basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
-
Upload
richelle-lucas -
Category
Documents
-
view
40 -
download
6
description
Transcript of basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
![Page 1: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/1.jpg)
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
door Peter RoelsMonitoraat Wetenschappen
K.U. Leuven
Deel 1
![Page 2: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/2.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
![Page 3: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/3.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
![Page 4: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/4.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
DNA-dubbelhelix
![Page 5: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/5.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
DNA-dubbelhelix
5’ TGA 3’3’ ACT 5’
![Page 6: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/6.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
![Page 7: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/7.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
3 pijlers in derecombinant-DNA-technologie
• complementaire basenparing• restrictie-enzym of restrictie-endonuclease• DNA-polymerase
![Page 8: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/8.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
complementaire basenparing
steeds:adenine – thymine(2 H-bruggen)
guanine – cytosine(3 H-bruggen)
van groot belang in biologische werking, o.a.:- DNA-replicatie- RNA-synthese
cruciaal in vele technieken!
![Page 9: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/9.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
complementaire basenparing
temperatuur
absorbantie
DENATURATIE
ds DNA
es DNA
![Page 10: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/10.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
complementaire basenparing
temperatuur
absorbantie
Ts
![Page 11: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/11.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
complementaire basenparing
temperatuur
absorbantie
Ts < Ts< Ts
GC-gehalte
![Page 12: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/12.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
complementaire basenparing
temperatuur
absorbantie
RENATURATIE
es DNA
ds DNA
![Page 13: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/13.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
complementaire basenparing
• ook tussen niet perfect complementaire strengen is renaturatie (hybridisatie) mogelijk
• algemene regel:- smelttemperatuur van deze dubbelhelix lager naarmate aantal complementaire basen afneemt - hoe meer de strengen complementair aan elkaar, hoe hoger de temperatuur van het medium vóór denaturatie
![Page 14: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/14.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
restrictie-enzymen
• herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp)
• herkenningssequentie is palindroom
5’...GAATTC...3’3’...CTTAAG...5’
![Page 15: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/15.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
restrictie-enzymen
...G AATTC...
...CTTAA G...
• herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp)
• herkenningssequentie is palindroom
• vaak met vorming “kleverige eindjes”
5’...GAATTC...3’3’...CTTAAG...5’
![Page 16: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/16.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
DNA-polymerase
• maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs
• steeds dubbelstrengs DNA nodig als start
3’...CTTAAG... 5’5’...GA 3’
• steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde
![Page 17: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/17.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
DNA-polymerase
• maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs
• steeds dubbelstrengs DNA nodig als start
3’...CTTAAG... 5’5’...GA 3’ ATTC...
• steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde
![Page 18: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/18.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
![Page 19: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/19.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym
![Page 20: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/20.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym
![Page 21: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/21.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym
![Page 22: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/22.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym• gelelektroforese (met agarosegel)
![Page 23: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/23.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: opzet stalen
1 2 3
![Page 24: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/24.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: opzet stalen 1 2 3
![Page 25: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/25.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
-
+
gelelektroforese: spanning
![Page 26: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/26.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
-
+
gelelektroforese: spanning
![Page 27: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/27.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
-
+
gelelektroforese: spanning
![Page 28: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/28.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
-
+
gelelektroforese: visualisatie
1000
500
300
200
100
![Page 29: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/29.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
-
+
gelelektroforese: visualisatie
![Page 30: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/30.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
• digestie van DNA met restrictie-enzym• gelelektroforese (met agarosegel)• interpretatie
![Page 31: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/31.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie 1 2 3
400
50
![Page 32: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/32.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie
5’…CAACTG…3’3’…GTTGAC…5’
5’…CAATTG…3’3’…GTTAAC…5’
5’…CAATT 3’3’…G 5’
5’ G…3’3’ TTAAC…5’
1 2 3
400
50
![Page 33: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/33.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie 1 2 3
400
50
![Page 34: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/34.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie
5’…CGGTCTAGGTG…3’3’…GCCAGATCCAC…5’
5’…CGGGGTG…3’3’…GCCCCAC…5’
5’…CGGTCTAGGTG…3’3’…GCCAGATCCAC…5’
1 2 3
400
50
![Page 35: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/35.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie 1 2 3
400
50
![Page 36: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/36.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
gelelektroforese: interpretatie 1 2 3
400
50
![Page 37: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/37.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
resultaat na digestie van totaal genomisch DNA
1 2 3
400
50
![Page 38: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/38.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
![Page 39: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/39.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
Southern-vlektechniek
nylondrager
blotting
autoradiogram
+ sonderadiografie
5’…AACTCAGCTG … 3’
5’ … AACTC 3’
5’ AGCTG … 3’
3’ GAGTCG 5’
3’ GAGTCG 5’
3’ GAGTCG 5’
agarosegel
![Page 40: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/40.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
Southern-vlektechniek:afkomst sonde (probe)
• uit gekende aminozuursequentie van eiwit (degeneratie code!)
• uit mRNA, na omzetting in cDNA• sonde gebruikt in een ander, verwant
organisme (voldoende complementair!)
![Page 41: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/41.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
• DNA-dubbelhelix• inleiding: 3 pijlers• restrictiefragment-lengtepolymorfisme• Southern-vlektechniek• genkloning• polymerase-kettingreactie• DNA-sequentiebepaling
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
![Page 42: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/42.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’
genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment
lacZ-gen (enzym katalyseert omzetting “X-gal” naar blauwe kleurstof)
ampicillineresistentiegenpUC18
![Page 43: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/43.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment
5’ GAATTC GAATTC 3’3’ CTTAAG CTTAAG 5’
5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’
![Page 44: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/44.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment
5’ GAATTC GAATTC 3’3’ CTTAAG CTTAAG 5’
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’
![Page 45: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/45.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment
+ ampicilline+ X-gal
bacterie – plasmide = niet-AB-resistent
plasmide zonder donor-DNA = blauw
![Page 46: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/46.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment
blotting radiografie
![Page 47: basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062411/56812b3d550346895d8f50d3/html5/thumbnails/47.jpg)
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...
genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment