Bakterijska kemotaksazaključni seminar na študijskem programu 1. stopnje Fizika

Tine Curk

Povzetek

V seminarju predstavim računalniške simulacije kemotakse bakterij tipa Esche-richia coli. Obnašanje računalniške E. coli se zelo dobro ujema z eksperimentalnimipodatki gibanja pravih bakterij. Pokažem tudi, da variabilnost v obnašanju medposameznimi bakterijami vpliva pozitivno na uspeh celotne populacije, če ta živi indeluje v spremenljivem okolju.

Mentor: Prof. Dr. Jure Dobnikar

Maribor, 2010

Kazalo1 Uvod 3

2 Escherichia Coli 42.1 Plavanje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.2 Kemotaksa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.3 Motor in flagela . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.4 Fizikalne omejitve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3 Model 83.1 Molekularni procesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83.2 Motor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.3 Plavanje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133.4 Hrana in razmnoževanje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4 Izvedba simulacij in parametri 154.1 Meritve gibanja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164.2 Časovna zahtevnost . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

5 Rezultati in diskusija 175.1 Izotropno okolje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175.2 Odziv na gradient hrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215.3 Uspešnost populacij . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

6 Zaključek 26

Literatura 28

2

1 Uvod

Bakterije so prokariontski organizmi različnih oblik, z dolžino nekaj µm. Prisotne so vvseh življenskih okoljih in predstavljajo velik del svetovne biomase. Večina ima sposobnostplavanja. To jim ponavadi omogočajo ena ali več spiralnih flagel, ki se vrtijo kot propelerjiin celico potiskajo v določeni smeri. Bakterije vseh vrst se odzivajo na dražljaje iz okolja.Ti ponavadi predstavljajo spremembe v temperaturi, kemični sestavi ali svetlobi. Svojegibanje prilagodijo glede na informacije o okolju, in tako npr. plavajo proti hrani ali stranod neugodnih življenjskih razmer.

Kemotaksa je sposobnost bakterij, da usmerjajo svoje gibanje glede na kemične gra-diente v okolju. To ponavadi pomeni plavanje proti večjim koncentracijam hrane aliizogibanje strupom. Escherichia coli je tipična prokariontska bakterija s to lastnostjo.Postavljena v gradient hrane bo v povprečju plavala proti hrani s hitrostjo reda 1 µm/s[1].

Velikost E. coli je približno 2 µm, kar tipična molekula hrane, raztopljene v vodipri 30◦C, predifundira v okoli 1 ms [1]. Bakterija je premajhna, da bi lahko zaznavalagradiente s primerjavo koncentracij po lastni dolžini. Zato gradiente zaznava s časovnospremembo zaznane koncentracije pri plavanju. Če se pri ravnem plavanju koncentracijahrane povečuje, E. coli to zazna kot ugodno smer in obratno. Njeno obnašanje lahkoprimerjamo z naključnim sprehajalcem. Bakterija plava približno premo (z maksimalnohitrostjo ≈ 30 µm/s) povprečno 1 s, ter se nato približno 0,1 s vrti na mestu in spreminjaorientacijo. Nova smer plavanja je naključna. Kemotaksa deluje tako, da E. coli podaljšaskoke, ko zazna, da plava v ugodni smeri, ter skrajša skoke v neugodni. To ji omogoča,da se odziva na gradient s povprečno hitrostjo okoli 10% hitrosti plavanja. Značilnostkemotakse E. coli je natančna adaptacija na okolje. Obnašanje bakterij ni odvisno odabsolutnih koncentracij kemikalij, le od gradientov.

Zanimalo me je, kako se lahko tako preprost organizem učinkovito odziva na gradienterazličnih kemikalij, kako posamezna bakterija kemikalije oz. ligande zaznava, kako plavater kako se na njih odziva. E. coli, in ne katere druge vrste, sem izbral zato, ker je ta mednajbolj poznanimi in raziskanimi prokariontskimi organizmi. Veliko dela na njeni kemo-taksi je že bilo opravljenega [1]. Kemotaktični aparat deluje v grobem takole. Receptorjizaznavajo koncentracijo ligandov. Ko se ta spremeni, kemotaktični aparat, sestavljen izpetih proteinov, to interpretira kot dobro ali slabo. Nato pošlje signal motorjem, ki poga-njajo flagele, v katero stran se naj vrtijo. V grobem velja, da se flagele, ki se vrtijo v levo,združijo v snop in bakterija plava naravnost. Flagele, ki se vrtijo desno, snop razdrejo inbakterija se pretežno vrti na mestu.

Reakcije med receptorji in proteini so bile raziskane [2] in se lahko opišejo z navadnimidiferencialnimi enačbami. Prav tako je bil raziskan odziv motorja na signalni proteinCheY-P [3, 4]. Sam sem nato poskušal poiskat model, ki bi dobro opisal, kako se v te-kočem mediju E. coli giblje v odvisnosti od dinamike vrtenja flagel. Natančnost modelabom preveril z računalniškimi simulacijami, katerih opis zajema večji del naloge. Rezul-tate simulacij bom primerjal z eksperimentalnimi podatki gibanja in odziva posameznihbakterij ter populacij [1, 5, 6, 7]. Na koncu bom še pokazal, da je variabilnost v obnašanju(povprečna dolžina enega skoka) med posameznimi bakterijami, za populacijo kot celotokoristna. Taka populacija bakterij je namreč bolj prilagodljiva na spremembe v okolju.

Obstaje več podvrst E. coli. Jaz se bom ukvarjal le z divjim tipom (angl. wild type)RP437, ter odzivi na gradiente α-metil-DL-aspartata, ki je E. coli hrana. Povzeti model

3

[2] namreč opisuje ta tip bakterije in receptorje, ki nase vežejo to aminokislino. Tako vnadaljevanju besedi hrana in ligand vedno pomenita aspartat.

Najprej bom v naslednjem poglavju podrobneje predstavil bakterijo Escherichia coliin njeno delovanje ter kemotakso. Nato bom opisal povzeti model kemotaktičnega apa-rata ter dodal svojo razširitev, ki opisuje gibanje, porabo hrane in razmnoževanje. Četrtopoglavje govori o izvedbi simulacij obnašanja bakterij in parametrih uporabljenih pri tehsimulacijah. Na koncu bom še predstavil rezultate simulacij ter jih primerjal z eksperi-mentalnimi podatki.

2 Escherichia Coli

Escherichia coli je prokariontska bakterija, ki normalno živi v črevesju ljudi in drugihtoplokrvnih živali. Enkrat izločena, poskuša preživeti v vodi ali zemlji, dokler ne najdenovega gostitelja. Večina podvrst oz. sevov (angl. strain) ni nevarnih in so del normalnečrevesne flore. Po drugi strani so nekateri sevi za človeka patogeni in povzročajo različneinfekcije ali zastrupitve. Sev O157:H7 živi v črevesju, predvsem industrijsko hranjenega,goveda in povzroča nevarno zastrupitev, če ga po pomoti zaužijemo skupaj z ne dovoljkuhanim mesom.

Bakterijo je že leta 1885 odkril nemški pediater Teodor Escherich in po njem je tudidobila svoje ime. Danes je E. coli, predvsem zaradi dostopnosti in relativne varnosti,eden najbolj raziskanih prokariontskih organizmov. Je približno 2,5 µm dolga in 0,8 µmširoka gram-negativna bakterija paličaste oblike z zaobljenima koncema [1]. Ko celicaraste, postaja daljša in se nato razdeli na dva dela, kar pri obilici hrane traja le okoli 20minut. Nima jedra, citoskeleta ali notranjih organelov, znotraj celične membrane najdemole relativno homogeno citoplazmo. Vendar ima dva zunanja organela: kratke paličiceimenovane pilusi, ki omogočajo povezavo z drugimi bakterijami in izmenjavo plazmidov,ter daljše flagele, s pomočjo katerih bakterija plava.

2.1 Plavanje

Tipična E. coli ima približno 4 spiralne bičke oz. flagele [5, 8], ki delujejo kot propelerji inso enakomerno posejane po površini celice. Z njihovo pomočjo bakterija plava s hitrostjodo okoli 30 µm/s [5, 6]. Vsako flagelo poganja motor, ki se lahko vrti levo ali desno. Če E.coli opazujemo pod mikroskopom, vidimo, da se posamezna bakterija obnaša kot naključnisprehajalec. Obnašanje lahko v grobem razdelimo na dve obliki, ki sta prikazani na sliki1. Ko se motorji vrtijo v isto smer, ponavadi levo (nasprotna smer urnega kazalca), kot tovidi opazovalec, od katerega se bakterija oddaljuje, se bički združijo v snop in bakterijaplava približno premo. Ko potem eden ali več motorjev obrne smer v desno (smer urnegakazalca), se bički med seboj zagozdijo in snop zaradi velikih sil razpade [1]. Bakterija sepretežno vrti na mestu. Nato spet motorji obrnejo v levo in snop se ponovno združi.

Obnašanje bakterije v izotropnem tekočem okolju (ni kemotakse, ki jo bomo obrav-navali v naslednjem poglavju) je podobno naključnemu sprehajalcu. Posamezno plavanjetraja v povprečju približno 1 s ter vrtenje 0,1 s, obe časovni porazdelitvi sta eksponentni[1, 6]. Populacijo lahko primerjamo tudi s termičnim gibanjem molekul plina. Če vsakovrtenje obravnavamo kot trk, se populacija bakterij približno obnaša kot zelo ohlajen plins povprečno hitrostjo molekul nekaj 10 µm/s in povprečnim časom med trki 1 s. To bomv nadaljevanju uporabil za oceno difuzijske konstante populacije bakterij.

4

(a) (b)

Slika 1. Obnašanje E. coli pri prostem gibanju skozi tekočino. a) Plavanje: bički sovečinoma združeni v snop, celica plava približno premo naravnost. b) Vrtenje: bički sovečinoma razdruženi, celica spreminja orientacijo.

2.2 Kemotaksa

Sposobnost enoceličarjev, da usmerjajo svoje gibanje glede na kemične dražljaje iz okolja,imenujemo kemotaksa. Ta je večinoma pozitivna, npr. bakterija plava proti mestu višjokoncentracijo hrane (aspartat, serin, dipeptidi, fruktoza, glukoza, itd.), ali spermij protijajčecu. Kemotaksa je lahko tudi negativna, ko bakterije bežijo pred strupi (etanol,leucin, itd.) [1]. Mehanizem je dokaj preprost. Kadar potuje proti ugodnejšim razmeram,podaljša čas trenutnega plavanja, kadar proti slabšim, ga skrajša. Tako potuje protigradientu s hitrostjo, ki je približno enaka 10% lastne absolutne hitrosti, odvisno odsnovi in velikosti gradienta. Obnaša se približno kot naključni sprehajalec na hribu, kiraje hodi navzdol, ali kot molekula, ki je podvržena nenehnemu Brownovemu gibanju inhkrati počasi difundira v določeni smeri.

Veliko bioloških sistemov se na nek dražljaj odziva logaritemsko. To lastnost imenu-jemo Weber-Fencherjev zakon, ki se zapiše v diferencialni obliki kot

dp = kdS

S, (1)

kjer je dp sprememba percepcije dražljaja, S dražljaj in k konstanta. Sistem torej zaznavarelativne spremembe, kar omogoča veliko večji dinamični razpon v zaznavi dražljajev. Nata način delujejo tudi človeški vid, sluh in tip.

E. coli prav tako v okolju zaznava relativne spremembe in ne absolutnih. Vhodni dra-žljaj je koncentracija nekega liganda (hrana, strupi) označenega z L, odziv pa povprečnahitrost 〈v〉 potovanja proti gradientu

〈v〉 = k∇LL

= k∇ lnL (2)

in je odvisna od gradienta logaritma koncentracije hrane. E. coli zaznava ligande loga-ritemsko, kar je bilo tudi eksperimentalno izmerjeno [7]. Povprečna hitrost potovanja jetorej konstantna v eksponentno porazdeljeni hrani, saj je lastnost eksponentne funkcijeta, da je njen relativni gradient povsod enak.

5

2.3 Motor in flagela

Motor in flagela sta strukturi, ki E. coli omogočata plavanja in si zato zaslužita maloveč pozornosti (slika 2). Motor je vgrajen v celično membrano in ima premer le okoli45 nm. Z enako hitrostjo in učinkovitostjo se lahko vrti levo ali desno. Poganja ga tokprotonov (ne ATP), ki je posledica potencialne ter pH razlike čez celično membrano.Celica vzdržuje potencialno razliko (med notranjostjo in zunanjostjo) ≈ -120 mV. Njenlastni pH je okoli 7,7. Če živi v vodi (pH=7), dobimo razliko pH čez membrano 0,7. Tapovzroči dodatno potencialno razliko ≈ 50 mV zaradi različnih koncentracij oksonijevihionov (H3O+). Skupna efektivna potencialna razlika je torej okoli -170 mV. Motor delujekoračno. Za vsak obrat potrebuje energijo približno 1200 protonov, izkoristek je skoraj 1.Navor motorja je pri ≈ 25◦C dokaj neodvisen od hitrosti vrtenja med -100 Hz (nagativnahitrost pomeni, da motor prisilno vrtimo vzratno) in 200 Hz, ter znaša ≈ 4600 pN nm oz.4, 6 · 10−18 Nm. Obremenjen z bičkom se motor vrti z okoli 100 Hz, 4 motorji vrteči levotako povzročijo, da se celotna celica vrti desno s približno 10 Hz [1].

