Bez tytułu slajdu...bez zmiany apertury obiektywu prowadzi to tylko do rozciągnięcia obrazu bez...
Transcript of Bez tytułu slajdu...bez zmiany apertury obiektywu prowadzi to tylko do rozciągnięcia obrazu bez...
Mikroskopia
optyczna
Mikroskopia optyczna
Mikroskop to instrument optyczny do
oglądania w powiększeniu małych
przedmiotów.
Mikroskop optyczny wynalazł Holender
Zacharias Janssen w 1595r. Z pomocą ojca
Hansa.
Przyrząd ten udoskonalił Leeuwenhoek,
urzędnik z Delft w 1673r., który biologią
zajmował się tylko amatorsko.
Szlifował on niezwykle precyzyjnie szklane
soczewki w taki sposób, że jego mikroskop
powiększał aż 300 razy. Przy takim
powiększeniu można już było obserwować
mikroorganizmy.
Antony van Leeuwenhoek (1632-1723)
Mikroskopia optyczna
W 1683r. Antony van
Leeuwenhoek opublikował
pierwsze rysunki bakterii i
pierwotniaków.
Pierwsze komórki pod
mikroskopem zaobserwował w
1655r. angielski uczony Robert
Hooke.
A potem już się potoczyło…
http://campus.udayton.edu/~hume/Microscope
/microscope.htm
Robert Hooke (1635-1703)
R. Hooke Micrographia, Royal Society, London, 1665.
Mikroskopia optyczna
Normy dotyczące mikroskopii optycznej:PN-84/N-53050 Przyrządy optyczne wizualne -- Podstawowe wymagania optyczne i metody badań
PN-88/N-53049 Olejek immersyjny do mikroskopów -- Wymagania podstawowe
PN-89/N-53041 Mikroskopy optyczne -- Obiektywy -- Podstawowe wymagania
PN-90/N-53048 Szkiełka do preparatów mikroskopowych
PN-91/N-53053 Mikroskopy optyczne -- Okulary -- Podstawowe wymagania
PN-ISO 8036-1:1996 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Olejek immersyjny ogólnego
stosowania w mikroskopii optycznej
PN-ISO 8037-1:1996 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Szkiełka podstawowe -- Wymiary,
właściwości optyczne i znakowanie
PN-ISO 8038-1:2000 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Gwinty obiektywów i ich opraw --
Gwint typu RMS (4/5 in x 1/36 in)
PN-ISO 8039:2000 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Powiększenie
PN-ISO 8255-1:1996 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Szkiełka nakrywkowe -- Odchyłki
wymiarów, grubość i właściwości optyczne
PN-ISO 8578:1999 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Znakowanie obiektywów i okularów
PN-ISO 9345-1:1999 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Związek odległości obrazowych z
mechanicznymi płaszczyznami odniesienia -- Długość tubusa 160 mm
PN-N-53041:1989 Mikroskopy optyczne -- Obiektywy -- Podstawowe wymagania
PN-N-53048:1990 Szkiełka do preparatów mikroskopowych
PN-N-53049:1988 Olejek immersyjny do mikroskopów -- Wymagania podstawowe
PN-N-53053:1991 Mikroskopy optyczne -- Okulary -- Podstawowe wymagania
Mikroskopia optyczna
Konwencjonalna mikroskopia optyczna (ang. far-field
microscopy) wykorzystuje zjawiska związane z płaskimi
falami świetlnymi rozchodzącymi się podłużnie.
NA = nsin Warunek Abbe’go
NA – szczelina (apertura) numeryczna X = Y2/Y1 = n sin u1 / n sin u2
n – współczynnik załamania u1+ u2
Schemat układu optycznego mikroskopu
Źródło
światła
Kondensor wytwarza
równoległą wiązkę
promieni o dużej
intensywności
Soczewki
pomocnicze
przysłona
aperturowa
zmniejsza ilość
światła ale
zwiększa głębie
ostrości
przysłona
pola widzenia
przepuszcza środkową
część wiązki odcinając
promienie zewnętrzne
które wywołują wady
optyczne
okular
Obraz
pośredni
(rzeczywiy)
płytka
półprzeźroczysta
obiektywobiektyw
próbka
Całkowite powiększenie
mikroskopu Pc
Pc = Pob x Pok
Gdzie:
Pob =t/fob oraz Pok =d/fok
Gdzie:
t – długość optyczna tubusu mikroskopu, w mm (odległość pomiędzy ogniskiem obrazowym obiektywu a ogniskiem przedmiotowym okularu)
d – odległość najlepszego widzenia (250 mm)
fob – ogniskowa obiektywu
fok – ogniskowa okularu
Mikroskopia optyczna – ograniczenia
warunek dyfrakcyjny Abbe’go
Mikroskopia optyczna – ograniczeniaZjawisko dyfrakcji Fraunhofera
1. Światło jest rozchodzącą się falą podlegającą ugięciu na szczelinie.
2. Obraz obiektu punktowego może być opisany funkcją
rozproszenia Airy’ego.
sin = k/2d
k – numer prążka
Mikroskopia optyczna – ograniczenia
3. Kryterium Rayleigh’a
Najmniejsza rozróżnialna odległość (lmin) określona jest przez odległość
dwóch różnych obiektów punktowych, które mogą być widziane jeśli
maksimum funkcji Airy’ego jednego obiektu pokrywa się z minimum funkcji
Airy’ego drugiego obiektu.
lmin = 0,61 /nsin
/2
lmin 0,4
min 4000 Å
czyli lmin 1600 Å,
więc powiększenie Xmaks 7000, jeśli obraz ma mieć około 1mm.
Mikroskopia optyczna – ograniczeniazdolność rozdzielcza mikroskopu
d =λ/2NAobgdzie:
d – najmniejsza odległość pomiędzy dwoma obiektami przedmiotu, które w obrazie
mikroskopowym mogą być jeszcze rozróżniane jako oddzielne
d
NAob – apertura obiektywu, charakteryzuje możliwość efektywnego wykorzystania obiektywu
dla uzyskania obrazu o możliwie największej ilości szczegółów
α
NAob = nsin
gdzie:
n – współczynnik załamania światła (np. dla powietrza n = 1, dla olejku
immersyjnego n =1,5)
α – kąt pomiędzy główną osią optyczną obiektywu a najbardziej
skrajnym promieniem wpadającym do obiektywu po ugięciu na
preparacie i biorącym jeszcze udział w tworzeniu obrazu
Mikroskopia optyczna – ograniczeniazdolność rozdzielcza mikroskopu
1/d =λ/2n·sinα
Przykład obliczeń:
Stosując do oświetlenia preparatu w mikroskopie wiązkę światła
monochromatycznego o długości fali 0,55 μm (550 nm), przy
obiektywie o aperturze 0,65 zdolność rozdzielcza mikroskopu
wyniesie 0,42 μm (420 nm). Dla porównania - rozmiar bakterii waha
się w granicach 0,2 μm do kilkunastu μm.
Graniczna zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego mikroskopu
wynosi 0,15 μm (150 nm) przy założeniu, że α = 90°, n = 1,52
(obserwacje z immersją), λ=0,45 μm (450 nm, niebieskie).
Mikroskopia optyczna – ograniczenia
zdolność rozdzielcza mikroskopu
Mikroskopia optyczna – ograniczeniapowiększenie użyteczne mikroskopu
Powiększenie „puste” jest związane z ograniczoną zdolnością
rozdzielczą oka. Zwiększenie Pok bez zmiany apertury
obiektywu prowadzi to tylko do rozciągnięcia obrazu bez
ujawnienia nowych szczegółów.
Puż = lo/d
lo – zdolność rozdzielcza oka około (0,15 – 0,3) mm
d – zdolność rozdzielcza mikroskopu
Przyjmując średnią długość fali dla światła białego λ=0,55·10-3 mm
można wykazać, że:
Puż ~ (500÷1000)· NAob
Mikroskopia optyczna – ograniczeniaprzykład doboru okularu do obiektywu
Do obserwacji zostanie użyty obiektyw o powiększeniu 63 i aperturzeNAob=0,65 (na obiektywie 0,65/63). Jaki należy dobrać okular?
Puż ~ (500÷1000)· NAob=325-650Zakładamy, że Puż=Pc, więc
Pok=(Puż/Pob)=(325/63)÷(650/63)= 5,1÷10,3
Przy okularach o większym powiększeniu wystąpi tzw. powiększeniepuste, a przy okularach o mniejszym powiększeniu nie wszystkieszczegóły obrazu obiektywowego zostaną dostatecznie powiększone irozróżnione przez oko ludzkie w obrazie mikroskopowym.
Budowa mikroskopu
Pierwszy mikroskop składał się z jednej soczewki.
Wady soczewek:
• aberracje, np. chromatyczna),
• astygmatyzm,
• koma.
Aż do współczesnych układów wieloelementowych.
Budowa mikroskopuhistoria i współczesność
1. Jones, Thomas E.1995. http://www.utmem.edu/~thjones/hist/hist_mic.htm
2. Bradbury S. 1967. The Evolution of the Microscope.Pergamon PressLtd, Oxford,
London.
3. Samuel H. Cohen. 1994. Seeing the Invisible: The New Microscope. Collier’s Year
Book.
4. Bradbury S. 1968. The Microscope: Past And Present. Pergamon PressLtd, Oxford,
London.
5. Ford, Brian J. 2001. http://www.sciences.demon.co.uk/whistmic.htm
6. Doane, Nathaniel . 1995.
http://www.otal.umd.edu/~vg/amst205.F97/vj06/project6.html
7. 1998 A-Z Microscope Corporation. http://www.az-
microscope.on.ca/history/history.html
http://www.ucmp.berkeley.edu/history/hooke.html
Mikroskopia optycznametody badań mikroskopowych
Maksymalna ilość informacji przy obserwacjach mikroskopowych
zależy nie tylko od zdolności rozdzielczej mikroskopu, ale również
od dostatecznie dużego kontrastu pomiędzy interesującymi
szczegółami preparatu.
Zwiększenia kontrastu można dokonać na drodze optycznej.
Mikroskopia optycznametody badań mikroskopowych
Techniki:
w jasnym polu
w ciemnym polu
w świetle spolaryzowanym
z kontrastem fazowym i interferencyjnym
Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym polu
Preparat oświetlony jest wiązką prostopadłą do jego powierzchni (oświetlacz Becka – półprzeźroczysta płytka szklana ustawiona pod kątem 45° do osi optycznej obiektywu). Obraz jest płaski z
ostrymi i wąskimi konturami szczegółów.
Zalety:
• Pełne wykorzystanie apertury obiektywu i tym samym
zdolności rozdzielczej.
Wady:
• Duże straty światła na płytce półprzezroczystej zmniejszają
jasność i kontrast.
• Konieczność używania silnych źródeł światła np. lampy
rtęciowej lub ksenonowej.
Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym polu
Preparat oświetlony jest wiązką skośną do jego powierzchni (oświetlacz Nacheta – zamiast płytki szklanej pryzmat).
Obraz jest bardziej plastyczny i kontrastowy.
Zalety:
• Znacznie jaśniejszy obraz niż przy oświetlaczu
Becka.
Wady:
• Pogorszenie zdolności rozdzielczej mikroskopu
ponieważ jest wykorzystana tylko połowa apertury
obiektywu.
Mikroskopia optycznaobserwacje w ciemnym polu
Preparat oświetlony jest wiązką skośną do jego powierzchni (oświetlaczwykonany z pierścienia szklanego ustawiony pod kątem 45° do osioptycznej obiektywu). Uzyskuje się efekt czarnego tła obrazu, naktórym pojawiają się jasne kontury nierówności, którychpowierzchnia nie jest prostopadła do głównej osi optycznejobiektywu.
Zaletą tego sposobu obserwacji jest
maksymalne wykorzystanie apertury
obiektywu, co zapewnia wykorzystanie
pełnej zdolności rozdzielczej.
Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym i w ciemnym polu - przykłady
Badanie krwi w ciemnym polu widzenia jest ściśle związane
z osobą niemieckiego profesora Günthera Enderleina (1872-
1968), który stworzył podstawy teoretyczne tego badania.
Do badania używa się świeżej krwi włośniczkowej pobranej z
opuszka palca. Bezpośrednio po pobraniu krew umieszcza
się na szkiełku podstawowym, przykrywa szkiełkiem
nakrywkowym i ogląda pod mikroskopem z ciemnym polem
widzenia.
Ciemne pole ma przewagę nad jasnym pod względem
obserwacji mikroorganizmów, szczególnie bakterii, bez
potrzeby ich utrwalania i wybarwiania, gdyż wyraźnie świecą
one na ciemnym polu obserwacji.
Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym i w ciemnym polu - przykłady
Bieg promieni w mikroskopie
a) z ciemnym polem widzenia, b) z jasnym polem widzenia
Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym i w ciemnym polu – przykłady
Obraz krwi w mikroskopie
a) z ciemnym polem widzenia, b) z jasnym polem widzenia
Mikroskopia optycznaobserwacje w ciemnym polu – przykłady
Obraz Treponema pallidum w
mikroskopie z ciemnym polem
widzenia Krętek blady (Treponema
pallidum) pod mikroskopem
elektronowym
Mikroskopia optycznaobserwacje w ciemnym polu – przykłady
Skrzydło motyla w mikroskopie z
ciemnym polem widzenia
(powiększenie 50x)
Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym i w ciemnym polu – literatura
W.Z. Traczyk: Fizjologia człowieka w zarysie, PZWL
2000.
A. Litwin: Podstawy technik mikroskopowych,
Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
1999.
Ratajczak J., Wysocki M., Hayek F., Janowska-Wieczorek
A., Ratajczak M.Z.: Membrane-devided microvesicles:
important and underappreciated mediators of cell-to-cell
communication. Leukamia 20, 1487-1495, (2006).
