Bi9393 Analytick á cytometrie Lekce 3

Bi9393 Analytická cytometrieLekce 3

Oddělení cytokinetikyBiofyzikální ústav AV ČR, v.v.i.Královopolská 135612 65 Brno

e-mail: [email protected].: 541 517 166

Karel Souček, Ph.D.

K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

Image Stream & Flowsight Amnis – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu

Amnis - aplikace

Principy průtokové cytometrie a sortrování

sorting zpracování signálu analýza dat kompenzace signálu


+++++-----

+++++

+++++-----

+++++

++

+++++-----

+++++

+++++++

+

+++++-----

+++++

+

+++++

-----

+++++-----++++++++++

-----

+++++----- ++++++++++

-----

- -

+++++-----

- - - - -

- -

- - - - -

-

+++++-----

-

- - - - - - - - - -

-

+++++------ - - - - - - - - -

-

+++++------ - - - -- - - - -

-

+++++------ - - - - - - - - -

SORTING

Frequency

Charge

Drop Delay

Amplitude

SORTING

SORTING

Sheath Pressure

Nozzle SizeFrequency

Amplitude

SORTING

Drop delay

Interrogation point

Breakoff

SORTING

Sort Setup mode

Default Sheath

Pressure70 micron

70 custom

70 psi

85 micron

85 custom

45 psi

100 micron

100 custom

20 psi

130 micron

130 custom

10 psi

SORTINGEach sort setup includes:

Sheath pressureBreakoff window valuesSide Stream window valuesInstrument window > Laser tab values

SORTING - Streams

Good Bad

SORTING – Setup Side Streams

Drop Delay interrogation point

drop delay

breakoff

WasteWaste

BD FACS™ Accudrop technology

Accudrop beads Diode laser Camera Optical filter

Sorting - Sort Masks

Cells are randomized distributed over the stream

Sorting - Sort Masks

Trailing

Interrogated

Leading

Mask

A region of the stream monitored for the presence of cells Determines how drops will be deflected if a sorting conflict

occurs Measured in 1/32 drop increments

Mask = 0 Mask = 8 Mask = 16 Mask = 32

4

4

8

8

16

16

Conflict Resolution

Precision modes include three types of masks– Yield– Purity– Phase

Sorting - Sort MasksSort decisions are determined by sort masks

Target particles in a drop with 1/32-drop resolution

Sorting - Yield MaskThe yield mask defines how many drops will be sorted Yield mask of

8/32 indicated in blue; target particle shown in green

Yield Mask

Sorting - Purity Mask

Purity mask of 8/32 in blue, 4/32 in each adjacent drop; target particles in green, non-target particles in red

Purity Mask

Purity Mask

LaserLaser

LaserLaser

LaserLaser

Creation of a Voltage Pulse

Time

Volt

age

TimeV

olt

age

Time

Volt

age

1

2

3

Height, Area, and Width

Time (µs)

Volt

age Pulse

area(A)

Puls

e H

eig

ht

(H)

Pulse Width (W)

0

Signal processing

time

anal

og s

igna

l int

esity

VO

LT

AG

E

FSC ~ cell size

FL-1 (530/30nm) ~ green fluo.

FL-2 (585/42nm) ~ red fluo.

Analog/digitalconversion

Height

Width

Area ( ∫ )

FL- (H, W, A)

FL

-1 (

H)

FL-2 (H)

dot plot

0 1000

1000

Zesílení signálu (!)

lin nebo log


Lineární a logaritmický obvod

lineární logaritmický dynamický rozsah kompenzace fluorescenčního signálu

Lineární obvody výstupní signál odpovídá (poměrově) vstupnímu

signálu detekce signálu založeného na kvantitativním vztahu

(DNA značení) vyžaduje 10 bitové rozlišení vyšší přesnost vyžaduje vyšší množství bitů současná zařízení mají rozlišení 4 řádů v logaritmické

škále - ADC musí mít schopnost rozlišení nejméně 1/10,000 což odpovídá 1 mV v 0-10 V škále.

pro dosažení této přesnosti je nutné 14ti bitové rozlišení

upraveno podle J.P.Robinson

AD převodníkyPočet bitů # kanálů rozlišení

8 256 39.1 mV

10 1024 9.77 mV

12 4096 2.44 mV

14 16384 610 V

16 65536 153 V

18 262144 38.1 V

20 1048576 9.54 V

22 4194304 2.38 V

24 16777216 596 nV

28 = 256210 = 1024...

Full scale measurement range = 0 to 10 volts ADC resolution is 12 bits: 212 = 4096 quantization levels

ADC voltage resolution is: (10-0)/4096 = 0.00244 volts = 2.44 mV K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

Proč používat lineární obvody?

Kompenzace signálu musí být prováděny na lineárních datech. Tzn. že celá elektronika musí být lineární (> 14-ti bit ADC) nebo musí být doplněn speciální obvod mezi předzesilovač a display.

Pro imunologické fenotypizace potřebujeme velký dynamický rozsah.

průtokový cytometr zesiluje signál na hodnoty mezi 0-10 V před ADC.


Kolik bitů? Pokud konvertujeme analogový signál

pomocí 8 bitového ADC – máme 256 kanálů (28=256) odpovídajících rozsahu 0-10 V

Rozdíl mezi kanály je 10/256=~40mV

0 50 100 150 200 250

10V1V

100mV

Channels


Ideální logaritmický zesilovač

0 50 100 150 200 250

10 V1 V100 mV

0 50 100 150 200 250

10 V1 mV

Channels

Linearní

Log

1 V100 mV10 mVLog amp


Logaritmické zesílení & dynamický rozsah


lin

log

„Ratio circuits“ jsou analogové obvody generující výstupní signál

odpovídající poměru ze dvou vstupních signálu (dvou detektorů)

Tvořeno speciálními moduly tzv. analogové násobiče. např. pro výpočet povrchové denzity navázaných

antigenů dělíme počet navázaných molekul velikostí povrchu buněk (není běžné)

Detekce intracelulárního pH Detekce intracelulárních Ca2+ (Indo-1) lze také kalkulovat pomocí speciálních softwarových

nástrojů


Kompenzace fluorescenčního signálu

…později

přesnost – koeficient variance (CV) citlivost, šum, pozadí MESF jednotky Přesnost a linearita

Koeficient variance

Klíčové pro jeho hodnotu je:• stabilita fluidního systému• obarvení (označení) buněk

průměr

CV=3.0

CV=3.0

%CV definice = St.chyba x 100průměr


Kvantitativní jednotky - ABCAntibody Binding Capacity

množství protilátky, které se specificky váže na populaci buněk (nebo mikročástic)

pozn.: Hodnota ABC nemusí odpovídat skutečnému množství antigenů na povrchu buněk nebo částic


0 50 100 150 200 250

1

10

100

1,000

10,000

100,000

1,000,000

Histogram Channel

An

tib

od

y B

ind

ing

Cap

acit

y

Mean98%

Detekce prahu (šumu)

Slide from Dr. Abe Schwartz


Určení ABC

AB

C

Proč je důležité určit práh?

určuje nejnižší množství značky (protilátky) detekovatelné přístrojem

určí, zda pozadí (šum) interferuje s analýzou

Dako Cytomation

MEFS Units Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome

(MESF) Units – metoda pro určení citlivosti přístroje (Abraham Schwartz)– směs částic označených známým množstvím molekul

fluorescenční značky– práh určený pomocí MESF znamená nejmenší

detekovatelné množství fluorochromu (BD FACS Aria II 85 MEFS – FITC)


Linearita detekce

praktický příklad nelinearity může být během měření množství DNA v buňkách v G0/G1 a G2/M fázi buněčného cyklu

lze použít mikročástice nebo jiné vnitřní standardy pro kalibraci


Analýza dat

Zobrazení dat– histogram– dot plot– isometric display– contour plot– chromatic (color) plots– 3 D projection