Slika 2. Motor in biček. Slika je povzeta po ref. [9].

Biček je na motor pritrjen preko pravokotne kljuke, kar kaže slika 2. Flagele so dolgepribližno 8,3 µm in glede na smer vrtenja motorja zavzamejo različne oblike spirale. Zanas so pomembne 3. Normalna oblika (levosučna) ter pol zavita (angl. semicoiled) inkodrasta (angl. curly), ki sta desnosučni. Ko se motor vrti levo, je pripadajoča flagela vnormalni obliki. Nato preklopi v desno in flagela zaradi viskoznih sil, spremeni obliko vpol zavito, ki je desnosučna. Čez približno 0,1 s se flagela zaradi viskoznosti še bolj zavijev kodrasto obliko ter na koncu spet v normalno, ko se smer motorja spremeni nazaj vlevo [5].

6

2.4 Fizikalne omejitve

Fizika okolja bakterij je precej drugačna od fizike človeškega okolja. Pri E. coli ni trebaupoštevati vztrajnosti ali gibalne količine, saj je njena teža zanemarljivo majhna v pri-merjavi z viskoznimi silami. Če bi se pri hitrosti 30 µm/s vsi motorji naenkrat ustavili,bi celica v povprečju nadaljevala svojo pot le še desetinko premera vodikovega atoma [1]!

Druga omejitev je difuzija. E. coli išče hrano z meritvijo koncentracije ligandov. Čenaj bo meritev natančna, mora pri povprečni dolžini skoka prehiteti difuzijo liganda. Zamajhno molekulo v vodi pri 30◦C, je difuzijska konstanta približnoD ≈ 10−9 m2/s. Bakte-rija, ki plava s hitrostjo v, bo dohitela difuzijo liganda, ko bo izpolnjen pogoj vt ≈

√Dt,

kar pomeni t ≈ 1 s. Eno plavanje (skok) mora torej trajati vsaj 1 s, da lahko bakte-rija dovolj natančno izmeri, kako se koncentracije ligandov spreminjajo. Translacijskadifuzija celotne celice je zanemarljiva, saj je difuzijski koeficient za negibljivo E. coliD ≈ 2 · 10−13 m2/s [1] in tako gibljiva celica lastno difuziji prehiti že v približno 1 ms.Zelo pomembna pa je rotacijska difuzija, ki jo zapišemo kot⟨

θ2⟩

= 2Drott (3)

za gibanje okoli ene osi. 〈θ2〉 je povprečen kvadrat spremembe kota v času t ter Drot

koeficient rotacijske difuzije, ki znaša 0,15 rad2/s [6, 10]. To je vrednost, ki jo pričakujemoza kroglico s polmerom 1 µm. Tako celica povprečno vsako sekundo spremeni smer zapribližno 30◦. Zaradi tega so skoki daljši od okoli 5 s nesmiselni, saj se začetna smerpopolnoma izgubi.

E. coli se je prilagodila pogojem, v katerih živi. Povprečen čas plavanja je 1 s, priplavanju v ugodni smeri se lahko nekajkrat poveča, a le malo zmanjša v neugodni smeri,saj bakterija v manj kot 1 s ne more natančno izmeriti sprememb ligandov v okolju. Vvečji meri se odziva na spremembe na boljše. E. coli je torej optimist.

3 Model

3.1 Molekularni procesi

Značilna lastnost kemotaktičnega aparata E. coli je natančna adaptacija. To pomeni,da je obnašanje celic v izotropnem okolju neodvisno od absolutnih koncentracij različnihligandov (med 0 in ≈ 10 mM). Če bakterijo iz čiste vode vržemo v raztopino bogato shrano (npr. raztopino 1 mM aspartata), bo približno 1 minuto samo plavala, ter se natopopolnoma prilagodila novemu okolju. Prej sem omenil, da je E. coli optimist, sedajlahko dodam, da je večno nezadovoljni optimist, saj zmeraj išče boljše okolje, ne glede naabsolutno stanje.

