Biologia Molecolare Caratterizzazione di un gene clonato.
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Biologia MolecolareBiologia Molecolare
Caratterizzazione di un gene clonato
Il sequenziamentoIl sequenziamento
Sequenziare significa determinare la successione dei monomeri che costituiscono un polimero biologico
•PROTEINE (sequenza di Aminoacidi)
•DNA (sequenza di nucleotidi)
•DNA Genomico
•cDNA
Principi del sequenziamento del DNAPrincipi del sequenziamento del DNA
Molte tecniche di biologia molecolare si basano sulla possibilità di replicare molecole di DNA in vitro:-Molecola stampo-Nucleotidi trifosfato-DNA polimerasi-Primers-Appropriato buffer di reazione
La replicazione del DNALa replicazione del DNA
I Nucleotidi utilizzati durante questa sintesi non sono nucleotidi normali (cioè nucleosidi-fosfato) ma sono nucleosidi trifosfato.Questi legami fosfato sono legami ad alta energia, la loro rottura e la liberazione del pirofosfato fornisce energia più che sufficiente per la generazione del nuovo legame covalente tra un nucleotide e un altro
Metodo di SangerMetodo di Sanger
Metodo di SangerMetodo di Sanger
Sequenziamento automaticoSequenziamento automatico
• Stesso principio del metodo di Sanger• Il primer o i ddNTP sono marcati con un
marcatore fuorescente• Lettura tramite laser della molecola appena
questa esce dal gel• Utilizzo di una sola corsia
– Se si marca il primer?– Se si marcano i ddNTP
• Gel di poliacrillamide o capillare• Dato di sequenza acquisito automaticamente
e trasferito al computer
Interpretazione automatica del datoInterpretazione automatica del dato
elettroferogramma
Allungare la sequenzaAllungare la sequenza
• Con i metodi automatici è possibile ottenere sequenze oltre il migliaio di basi
• Con l’allungamento della sequenza diminuisce la risoluzione e l’intensità del segnale
• Aumento probabilità che una struttura secondaria termini la sintesi
• L’affidabilità diminuisce allontanandosi dal primer
WalkingWalking
Sequenziamento shotgunSequenziamento shotgun
• Per sequenziare un frammento lungo la migliore stratgia è quella di dividerlo in framenti più piccoli.
• Il DNA può essere frammentato e clonato in una librerie M13 o in plasmidi.
• La libreria deve contenere frammenti parzialmente sovrapposti
• Dalla libreria si prelevano cloni a caso e si sequenziano
Sequenziamento shotgunSequenziamento shotgun
Diminuzione della produttivitàDiminuzione della produttività
• Una accurata determinazione del 90% della sequenza può essere ottenuta molto rapidamente
• Per ottenere un ulteriore 9% sarà necessario un tempo paragonabile a quello utilizzato per ottenere il 90%
• Una quantità simile di lavoro sarà necessaria per ottenere un ulteriore 0,9%
Effettuata da alcuni virus a RNA chiamati retrovirus
Il flusso dell’informazione genicaIl flusso dell’informazione genica
Il dogma centrale della biologia•L’informazione genica è contenuta nel DNA
•Questa informazione è perpetuata nelle generazioni future tramite il processo semiconservativo chiamato duplicazione del DNA
•L’espressione della informazione genica è invece un processo che passa attraverso un intermediario transitorio: l’RNA messaggero. Questa molecola è sintetizzata sulla base di uno STAMPO sul DNA e l’informazione in esso contenuta serve per dirigere la sintesi di proteine.
•L’informazione passa (quasi) sempre dal DNA all’RNA e da questo alle proteine.
DNA RNA ProteinaTrascrizione Traduzione
Mantenimento dell’informazione Trasferimento dell’informazione Ruolo funzionale
Informazione contenuta nella sequenza
Informazione contenuta nella sequenza e nella quantità
Informazione contenuta nella struttura e nella quantità
Retrotrascrizione
IL DNA: natura ed informazioneIL DNA: natura ed informazione
Contenuto informativo del DNALa struttura del DNA è costante. Il DNA è sempre una doppia elica INDIPENDENTEMENTE dalla sequenza di nucleotidi che lo compone.
L’ossatura di zucchero e fosfato è costante.
La parte variabile, e quindi più informativa, è rappresentata dalla sequenza di BASI AZOTATE.
Per questo motivo, in bioinformatica, l’informazione contenuta nel DNA è rappresentata da una stringa composta da un alternanza 4 caratteri che rappresentano le basi azotate del DNA.