Mikroskopia optycznaobserwacje w świetle spolaryzowanym
• Mikroskop polaryzacyjny to mikroskop, który przystosowany jest do obserwacji preparatów w świetle spolaryzowanym liniowo. Wykorzystywany jest on głównie do badania anizotropowości obiektów.
• Oprócz klasycznych elementów mikroskopu, w polaryzacyjnym występuje jeszcze dodatkowo polaryzator, analizator oraz soczewka Bertranda. Polaryzator jak sama nazwa wskazuje, służy do polaryzacji światła, analizator - do sprawdzenia polaryzacji światła. Soczewka Bertranda jest to soczewka, której użycie powoduje powstanie jedynie obrazu źrenicy obiektywu, a w okularze nie obserwujemy obrazu preparatu. Gdy nie ma preparatu na stoliku, to skrzyżowanie polaryzatora i analizatora spowoduje powstanie w źrenicy obiektywu obrazu przedstawiającego czarny krzyż tzw. konoskopowy.
• Gdy natomiast umieścimy na stoliku preparat, to krzyż ten zostanie zmodyfikowany i utworzy się figura charakterystyczna dla danego typu anizotropowości jaka występuje w preparacie.
Mikroskopia optycznaobserwacje w świetle spolaryzowanym
• W przypadku gdy obserwujemy pod mikroskopem jedno-lub dwuosiowy kryształ, to powstały obraz (oprócz krzyża) może także przedstawiać barwne prążki, a także pewne figury interferencyjne, które są określane mianem obrazów konoskopowych. Do analizy takich obrazów wykorzystuje się zazwyczaj płytki opóźniające, jak np. ćwierćfalówka lub też dwójłomne kompensatory.
• Pierwszy mikoskop polaryzacyjny został skonstruowany w 1834 roku, przez Tabolta i Brewstera i był wówczas wykorzystany do badania minerałów. Obecnie mikroskopy polaryzacyjne wykorzystywane są w biologii i medycynie, gdzie bada się nimi strukturę komórek i tkanek, a także w metalografii, czy przemyśle szklarskim i włókienniczym.
Mikroskopia optycznaobserwacje w świetle spolaryzowanym
Płaszczyzna drgań wektora Ē
Polaryzator Płaszczyzna polaryzacji światła
kierunek polaryzacji polaryzatora
kierunek biegu wiązki światła
Płaszczyzna drgań wektora Ē
Polaryzator Płaszczyzna polaryzacji światła
kierunek polaryzacji polaryzatora
kierunek biegu wiązki światła
Polaryzator Analizator
Źródło
światła
Ē B
Mikroskopia optycznaobserwacje w świetle spolaryzowanym
Celem badań w świetle spolaryzowanym jest wykrywanie
anizotropii szczegółów obserwowanego obiektu
Polaryzator umieszczany jest zwykle przed kondensorem.
Po odbiciu od powierzchni wiązka promieni świetlnych dostaje się
do analizatora.
Analizator ustawiony „równolegle” przepuszcza wiązkę, a
„skrzyżowany” wygasza światło spolaryzowane.
Izotropowa powierzchnia nie zmienia stanu polaryzacji wiązki
światła (płasko spolaryzowana wiązka pozostaje taka sama i może
być wygaszona przez właściwy obrót analizatora).
Mikroskopia optycznaobserwacje w świetle spolaryzowanym
Oprócz obserwacji przy jednoczesnym zastosowaniu polaryzatora i
analizatora można prowadzić obserwację przy wprowadzeniu w bieg
promieni samego analizatora. Otrzymuje się wtedy interesujące dane
o właściwościach optycznych (zmiana świecenia, charakterystyczne
zabarwienie) składników strukturalnych preparatu wykazujących
silną anizotropię.
Okresowo powtarzające się wygaszanie i rozjaśnianie obrazu
podczas obracania stolika mikroskopu przy skrzyżowanych nikolach
oznacza, że dany szczegół wykazuje zjawisko anizotropii optycznej.
Jeżeli mimo obrotu obraz szczegółu pozostaje jednakowo jasny,
wtedy jest on izotropowy.
A. Litwin: Podstawy technik mikroskopowych, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego,
Kraków 1999.
Mikroskopia optycznaobserwacje w świetle spolaryzowanym - przykłady
Z. Róg, J.E. Badurski : Ocena form i stopnia mineralizacji chrząstki stawowej metodą
mikroskopii optycznej w świetle spolaryzowanym. Postępy Osteoartrologii 6, 48, 1994.