Eksperimentalno in teoretično dognan kemotaktični aparat, ki ima lastnost natačneadaptacije, je na sliki (3). Model je povzet po ref. [2] in opisuje kemične reakcije medreceptorji Tar in petimi kemotaktičnimi proteini. Vhodna spremenljivka je koncentracijaα-metil-DL-aspartata, ki se veže na ta receptor, izhodna pa koncentracija signalnega pro-teina CheY-P, ki vpliva na smer vrtenja motorja. Seveda obstajajo tudi drugi receptorjiza druge ligande npr. Tsr za serin, vendar se bom ukvarjal le s Tar receptorji, ki vežejoaspartat.

Vsak receptorski kompleks je lahko aktiven ali neaktiven ter ima lahko nase vezanedo 4 metilne skupine (-CH3). Te, skupaj s koncentracijo liganda v okolju, določajo pov-prečno aktivnost. Vejetnost (pm), da je m-krat metiliran receptor aktiven v odvisnosti od

7

Slika 3. Shema E. coli in njenega kemotaktičnega aparata, od receptorja preko petihproteinov do motorja in flagele. Trije proteini so lahko v normalni (CheA, CheB, inCheY) ali fosforilirani (CheA-P, CheB-P, in CheY-P) obliki. Vsak receptor ima nasetrajno vezan en CheA oz. CheA-P, ostali proteini se prosto gibljejo po citoplazmi v celici

trenutne koncentacije liganda (L), je podana z Hillovo funkcijo

pm(L) = Vm

(1− LHm

LHm +KHmm

), (4)

kjer sta Hm in Km Hillova koeficienta in Vm konstanta.Kemijske reakcije metilacije in demetilacije receptorjev (5) opišemo z Michaelis-Mentenovo

kinetiko, fosforilacijo in defosforilacijo proteinov (6)-(8) pa se opiše z navadno kemijskokinetiko [2]:

dTmdt

= kRRTm−1

KR + T T+ kBBp

TAm+1

KB + TA

− kRRTm

KR + T T− kBBp

TAm

KB + TA,

(5)

dAp

dt= kA

(AT − Ap

)TA − kYAp

(Y T − Yp

)− k′

BAp

(BT −Bp

), (6)

dYpdt

= kYAp

(Y T − Yp

)− kZYpZ − γY Yp, (7)

dBp

dt= k

′

BAp

(BT −Bp

)− γBBp. (8)

8

Proteini so označeni s pripadajočimi črkami, npr. A pomeni koncentracijo CheA ter Ap

pomeni koncentracijo CheA-P, enako velja za ostale proteine. Tm predstavlja koncentracijo(število) m-krat metiliranih receptorjev ter TA

m koncentracijo aktivnih m-krat metiliranihreceptorjev. T T in TA pomenijo totalne koncentracije vseh in aktivnih receptorjev, kjervelja TA

m = pm(L)Tm in TA =∑4

m=0 TAm . Prav tako velja, da je totalna koncentracija

proteina (AT ) enaka vsoti proteina v normalni (A) in fosforilirani (Ap) obliki. TorejAT = A + Ap in obrnjeno A = AT − Ap, enako velja za B in Y . Ostalo so konstante, kiso podane v naslednjem poglavju pri parametrih. S kx so označene konstante reakcijskihhitrosti, s Kx Michaelisove konstante, z γx pa konstante hitrosti spontane defosforilacije,kjer pri vseh x pomeni poljuben protein.

Enačba (5) nam pove, kako se koncentracija m-krat metiliranih receptorjev spreminjas časom. CheR receptorje metilira, CheB-P pa demetilira le aktivne receptorje. Prvi členna desni strani predstavlja povečanje koncentracije m-krat metiliranih receptorjev zaradimetilacije (m − 1)-krat metiliranih receptorjev s CheR. Hitrost metilacije je odvisna odkoncentracije (R) CheR, koncentracije Tm−1 ter koncentracije vseh receptorjev T T . kRpredstavlja konstanto hitrosti metilacije, KR pa je Michaelisonova konstanta. Hitrost me-tilacije (iz m−1 v m) je torej sorazmerna R in Tm−1. Tretji člen na desni strani je enak, leda opisuje metilacijo Tm v Tm+1 kar povzroči nižanje koncentracije Tm. Drugi člen na desniopisuje povečanje Tm zaradi demetilacije aktivnih receptorjev TA

m+1 s pomočjo Bp. Spetje hitrost procesa sorazmerna neki konstanti koncentracijam Bp in TA

m+1, sorazmernostnakonstanta je kB. Razlika je v tem, da Che-B lahko demetilira le aktivne receptorje (TA),prav tako se koncentracija teh receptorjev spreminja in se hitrost demetilacija manjša zvečanjem koncentracije vseh aktivnih (TA) receptorjev. Četrti člen je enak drugemu, leda predstavlja demetilacijo TA

m in s tem nižanje koncentracije TAm .

Enačbe (6)-(8) so nekoliko preprostejše, saj opisujejo navadne kemijske reakcije. Takonam (6) pove, kako se s časom spreminja koncentracija Ap. Ta se povečuje ko aktivni re-ceptorji (TA) fosforilirajo CheA. Hitrost fosforilacije je premosorazmerna koncentracijamTA in A ter konstanti kA. Drugi in tretji člen sta zgrajena na podoben način in predsta-vljata nižanje Ap, ko ta oddaja fosforno skupino Y ali B. Dalje nam enačba (7) pove, kakose spreminja Yp. Ta se poveča, če Y prejme fosforno skupino od Ap, kar predstavlja prvičlen na desni. Zadnja dva člena predstavljata nižanje Yp zaradi defosforilacije s pomočjoCheZ ter zaradi spontane defosforilacije, ki je odvisna le od trenutnega Yp in konstanteγY . Zadnja enačba (8) opisuje spremembe Bp in je zelo podobna prejšnji (7), le da nobenprotein ne opravlja defosforilacije Bp. Ostalo je enako, Bp se poveča, ko prejme fosfornoskupino od Ap, ter manjša, ko spontano razpada s konstanto γB.

Model deluje na sledeč način: Ko se koncentracija L liganda (aspartat) poveča, ak-tivnost receptorjev pade (enačba (4)), kar upočasni fosforilacijo CheA v CheA-P (enačba(6)). CheA-P oddaja fosforno skupino CheY, ko se torej zmanjša koncentracija CheA-P, pade tudi koncentracija CheY-P (enačba (7)), ki je signalni protein za motor. ManjCheY-P pomeni tudi manjšo fosforilacijo CheB v CheB-P (enačba (8)). To povzročimanjšo demetilacijo aktivnih receptorjev (enačba (5)), zato se čez nekaj časa št. aktivnihreceptorjev poveča (en. 4) in vrne nazaj na začetno vrednost. Bakterija se tako adaptirana novo okolje.

Odvisnost smeri vrtenja motorja od koncentracije CheY-P je bila izmerjena [3] in jepodana z Hillovo funkcijo

9

τ =Y Hcp

Y Hcp +KHc

c

, (9)

kjer sta Hc in Kc Hillova koeficienta in τ verjetnost, da se motor vrti desno (slika 4a).Motor je zelo občutljiv že na majhne spremembe signalnega proteina, kar je potrebnalastnost, če naj bo kemotaksa dovolj učinkovita. Po drugi strani pa mora koncentracijatega proteina ves čas ostati v mejah občutljivosti motorja (med približno 2,2 in 4,5 µM),če naj kemotaksa sploh deluje. To nas pripelje do naslednje pomembne lastnosti aparatain sicer: stacionarna koncentracija CheY-P je približno 3 µM in je neodvisna na n-kratnokorelirano spremembo totalnih koncentracij vseh proteinov.

Med celicami v populaciji prihaja do kvantitativnih razlik v sintezi proteinov, kar jeposledica naravne variabilnosti. Variabilnost je med različnimi proteini večinoma koreli-rana (slika 4b). Bila je izmerjena [2] in jo lahko opišemo z

Xi = X̄i(rex + νξ(2)i ), (10)

kjer jeXi koncentracija i-tega proteina ter X̄i njegova povprečna koncentracija. Parameter

rex = Nr exp[αξ(1) ln(10)] (11)

je korelirana variacija in torej enaka za vseh 5 proteinov. α in ν predstavljata intenzivnostkorelirane in nekorelirane variacije ter imata oba vrednost 0,2, ξ(1) in ξ(2) sta normalno po-razdeljeni naključni števili s povprečjem 0 in standardno deviacijo 1, Nr je normalizacijskakonstanta, ki je izbrana tako, da velja 〈Xi〉 = X̄i.