GCGGCGGCGGGCGGGTACTGGCTTCTGGGGCCAGGGGCCAGGGGCGGTGGGCGCCGGGACCGCGGAGCTGAGGAGCGGGGCCCGGCCAGGGCTGGAGACTTTGCGCCCGGGGGCACCGGGGCTGCGCGCGGTCGCACACATCCACCGGCGCGGCTTCCCTCGGCGGCCCGGGCTCCGCTCATCCTGCGGCGGGCGGCGCCGCTCAGGGGCGGGAAGAGGAGGCGGTAGACGCGACCACAGAAGATGTCGGGCCAAACGCTCACGGATCGGATCGCCGCCGCTCAGTACAGCGTTACAGGCTCTGCTGTAGCAAGAGCGGTCTGCAAAGCCACTACTCATGAAGTAATGGGCCCCAAGAAAAAGCACCTGGACTATTTGATCCAGGCTACCAACGAGACCAATGTTAATATTCCTCAGATGGCCGACACTCTCTTTGAGCGGGCAACAAACAGTAGCTGGGTGGTTGTGTTTAAGGCTTTAGTGACAACACATCATCTCATGGTGCATGGAAATGAGAGATTTATTCAATATTTGGCTTCTAGAAATACACTATTCAATCTCAGCAATTTTTTGGACAAAAGTGGATCCCATGGTTATGATATGTCTACCTTCATAA
I GeniI Geni
• Il gene è l'unità ereditaria e funzionale degli organismi viventi.
• La maggior parte dei geni codifica proteine, che sono le macromolecole maggiormente coinvolte nei processi biochimici e metabolici della cellula.
• Altri geni non codificano proteine, ma producono RNA non codificante, che può giocare un ruolo fondamentale nella sintesi delle proteine e nell'espressione genica (La trascrizione del DNA in RNA e la traduzione dell'RNA in proteina).
• Parte del contenuto dei geni non viene trascritto, ma può coordinare la stessa espressione genica.
• Tra queste regioni figurano i promotori, i terminatori e gli introni .
Struttura del geneStruttura del gene
Non tutti gli esoni codificanoNon tutti gli esoni codificano
• Gli esoni sono normalmente codificanti, ad eccezione di quelli alle estremità 5' e 3' del gene.
• Tali esoni prendono il nome di UTR (UnTranslated Region).
• In questo caso il 5' UTR è costituito da tutto il 1° esone e da parte del 2° esone (regione arancione).
• La regione codificante è indicata in blu, inizia nel 2° esone e termina nell'ultimo esone.
• Il 3' UTR è costituito da parte dell'ultimo esone (regione gialla).
Introni
Esoni
I GeniI GeniI GeniI Geni
• Il gene è l’unità ereditaria e funzionale degli organismi viventi; ad esso sono associate molteplici informazioni:
GeneGene
Sequenze omologhein altri genomi
AnalisiFilogenetica
Sequenza Localizzazionegenomica
Struttura
Proteina(Funzione)
Le sequenze biologicheLe sequenze biologicheLe sequenze biologicheLe sequenze biologiche
• Le sequenze nucleotidiche vengono rappresentate mediante stringhe su un alfabeto di 4 caratteri (A, C, G, T), nelle quali ciascun carattere rappresenta un singolo nucleotide.
• Analogamente le sequenze proteiche (o aminoacidiche) vengono rappresentate mediante stringhe su un alfabeto di 20 caratteri, ciascuno dei quali rappresenta un singolo aminoacido.
Lo Standard IUB/IUPACLo Standard IUB/IUPACLo Standard IUB/IUPACLo Standard IUB/IUPAC
Aminoacidi
A Alanina B Acido Aspartico o Asparagina C Cisteina
D Acido Aspartico E Acido Glutammico F Fenilalanina
G Glicina H Istidina I Isoleucina
K Lisina L Leucina M Metionina
N Asparagina P Prolina Q Glutammina
R Arginina S Serina T Treonina
U Selenocisteina V Valina W Triptofano
Y Tirosina Z Acido Glutammico o Glutammina X Qualsiasi (Any)
* Stop traduzione - Gap
Acidi Nucleici
A Adenina R G o A (Purine) B G T C
C Citosina Y T o C (Pirimidine) D G A T
G Guanina K G o T H A C T
T Timina M A o C V G C A
U Uracile W A o T N A C G T (Any)
- Gap
NCBINCBINCBINCBI
• NCBI (National Center for Biotechnology Information) è l’istituto americano che ospita GenBank, una delle tre banche dati primarie di sequenze nucleotidiche (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
• Oltre a GenBank in NCBI sono disponibili numerosi altri Database tra cui:– GenPept: Database di sequenze proteiche– Gene: Database di geni– Pubmed: Database di letteratura biomedica (Abstract,
articoli e citazioni)• NCBI offre anche svariati strumenti per l’analisi di
dati biologici tra cui BLAST, un tool che permette di effettuare ricerche per similarità nei database di sequenze.