Włókna jedwabiu Ludzki włos
Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego
Przy prowadzeniu obserwacji w jasnym polu, kontrast w obrazie
powstaje w wyniku różnic natężenia (amplitudy) i barwy światła
odbitego od powierzchni. Jeżeli jednak szczegóły powierzchni nie
zmieniają amplitudy oraz długości fali, a powodują jedynie
przesunięcie w fazie fal świetlnych odbitych od nich (względem
fal odbitych od powierzchni), wtedy nie dają one zmiany
kontrastu w obrazie.
Metoda kontrastu fazowego
została opracowana przez
holenderskiego fizyka Fritsa
Zernike (1888-1966), za co w
roku 1953 otrzymał Nagrodę
Nobla.
Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego
Długość wektorów odpowiada
amplitudzie fal świetlnych, a kierunek
ich fazie. OP jest wektorem światła
odbitego od punktu powierzchni, a
wektor OQ od szczegółu znajdującego
się blisko powierzchni, ale leżącego w
zagłębieniu o takiej samej zdolności
odbijania światła jak powierzchnia.
Na skutek różnicy dróg optycznych światła odbitego od powierzchni i od zagłębienia pojawia się
opóźnienie fazowe φ wektora OQ względem wektora OP. Zgodnie z teorią Abbego obraz powstaje w
wyniku interferencji światła ugiętego na przedmiocie z światłem nieugiętym. W wyniku tej interferencji
widać, że wektor OQ jest sumą wektorów OP i PQ. Kąt ψ jest bliski 90o jeżeli kąt opóźnienia fazowego φ
jest mały. OP odpowiada wektorowi światła nieugiętego PQ natomiast reprezentuje wektor światła ugiętego
na preparacie. Ponieważ wektor OP ma taką samą długość (amplitudę) jak wektor OQ natężenie światła w
obszarze zajmowanym przez obraz szczegółu przedmiotu jest takie samo jak w pozostałej części pola
widzenia. Szczegół ten jest więc w obrazie niewidoczny. Jeżeli jednak w płaszczyźnie ogniskowej
obrazowej obiektywu umieści się płytkę fazową, która zmieni fazę światła ugiętego PQ o + 90o lub -90o
(odpowiada to obrotowi wektora PQ do pozycji PQ’ lub PQ’’), wtedy w wyniku interferencji tego światła ze
światłem nieugiętym OP w obrazie pojawi się kontrast od niewidocznego poprzednio szczegółu.
O P O
Qφ
O P O
Qφψ
P
O P O P
Q
Q’ Q’’P
Schemat mikroskopu do badań z kontrastem fazowym
Źródło
światła
kondensor
Przysłona
pierścieniowa
przysłona
aperturowa
przysłona
pola widzenia
okular
płytka
fazowa
płytka
półprzeźroczysta
obiektywobiektyw
próbka
Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego
Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego - przykłady
Hodowla komórek – obserwacja w kontraście fazowym
Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego - przykłady
Pasożyt Taenia pisiformis (tasiemiec) –
obserwacja w kontraście fazowym.
Osiąga długość do 2m. Dojrzałe człony osiągają
szerokość większą niż długość (porównaj
zdjęcie).
Najczęściej spotykany u psów. Jego żywiciele
pośredni to zające, króliki, drobne gryzonie.
Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego - przykłady
Orzęsek Paramecium bursaria – obserwacja w
kontraście fazowym.
Organizm jednokomórkowy, częsty obiekt
badań biologów.
Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego
Zalety metody obserwacji z kontrastem fazowym:
1. Bardzo duża czułość – można wykrywać szczegóły struktury o różnicach
wysokości powyżej 5 nm.
2. Umożliwia obserwację przezroczystych struktur komórkowych, które zmieniają
fazę światła i/lub nieznacznie je uginają, nie powodując jednocześnie spadku
jego amplitudy promieniowania. Może być stosowana również do preparatów
żywych.
3. Eliminuje konieczność uprzedniego czasochłonnego barwienia preparatu.
4. W mikroskopach kontrastowo-fazowych bardzo dobrze widać znacznie więcej
organelli komórkowych, również drobnych, które nie są dostrzegalne w
mikroskopie jasnego pola.
5. Wyraźnie widać również niektóre procesy życiowe komórki, jak ruch
cytoplazmy lub endocytozę.
Mikroskopia optycznaobserwacje z kontrastem interferencyjnym - zjawisko interferencji
przesłona z dwiema szczelinami
przesłona z jedną szczeliną
ekran
źródło
światła
n = dsin
Mikroskopia optycznaobserwacje z kontrastem interferencyjnym – przykłady
Ze zjawiska interferencji światła korzysta również mikroskopia
interferencyjna. Działa ona na tej samej zasadzie, co kontrast faz, tzn.
zamienia różnicę w fazie wiązek świetlnych na jedną wiązkę świetlną
o nowej amplitudzie.