Gating

Způsoby pro zobrazení dat


Histogram distribuce četnosti Histogram zobrazuje četnost částic pro jeden parametr Jednoduchý výstup Nekorelujeme s dalším parametrem Problém s identifikací populací


Dot plot Zobrazuje korelaci dvou libovolných parametrů Jednotlivé tečky představují konkrétní změřené buňky (částice) Hodnoty pro řadu částic mohou ležet ve stejném místě Nemáme informaci o relativní denzitě částic Problémy s vykreslením v případě velkých objemů dat


Density & contour plot

Density plot: Zobrazuje dva parametry jako frekvenci četnosti barva a nebo její odstín odpovídá četnosti částic

Contour plot: spojnice spojuje body (částice) se stejnou

hodnotou signálu

V podstatě simulujeme 3D graf – třetí rozměr je frekvence


Čas jako jeden z parametrů

R1


3D zobrazení

2 parametry + četnost

3 parametry společně


3 Color Combinations

Negatives

Positives

4+4=8

FITC

PE

APC 4+4+4=12


3 Color Combinations

FITC

PE

APC 4+4+4=12

PE-FITC Pattern

FITCFITC

TR-FITC Pattern

FITCFITC

TR-PE Pattern

PhycoerytherinPhycoerytherin

.1.11

1010

010

010

0010

00

.1.111

1010

100

100

1000

1000

.1.111

1010

100

100

1000

1000

.1.1 11 1010 100100 10001000 .1.1 11 1010 100100 10001000 .1.1 11 1010 100100 10001000

CD4CD4

CD5CD5 CD38CD38

K/LK/L

CD45CD45CD3CD3

NegativeNegative NegativeNegative

CD10CD10

HLA-DR

HLA-DR

CD20CD20CD8CD8

CD7CD7

CD2CD2

CD8CD8

CD8 (dim)CD8 (dim)CD2CD2

NegativeNegative CD4CD4 CD5CD5

KK

Tex

as R

edT

exas

Red

Tex

as R

edT

exas

Red

Ph

yco

eryt

her

inP

hyc

oer

yth

erin

CD3CD3

CD3CD3

IgMIgM

IgGIgG

CD3CD3

CD8CD8CD3CD3

CD20CD20

IgGIgG

LL

CD20CD20

CD20CD20

CD45CD45


„Gating“

Real-time gating vs. softwarový „gating“Určení regionůStrategie „gatingu“Analýza kvadrantůBoolean „gating“zpětný „gating“

Real-Time vs. Software Gating

Real-time (live) gating: -omezuje akceptovaná data během měření

Software (analysis) gating:-vyřazuje určitá data během následné analýzy


Určení regionůObjektivní nebo subjektivní?

-školení/schopnosti/trénink

Možné tvary: -obdelník-elipsa-“free-hand“ (polygon)-kvadrant

Statistika- počet- podíl (%)- průměr, medián, S.D., CV, ….

Region vs. gateRegionoblast (plocha) v grafu definovaná uživatelemmnoho regionů v jednou grafuohraničujeme pomocí nich populace našeho zájmuje možné je barevně odlišitje definován stejně pro všechny vzorky v analýze

Gateje definován jako jeden a nebo více regionů zkombinovaných pomocí logických operátorů (AND, OR, NOT; Booleova logika) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie

Region 1 establishedRegion 1 established Gated on Region 1Gated on Region 1

Using GatesUsing Gates

log

PE


Statistika

Aritmerický průměr Geometrický průměr Medián

– odhad střední hodnoty

– není ovlivněn extrémními hodnotami Směrodatná odchylka Koeficient variance Modus – nejčastější hodnota


Statistika pro histogram


Analýza kvadrantů

(+ +)( - +)

(+ -)(- -)


Logický „Gating“ (Booleova logika)S překrývajícími se oblastmi máme mnoho možností:


Boolean GatingBoolean Gating

Not Region 1:Not Region 1:



Not Region 2:Not Region 2:



Region 1 or Region 2:Region 1 or Region 2:


Boolean Gating

Region 1 and Region 2:Region 1 and Region 2:


