefa Šafárika ... · Model tekutej mozaiky V dôsledku...
Transcript of Biologické membrány - Univerzita Pavla Jozefa Šafárika ... · Model tekutej mozaiky V dôsledku...
Biologické membrány
Biologické membrány sú dynamické štruktúry, zložené z lipidov a proteínov, umožňujúce kompartmentalizáciu (štrukturovanie) buniek.
Kontrolujú chemické zloženie a koncentráciu molekúl v jednotlivýchbunkových štruktúrach, čím vplývajú na metabolické procesy.
Podieľajú sa na prenose informačných signálov vnútri bunky, ako aj medziBunkami.
Zohrávajú úlohu pri pohybe a zachovávaní tvaru buniek, ako ajv procese vzájomného kontaktu medzi bunkami.
20. roky 20. st. - začalo terajšie chápanie membránovej štruktúry - model biologickej membrány pozostával len z lipidovej dvojvrstvy
40. roky 20. st. - na vysvetlenie mechanických vlastností plazmatickej membrány sa predpokladalo, že povrch membrány je pokrytý proteínmi
70. roky 20. st. - ukázalo sa, že proteíny sú zapustené do lipidovej dvojvrstvy - kvapalno-mozaikový model membrány
Začiatok 21. st.- odhalila sa atómová štruktúra niektorých proteínov premosťujúcich membránu
História pohľadu na biologické membrány
Chemické zloženie membrán
Hlavné komponenty membrán: lipidy a proteíny
Ich zastúpenie závisí od funkcie konkrétnej membrány.
Minoritné zložky: glykolipidy a glykoproteíny
Lipidy
Fosfolipidy : glycerofosfolipidy, sfingomyelínyCholestrol
GlycerofosfolipidyGlycerofosfolipidy sú estery glycerolu, kyseliny fosforečnej a vyšších mastných kyselín.
1,2-diacylglycerol 3-fosfát - základ štruktúry glycerofosfolipidov
Konkrétny typ glycerofosfolipidu je daný alkoholom esterifikujúcimfosfátovú skupinu: cholín, etanolamín, serín, glycerol, inozitol.
Mastné kyseliny nachádzajúce sa v štruktúrach glycerofosfolipidov:Nenasýtené: myristová, steárová, palmitováNasýtené: palmitoolejová, olejová, linoleová, arachidonová
Amfifatický charakter glycerofosfolipidovNepolárna hydrofóbna časť – mastné kyselinyPolárna nabitá časť – fosfátová skupina + esterifikovaný alkohol
Sfingolipidy
Sfingozín a dihydrosfingozín - základné štruktúrne molekuly sfingolipidov
Významné sfingolipidy: ceramid, sfingomyelín, glykosfingolipidy (cerebrozidy, gangliozidy)
sfingomyelín
- hlavný sterol v membránach živočíšnych buniek je cholesterol- prevažne apolárny- v dvojvrstve - hydroxyl na atóme C3 smeruje k povrchu membrány- v ľudskom organizme je transportovaný prostredníctvom lipoproteínov s nízkou hustotou (angl. low-density lipoproteins – LDL)
Cholesterol
Lipidové zloženie jednotlivých membrán sa líši.
Toto zloženie je veľmi podobné v rovnakých vnútrobunkových membránach v špecifickom tkanive u rôznych druhov:
- plazmatická membrána má najvyššiu koncentráciu neutrálnych lipidov a sfingolipidov
- myelínové membrány axónov nervového tkaniva sú bohaté na sfingolipigy s vysokým podielom glykosfingolipidov
- lipidové zloženie membrán mitochondrie, jadra a zrnitého endoplazmatického retikula je podobné
Lipidové zastúpenie v membránach
Membránové proteíny
Periférne - lokalizované na povrchu membrán, obyčajne rozpustnévo vode, izolujú sa prostredníctvom roztokov s vysokou iónovou silou,alebo pri extrémnych pH
Integrálne – proteíny vnorené do membránovej štruktúry, obsahujú sekvencie hydrofóbnych aminokyselín, ktoré interagujú s reťazcamimastných kyselín, izolácia prostredníctvom detergentov
Funkcie membránových proteínov
katalytické, transportné, receptorové, štrukturálne
Micely a lipozómy
Amfifatické molekuly fosfolipidov pri istej koncentrácii (kritická micelárna koncentrácia) vytvárajú vo vodnom prostredí sférické častice nazývané micely.
V závislosti na vonkajších podmienkach dokážu fosfolipidy vytváraťdvojvrstvové lipidové štruktúry. Pri rozrušení tejto lipidovej dvojvrstvy sa môže vytvoriť do seba uzatvárajúca sa sférická vezikula - lipozóm.
Lipozómy sú vhodné prenášače liečiv, enzýmov, nukleových kyselín.
