BIOCATALISIBIOCATALISI A. 2008 -2009 Dr. Davide Tessaro Lezione 4: Enzimi redox: le deidrogenasi.
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BIOCATALISI
A.A.
2008 -2009
Dr. Davide Tessaro
Lezione 4:Enzimi redox:
le deidrogenasi
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Scala redox composti bio
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Enzimi redox
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Le DHasi NAD-dipendentiSi avvalgono del cofattore Nicotinammide Adenina Dinucleotide (NADH), eventualmente fosforilato (NADPH), che non è legato covalentemente all’enzima e che viene consumato in quantità stechiometrica.
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MeccanismoNella catalisi è coinvolto anche uno ione Zn++, che orienta e attiva il substrato
Le Dhasi sono selettive per quanto riguarda la stereochimica dell’idruro del cofattore: ogni enzima ha una propria specificità
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Stereospecificità
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Specificità di substrato
Y = lievito; HL = fegato di cavallo; TB = Thermoanaerobium brockii;
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Riciclo del cofattorePrimo metodo: accoppiamento dei substrati
• per spostare l’equilibrio verso i prodotti va usato un eccesso di substrato ausiliario
• l’attività dell’enzima è distribuita tra le due reazioni;
• il prodotto deve essere purificato dalla gran quantità di ausiliario
• ausiliari reattivi deattivano l’enzima
• le alte concentrazioni in gioco portano ad inibizione
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Riciclo del cofattoreSecondo metodo: accoppiamento di enzimi
• le reazioni devono essere indipendenti l’una dall’altra
• i substrati non devono competere per lo stesso enzima
• stato dell’arte OK per NADH, si cerca ancora un metodo efficiente a livello industriale per NADPH
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Formiato deidrogenasi
• la reazione è irreversibile
• sia il formiato che la CO2 sono innocui (anche per l’enzima) e facilmente separabili
• il formiato è poco costoso
• TTN: 103 105
• FDH costosa e poco attiva (3 U/mg) si immobilizza l’enzima o si una una membrana
• FDH da Candida boidinii per NAD, FDH da Pseudomonas sp. Ingegnerizzata per NADPH
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Glucosio deidrogenasi
• reazione irreversibile per idrolisi gluconolattone
• GDH da Bacillus cereus accetta sia NAD+ che NADP+ ed è stabile
• GDH costosa e separazione prodotto può essere non banale
• G6PDH da Leuconostoc mesenteroides è poco costosa, accetta sia NAD+ che NADP+, ma G6P è costoso, deve essere preparato in situ (uso di esokinasi + ATP) o sostituito con ausiliari simili (gluc-6-solfato)
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Alcol deidrogenasi
• l’equilibrio va spostato rimuovendo i prodotti o usando un eccesso di reagenti
• ultimamente ADH da Rhodococcus ruber usa i-PrOH (fino al 50%) come substrato
• ADH da lievito per NADH, ADH da Leuconostoc mesenteroides per NADPH
• TTN ancora un po’ bassini
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Forma ossidata
• attenzione al potenziale redox
• LDH accetta solo NADH
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ApplicazioniH
H
O O
H
H
O
O
O O
H
H
O OH
H
H
OH
O
O OH
HL-ADH
riciclo NADH
HL-ADH
riciclo NADH
HL-ADH
riciclo NADH
e.e. > 98%
e.e. > 98%
e.e. > 98%
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Riduzioni con cellule intere
R1 R2
O
R1 R2
OH
• facile trattabilità, costo ridotto
• largo spettro di attività
• no aggiunta cofattori (riciclo interno, consumo Glu)
• combinano diversi enzimi
Lievito da panettieri (S. cerevisiae)
• basse produttività
• eventuale tossicità del substrato o prodotto
• purificazione difficoltosa
• diversi enzimi presenti: controllo reazioni collaterali
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DHasi da lievito
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Riduzione chetoni
Il lievito agisce secondo le regole di Prelog
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riduzione beta-ketoesteri
Evidentemente agiscono contemporaneamente enzimi diversi
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Inibizione selettivaSi va ad inibire l’enzima “D”
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Diastereoselettività lievito
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Diastereoselettività lievito
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Deracemizzazione alcoliSi procede via stereoinversione, sfruttando i sistemi già presenti nel microorganismo.