(a) (b)

Slika 4. Odziv motorja in variacije proteinov. a) Verjetnost, da se motor vrti desno (τ) vodvisnosti od koncentracije fosforiliranega proteina CheY-P, b) Fazni diagram relativnihkoncentracij dveh proteinov pri 100 različnih bakterijah (vrednosti so izračunane z enačbo(10)).

Izhodni signal (CheY-P) kemotaktičnega aparata je neodvisen od koreliranega šumav sintezi beljakovin, kar omogoča, da ima v populaciji kar največ bakterij sposobnostkemotakse. Po drugi strani pa kemotaktični aparat ni invarianten na (manjši) koreliranšum. Zaradi tega imajo znotraj populacije bakterije različne „osebnost“. Stacionarne

10

koncentracije CheY-P se od celice do celice malo razlikujejo. Motorji neke bakterije setako večinoma vrtijo levo in bakterija večinoma plava in dela dolge skoke. Motorji drugebakterije pa veliko preklapljajo med levo in desno smerjo, celica se več časa vrti in delakratke skoke.

3.2 Motor

Enačba (9) podaja verjetnost, da se motor v poljubnem trenutki vrti v desno. Pri pov-prečni bakteriji v izotropnem okolju je ta približno 0,2 [1, 2, 8]. Porazdelitev trajanjavrtenja v neko smer je bila izmerjena [4] za različne vrednosti τ in jo lahko opišemo zgama porazdelitvijo. Izmerjene vredosti parametrov teh gama porazdelitev, so prikazanev tabeli 1. Eksperimentalni podatki obstajajo samo za 9 diskretnih vrednosti τ , od 0,1do 0,9 s korakom 0,1. Pri poljubnem τ se porazdelitev izbere z linearno interpolacijo oz.ekstrapolacijo, če je τ manj kot 0,1 ali več kot 0,9. Pri τ npr. 6,7 je tako 70 % verjetnost,da se čas vrtenja motorja izbere iz porazdelitve pri τ = 7, in 30 % verjetnost da se izbereiz tiste pri τ = 6. Kadarkoli motor spremeni smer, se novi čas vrtenja določi iz gamaporazdelitve, ki je odvisna od trenutnega τ . Pri povprečnem τ = 0, 2 traja vrtenje v levo1,3 s in vrtenje v desno 0,33 s. Tako definiram, da motor obrne smer, ko je izpolnjenpogoj

tvrt ≥ t0(τ)〈t(τ)〉〈t0(τ)〉

, (12)

kjer je tvrt pretekli čas vrtenja v trenutni smeri, t0(τ) je celotni čas določen z gamaporazdelitvijo ob začetku vrtenja v trenutni smeri, 〈t(τ)〉 in 〈t0(τ)〉 sta trenutni in začetnipovprečni čas vrtenja.

Tukaj predpostavim

• motor se takoj odzove na spremembe v koncentraciji CheY-P,

• gama porazdelitve so za različne τ med seboj podobne, saj so parametri oblike gamaporazdelitve za vse τ med 2 in 5.

Recimo, da v nekem trenutku, pri τ = 0, 2, motor obrne smer iz desne v levo. Na-ključno se izbere nek čas vrtenja npr. 2 s. Bakterija plava v neugodni smeri in po preteku1 s se τ poveča na 0,25. Motor bi se moral vrteti levo še 1 s, vendar so se pogoji spremenili,zato se preostali čas vrtenja zmanjša po enačbi (12) na 0,66 s.

3.3 Plavanje

Sedaj je treba ugotoviti še, kako smer vrtenja motorjev vpliva na gibanje bakterije. Eks-perimentalni podatki [5] kažejo, da celica plava naprej, ko se vse flagele vrtijo levo in sozdružene v snop (lahko tudi plava, ko se vse vrtijo v desno, a je to zelo redko). Ko enaizmed flagel obrne smer, zapusti snop in spremeni smer gibanja celice za povprečno ≈ 35◦

[5] (to velja, če ima bakterija vsega skupaj 4 flagele). Hitrost plavanja se zmanjša gledena to, koliko flagel je zapustilo snop.