Typy pohybov fosfolipidových molekúl v dvojvrstve
Rýchle: rotačno - difúzny pozdĺžno - (laterálno) difúzny ohyb uhľovodikových reťazcov
Pomalé: medzivrstvová (transverzná) výmena (tzv. flip - flop)
Štruktúra biologických membrán
Všetky biologické membrány majú lipidovú dvojvrstvovú štruktúru, do ktorej sú zabudované proteíny (integrálne, povrchové) -
model tekutej mozaiky
Názov modelu pre biologické membrány indikuje dynamičnosť štruktúry(pohyb ako lipidovej, tak aj proteínovej časti) membrán.
Tento model vysvetľuje viaceré vlastnosti biologických membrán: fluidita,flexibilita, zmena tvaru, nepriepustnosť pre nabité molekuly.
- spôsob vzájomného usporiadania molekúl lipidov a proteínov v biologickej membráne (Singer a Nicolson, 1972) - základom membrány je lipidová dvojvrstva, do ktorej sú zabudované proteíny
- všetky zložky membrány sa nachádzajú vo viac-menej tekutom stave a pohybujú sa (tekutosť)
- mozaikový - kvôli istému rozmiestneniu proteínov, z ktorých niektoré prenikajú celou hrúbkou membrány a iné sú lokalizované na jednej z jej strán
Model tekutej mozaiky
V dôsledku uvedeného rozmiestnenia proteínov sa membrána stáva asymetrickou. Membrána je taktiež dynamickým systémom, pretože lipidy a proteíny sa v nej môžu pohybovať.
- hydrofóbne reťazce mastných kyselín môžu byť veľmi usporiadané - pomerne tuhá štruktúra (pravý kryštál, gel) alebo neusporiadané (tekutý kryštál)
- usporiadaná dvojvrstva sa so zvyšovaním teploty „topí“ - pri istom kritickom teplotnom intervale dochádza k fázovému prechodu - k nárastu fluidity (tekutosti) membrány
- teplota prechodu - teplota, pri ktorej štruktúra podstupuje prechod z usporiadaného do neusporiadaného stavu
- k širokému rozsahu teplôt topenia prispieva zloženie a asymetrické rozmiestnenie lipidov v membránovej vrstve - plynulý prechod lipidov v membráne medzi tekutými a tuhými stavmi vytvára v membráne dočasné (krátkodobé) domény
- proteínové molekuly môžu vykazovať odlišné kinetické vlastnosti, keď sú obklopené fosfolipidmi v usporiadanom stave alebo v neusporiadanom stave
Fázový prechod v membráne
Interakcie medzi lipidovou a proteínovou časťou biologickej membrány
Integrálne proteíny Integrálne proteínyinteragujú s lipidmi prostredníctvom hydrofóbneho úsekuaminokyselín (najčastejšie leucín, izoleucín, valín, fenylalanín), ktoré vnútrimembrány vytvárajú α - závitnucu.
V závislosti od typu proteínu môže existovať jeden, alebo viac transmembránových segmentov.
Vlastnosti integrálnych proteínov často závisia od lipidového zloženiamembrán.
Periférne proteínyPeriférne proteíny sú väčšinou voľne naviazané na povrch membrán(elektrostatická interakcia s nabitými fosfolipidovými časťami, väzba naintegrálne proteíny, čiastočné zanorenie hydrofóbnej sekvencie aminokyselíndo membrány, spojenie prostredníctvom kovalentne naviazaných lipidov).
Transport molekúl cez membrány
Pasívny transport: difúzia, uľahčená difúzia (membránové kanály,transportéry pasívneho transportu) – transport molekúl v smere koncentračného gradientu
Aktívny transport: transportéry aktívneho transportu – transport proti koncentračnému gradientu
Difúzia
Difúzia je proces, pri ktorom molekuly samovoľne prechádzajú z miest svyššou koncentráciou na miesta s nižšou koncentráciou týchto molekúl.
Ľahko difundujúce molekuly cez membrány : O2, CO, N2, NO, rôznelipofilné nízkomolekulové zlúčeniny.
Voda difunduje tiež relatívne dobre biologickými membránami cez tzv. prechodové priestory (transitory spaces) (priestory vytvorené medzi reťazcami mastných kyselín pri ich vzájomnom pohybe).
Membránové kanály (póry)
Membránové kanály patria medzi integrálne membránové proteíny, ktorévytvárajú hydrofilný otvor cez membránu a umožňujú tak rýchly pohyb iónov,alebo špecifických molekúl cez membránu v smere koncentračného gradientu.
Typy membránových kanálov:
Napäťovo regulovaný – napr. Na+ kanál
Chemicky regulovaný – napr. acetylcholínový receptor
cAMP regulovaný – napr. Cl- kanál
Iné typy – napr. citlivý na tlak
Membránové transportéry
Membránové transportéry sú molekuly, ktoré špecificky viažu a prenášajú cezmembránu anorganické katióny a anióny (napr. Na+, K+, Ca 2+, Cl-, HPO4
2-) arôzne organické molekuly (aminokyseliny, cukry).