Dokonuje tego jednak w zupełnie inny sposób, a mianowicie
rozszczepiając wiązkę światła na dwie oddzielne, jeszcze zanim
dotrze do stolika z obserwowanym obiektem. Jedna z wiązek po
przejściu przez preparat może ulec na strukturach komórkowych
przesunięciu w fazie, po czym w obiektywie znów zbiega się z drugą
wiązką, której bieg jest tak ustawiony, aby pominąć preparat.
Podobnie, jak wcześniej dochodzi do interferencji i wzmocnienia, lub
osłabienia amplitudy światła.
Mikroskopia optycznaobserwacje z kontrastem interferencyjnym – przykłady
Mikroskopia interferencyjna pozwala na
wyznaczenie suchej masy komórek z dużą
dokładnością lub określenie grubości preparatu.
Istnieje też możliwość rozszczepienia wiązki
świetlnej na poszczególne składowe widma światła
białego, dzięki czemu można w nieszkodliwy dla
komórek sposób pozornie wybarwić je światłem, a
nie odczynnikami chemicznymi.
Mikroskopia optycznaobserwacje z kontrastem interferencyjnym – przykłady
Badanie włókien
kolagenowych
nicień
Mikroskopia optycznaobserwacje z kontrastem interferencyjnym – przykłady
Komórki HeLa – obserwacja
w kontraście fazowym (a) i w kontraście interferencyjnym (b)
Dawczynią komórek HeLa była Henrietta Lacks, która w wieku lat 31 zgłosiła się
do John Hopkins University z zaawansowanym stadium nowotworu.
Dziś linia komórkowa HeLa służy naukowcom do badań.
a b
Mikroskopia optycznaobserwacje z kontrastem interferencyjnym – przykłady
Pasożyt Echinococcus granulosus (Tasiemiec bąblowcowy, bąblowiec)
w kontraście fazowym (a) i w kontraście interferencyjnym (b)
Gatunek tasiemca, w postaci dojrzałej bytujący w jelicie cienkim
psowatych, przypadkowo występujący u człowieka, który jest wtedy
żywicielem pośrednim.
a b
Badania komórek i tkanek
Histopatologia (histologia patologiczna) jest działem
patomorfologii (dawniej nazywanej anatomią patologiczną),
która bada i rozpoznaje zjawiska mikroskopowe zachodzące
w komórkach oraz tkankach organizmu przy różnego
rodzaju schorzeniach.
Badanie histopatologiczne materiału tkankowego ma duże
znaczenie w rozpoznawaniu chorób nowotworowych, wielu
schorzeń zapalnych i zwyrodnieniowych, monitorowaniu
postępu leczenia, a także przy stwierdzeniu przyczyny
zgonu i istniejących zmian chorobowych u osób zmarłych,
u których wykonano sekcję.
Badania komórek i tkanek
Zakres wykorzystania diagnostycznego i znaczenie histopatologii w codziennej praktyce klinicznej stale się zwiększa. Przedmiotem badania histopatologicznego są usunięte chirurgicznie narządy lub części narządów oraz
specjalnie pobrane wycinki tkankowe w trakcie zabiegów chirurgicznych nazywanych biopsją. Badanie histopatologiczne w odróżnieniu od badania
cytopatologicznego umożliwia ocenę przestrzenną zmian chorobowych w tkance, stąd rozpoznania
histopatologiczne są na ogół wiarygodniejsze i dokładniejsze niż cytologiczne.
Badania komórek i tkanek
Cytopatologia to metoda diagnostyczna w medycynie,
polegająca na badaniu pod mikroskopem świetlnym
komórek pobranych przyżyciowo.
Ocena mikroskopowa polega na analizie składu
komórkowego preparatu, szczegółów
cytologicznych, poszczególnych komórek, sposobu
grupowania się komórek (płaty, gniazda, komórki
rozproszone etc.) oraz tzw. "tła" preparatu (bakterie,
składniki nieupostaciowane, wydzielina białkowa).
Badania komórek i tkanek
Zaletami badań cytopatologicznych (w porównaniu z
badaniami histopatologicznymi są:
• mała inwazyjność badania i możliwość ich powtarzania,
• niewielkie koszty materiałowe,
• szybkość badania,
• prostota procedur laboratoryjnych (zwłaszcza pominięcie
etapu bloczka parafinowego, podczas którego niszczone są
niektóre substancje zawarte w komórkach np. tłuszcze,
glikogen, niektóre białka, co czyni możliwe je do
uwidocznienia drogą specjalnych barwień),
• dobre uwidocznienie szczegółów komórkowych.
Badania komórek i tkanek
Wadami badań cytopatologicznych (w porównaniu z histopatologicznymi) są:
• niemożność oceny topografii tkankowej (wzajemnego położenia komórek, włókien, naczyń, etc.),
• trudności w ocenie ilościowej obrazu mikroskopowego,
• czasochłonność przy ocenie preparatów cytopatologicznych, wymagająca dużej skrupulatności, wnikliwości i spostrzegawczości od oceniającego (powoduje mniejszą wydajność oceniających wynikającą m.in. ze znużenia i zmęczenia wzroku),
• mała liczba specjalistów umiejących wiarygodnie oceniać niektóre typy preparatów (konieczność posiadania dużego doświadczenia przez cytopatologa przy ocenie niektórych materiałów),
• mniejsza objętość próbki (nie zawsze).
Badania komórek i tkanek
Badanie cytopatologiczne jest wykorzystywane zwłaszcza w
diagnostyce wczesnych postaci chorób nowotworowych, a
także w ocenie zaburzeń hormonalnych monitorowaniu
postępu leczenia i innych.
W przypadkach wątpliwych, ocena cytopatologiczna
powinna być potwierdzona badaniem histopatologicznym,
które umożliwia ocenę większej liczby szczegółów obrazu
mikroskopowego.
Badania materiałów cytologicznychMateriał cytologiczny może pochodzić z:
1. biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (zabieg z użyciem typowej igły iniekcyjnej i
strzykawki; nakłucie badanej tkanki oraz wytworzenie podciśnienia poprzez
wsteczny ruch tłoka powoduje niewielką, miejscową traumatyzację, wystarczającą
do uwolnienia niewielkich grup komórek aspirowanych do światła igły; z pobranych
komórek sporządza się preparaty cytologiczne),
2. cytologii złuszczeniowej:
• wydzieliny ciała (fizjologiczne i patologiczne),
• płyny z jam ciała i aspiraty (przy większej objętości płynu, w którym znajduje
się złuszczony materiał komórkowy, jest on zagęszczany przez delikatne
wirowanie lub sedymentację),
• rozmaz, szczotkowanie (materiał uzyskany z powierzchni zmiany lub błony
śluzowej, który jest bezpośrednio nanoszony na szkiełko mikroskopowe),
3. preparatów miażdżonych (niewielkie strzępki tkankowe są rozcierane lub
rozdrabniane bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym),
4. preparatów odbitkowych (komórki są pozyskiwane poprzez przesuwane szkiełka
podstawowego po świeżo wykonanym przekroju badanej tkanki, np. przekroju guza,
węzła chłonnego).
Badania materiałów cytologicznych
Cytologia to nauka o strukturze żywych komórek, ich funkcji
(cytofizjologia), rozwoju i rozmnażaniu (cytokineza); dział histologii
botanicznej i zoologicznej (także medycznej). Cytologia pojawiła się w
XIX wieku wraz z udoskonaleniem mikroskopii optycznej, co pozwoliło
zaobserwować podstawowe elementy składowe komórki (np. jądro
komórkowe i cytoplazmę). Dzięki rozwojowi nowych metod w XX
wieku (m.in. mikroskopii elektronowej) poznano ultrastrukturę i funkcje
drobniejszych struktur komórkowych (organelli, cytoszkieletu czy
kompartmentacji cytoplazmy).
Po pozyskaniu materiał cytologiczny umieszcza się na szkiełku
mikroskopowym, poddaje barwieniu i utrwaleniu.
Badania materiałów cytologicznychpozyskanie materiału
Materiał do badania cytologicznego w ramach programu profilaktycznego szyjki macicy jest pobierany z tarczy części pochwowej i kanału szyjki specjalną szczoteczką, która pozwala na pobranie komórek nie tylko komórek nabłonka
zgodnie z kryteriami prawidłowej oceny cytologicznej.
Materiał cytologiczny zwykle pobierany jest bezpośrednio na szkiełka mikroskopowe i
natychmiast utrwalany.
Badania materiałów cytologicznych
Proces utrwalania umożliwia zachowanie obrazu komórkowego po natychmiastowym przerwaniu
wszystkich życiowych funkcji komórki. Aby ten cel osiągnąć należy bezpośrednio po pobraniu rozmazu,
utrwalić go za pomocą utrwalacza.
Przedłużenie czasu jaki upłynął od pobrania materiału do jego utrwalenia powoduje wysychanie materiału, jego
obkurczanie się bądź procesy rozpadu uniemożliwiające prawidłowe zabarwienie się i interpretację uzyskanych obrazów. Jako utrwalacz w diagnostyce cytologicznej
stosowano początkowo 96% alkohol, a obecnie częściej aerozolowe preparaty do utrwalania rozmazów
biologicznych. Przed ich późniejszą oceną wykonuje się barwienie przygotowanych preparatów.
Badania materiałów cytologicznych
W wyniku skomplikowanej procedury komórki warstw powierzchniowych barwią się na kolor różowo-
czerwony, a komórki warstw pośrednich zielono-niebiesko. Jądra komórkowe barwią się hematoksyliną na kolor fioletowo-niebieski. Erytrocyty są czerwone, leukocyty mają ciemno barwiące się hematoksyliną
jądra i zielonkawą cytoplazmę. O komórkach barwiących się czerwono mówimy, że są
eozynochłonne, a o przyjmujących barwę zielono-niebieską cyjanochłonne. Barwienie umożliwia
rozpoznanie komórek nieprawidłowych.
Badania materiałów cytologicznych
Obecnie stosuje się wzór opisu według systemu Bethesda, który nie tylko informuje o obecności komórek nowotworowych, ale także o procesach
zapalnych i zmianach charakterystycznych dla konkretnych wirusów, bakterii czy grzybów. Wynik badania zawsze zawiera:
1. Oświadczenie na temat przydatności pobranego materiału do oceny cytologicznej.
2. Ocenę ogólną prawidłowości nabłonka szyjki macicy.
3. Część opisową obejmującą:
– zakażenia,
– zmiany odczynowe,
– zmiany nowotworowe w komórkach nabłonkowych,
– inne zmiany nowotworowe,
– ocenę cytohormonalną.
www.zdrowiekobiety.org
Badania preparatów
barwienie
Metoda Grama barwienia bakterii została opracowana w 1884
roku przez Duńczyka, Hansa Christiana Grama (1853–1938).
Pozwala ona doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie
duże grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na
różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie,
także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki.
Badania preparatów
mechanizm barwienia
• Wszystkie komórki bakteryjne, zarówno Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne,
zabarwiają się fioletem krystalicznym.
• Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego
tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie
obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe.
• Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje
zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych,
mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie
kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w
przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol
świetnie wypłukuje barwnik.
• Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-
ujemne – bezbarwne.
• Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) niezbyt mocno dobarwia komórki
Gram-ujemne, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.
Badania preparatów
barwienie i utrwalanie
Barwienie metodą Ziehla-Nielsena to rodzaj techniki
diagnostycznej służącej do odróżniania bakterii
kwasoopornych i niekwasoopornych (diagnostyka gruźlicy).
Kwasooporność np. prątków jest zależna od budowy
fizykochemicznej i obecności kwasu mikolowego.
Metodą tą można też barwić zarodniki grzybów i przetrwalniki
bakterii.
Badania preparatów
barwienie i utrwalanie
• Na utrwalony rozmaz bakterii na odtłuszczonym szkiełku podstawowym
nanosi się barwnik podstawowy (stężona fuksyna) na 15 min. W trakcie
barwienia preparat podgrzewany jest palnikiem,
• Barwnik zlewa się i spłukuje wodą destylowaną,
• Preparat odbarwia się w 3% roztworze HCl w etanolu (tzw. kwaśny alkohol) i
spłukuje wodą destylowaną,
• Następnie nanosi się barwnik kontrastowy, np. błękit metylenowy na 10 min., a
następnie spłukuje wodą destylowaną i suszy.
• W wyniku takiego postępowania bakterie kwasooporne przybierają kolor
czerwony pochodzący od fuksyny (nie odbarwiają się one bowiem w kwaśnym
alkoholu). Natomiast bakterie niekwasooporne są wrażliwe na działanie
kwaśnego alkoholu, odbarwiają się w nim z fuksyny i mają kolor niebieski
pochodzący od błękitu metylenowego.
Badania preparatów
literatura
1. K. Florczak, G. Głąb: Cytodiagnostyka w ambulatoryjnej opiece
ginekologicznej - atlas multimedialny, DMITF, Gdańsk 2006.
2. E.U. Kurczyńska, D. Borowska-Wykręt: Mikroskopia świetlna w
badaniach komórki roślinnej. Ćwiczenia. Wydawnictwo Naukowe
PWN, Warszawa 2007.
Wszystko o mikroskopii i mikroskopach:
definicje i podstawowe pojęcia
bardzo ciekawe filmy i prezentacje
http://micro.magnet.fsu.edu
Mikroskopia optycznaliteratura
Mikroskopia optycznaliteratura
Fizyczne metody badań w biologii, medycynie i ochronie
środowiska, pod red. A.Z. Hrynkiewicza i E. Rokity,
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999.
Podstawy technik mikroskopowych, Jan A. Litwin,
Wydawnictwo Collegium Medicum UJ, Kraków 1995.
Mikroskopia elektronowa, pod red. Andrzeja Barbackiego,
Wydawnictwo Politechniki Poznańskiej, Poznań 2003.