R1 R2
OH
R1R2
OH
R1 R2
O
NAD(P)+
NAD(P)H
deidrogenasi enzima redox
La seconda reazione DEVE essere irreversibile
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Deracemizzazione alcoli
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Enoato reduttasiÈ noto che diversi generi di microorganismi (Clostridia, Proteus, Beauveria, Saccharomyces) sono capaci di ridurre doppi legami attivati con alte specificità.
Tale attività è associata ad una classe di enzimi (enoato reduttasi) coinvolti nella biosintesi degli acidi grassi.
Pur essendo stati, tali enzimi, isolati e caratterizzati, si preferisce fare ricorso, per le biotrasformazioni, alle cellule intere, per evitare problemi di riciclo del cofattore e di stabilità all’ossigeno dell’enzima stesso.
La formale addizione di idrogeno avviene, solitamente, con stereochimica trans.
La scoperta di tale attività, nel lievito da panettiere, risale addirittura al 1934.
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Substrati per lievitoVengono ridotti solo doppi legami C=C attivati dalla coniugazione con gruppi elettron-attrattori. Doppi legami isolati e tripli legami non vengono ridotti.
• acidi ed esteri α,β-insaturi. Gli esteri possono venire parallelamente idrolizzati.
• lattoni α,β-insaturi
• aldeidi α,β-insature. C’è la parallela riduzione del carbonile. Alternativa: alcoli allilici
• chetoni α,β-insaturi: destino simile alle aldeidi
• nitrocomposti α,β-insaturi
• 1,3-dieni attivati (coniugati): viene ridotto solo il doppio legame α,β
Spesso (ma non sempre) la stereochimica della riduzione è controllabile a partire dalla conformazione E o Z del substrato
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Esempi
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Esempi
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Esempi
Processo Hoffman La-Roche
pH 8.0-9.0; 20°C
Fed-batch per evitare livelli tossici di oxoisoforone
Conv. 87%, resa 80%, selettività 92%, e.e. 97%
STY 2.8 g/(L d)
Scopo: produzione carotenoidi
OH
OH
zeaxantina: mais, zafferano, tuorlo d'uovo, retina oculare
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Controllo reazioniLa cellula di lievito è un sistema multienzimatico: se più enzimi competono per lo stesso substrato, è necessario trovare un metodo di controllo cinetico.
Devo fare in modo che la concentrazione di substrati e prodotti rimanga piccola, di modo da non incorrere in fenomeni inibitori o in reazioni collaterali.
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Extractive biocatalysisUso una resina apolare: substrato e prodotti si adsorbono su di essa mantenendo una loro (piccola) concentrazione in acqua determinata dal rispettivo coefficiente di partizione.
Anche il work-up è facile: basta filtrare le particelle di resina e poi “lavare via” il prodotto avvalendosi di un solvente organico
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Esempio
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EsempioO
OO
O
OOH
Processo Eli Lilly
Cellule intere di Zigosaccharomyces rouxii, pH 7.0, 33-35°CIl substrato ha un limite di tossicità di 6 g/L: usando una resina XAD-7, si hanno meno di 2 g/L in soluzione, pur avendo 40 g/L complessivamente.La resina ha log P < 2, non è tossica, non ha effetti denaturanti, e può essere facilmente riutilizzata.
Resa 96%, e.e. > 99.9%, purezza 95 %, STY 75 g / (L d)
O
OOH
O
O N
N
NH2
O
LY300164benzodiazepina
in test per trattamentosclerosi laterale amiotrofica