Hoci transportéry značne uľahčujú a urýchľujú prenos molekúl cez membránu v porovnaní so spontánnou difúziou, táto rýchlosť (102 – 103 molekúl .s-1) je oveľa menšia než v prípade prenosu cez kanály (10 7 molekúl.s-1).
Charakteristiky membránových transportérov
- saturačná kinetika- špecificita pre prenášané molekuly- môžu byť inhibované- molekuly sa prenášajú v smere (pasívny transport), alebo proti smeru (aktívny transport) koncentračného gradientu- prenos nevyžaduje (pasívny transport), alebo vyžaduje (aktívny transport) prísun energie
Mechanizmus transportu molekúl cez membrány prostredníctvom prenášačov (transportérov)
-„spoznanie“ (recognition) prenášanej molekuly prenášačom- prenos molekuly cez membránu- uvoľnenie prenášanej molekuly z prenášača do prostredia- obnovenie pôvodnej štruktúry a polohy prenášača pre transport ďalšej molekuly
Existujú systémy, ktoré simultánne prenášajú dve molekuly.
- prenos jednej molekuly jedným smerom - uniport- prenos dvoch molekúl v jednom smere - symport- prenos dvoch molekúl v opačných smeroch - antiport
Energetika membránového transportu
Rýchlosť difúzie sa riadi 1. Fickovým zákonom:
J - množstvo prenesenej látky jednotkovým prierezom za jednotku časuD - difúzny koeficient
Zmena voľnej energie (ΔG) pri prenose nenabitých molekúl z jednej strany membrány (koncentrácia molekúl c1) na druhú stranu (koncentrácia molekúl c2):
V prípade prenosu nabitých molekúl je zmena voľnej energie vyjadrená:
F – Faradayova konštanta, z – náboj prenášanej molekuly, ∆Ψ – rozdiel v elektrických potenciáloch medzi stranami membrány
( )12clog..R.3,2 cTG =∆
( ) ΨzcTG ∆+=∆ F..clog..R.3,2 12
( )xcD ∂∂−= .J
V rovnováhe platí vzťah:
potom:
ΔΨ sa nazýva Nernstov potenciál
Nernstova rovnica
- vyjadruje rozdiel elektrického membránového potenciálu ako funkciu koncentrácií iónov (ktoré dokážu prechádzať membránou) na obidvoch stranách membrány pri termodynamickej rovnováhe
- umožňuje vypočítať a) distribúciu iónov ako funkciu elektrického potenciálu b) elektrický potenciál, ktorý je indukovaný rôznym rozložením iónov
Ak by v systéme existoval len jeden typ iónov priepustných cez membránu,tak membránový potenciál by sa rovnal Nernstovmu potenciálu tohto iónu.
Nernstov potenciál
[ ] [ ]( ) ΨzXXTG AB ∆+==∆ F..log.R..3,20
[ ] [ ]( )AB XXzTΨ log.F.R..3,2−=∆
Donnan poukázal na vplyv nabitých makromolekúl, ktoré sa nachádzajúna jednej strane polopriepustnej membrány, na rozdelenie malých iónovna oboch stranách membrány.
Systém - makromolekuly s nábojom (M-n) nachádzajúce sa na jednejstrane polopriepustnej membrány a voľne difundujúce ióny A+ a B-.
Elektrický membránový potenciál pre ióny A+ a B- (predpokladajme, že sajedná o jednomocné ióny) má hodnotu:
Δ ψ= - R.T/F.(ln([A+]II/[[A+]I)= R.T/F.(ln ([B-]II/[[B-]I)
[A+]II/[[A+]I= [B-]I/[[B-]II = D, Donnanov koeficient
Na obidvoch stranách membrány platí podmienka elektroneutrality:
[A+]I= [B-]I a [A+]II= [B-]II + n [M-n]
Donnanova rovnováha
Donnanova rovnováha
Úpravou predchádzajúcich dvoch rovníc dostávame:
[A+]II/ [A+]I = ([B-]II + n [M-n]) / [B-]I => D= (n.[M-n] / [B-]I) +1/D
Ďalšou úprava vedie ku kvadratickej rovnici:
D2 - (n.[M-n] / [B-]I) .D -1=0
Jej riešením je výraz: D= (n.[M-n] / 2.[B-]I) + (1+(n.[M-n] /2.[B-]I)2)0.5
Pre elektrický potenciál na membráne za daných okolností platí“
Δ ψ = - (R.T/F).lnD
Z vyjadrenia pre Donnanov koeficient je zrejmé, že čím je vyššia koncentrácia makromolekuly, tým výraznejšia je asymetria rozdelenia nízkomolekulových iónov na oboch stranách polopriepustnej membrány.