Not (Region1 and Region 2):Not (Region1 and Region 2):

Boolean Gating


90 Degree Scatter0 200 400 600 800 1000

Forw

ard

Sca

tter

0 2

00 4

00 6

00 8

0010

00

8

15

20

30

40

50

100

200

1000

Lymphocytes

Monocytes

Neutrophils

Side Scatter Projection

Forw

ard

Sca

tter P

roje

ctio

n

Light Scatter Gating

Scale


Back Gating

Region 4 establishedRegion 4 established Back-gating using Region 4Back-gating using Region 4

log

PE

Back gateBack gate


Back Gating


FITC+PE+

FITC+APC+

PE +APC+

3 Parameter Data Display


Vícebarevné analýzy generují mnoho dat…

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3 color4 color 5 color

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+

Log Fluorescence

QUADSTATS

Log

Flu

ores

cenc

e

++

-- +-

-+


Způsoby pomocí kterých lze upravit výsledky:

1. Odstranění „doublets“2. Čas jako parametr pro kontrolu kvality

Příklad - pro DNA analýzu je třeba:- odstranit „debris“ a shluky- odstranit „doublets“- udržovat konstantní průtok


DNA Histogram

G0-G1

S

G2-M

Fluorescence Intensity

# of

Eve

nts

Co je problém při vícebarevné detekci?


Emission Spectra–Spectral Overlap

Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci

Proces při kterém dochází k eliminaci všech fluorescenčních signálů kromě signálu z fluorochromu který má být na příslušném detektoru detekován

Nastavení pomocí mixu mikročástic či buněk označených/neoznačených příslušnými fluorochromy.


Co je problém při vícebarevné detekci?


Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci




FITC positive & negative

PE negative beads#2



FITC positive & negative

PE negative beadsNONE!

Nastavení kompenzací

parametr - detektor amp.FL1 - 544FL2 - 434kompenzaceFL1 - 1.1%FL2 FL2 - 17.5%FL1

značené mikročástice – pro běžně konjugované fluorochromy

značené buňky – pro vitální značení

Which marker for compensation?

Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation.

Kompenzace - literatura

Mario Roederer - Compensation in Flow CytometryCurrent Protocols in Cytometry (2002) 1.14.1-1.14.20 John Wiley & Sons, Inc.

M. Loken, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1977). Two-color immunofluorescence using a fluorescence-activated cell sorter. J. Histochem. Cytochem. 25:899-907.

M. Roederer & R. F. Murphy (1986). Cell-by-cell autofluorescence correction for low signal-to-noise systems: application to EGF endocytosis by 3T3 fibroblasts. Cytometry 7:558-565.

S. Alberti, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1987). A single laser method for subtraction of cell autofluorescence in flow cytometry. Cytometry 8:114-119.

C. B. Bagwell & E. G. Adams (1993). Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters. in: Annals of the New York Academy of Sciences, 677:167-184.


No Data No Data Analysis Analysis Technique Technique CanCan MakeMake Good Data Good Data Out of BadOut of Bad Data!Data!Shapiro’s 7th Law of Flow CytometryShapiro’s 7th Law of Flow Cytometry

Shrnutí přednášky sorting zpracování signálu vizualizace dat a „gating“ kompenzace

Na konci dnešní přednášky by jste měli:

1. Znát základní principu sortování,2. popsat způsob zpracování signálu,3. rozumět lin / log zesílení signálu,4. rozeznat jednotlivé způsoby vizualizace dat,5. chápat základní principy „gatingu“,6. znát princip kompenzace signálu při vícebarevné detekci.

Na konci dnešní přednášky by jste měli:

1. Znát základní principu sortování,2. popsat způsob zpracování signálu,3. rozumět lin / log zesílení signálu,4. rozeznat jednotlivé způsoby vizualizace dat,5. chápat základní principy „gatingu“,6. znát princip kompenzace signálu při vícebarevné detekci.


Bi9393 Analytick á cytometrie Lekce 3

Documents

Transcript of Bi9393 Analytick á cytometrie Lekce 3