EntrezEntrezEntrezEntrez
• I vari database di NCBI sono accessibili mediante un unico motore di ricerca che prende il nome di Entrez:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/index.html
Esempio di ricerca: BAX (1)Esempio di ricerca: BAX (1)Esempio di ricerca: BAX (1)Esempio di ricerca: BAX (1)
• Ricerchiamo i dati relativi al gene BAX utilizzando Entrez:
• Otterremo i risultati suddivisi per categoria:
Esempio: BAX (2)Esempio: BAX (2)Esempio: BAX (2)Esempio: BAX (2)
• Nella pagina dei risultati relativi alle sequenze nucleotidiche clicchiamo sul link alla sequenza cercata:
• A questo punto otterremo la pagina coi risultati (formato GenBank), che andiamo a vedere nel dettaglio nella prossima slide.
Esempio: BAX (3)Esempio: BAX (3)Esempio: BAX (3)Esempio: BAX (3)
Lunghezza Lunghezza della della sequenzasequenza
Tipo di Tipo di sequenzasequenza
Accession Accession NumberNumberOrganismoOrganismo
Riferimenti Riferimenti bibliograficibibliografici
Esempio: BAX (4)Esempio: BAX (4)Esempio: BAX (4)Esempio: BAX (4)
Link alla Link alla regione regione codificantecodificante
Estremi Estremi della CDSdella CDS
Link alla Link alla proteina proteina corrispondecorrispondentente
Esempio: BAX (5)Esempio: BAX (5)Esempio: BAX (5)Esempio: BAX (5)
• Cliccando su “CDS” otteniamo la regione codificante della sequenza:
Il formato FASTAIl formato FASTAIl formato FASTAIl formato FASTA
• E’ possibile scegliere il formato di visualizzazione della sequenza; scegliamo il formato più utilizzato, il FASTA.
• E’ anche possibile inviare la sequenza nel formato prescelto direttamente su file (Send to -> File).
Esempio: BAX (6)Esempio: BAX (6)Esempio: BAX (6)Esempio: BAX (6)
• A questo punto andiamo a visualizzare la proteina codificata cliccando A questo punto andiamo a visualizzare la proteina codificata cliccando sul link relativo; si aprirà una pagina simile a quella vista per la sul link relativo; si aprirà una pagina simile a quella vista per la sequenza nucleotidica (formato GenPept):sequenza nucleotidica (formato GenPept):
Esempio: BAX (7)Esempio: BAX (7)Esempio: BAX (7)Esempio: BAX (7)
• Facciamo adesso un passo indietro tornando alla schermata di Entrez. Clicchiamo su Gene:
Esempio: BAX (8)Esempio: BAX (8)Esempio: BAX (8)Esempio: BAX (8)
• Verrà visualizzata una pagina con informazioni dettagliate sul gene:
Nome del Nome del gene e gene e specie di specie di appartenenappartenenzaza
InformazionInformazioni varie sul i varie sul gene, gene, tassonomia, tassonomia, tipo, breve tipo, breve descrizionedescrizione
Accession Number della entry di Gene
Esempio: BAX (9)Esempio: BAX (9)Esempio: BAX (9)Esempio: BAX (9)
• Scorrendo la pagina si trovano le informazioni strutturali:
Accession number Accession number della sequenza del della sequenza del
genegene
Struttura delle Struttura delle isoforme del gene isoforme del gene (in blu la regione (in blu la regione non tradotta, in non tradotta, in rosso la regione rosso la regione codificante)codificante)
Accession Accession numbers numbers dei dei rispettivi rispettivi geni geni (GenBank)(GenBank)
Accession Accession number delle number delle rispettive rispettive proteine proteine (GenPept)(GenPept)
Esempio: BAX (10)Esempio: BAX (10)
• Informazioni sulla localizzazione genomica
CromosomaCromosomaCoordinate posizionaliCoordinate posizionaliBAX e suo BAX e suo orientamentoorientamento
Geni limitrofi e relativo Geni limitrofi e relativo orientamentoorientamento
Esempio: BAX (11)Esempio: BAX (11)Esempio: BAX (11)Esempio: BAX (11)
• In fondo alla pagina troviamo ulteriori inf. :
Informazioni generali Informazioni generali sulla funzione e sui sulla funzione e sui processi biologici processi biologici interessati.interessati.
Omologhi del gene in Omologhi del gene in altre speciealtre specie
Fenotipo (modo in cui Fenotipo (modo in cui si manifesta la funzione si manifesta la funzione della proteina della proteina codificata)codificata)
Pathways: cascate di Pathways: cascate di reazioni all’interno reazioni all’interno delle quali è coinvolta delle quali è coinvolta la proteina codificatala proteina codificata
Varianti del geneVarianti del geneSequenze correlateSequenze correlate
La Gene TableLa Gene Table
• E’ possibile scegliere dalla tendina in alto a sinistra, di visualizzare la Gene Table:
• La Gene Table mostra i confini di esoni ed introni del gene: