Group5.the influence of phosphorus precursors on the synthesis and bioactivity si o2 cao-p2o5
Bioavailability and intestinal bioactivity of intact and in vitro digested ...
Transcript of Bioavailability and intestinal bioactivity of intact and in vitro digested ...
BIOAVAILABILITY AND INTESTINAL BIOACTIVITY
OF INTACT AND IN VITRO DIGESTED β-CASEIN
María Eugenia Núñez Salces 201390169
Master’s Degree in Molecular Nutrition and Food Technology
60 ECTS
November 2015
Supervisor:
Jan Trige Rasmussen · Senior researcher
master thesis
!"#$%&
'!()"
$*+,'!-
.//01/./
2!3!$4 2
3-!"5"
$%&6"7
'!()"
7)89:#
$*;,'!-
:.//0
0"&!<%&/=>)#0!&
/"&%!)!>&&&"/ !%:
")")"&)?;#&!:%&0/
3) @% ! 3 -!" 5" !) !> %) && & ?;
%%!!&&/A%)#)"
>!!%% ! %!/ A
#!%%)&&&)%%!!
/ !&# % B ) ! % & ! ?;
%%/
)")""%%#?;%&
>%&/6)">%" &)&!% &?;
!&&/A!#-;# &!
#>%">!!?;!"">)%
&&)@%/C!!!#?;%>
) >!! ?; %% > % -;
"/ %" > %& & ! & %% %
&%/
C&)"!>%)&&&)"&
); / !# %%> & )" / A
#&&!%:!>!?;&&&%
/)#%%>!%&&!))
%-;"/
!>0%!<!>%&!3-!"5"#'!
()"/ !%:%D- !&"/
A>0@%"2!3!$4 2&!%%"&
"!!%)#>&!")
%&>%/!#A>0!05" !5E!#
2%"'6:&!%/
'%!0"'3&4)F3&56!5&!
%%"&"@%%"@%!$%&
# '! ()"/ '"# & ! @% > !) %
>!!)!%)&3 ! ! !55" !24/
)# !0 )" !3-!"5"/' & "!)%& !
%:/
)
'0%!%! '53
'A;)" '-
6)%% 63
-%!%!%% -33
7"%% 73
-%!%! --3
-%"$' $'
$G& $
%" A
) 6
7 7A
A;3;3 A33
A&"> A6$
A; &; A
5B!%!" 5-
%"
C%%% C3
C) C9'
3;%" 31
3;%" 31
)
3!"!" 3A -
3!"!&"& 3
3!"!!" 3 =
3!%!;&& 36
3"! 3-2
H))%
%"!B2 ;3-2
!!" -
!: 4
%! 2
&>!&? 7;?
9;3;3 933
I; I;-
I; I;-
?; ?;-
?;%! ?;-
?;%!J ?;-J
)
-%///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
'!//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
%)////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
'//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
'0>/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
')/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////)
A////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
/ 0/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// 0%-///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
/ 0%=!&"!//////////////////////////////////////////////////D
// 6)0%/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D
// 6)0%%/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////J
// ?;6)%%////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
/ 7%!""////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// $&%//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// '%&%////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////J
/ !;///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////,
// -;/////////////////////////////////////////////////////////////////////////K
'&!"////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
!//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
/ ?;////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// =!%")?;/////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// '&?;%"////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// ?; ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////L
/ ?;)")"///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////J
// -//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////J
// A///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////J
// %!////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////,
// '0%!%!"////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////K
//L !&&"&;&-;////////////////////////////
//D !)%&)!""&////
//J &&&?;!"");!-;//////////////
)
//, 3B&/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
//K 7@%@%/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// %!&%%/////////////////////////////////////////K
// 5-;A;1@%////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
2///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
/ ?;////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// 3&&?;///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////
// ?;)///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D
/ &&"&;&;//////////////////////////////////////////D
/ )%&)!""&//////////////////K
/ &&&?;!"");!-;//////////////////////L
/L %"!&%%//////////////////////////////////////LL
L $//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////LJ
L/ ?; //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////LJ
L/ &&"&;&-;/////////////////////////////////////////L,
L/ !)&&&)&//////////////////////////////////LK
L/ &&&?;!"");!-;//////////////////////D
L/L %"!&%%////////////////////////////////////////////////D
L/D 80>!!-;///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////DL
D -///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////DD
2&////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////DJ
)
!
!%:)!%)"&?;/0%
"%&%!")%/ !)&
!!@)/A!%:!%%"&?;
&!"!/ !&%!%"
! && ! &">#) "% A
#!&!&%!%)
!/C!!!#!!!!0
%#"& !%% 0% !)"! !&
/#!%:!%"&%%))B"%
!!/
!)&%A!&%#&%!0
@%@%/ !&>%&!)>&!
)&&0%#%"?;#!%&"/
B"#!%!""&%<@%#&">!%&
! ! ! ) ! % & ?;
%"#>!%)%&!%/
!"!
%%)#0 & ! && !"& &
#>!!&!B&!>&!%%ML#JN/
%!";!%&)>#0%@"&%&&
%!!@M,;N
• &##)!>/
• -%&%/
• C18#>!&B%!/
A)0#&>&O0P#!%&&%
)&!&!##&#"#/MJ#KN
=>)#))&%>/
# $%&'$(!))%* $'$(!))%*
8 ,J ,L;K
3 / /K;
/J /L;L
5 /, ;L/L
/K /J;
0%#0&&!!>B&
%/#"0&0%"#)!"
L*1">0Q&!&"/=>)#!%>
%&%&!!)#)!
&)#0%!%!#!MN/
!"!"! %+#,-,,
-!&!%&>0/A#!"%,Q
&!&%/-!%&"&%#!&
!@&&% MJN/
!"
./01%2,
I;
I;
?; L
R; L
-%#>!>!>L0$/'"#!"
!"!))%%&""/#?;
KQ&I;!@LQ&?;MLN/=>)#!"
%@&!&/)!)
%%!&#!>)&!!)!&>
&MD#J#N
• - %!%! !
#
&/
• !) !"%! # >!
&!S"I;?;T
/
• C!!!#!!)R;
!"%! #>!! &
!&!"
!%!!-;
&R;%/
# $
• )#!""!)!&%=D/J/
8!!%%>)&!/
?;S?;-T!:&!%/A!>!&
0$!!"%!%&MLN/!#!!%&!
%# !!"%"%!# L&&)>! !
&MN/6?;-'#!"&&MN/
# % &'(
2!%#)!)!!%#>!?;-!
%>!!!!&!SL%TMJN/!)&%
!"%!0&"/AB&!>)&
""#@!!!"!!#
L
!"!")")%")>!%MJN/6#>!
%!#%!?;-&&!/A&#
"/'%!)MJ#DN/'"#!0%
& ! !"%!%!%#!!?;- !>!!!%!%!
#!;L%!%!%%/ !%!%!&!%
!!!"@"%&S3T"&%!%!/
')"#%&!%!%!&0>!!&&
%!%! !> / 6! 0 & %!%! % &
&!&MD#J#N/
# )$ (
D
!"3 - 4
'�B&!%)&!B%%"
! " &/=>)# " )"> ! !0 ! &
#"&%&&!!&"MJ;N/A#
")%&&)!%MN&
!%!%>!!&M;N
# *+
A!0&&%>!%!@!
&&&<)/!00
&!%%&)%MN/)#)!!!!
!>)"&%!0#&!""&
!0%!)%%/
!"3"! 2%+#,
0)%!&%!"%%!)#&!
!>!"&/5&#&#%"!%
&0/ !;%"!!>!&;)#
!)"&&MN/')"#!%&&!)
7A!! A&& ')"
'!"%) 6!! 3&&
J
%%&!%#0&&%!S"
!TMN#)%&!&!MN/
C!!!#0&#%&%%&
%%/ !"%)%)"#>!!%")&
! " & ! " MN/ !#0
% & >! &# > >! % !
!&)"&%!>"/C&!>!&!
)0!#!&>!&?S 7;?T%"!/A
%&#%&&&U!!
!!&"!>&!!%)#!
&&! 7;?@>!&"%>#!)/
M##N/
A"#%&!)"&>@%&)%/A!0
&&)%!/)# %!&!
&&&)&)%%ML#DN/
!"3"3 2%+##5,
6& &%% ! �% %&
")%%/ !%"0%"%)
%% S63T>! ! B/ !%% )>!%& !%
%# !>) !" %" ) " % ! " &
) ML# JN/ 63 %" # !> "
! ! ) & & 0 >! %" /
'"#!&!%%!%M,#KN/
!)"&!%&!%B/ !
)">#)0!
"&!63)&%%!"#!&%&63@&&
&&/'"#&&&&!ML#
JN/!#)0>!0%%%&63/=>)#
,
!:)&!%!")%!>L
M#,N/
# (, - (
"&!)0)%%#&O%P#>!!
%%&!"%%S73T&R;/-%!)
!%%)!0!)
MN/"#!%"!&%&0#
!")!73&R;#>!!0!"#!
/C!!!#!&#!)&
&&#>!!%"%<&MN/#!%
!%%&73S&D+DT&!&
!V;!&&S!>DT#>!!!%&&!
& & !%" & !!%!%/ A
B#!%!&%"!!%#
!& ! %>0 ML# N/'"# %% &R;!
!%)0M#N&&MN#>
! % % & 73 " ! ! >! & !& % !
%&&&%#0&M#LN/
%S>!"%T
!>!&&/
'&/
3)"/
:0%ST
26#%6,,
7&/
&%%/
'&/
A/
26
K
# . % / )
'!@%&0%%>!%%!"&&%!%!%%S-33T
!!)&!""0
M#JN#>!"%M,#KN/2!;%#
!" )# B" !%% !%
!/ !%%"&-33!&#%!%!%
!%"&@%&!%&;%!%!
MN/'@%&-33!;L&)?;#>!!
%!%!>!B!>J#&@;L
MJN/'"#!!!!!&)!>!
!B&-330!%"MN/
# "0$++1 &')"
)#!63&&"&!#
>"/ # !"" !) ! &&
&%&/'"#!">)
!!!%)&%"#&>%)
>MN/"#%!"%)&&!063/ !&#
!">!@/
!"3"7 892,2##5,
?;!!")%>!0!%)
&!%"/A&#!!)"!!%%&
!%#0%)MJ#N#!ML#N""&&ML#
N/=>)# !"%) % B %" ! %%
!)"&%!"&&!!)"%!
%/
% 2'A;)"S'-T!&!
&%/A)-;%%&A"0S!>,T/
A ! & # ! % ) AA # >! "0
)#!&@)"/ !B&!#
%MN/3"#"0%!)&
&'-!/6"#!"%)&'-#%&!
0&'-!"BS0%T#!)!
!%&!!"%!!-;&&!!%>!
!)&!"/!#>!"!!%"&!!"
>!!!)S%"%TMN/
# 34 % %*(
="%)%%&O0P)"
!%%/=>)#!"%%!)&>MLN/?;-!
>!I;#!%&!"%)%%0%#
K/2?;-#!)!)B!%
> !"% MDN# )! ! %% 9;3;3 S933T A;3;3 SA33T#
0>O%%P#!&>!!&/5%%
%0&&0#>!!!)%&
&%!#> MD#JN/-B"#
!%%&!%%M#DN@
@%&0;%&%/
# 5,' %%%% *
-20)%%!!>&%%%"
&/%%>"%!"S#)#
"T#!"@)"&&&!"#%
! & /C%%% !>% !"!) "
!;#&>"!!!&!%
M,N/ !%%&?;-?;%!/8!!!)
!"%!&&)"&%&�!"!
&">% # ! &&& )
"#!M#,N/=>)#!#"&!&&
&?;-%&&&0!%&/
;&"%!%""!"!)!%"
&%"&!&))%!/ !%)
"# %! !" %) 0 " # 0
%" " MKN/ A ! # ?;%! J SF3373A ?;-JT !
!>!&&?;%!%MLN/'&&!!
!#)MLN/A!#;
%&&?;-J<%!>)"@#
%/'"#!%%>!%&!
!&!%!%MLN/
!# ?;%! ! && & & 0# >
!!%&&>!&&MLN#!!
& & 0 %@ % & " %!" # >
)&MLN/A%#!"&%%%&"!
@%/C#"!)%!%%&#
%" ?;%!# "/ ! &! ! ! && > !
&%%%>!!%%#!&&>!&!
& @ MLLN/C ! ! # % ! ! %
! )) ! & " " 63 ! & !"0#
!%%!"!%&"%%MLLN/A
>! !# ! & ! "# " %% ! !" & !
&!"0"!&&&?;-JMLDN/ !&&!%
&063&/
A"#!)%%)&?;-!)!!&%
! "# & ! )# 0 ! ) !
& 0 % ! # & %/ A 63
%)%0>/=>)#)">!!";%%
%& ! MLJN#)"!
!!%!%&!%%)ML##LDN#
&& !%% !" M#,#D#LN#%& !
& !%% ! ! / 0!
&!#%)&!63&>!!
!"&"%"%)&&!
!/
!"7 44
!S7AT"%&!%&!B
& ! )) & ) / 7A % &&& & % !
)&!"#!!)!%%ML,N
• !""/
• #%&!!%&&/
• 9!)"&!"/
C&!)#!7A"%&>%%
!"MLKN
• $!0>)%&&&&!)/ !
% "! ! )/ ! & " %#
"!>&!7A#!#
@>! ! & !7A " &") !! ! / !
%#!&!%)!"#
!!&&!&!/
• $ %# ! > % " % ) & !
%&!7A!!"%!/
!>!7A%"!!!&&
))/ !# ! !& ! & !
%!""&!7A"ML,#LKN/
!"7"! $,/#,
!%&&%!!#>!%%%%/ !
=-&!&&%%#>&;)/'"#
%!B"&#%!%%
MDN/ !#!%%>!"%%"%%%%/
L
3%%%!!&%%!%&
>%"MLJN/A!%)"%=/A#
)" ) %=L )" %=J MKN/ 3% % & %
!"%!>!!%&">!)%% >!!!
@"%%)"M#DN/
'!!)!#%"!%S"%#!""%#
@"%%T>%"!%/ !%
@%"&/ !#)!#%=>!%
/A#!&%%#!;"#&)
!"&"%/AB&!!""#"%)!!"
!)&MLJN/ !)%>)&&%%%
SJQTSQTMN/
3 % % & %% "%# !""% S
%T#@%%@"%%'6/'&!!>&&%&"
!!!""&&&%%/@%#"%!!"%&"
!%%0@S"T/A#!""%
)!"%!/#!!!#!""!
#"MDN/ !%%>0"@%%#>!!
;"!)&!@"MLJN/
6! @"%% !> %&" & && / C !# @"%% '
%&"%!>!!"%!!S)##
T/C!!!#@"%%6"MDN/
D
)$ 6
:6 2, 2 %$, 5&2,
3% ') %% "#3!#5#
'%
5%%
&&
"%%%
"%%% '5" C%%
-!""% "% %% "# %#3!#
#5C%%
"% %% '#7"# C%%
-@"%%
' "% @%%
-@";
9#
5#A#'
-@"%%
6 "% @%%
-@";
'
5"
-%" % "# %% 0 " %%
>!!"!;/ !)&&!"""!
%& ) @" " >! %%
S%%# %%# @"%% %%T MLJN/ ! " !>
!!&&"&)"%%MN/)#!!&%&
!"" "# !" %% !
%%STMLJN/
;D
J
!"7"3 ,#/#,
%%"
#"
!! %& !;
"#&>"
&!"
%MLJN/
&
"# " %
% ! %&"# !!
%& 5;# !
%&"!!@!MDN/
!#&!!!
&!%&"
! /C !! !#
%%S"%";%%T!>
% ! ::
%""33 #!:%&%%&!/ML,#DN/
C!%&!"%&
"# !" %/ !% !!&& %
!%&"/ !!)!>!))%%%&"
&!%>"S&"
))TMDN/'"#&!#%%!!)!!%&
>!)!!&!!""&)!"&/A&#
!"!Q&!%)%
%%MLJN/)#0>!%%!!
&/ "!0"!@%!"MN#!
%>"!)">!"ML,N/
# 67
)
,
!"; 93
!-; ! &B" & !
/ !" >" >! ! & & # @"
3!"/ $% & # & # !" & % &
"!!>&!%!&!&";0
) !%# ! :>:@%&
" %/ A # ! "%"
% %% ! % ! % %# >!! !
!&#%)"MN/6&!&#!
)"%%&!"&%)%#>! &
!!&!%!&M#DN/
# $' $
!)&%%@%#>&&%!>"!
!&!%&&
!!!U!%#>!!!&&&!!!!%
>!/A!&!%!>"#"@%%!>
) ! MDN/ A ! # ! ! ! ;"
&& % ! -; %" ";0 !# !"
@%%&##&"#;%%#/!
# ! -; ) %!
)MN/!#!&!%#!%&
K
"!>)#0>
! : S 4T#>!! ! %
% & ! % %"
MDN/ 4 ! " %@ &
&& % ! 0
! !! %
%!!"0MDLN/
A!"&# 4&-;
" & ; " &
#!"@%&")%
""MDN/AB#!
) & ! %
%!>"/
'"#&#-;!)%)&!
& MDN/ 0 ! "
S&">T!"0"#-;
%)!&:"%%MD#DDN!)
%!/
A#-;&@& &! &%
!#>&&%!%!"&!
%!/
!";"! 2932%%,-5&2&%&25,
>"# ! ! & -; ! & &
)S;QT&%%&!!$G&S$T
MDJN/)@"%@@!%)>!&&%
&!#&&%&MD,N/A#;
%% && ) ) & >! ! -; #
% ! )% & ! >;&& "# ! %
# .$' 6%
*
!>!%&%/=>)#&;%%
&&)#!>&!!%%"&!%/
!# ! %" & % & % & ! & "
0> ! "# ! )& @%
"&&%")&@%MD,N/ !%&
#%">!@)!&!"#0
:" % # >!! &!%%& ! !& !"
/
# )$ 3
'>!%#;&%%)/A!#
>;&%%#A; &;SA T#!%)&
! ;%% MDJN/ A !; %%
% %& & ;& & ! "% MDKN/ A# Q & A
%% & -; !) % !
)% &">! )" ! ! ! ! >!
%%#&!!")MDJN/
3 4
?;S?;-T%>!"%)%%/A%)<!!
3-!"5"#>!>!?;-%%!%)&&&!
%"/C!!!#>)"&%)&&&?;-%%!)
! " /=>)# )&& & ! %% "
%&!">!/ !&#!!>)
%)%&?;-%#>"%)&&&?;-
!"" )/ !%%#?;->%&#
)")"@%/-;#)&!>%"
&!0&/
7
!!%!)>%/"#%&"%&!
) @% @%/ "# & & )"
)"&?;-%/
7"! <9
7"!"! $1#&6892,
A)!)")"&%!"
%@@#%&%/A!#!&!@%
!!%"?;-!)"%%/
!%&%%)"!MJN">!%;
&>0%&!0%/#%&0
&S@#T)0&/'&>#!0
00%S%=/DT>!Q%%%
! % & >!" %/ '! & & S @ #
T"%!%&/'#%/ !
%>!>!&/S%=/DT&@
& /8! & % % # &" !
%&&S,#L#%=L/T/ !
%!-5;D6!%)">B>!!&&
&!&!%/
%!-5;D6S7=!5&T;&;&@!
@!%!"/!%#!@&%/ !&#
>!%!#&!!
!!#!%B0"%!!
>!>%#)!!!%&!S!>T/
# * "
!!%!"%%/ !)&!>
5 ! &> > 51!/ ! & % > "
%%!" S,T $;3'7/ %#>!@%& R;#!)
>!#"R;&"%&!%/A!&!!
#)%%%)/ !&#!&!>&!
@%%!&!
$;3'7 ! %%! / ! % :
%&%#@!!%!"/
! @! S7
=! 5& T > &
@! !%!"/ ! ! %
&!;-=;C;/ !&#%
>!%)!>!!%
! % >! )
!!>L/6&!
% %# B >
#!!!%!%&>
%/5%
>:!/ !&>>
51>,&& S%=L/T
>! && &
> & !% S&&' L
*7 %8 ,
5% 5%
'* .&// '* .&//
L L
L L L
L
L LL
LJ
#&&6/7!> T/ !&!%>
"%%!"J,$;3'7/ !&%>%
&!"SI;#I?;T#&&>"#"%!/
# ( ' %"
$"%&%/3>
" S;0$>! ;&&# AT !%)">
/ !%>)&"%5&%
>5&L/!""0>,;
!!">>"%&LW-/'!&!%%>#
!&&!)!%&!@%&
"%!#>!!>"&&!/'& !%&
%#!!%"?;->;W-/
7"!"3 ,,,,/892,#&6
!&%%"&&&%%!>/A&%#$;
3'7!%%!>!>%)")%&
!%&!0%/C!!!#%B>
L
& & %" & / L % % %> ) %!%!
&&S7T/ !#!%>%")"&!&
> % # >!! B" > ! B
S33KB"#'%%6"T"!&&
/ !!!!B!0 !"
!&%!"!"S3A -0 T>!!;&!%#
&>!3A -;0)&!%#!
)&S%!"!!"3 =T>"/ !#!3 =;
&"!%!"!&&!B%"S;
-;T MJN/ A#!%>" !%"& %>!0>
& % " / ! & ! >! !
@&&&!%!!&!%"
!6;5 >S "#!%>!!
&"/
7"!"7 892,5$,
%>! " ) %
!/!#)&&&?;!)"!""&/
!&# &%&>%&/ !&>!!
%)<!!3-!"5"%&!"
"3/MJN/ !%"))!""%
%/'B#!!""&&!%"%%
&"!#%%>!/!%:#
!%%!>/
"#>)LQ&&15%%>
!! L/'&>#!@>
JW-&!/8!!>&!#!>"&
"%!/ !%>>!>!>)%/'
#;%S%"%%T>/8!%!!!
%#!">)L&&
D
15/ B"# % " > && S LT !
@&">&!JW-/
(9 /%
:6
5,2#
&$ #6
5&2
&
%
0(
3% ///3
;
'!3J 1
"% 3-* /// 6)% 8! J 1
'%!;
-!""%
/// 6)% 8! L 1
-@"%%
'
//J/ 6)%;
'!-KD, 1
///D 3% 8! DDL 1L
'&#!!"">%%"%!%&L
>!/8!!%&!B!#%!"!&"&
S3T#%!#>&&/L>
%&!/!3>&!"%%&#
)" >MJLN/"# !%> & "%!/ !#
>!% ># & "%! > % >
%%%!>;W-/!%&>
"$;3'7/8!%>B#!">)%&
/
J
7"3 <944
7"3"! &%&25,
&-;S$X#7"T D/C!>#
&)")"@%>")"&"#>!
L;DQ&&>!MJDN/'!%#&S$
%%>!Q&6Q&31T>)&!!S>!&L
#T>>>!>36/B"#"%>!!
>JW-!>!)/'&%#>
L5 & 23 & / ! %>
)#&!>;%!%/->>!!@X
SC&TLL1/"#!!>%0!
!&JW-LQ-C/
9 $'
5&2 /5, #6
$G&SYTZ7'Y $ 5&!
)#!) 6 5&!
3;%"S#(15T 31 5&!
$G%!%!;&&SYT 36 5&!
"%;$ 'S/LQT#%! "% 5&!
7"3"3 ,,,5$52
8!>@%#-;>!>"!>%&!
///=>)#;%&!>%&#!
&!@%SDT/!#&!#-;
> / %"!" %!! !! % " S6$ T
%;>%S6$T/C!>#>%>/
">JL1!> >!K[5&>!
,
L[5 !%/'&%#%>
&JW-LQ-C#&;"&/!"&
>"&!@%/C!!!#!>%&
)"!"!>!%&@%/!#&"L&%
!>!)""&%=/
# :
7"3"7 ,#1%%%22%,,2
- " %%! % ! >)
!%/A#%%&
!:&;&!>&>!!0/A
#%%!>"/ !&#%!
S 2T#!!!)!!!:%>"
"%!%"M#JJN/
\'%%Q31%%$
\6!QA; &;31%%$
6)"@%
\'%!6!Q6Q31%%$
%@%
K
# "0 % "3
2>>!"S2;#$%-%T/ !
" >;0 ! )/ '&
B > %# !
%& ! # ! 2" !) !) "/
2"!)&0%"!"!
&!S/T/ !%B
%&%#)"%%!
&!MJ,N/AB#@%]^/A!>"#%"&!
"#>!> 2))&!!%"))/
7"3"; %+%#1,#1,,,6
'0%!%!)"!%0&&&&-;
";0MJKN/ !&#!">!%%)%&!
)/'0%!%!)"#"%%
"/MJKN>&>/A0)#!>,#!")
%!%!%&!%;%!"%!%!#%%;%!#>!!
%%!"L/
# 34%%36
'0%!%!)""> "%"%&",#L&@%/'
%&%") J/A&"#>%
@"%/B"# !!> >>!%;>%!%!;&&
>! S36ZT/ A" &# ! " > "
%!36Z!%!&L[5&&&/ !#B
&L[5>0&!!##D,/2B>%
>&%!%SL[5T/8!!%>#!%
>>%%&%L/
&%;%!&%#)>%!@%
/
"; %
%& ,2#
%;%!"
%!%!S%33T
'&!#L-->
%%//L1&%33>&:%=K/L/ !
>%&!);!""+W-
/
-&& ;=-L-S%=_,T/
2&& )%33)&&&>@S%=K/T
% /LC=/
7"3"= ,$1//226/,&9/5&25,2932%%,
! > %& % ! &&" & ;& >! !
&&&&-;SQ%%&&)
6T/ !# ?;- !"" > ! &&
&&/
3&!&!@%>L/-&&&!
SJ,T,Q&&/-;>
///// >&>)!
@%!#;%%&$%%>!Q
&6Q&31!!&!/C!!!#;&#$
>!Q&31>%!$>!Q&; &;SA
Y#5&!TQ&31>&!/,;>
)%#!%%!>/!#
% & > " ! && " ! & ?;-
)S'LJ,#T!!""S%"%%%%T/[15&%#
%%%"%%>%%%!&/A!&?;-#>
")"&/C!!!#)>
)!&&&!&"%!&&&!-;
/!>/// %!>
)"!")!!:)%#0%!%!"
>%&!!!0!&&/
7"3"> ,$1$#2/%&165%6,,,%/&2
-;>@%)!""#&#!>!@%
% S"T/ !& ! "> !&&&)!""
%"/
3&!&!@%>/-&&&!
SJ,T,Q&&/-;>@%
/////;&>%"&!@%/ !&#K[5&
$%%>!Q&A Q&31>!#L
[5&$%%>![1&)S!%%%"%%TQ31
>&!%!/!>!!>
!/// %! >)" !" &>!
)&�%!%!">%&@"
!0!&&/'@%>%&%/
! @%# -; > @% ) SC9'T %"%% 1 ?;-
!"">!&&%%!S ,T>!!?;-!)
&&!)"&!&/
3&!&!@%>J/ !"&&&!
DQ&&/-;>!@%
/////;&>#>!K[5&$%%>!Q
&A Q&31!!#L[5&$%%>!Q
&31[1&?;-!""1C9'%"%%!%!/
% ,"!>/ >#>!
@%"0&%/ >%)!!&
&&&C9'%"/'%%!LD>!!?;!"">
!% !-;" ) &C9'%"%%@%#>! ! !
%%!%>/ !%%>)!)"%&!
&C9'!/'"#J,!)"C9'&&
>!?;!"">!/!#>%&
!&%!&!"!!
)&!/
3 % &' % %
5 5,2# 6)9? 6@9!; 6!=93!
! -' $ $ $
3 -6 C9' C9' C9'
7 -- C9' $ $
; -$ $ $ C9'
= ?;-%"%% C9' ?;-%" ?;-%"
> ?;-%% C9' ?;-%% ?;-%%
? @C9'Z?;-%"%% C9'Z?;-%" C9'Z?;-%" C9'Z?;-%"
@ @C9'Z?;-%% C9'Z?;-%% C9'Z?;-%% C9'Z?;-%%
)!B&!!%"#!@%&0"
& ! ! :)%>)"B2 ;3-2/6# %!
> )" >0 ! %" )# 0
%!%!">%& !0 & !@% ! !&&
&&/)#%B&&">%&>"!
!"!0!B)/
7"3"@ A&/2
3B&>&!&!-;#>!&
%!&/A!>#B&>
@%B)&%/%&&!"#"&&
S2A3'#T:!6-'3'"*S !&T>/
!6-'%"0!%"&!S6-'T-Z#>!!&
& ! & -Z>! % 0 )/8!6-'
%%S-ZT%%%!LD/ !
%%!&%%!%>!
)>!0>%S)T/
# 5 1%: ,$+ %<3
!@%# &%B&>% @"%/
B"# ! ! > > >! %;> %!%!;&& S36T/
A"$>)&!!L[5&"&&>%
!/'&L&">%%&/8!!>
; JK W- % B&/ C " & "# % > !> "
&>&K23&L/%>!%>
!>&:!0)%S;
[15T/ !#[5&%>@>![5&>0
%# >!! B" > % %& !0 & / ! % >
&!JW-/"#>LD/
7"3"B C#,,C#,
A"&&>"/@%&!%!
%:S%!5&">&@T/=>)#!%%!!
& & ! ! ! ! & !
& ! @% & ) / A B# ! & ! @% >
)!@%&#;;-;!!)%;
L
>!C9'1?;-/-;#;%&%&%
!!!:%@#>!!!:&!%%"
// %" MDN/ A ! @% & ! ! %
B);%"!SB2 ;3-2T>%&/6""!!B
2'%$'")%#!$'%&>!"!
"&!&%&/'%&!%%&
" # ! & ! !! & ) && & !
%& S!! " -T# !> / !&# ! &
@%&%&&&!-&%&B
%# " & & ! ! !!"/ AB# >-
)!!@%&))M,N/
# 6+$44$ 3
D
7"3"B"! #&/2
@%#!>>!C9'1
?;->%)":2'@%&/ !
%>>!!2"*SHT"&>
%&/6&"@%#!!&-;>>
&">!>!36/ !#36>)L[5&
" && S25 T > ! % !/ '& &
">!/'&>#L[5&
J Q ! S 2;& >T > ! " !
%>@"%%/B"#%SJ[5T
> ! 2" S%
%%& T > ) " )
" J [5 & 28&& 23&&> !
>! % & , @ &
!&!/%%"#&!2'#&
%&&&@%
!&!/'&#[5&
2;&>!S%>%%&T
2'>!&,@)#
! % &" @ ! 2' & !
#!"2'!
:>&%/'&!>!%#
&&2'%&@%/3%%S6T>
2'%"S'D1',T/!#2'">
"%![5&D@$'"S !&T[5&2;&
>>@>!%&[&2'/ !#%>Q!
>>! ;';$ '&&/,,2'>)>!F62&
$'SA)T/
# 4=%
J
7"3"B"3 2,61,,
2)%&2'>"%$'"!0S6;2T/A&>>#/L[
& 2' % > @ >! ! ! % & ! 0 &
/'&#!@>7'%3-2"KJ!"S'%%
6"T &>!% K/ !$'> ;W-
%>!!>>&/
57 9=%
#&'D* '*
L L
,L L
(&
7"3"B"7 A9
C2'!$'"!#B2 ;3-2%&/'&#>!
!!B#&@%/AB#&
% # ! % & ! S$' %# $' %"#
% @" %!%!T/ B % ) ! %/ !" !)
&%! ! L<; & % B! ! <;/ 8!
&%!B!%@"S%!%T#!B!
!&%"!&/=>)#>!!%"%&$'B#
@ )" ! % ! &%!# >!!
&!B!%@""M,N/
,
69 14'+$4
25$# ,
7'3$=7"!";;%!%!
!"2&M,N
'- 6 ?; 2&M,N
C-5 C !:%%!&
&@M,N
-5$ -; !:%;&%MDN
-5$ -; !:;&%MDN
A!@%!#>%!& !!&/
)>>&!0"))!&
!:%"/C!!!#@%&%S&@%T>
! ! 3-2 % S'% % KD;>T/ 2 ! %
%%#$'> #$ '&&/ ![5&$'!
>!K[5&3-2@>!>&3-2%/ !@[5&
;%&%%#[5& B)@AA,[5&2;&>/
8!%>>!%#0#!">>!'%%
!)&&L23/ !@%%#%
> %" %C3 2; 3-2 " ! > @
!"/
7"3"B"; %6,,
) &&> & -) " ! %C3
&>/6#-)& %>! B#
&&" % "!8/ 3&&& M,LN/ ! ! & )
B& % % % & / A B # 0%
&0!#4 %&#%)"/
K
010% 1+$4 1
)#&>7%!33&>";>"'C9'>!
$<%!!-)&%/&>%
^+`/L#^^+`/#^^^+`//
7"3"!) ,#,&5,5212,/,5##5,
'@%!#!!@%!%&&&&
)%%&& &&!"/"&!&&/
=>)#&!!!0%!/A#"&!%%!
& && )" S ! ! T &
%!/ 0!&!#!&
! " &" >!! %% %% !! ! -;
"!%&/!%%&&%>
?;-%%%"%%/A#B!%!"%">
&!%"&!%"%/
2%"#-;>>! !)!
/////3&!%"&!%%
>J!"!"&%>!L;DQ&&/ !
&& !>$%%>!Q&6&Q31 !
!/ ! > & "/ %! 0
%!%!">&!)%&"/ %
">%&"&#!%>%
&&&&M,D;,KN/!@%#&)#-;>
>>!%;>%!%!;&&>!%!%!S36ZT/ !#K[5
L [5 & %& % && S T > %
!#%)"/6#!&&%!![15&?;
-!""[&&">/ !#&%#>!!"
"&-;"!%&!
!&%%0""/'&%>!!
%&%&&#!">%0!&!/8!>
&!#&!!>#!>>>!36Z#B"
)S$%%>!Q&6Q&31T>!>
&" % > ! / 5& "> &@ > "
& S@ & >)! ,L # & >)! L, T & !
!!>&!%%%))M,,N/
'"#%!>&&%@%
!0!&>%"M,,N/
# % &'% %
3!%!;&&>!%!%!
=0G>!
S%%>!=3T
=0G>!
S%%>!=3LT
7"3"!! 99(C#,
% @% % ! >
%% ! ))
% !! ! -; "/
!&#!&!@%>!&
&!%%%"ST>&
! %%/ % !''
S>/T&/6&"@%#%%
B"!
1/ ! & ! !
&>!%&/ !#%%
&!!1/
6& : % @%# !" >
%; " %! @ %&"
%%/!%%#C=56
S8T>#!>&#
)!5-1/"#>)
>!)&!S<%">5#
!)_5T%>!)&
@ & D Q Q & /
'&># ) & Q & > &
B/'!%#[5&%S%&!
% @%T > / B"#
)&Q&>>!!
/ "# /L 5 & & D Q
Q&>>!
%%/ ! & % > "%!
;W-&&!"/
@%# ! %%! &> > B
!%!" %"
%" S5-;A;1T/ % &
$!
# );$'07':>:
%!@>)L[5&Q&#[5&!B>
' 33 A$ Y6;-, S3!@T ' 5- " !
%&!%&!%%&!!"%!"!"%!"
!!!"%!"S);%!!%!"TMKN/ !&&
>/LQ&S&&'T@&Q
/LQ&S&&6T/
8 ' %
.&//
L
, L
,L ,
KL ,
A"&%%&!5-#%=- (3 )""
S60$TB%%>!%"SAT%%S1T
%&!%%%"/$!%A%
>!!%&"%"&!%&!%"/%%)%
>!!&"/AB&)%#%)"
! ! ! %/ C !) %%# !"
/ ! % % " ! %% &
%&&!/ !!
"%/"#>"&0>)
0%&%%!/
;
;"! <9
;"!"! &/2/892,
)")"!%%?;->%&/!%&%
%; ) % > : & % & %& " @
!%!"%!-5D6S!>T/$!)%%%!I;#
I;?;"!>#!&&%"R;>%&/A
B# > % S' 6T ! @ & I;# I; ?;>
:%&%;@!/$!%#?;
->"&%# &>"!%&!&"/!# )
!!&&&6S,#T>:&%'S
T%6SLT#%)&/
Time (min)
Ab
so
rba
nce
(27
8 n
m)
8 M
ure
a, 1
M a
mm
on
ium
ac
eta
te (%
)
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0
50
100
β-CN
αs1-CN
# *+ $; ,. :'
$? : "3
3: !: @AB' @&'$=A!
%C'@C'$=A9'+80 &'$= # @:A
@&'$=@A&'$=@A! %A
6T'T
# (+, $; ,. :'
$? , : "3
3: !:@AB' @&'$=&'
$=A!%C'@C'$=AC'@C'$=A9'+80 &'$= # @:A
; &'$=&'$= !
%
'&L#&&&&6%)
&#!%%0!!/A%'#?;
>>&&B&#?;-ST?;-ST/ !>
!!!&%&!%0/C!!!#%6#%0
?;-L%%!!/ !%0>%"
)")/B"#%!!>!!&"&
?;%#%"&!&!>%%
!!%/C#%6!>!>&!>&!?;-%0/
A!&&&?;-ST#"%&&%!%!"&#
)&!%/!#%6&L!>!%!
%)%'/-B"#!!%%!
&! % & !?;-%0 !> ) % '/C ! ! !# "
%!#B>%&%"&!%/'@%
@%D#>!!!>%0&!&J&?;-/'&!
!&>!!?;-B)/
'T 6T
L
# &'$=1 %@D2EF2
GA7@A "=' &'$=@40;00;=A# &'$=
: ! &'$=@A
6T -T
$T T
T 7T
'T
D
6#>!%>&B#&%"&%>
>!"%"/A!%#?;->"
!>KKQ&!%/
;"!"3 892,5$,
?;-!""# >%&/ !!
&>)!""%&"#%%>&
&#&>0&%" S"%#%!;
!""%#@"%%'T>&&!&
?;-/J!>!%&!&&/:
&&& & &?;->!%% &
!/C!!!#&!>!)%
" %!# ! > ) & ! & >!
% "/ ! % & !"" > ) >! !!
& %" !%:/ '&> >!
%& !>! %# @) & ?;-/ A
#%>!!%&!&%"%%
>"!&! >!%%/
;"3 4 9 93
A%!&&"&A 6%%&&&&
-; # , & @% > ) %/ !# ! % >
) %& %! &)& !&& &?;-C9'
S#%"%%%%T! &%!/
# "9'+80
&'$=#
&'$=%
J
β-casein (ITS)
Time (day)
TE
ER
(Ω
*cm
2 )
0 5 10 15 20 25
0
200
400
600
β-casein (FBS)
Time (day)
TE
ER
(Ω
*cm
2 )
0 5 10 15 20 25
0
200
400
600Control
Intact β-CN
β-CN polypeptides
β-CN peptides
# 3 .$' &'
@&'$=A 9 @% 6'32 H)! % 5'(2 H! % '2 HA I 9 '
J 7 '6J
@#,A
, K# ! " & ! "# " !
& 2 )# ! ! & ! %" & !
! > %"/ !# %! , ) "
0&&&?;-!"!/A#C9'!""!>
&&!&!-;""#!>K/A#
C9' >! %"%% & 2 ) & ! & !
@%%/6#!&&>)>!! A
6#%!&K/
Ovalbumin (ITS)
Time (day)
TE
ER
(Ω
*cm
2 )
0 5 10 15 20 25
0
200
400
600
Ovalbumin (FBS)
Time (day)
TE
ER
(Ω
*cm
2 )
0 5 10 15 20 25
0
200
400
600ControlIntact OVAOVA polypeptidesOVA peptides
# 5 .$'
@-KA 9 @%6'32H)!%5'(2H!% '2HAI9 '
J7 '6J
@#,A
'T 6T
'T 6T
,
C!!!#!)"&0%!%!S'53T!!
0&&&&-;MJKN/%!6!>#)
!&&>)>!A %%%&
)#)&%;%!",>>&A %/ !>
>! % & % S?;- C9'T/ !# & ! >0 & !
@%#&!%;%!>/ !%>)
%>!&&%/)#%!'& !
)&!&0%!%!)"&"L/
Control (ITS)
Time (min)
p-n
itro
ph
en
ol ( µ
M)
0 2 4 6 8 100
200
400
600
800Day 8
Day 15
Day 21
β-casein
p-n
itro
ph
en
ol ( µ
M)
Day
8
Day
15
Day
21
0
200
400
600
800
1000
Ovalbumin
p-n
itro
ph
en
ol ( µ
M)
Day
8
Day
15
Day
21
0
200
400
600
800
1000Peptides FBS
Polypeptides FBS
Intact FBS
Control FBS
Peptides ITS
Polypeptides ITS
Intact ITS
Control ITS
# )6 @HA @;+A%%%3!(
$' ' @ J 7 A '
@6J '#,' A
&' ! % % 0 ;+ %
% @!*! 3A;+3
K 7@%A #,@%A &'
'T
6T
K
;"7 44
A /# >!! !>
) % & C9' %"%% %% %!
)#-;>@%C9'!""#
%% S0T ! &> ! !"" % ! C9'
%"%%&"&!)&&">
"!%&)"/;&>%"&
/!>!&!&
&C9'/ ' & % & >!
%%/=>)# && !%"
>)/>!%#>!:C9'B
%>)/
! ) & %! &
/A!>!C9'%%%"%"%%
%0&"/C!!!#!
) & & ! >! @%/
Time (day)
TE
ER
(Ω
*cm
2)
0 3 6 9 12 15 18 21
0
100
200
300
400
Pepsin control
Control
OVA polypeptides
OVA peptides
a
b
b
# ) . $' '
)66L> @-KA 2%+
-K % 9 I 9
@H)A-'%=-K%!9?
MM3N66 !MMMM3N6666 !
# ) 9'+80
-K
#
-K
L
# ))@;+A% ' @L:A;+%
% 3!( + -K
%9 I9 @H)A
!> &0%!%!)" "%&",# L&
@%/C!&>0&"#"!!%!>!!
)&!")"#%"%!%"%%%/C"L&#
)&&&!>#>!!">)&!
%"%%%/!#&%;%!>>!!
%)",/)#!"%&"!>:
!)&%;%!%%"L/=>)#>!"
&!!"&"%&#)!%%!
>&&)% S &%;%! T ! ! &
>0&#!!"!)0)!&!%/
L
;"; <9 449 93
! & ! @% > ) ! && & ?;- !"" " & -;
"&!@%)%"%%#!!%
%" S /T/ ! %% && @% %%! >
%"/;&>!@%/
7%!'ST!> 2)&&>0&C9';!&>
" >0 & ?;- !"" %%/ 7%! 6# ! && & ! >0 &
%%&@&?;-!""C9'%"%%BS[15
C9' %"%% Z [15 ?;- !""T/ A & ! %! ! !
%">!%"?;-/
Time (day)
TE
ER
(Ω
*cm
2)
0 7 14 21
0
100
200
300
400Control A
β-CN polypeptides
β-CN peptides
a a
Time (day)
TE
ER
(Ω
*cm
2)
0 7 14 21
0
100
200
300
400Control A
OVA+ β-CN polypeptides
OVA+ β-CN peptides
a a
# )* $' '
@ A O$ P B'$=
%@)66L>;A -K%@)66
L>;A 01 1 @)66 L>;A -K % &'$= % % @% A
)9 I9 @H)A-'%=-K%!
9? @%AMMMM3N6666@A
'T
6T
L
# )( $' '
@ A$ $ ,
-K@)66L>;A$ $.-K @)66L>;A!
% % $ 9
! % -K @)66 L>;A 9 I 9
@H)A-'%=-K%!9?
@%AMMMM3N6666@A
L !> 2)& @" !@%-6 %
!>>!C9'>0!%!>%)
@% S//T/ -- !> ! )& ! ">!
%%%>&&>0&C9'!/"#$>:
C9'"!>0&&&%#>!)"!! 2)!
!) Sa,]^T/ 2)& !% # ) !C9'
%"!"!)"/
!"#-$S"T!>%;)&S/DJT/
C ! ! !# ! !> %;) ` / ! %) >0 &
S"T/
D !> ) & 0 %!%! "/ A ) ! %;%!
%"!&!>0&!"/'"#>!!@%
& - ! !> )" " # %;%! % % & !
%!!@!"&"%&/A0!
!> " >!C9' S "T !> > ) & ! "/ A
L
#!>:?;-!""&C9'@%!>)&%;%!
)"!S'T/
# ) @;+A % ' @L:A 3
%( 9 I9 @HA
2&@%!>J/&!@%>
)&-;-;/8!#-$;=@%>
"&!S!>T/$;9=2')>LQ%
!>>!C9'%"%%!>!%&!@%/A!#
!>%"C9'%%&>"?;-@%#%
Q!!2'& !%;&/C !!!# !&$;9=* S
%";& ! :%T &2' )>)
"%!>>!?;-!""#>!@%/
L
!
!
# )"44= $;9='$;9='* ) &'
K $ %
1% $ @H)A-'%=-K
9?$ M+N66(!MM+N66
MMM+N666
"#,%"%&%&!%/'!!"&)
!&>0&!@%#%"&!%%/B)
%B&%/
"#"
"#$
%#"
%#$
#"
# )34 @>;A1%%% %"
9 9 @HA
LL
;"= 4
% &> " %" @%> %& ) !
& ?;- % ! % %!/ -;
& " ;%% > %" & %) /
%""0%"&@">%"
!>! % B " )%/7%! ' S KT !>
0%!%!)""/')%;%!)SaD[T&!
!);%%>&/
Day 21
Time (min)
p-n
itro
ph
en
ol
( µM
)
2 4 6 8
0
200
400
600
800
Time (day)
TE
ER
(Ω
*cm
2)
0 3 6 9 14 21 22
0
100
200
300
400
500
After
# )50 $'
% 9 I9 %
' @L:AK % @H)A
@H5A$O P % %%
'"# 2)&">&@>!&"/
7%!6SKT!>)& 2)&%"&"%%
"/!# &&&">&@%!
% @%/ ! & !"# & " ) ! %
&">&@&%!>>!Q 2)
%"!&%@%/
'T 6T
LD
2%"#%%!$>&#%"&!
% && %%! ! > / -"# %% > / =>)#
%% &>> & !% !">
&&%%!$#&!%"!&
!!&%%!/
&2/6%%0E
,%%21
'F*
.&2/6%%0/%&C
/L /DL
/L /,K
/ /L
0; F# @JA
@H)A
%
LJ
=
="! <9"#$"%&'
! !%!%:!<
!MKN!3-!"5"%&!%&""
3/MJN/&%!!>?;-%"%>!
%!"M#DN%"!!MK;KN/
A&%#!%"%%&!$;3'7&!&#
0> ! %% % " & %" " % M# DN/ A ! #
! / MKN & !&?;-"%% ! &!&
#&>!!!%%%>&/6#
! "# > & ! %"" ! -; & ! %#
";!&!%!>"%%)/
!"@%!%&!?;-%"%%!>&!%:
!))"!>!!!&%"MK#KN/A#!&
?;- $;3'7 & >! % "> >!
%&!>!%#%&!"!)
:"%% @ & M#DN/!# !>!
%#!!>&""!
!)#!"!!")%"MJN#!%"%%))@%&
;%/
C ! ! !# % ! %! && &
! & % & # !" " ! @ & %" &
% ! >! & % & / ! #
! & ! & % "/ !# !
)&&&& !%!!/6)
?;-%!!%))&&%&
)#"&%%)MK;KDN/
L,
0!&#!!&@%
%))&!MKN#>!!%"&"%!!)
) % ! "/ ! %:# %& ) > ! >! ! &
% &)"@% !>%)" !3-!"
"#!>)>!>)"&!%!%
!1)%%B">MK#KN/
="3 4 9 93
!@%>)!&&"&A; &;#;
&%%# %!)#>!! &)
S6T%%/'%)"#6)"%@@!%)
>! ! " % & ! >!# &&# / MD,N ! #
%%>!;Q&6!"&-;MDJN/-"#&
6%"!%>/#>&!
%&!MD,N/6#&%&%%)#!%"
0>%&6%!!%&!
&!#!&&!"!/ !
)"&@%MDJ#D,N#&&!!)>!>0>!
!!"!>%"&!#!-;MKJN/
!#!@%%>!6%%/
C!!!#%)<%:%&!3-!"5"
/Q&& 2)>![1&?;-%%%!&!
MKN/-B"#!@%>)&
)/A!>"#?;-!""S%"%%%%T>
! @% ! / '"# ) >
&&>!@%-;!"%/!#!
!&!;&#)&!%!"/MDJN>
%" A ! @%# ;& > %" & ! & !
@%/A#!%!"/MDJN#6;%%>
LK
&!&;"&!@%#;&>"%%>!
&&"/
2!&!@%#%&)!>%&!"SA
6;%%%T )!% S&&%T#!! )&
>) 2#>!!!)Sa]^TA 6
%% %# ! >! & & & MDJN/ !#
@%>!&)!""!&
"")%/0%!%!"#>)&%;%!>
&%>! A %% ! &>0& !@%# !
&&>)>! %&?;-)/"L#
)&%;%!>)/!%!&%"
MDJ#JKN/=>)#!"!"&&)&0%!%!)"Q>
>!A /
-?;-&&&&#&&>)%!
& % & ! % / !# ! & )#
)&&&!""S%"%%%%T 2)>)/ !
>!%%%@%)
&# !>" & %" MK,N/ !# &!
) !> !%:# >!! !&&& !
-;>&!)/
A#! )!&&"& A ;%%& !&
&&-;"%6;%%/2 2)
&0%!%!"!!@>!!%
!MDJ#JK#KJN/-B"# >! A %% &
&!!&@%&!%:/
="7
!&!">&%)S/T!!>%
) && & ) SC9'T !"" %"/C9' ! %
D
%&/A%!%!";%>!&%%@"L0$
!"0"%%"&
!MKKN/!@%#[15&C9'%"%%%%>%%
;&/'"#0%!&>>
! @% )&" ! ! ) % &C9' %"%%> "
)"&%%/
A!"#>>)&"!)%&C9'!""/"#
&C9'%%">)/A#"&"
!%&%MKK#N/A#$%MKN%;Q&
C9'& /6#!")!)"&
!%>" &!""/ A!)# !
&!-;&!!@&C9'>
%&)&!""#%&%%!&&)%
&!%%/A 0! 2)&!"
&&&#!%%)">&!%%
!@%/
A0%!%!#>)!!&!&&%
!)&%;%!%#>!!">0%!%!
)" %& @% C9'%"%%#>!! )&& !
!"/!#!C9';%%
!>)"&!""&!@%#&!>!
)"L#!C9'%&&0
%!%! )"/ ! & > && & C9';
@%">&!%&/'>&
@%"!0 ! >)" S
! %" !0 L/DT/8!>0>! ! -; @"
%@"!"!%/-;"
!%&&&>! & !)# &!) %>!
&& # !" > && % && %# 0
%&&/-&!@%#&&%"
>!0)&",/=>)#%!!
D
) %) S /T " ! MDJ# JKN ! ! )" & 0
%!%! !>: ! &>0&&&/-B"# >0&
&&!%&!@0%!%!)"!
!!)>!:!&&/A 2)
!%"&&&># ! !:
)%>%!B"&@%!&&&/
!&# && & > %
%/=>)#%!C9'!""0&
!:)%&!&!%&@%S)!%)
@% /T# B" 2 & ! @% !
!& && & C9' !"" ! %" & B &&
>/A"#!!)%&C9'!""
!!@%#C9'%"%%!%&>!
&&)%&&Sa,Q&T#>!)
& & C9' %%# > @ Sa L Q & T/ )#
&&# % [ & %;%!# > ) & & !
% " /)!# ! % & -; >!C9'%"%%#
>)>)&!>0&!@%/
"#!!%&&!"@!
@%L//=>)#%&))%/'!
&!&&%S"T#!"% 2)LQ>!!@%
L/ %;%! > J Q/ ! !
@%&&&%&!&!L/D/
D
="; <9 449 93
!&!@%>!)&!&&?;-!""-;"
!>!>!C9'%"%%#!>%)%"&
S/T/3)&&&?;-%%!))%)"!3
-!""MKN/!#!%!!"")
%""&&@%&!:<%MN/
A!"!)&%">"&&!%!
@%&!:/!#0%!%!
%B&>@"!!0&&B&
#%)"/ & 2"!>!&!%%?;-
!%)"&/A!#>%!!>!
&C9'%"%%!!>0&!"@%"
)" S-T/C!!!# >!"!C9'%%%
)%$#!%!>:C9'@%&!!!
&" " Sa,]^T/ A ! # % !"%% !>
)% & > >0 & && %" & C9' %"%%# ! >"
)%MKN/=>)#&%)S/T#>)!C9'
!)%"")%)!""&S%%T/C
!!!#>!!C9'""%":>!
!#0&MKN"MK,N/-B"#!&&&C9'
$@%!%&"&&!-;
!)"!)& >>0&&&/ A#!& 2)
0%!%!)"!))#&"&&&#"&!
&!%:/
2 & 3-2 # ! ! " % & !
: & > / C ! !) ! &
% %"" " & ! : M,# N ! %)" !> %;
"!0%%%MN/-;!!%;&
%!!@%0"%!/A#;;&!
:%MDN/
D
A -$;= @%# 2' ) > ! ! / -)"#
&)&@%>)&$;9= $;9=*/ A !&$;9=!
! ! %% & C9' %"%% S 6 >!
@&C9'Z?;-!""T!>LQ!!2')!'/!#
%!>:?;-&>0&C9'!%
)&$;9='>@/2$;9=*#0!)@%>"
>!?;-%%/ 0!&!#!$;9=
)) ! %" ! ! ) & 2 /
!# ?;- !"" )) 2' ) & $;9=*/ =>)#
)&$;9=*>!)& 2/AB#0"!
!!:%))@!!!%"
%!@%/A!#!MK,N!)%!C9'!@%
&)!:%#0!/ !&#@)
@%> )>&!!
%&C9';%&/
- 0 %!%! )"# % & %;%! > )
>!%C9'%%/A#")")-'
>!!C9'%%>&>0&!
S-#?;-%"%%?;-%%%T/6&aQ&")"
>&-6#&!)&&&//"#%B&>
%& @" ! & ! )& & #
S%"!& !&&%T/ A!#%&
>0 & @% %" % )# & & % & &
>%#@%L/D/
A"#&&!@%!!&&&&C9'%"#
?;-%%&&&!)"&&# 2)0
%!%!"!>/6#%& 2)>"?;-%%#
> !?;-!"" )&@%&;& !
:%S$;=9*A/A!#!&">!!
!@%&$;=9*!!)!"!)&&!
&@%S>!!&&&C9'%%T/
D
!! "#$%"&'())$"$*$(&#(#)&(
% " &> " %" > %& &" & &
%%&;% /
'%)"#!&)%%)&&&%%
&&&!"/#?;%!;JSF3373AT%%
& && ! ! / =>)# ! # %
&))%/A!%#)>
!!%%!!))%!!"
MLJ#DN/C!!!#!!!%!%&%%
ML#LDN/ #2/ MN % !%&J;
%%&?;-!!-;"/')"#!%M,DN&&!
%&?;-%%%! /A>!!#!@%
> ) !&?;- % ! ))
!-;">!%%%/
A & %# -; % / 2 & 0 %!%! )"
%! " ) & >! ;
%% / A# > !! @ % >! &
%//6#5&">%"")&"&"/
C!!!#%%!"%"#>&
!%%!$>!!!-;"/ !&
>)&>!!&&%&&%%!/!#!!>
!")>)!"/-!
&!@%#;%%!%&)&&
!!/=>)#!!)"!!%MN/C
!#!&%&/A!%#!
%"B% " &">!;;! S1T>
,/C!!!#!>%%!#%
>!""!%/A#&&
%)@%!>!%%!>%
!%"&!/)#%%>"
DL
%"/A!#)%&%&&&&%@@&;
%%%%/
="> 93
A!-;>"&!/=>)#!!!)
& >! ! & " >! ! !! ) & ) ! !"
% % ) &/ A & %# ! %: ! !> !
%% S & ;%%T !) % !
)% & & ! & ! MDJN/ #>! %%" ;&
#-;)%!>)&0%!%!)"/!#
!!%&!/A!%!>!!!
% %" !! %! ) MKJN/ !#
" %&!;&&&#!%">!
!&/ !&#B&&&&
!) ! ! &&" % MKJN/ A ! #
)"@%>! ;&/
%) S"%# &T# !
& " 0 & %% SA & T
" )"/ ! # % % ! )
@"%&S0%B&T!!&
%/)#!&>!"%&%"
!#!!&-;"&&&!S%
T/
DD
+ $",-)$"
& !%:) ))&&&?;- &#
! &&# !> >! %!
0 %!%! )" )/ =>)# > ) ! ?;- !"" >
! @% & $;9=*# ;& ! : %/ A ! # &!
)#>!!@%%%!SC9'%%T%&
&"&!%;@%&$;9=*!)%&/C!
!!#%%"!>!%%!$
)) %) % !! -;"/ !# > ) !
%% ! % & / !&# & %"
!%"&&!!&!%&!
! 0" ) %% ! ! ! ! / 5"# !
<%:#;&;%%%%!>/A>!
Q & A; &; % % & " &
)"@%/!#>"))!&!
0 & " ! " B && %%!/ # ! < %:# &
)" " %%# ;%% > !!
!&&&-;"/
DJ
/ HA'7#4=%:Q/%/
/ !#/#+ #0 Q/
/ 6#=/4/'/2#= #:+%%#8//6
/5/6%%#//%/KK;KJK/
/ ;9#2/2/#$'% #
$$-'$ G#/'/!#/#)6>F0#F#('/
L/ :9 %+ ##$ %#=/$/6#8/7!#3/!#/
K#%6/%/J/
D/ $!#$/7//-#
'2) !#/7%/K;DJ/
J/ @#3//3/5/=/>"#9 % % %/KK,#560
'b3&/J,/
,/ -!"#C/4/=/!#+%'+ :#9 %$ %#
3/>"3//@#/K#%>F0/%/DK;JL,/
K/ *"#'/5/5/6!5#': %#7 %R%:#
/8/7&&!#/#8!3!/%/;D/
/ 3&=/$7&&#$/// ///#()"&7%!#-#9 %
%,/#()"&7%!/
/ 56c2#5c%;=5c#4/4/6/3#;% S#
= T#'/7#/L#d3/
/ = /LU !"N/')&
!%11>>>/0//01%/%@e3A$_D/
/ 3;#6/#$ / '
' 2+9/# :$%&#'!
()"/J/
/ #=//#/#= + $?:U44&$"
#/@?SDT%/D;DJ/
L/ *0# //#//6>#4/=//# '
2 %'/&' 4/$"/#KKSJDT%/K;KL/
D/ =&/2//4/)#+ VW,X4&%b#
/7ST%/,;/
J/ 30#F/8/#, % /K#'#A>8";60>/
D/
,/ 6f#X/#,/')@%"UDD/
,#>F0%/K/
K/ #/##9 %+ /J8!3!5-2-355-/
/ *0#'/#:9 %+ ##/8";60>/
/ =#$/2/$//>#$2)#L/
/ 30#F/8/#- ,$:9 %+ #,
% #F/8/30#/K#8";60>'#A>/
/ C'#93g#/$//C#=
Y # = T#'/7#/L#d
3/
D,
/ #/=/:7,9/LU 7;?&N/')
&!%11>>>/!!/111/
L/ #=/#,+ +0 %,:+ -
-!"#LST%/KL;KK/
D/ 5#6/#7 2
'4-#/BBST%/J;J/
J/ *!#=/4/#,$,:#,$:9 %
+ #F/8/30#/K#8";60>/%/;/
,/ '"#4//X0#:' 3%"=
$>SCT#/>?%/,;D/
K/ *!#=/'/3!#,2+ %A
$"4#D/!>SKT%/KL;KD/
/ 4#3/'/=!#$ )#K,/
/ '0>#2/# /#=/*>0#,$$!$!
$#, % #F/8/30#/K#8";
60>'#A>/
/ 00#/#/#<!= + ,:'
'-!!%"#/;=S,T%/K;L/
/ 5%;@%#A/A/2#+ 0:+2
+ #,#X/6f#/,#%/
/ 6"#/3/#,% 64#/@;&##%!%/K;
D/
L/ >#/'/#/#8% 9 !
%' %'43!"
75)3!"#L%/:%//L/
D/ 3#*/3/# % % /2 ' )6'9$'
Z [8%'+ ' '+ /KKJ#3&!
'"&/
J/ 6!#/$/6#,2
%2%$)#/;;SLT%/K;,/
,/ #=/=/4#:9 +7 + /0
3//
K/ *>!# /#*/'#=/C#$ /$+
# :+ 4&9"#L/=!SLT%/JJ;
,/
/ #=/2/4/7#, 2
% %-3!$#/BSDT%/,K;KL/
/ 9#4/ /#/#4 %% %
%' ,,
$#/=7ST%/D;,/
/ 2!&;0>0#*/4/##
64#/!)@&##%3%/K;LJ/
/ # /#+ 7 Q27%9 %7 #,
$:9 %+ /K#8";60>/%/J;D/
/ # /#% +9 ,$W%+ #,
$:#X/6f#/,#%>F0/%/KL;J/
L/ %#2/#/#,
2b#/3ST%/,;J/
DK
D/ 7#2/4/#6/'/"#$/4/8!#Q% 4#
/!7;ST%/K,;,/
J/ 6#/4/*0#; % 2 64
#K/!)!SDT%/JJD;,D/
,/ 7#=///2/4/#- % 16!4"
&#/@;%/J;/
K/ F%#=/4/0#+ # 8 9:2
- -7"2%#L/!?SDT%/;,/
L/ ;'#C/#/##9 ,+7, #
A4&#/!=ST%/,LJ;,J/
L/ X!#/#/#&'$ '"
\'%'4&3!"";75)
3!""#D/3B)SDT%/7L;7/
L/ -#4/#/#0 %
..'4&3!"";75)3!""#/3@7ST%/
7L;7L,/
L/ 6#5/H/#/#09 %+ !0 %0 !,%W!
$240 $ $ ')#
/;ST%/,;,/
L/ $>>0#'//6#$ #7#= :/#
8";60>/%/L;LK/
LL/ 3%)#4/7/=/'#9 %%%'
4#/!73SKT%/JJL;,/
LD/ C#/#/#7 %''
'"b#/=ST%/JD;J,/
LJ/ #/#9 $ % + #8
%#3//5#/#%!/%/J;L,/
L,/ 9#'#/$/F/ #
#YT# = T#'/7#/L#d
3/
LK/ #/#/#8 #= :/#8";
60>/%/L;D/
D/ 7#6//#7 . /7;ST
%/;L/
D/ ;#-/#/#$ + $;= 2$
7 #$,%4 + 2$$-'$ G#/'/
!#/#)6>F0#F#('/
D/ #=/#/#$'% 2@%C%$
b @"#,/;ST%/KL;/
D/ # /F/#4//'#4/2/ #]7, #+%%
8 @#0A#5/2/4/*/7/$/*/5////$/8#/#
'36/%/;,,/
D/ 7#$/'//F#$. %3!"2)#
/B7ST%/LL;DK/
DL/ &#/#/# 21 4-
7#/;>&##%%/;J/
DD/ (>!>#$/#/#4. %%
%4#/!;!SLT%/JDK;JD/
J
DJ/ #/#/# ' ' $''@#
/7)ST%/LK;D,/
D,/ 6#$/#/# ' 2 '
'@#/3?ST%/L;D/
DK/ #5/#7' '@66DA//
J/ 2#5/*/#3/=h4%# //3# '
^'%4&6!"#KK/3)?ST%/L;/
J/ =!#7/#/0$ %+ ://
J/ 6;2#$0$ %/L/
J/ !#4/6/#+1%09 #;/#4!8"b#5/
J/ 3#7/#/#+ 2
4-!6'" !65&#/
@?@S;T%/KL;,/
JL/ ;'!#"33)6+%% @+%%% !'
% !+:#/
JD/ #/#/#8$' @A9#/3>S,T%/;D/
JJ/ F#/2/2#: : + %#40,
#/#b-"%5&/
J,/ -%#//#:_04'0 4%G 8//
JK/ #/#/# /%%
$' @A9#/3>S,T%/J;L/
,/ ;'!/*'= %% /')&
!%11>>>/!/11%11K,Ke_b_$*/
,/ -!#5/#/#R @,$A2
4 ' 4 ''"#/
!7?ST%/L,;,/
,/ !#5/#4'+$4//
,/ 0# /#3/4/=#$/2/->&#$ 4=16!B#
/3BST%/;J/
,/ *i0#'/8/'#:. %%
2!A#/=;ST%/KL;KD/
,L/ 3&&&#/8/#41#4'+$4# /$0#/#A()"
5/%/D;,/
,D/ A>#/#/# \' $'
% 3%#,/3BSDT%/;J/
,J/ 3#7/#/# $'%
-!#/!7BS;T%/;/
,,/ -#9 % #* /
,K/ &/A#3//'/3//'/#,!+ !%$
4 :G %!$'4&
3!/B3%/LL+LL,
K/ '#;$Q8;$$:9/L/
K/ #*/$/# %
#: ,%8/#'!()"'!#$0/
K/ 3;#6/#/#7 ' @A!@A!,!72
' /% %%4$"#L/
B@ST%/L;D/
J
K/ !#-//=/#/#+&'2
4&-!%!"'#J/!!>>S+T%/,;L/
K/ $%#$/#/#$
2#/=;SDT%/JDJ;,/
KL/ $#'/6/#*/8#C/ / #7 % %
-!#D/!B)%/L,;J/
KD/ 6d#/#/#7 %&'
770' % -!"#
/!;7%/L;L/
KJ/ "#F/#/#$' 2
' $' -6" @"#
L/3!ST%/;D/
K,/ -!# /#/## . %
% '34'"A#/73ST%/L;L/
KK/ 6d#/#/#770',+Q0-9K
Q8 #4&'-!"#
/>3ST%/L;L,/
/ #7/#/#0%4'
-!#/=@SKT%/LD;,/
/ 0# /#4 %%.-5&#
/?)ST%/D;LK/
/ F#=// #'+ ' ''8
. %% $'64#/!);SJT%/
KL;D/
/ 2#$/#/#@5)'65A"' '
$'% 2#/=;ST%/,;L/
/ #F/#/#+0+ :%$792979
G9%;Q% 7 ;1$ %
: %'"-!"#/@>SJT%/LD,;LJ/