Na podlagi eksperimentalnih podatkov sem tako določil, da ima simulirana E. coli 4flagele, ki so lahko v treh oblikah:

• normalna oblika (2): motor se vrti levo,

11

Levo Desnoτ kL θ−1

L kD θ−1D

0,1 2 0,8 5 16,50,2 3 2,3 5 150,3 3 3,5 5 13,30,4 4 5,9 5 110,5 5 9,3 5 9,30,6 5 12 4 6,50,7 5 14 3 3,50,8 5 17 3 2,50,9 5 21 2 1

Tabela 1. Parametri gama porazdelitev, ki opisujejo čas vrtenja motorja v določeni smeri,pri različnih τ . Vzel sem izmerjene [4] vrednosti, ter jih nato fino nastavil tako, da je grafpovprečnega časa vrtenja v neko smeri v odvisnosti od τ , čim bolj gladek.

• pol zavita (0): prvih 0,08 s, ko motor preklopi v desno,

• kodrasta (1): ko se vrti desno več kot 0,08 s.

V oklepajih so napisane obtežitve (f) posamezne oblike, ki se uporabijo pri izračunuhitrosti bakterije. Hitrost definiram kot

v = vmax ·(∑

fi8

)2

, (13)

kjer je vmax maksimalna hitrost ter fi oblika i-te flagele. Vsota gre po vseh štirih flagelah.Celotna sprememba smeri, ko en biček obrne v desno, se določi naključno s povprečjem

pri okoli 40o, oblika porazdelitve je opisana v naslednjem poglavju. Glede na eksperimen-talne podatke sem določil, da se celotna sprememba izvrši enakomerno v dveh zaporednihkorakih, to je 20 ms in 40 ms po tem, ko motor obrne v desno. Tako definirana hitrostplavanja in sprememba smeri približo opišeta mehaniko in hidrodinamiko gibanja E. coliv tekočini. Smer se bakteriji ves čas spreminja tudi zaradi rotacijske difuzije (enačba (3)),kot je bilo opisano v prejšnjem poglavju.

3.4 Hrana in razmnoževanje

Ukvarjal sem se tudi z razvojem in uspešnostjo populacij. Tako sem simuliral tudi porabohrane in razmnoževanje. Hrano sem postavil na 2D mrežo z medmrežno razdaljo 50 µm,kar hrana predifundira v približno 2 s (pri D ≈ 10−9 m2/s). Med različnimi točkami mrežehrana ne more difundirati, saj bi bilo simuliranje tega zelo časovno potratno. Bakterijese lahko prosto gibljejo in na mrežo niso vezane. Koncentracija hrane se določi z line-arno interpolacijo najbližjih štirih točk mreže. Prav tako se z interpolacijo določi, kolikohrane s katere točke bakterija poje. Izbral sem, da simulirana E. coli porablja hranopremosorazmerno njeni koncentraciji

∆Lpor = kporL∆t, (14)

kjer je L absolutna koncentracija liganda, ∆Lpor je porabljena hrana v času ∆t in kpor jekonstanta, katere vrednost je izbrana na 0,05 s−1. Za L večje od Lmax je poraba konstantna

12

in enaka vrednosti pri Lmax. Bakterija potrebuje energijo za delovanje (življenje), izbralsem, da vsako sekundo potrebuje Ldel = 0,5 µM hrane. Sprememba v lastni zalogi ∆Lshr

je torej

∆Lshr = ∆Lpor −∆Ldel. (15)

Če se želi celica množiti, mora seveda pojesti več kot porabi za preživetje. Celica se razdeli,ko zaloga hrane doseže kritično vrednost pri 20 mM. To pomeni, da se v najboljših pogojihrazdeli vsakih 7 min. Dejanski čas pri resničnih celicah je 20 min. Krajši čas sem izbralzato, da se pri simuliranju uspešnosti populacij prej pokažejo rezultati (v 4 urah namestov 12). Simuliranje 4 ur življenja ene populacije bakterij je trajalo dobre 3 dni. Simuliranje12 ur bi trajalo okoli 10 dni. Podrobnosti o tem so opisane v naslednjem poglavju priizvedbi.

Pri delitvi se poleg originalne bakterije ustvari njena kopija, ki nato po svoje nadaljujepot. Vsaka hčerinska bakterija obdrži polovico celotne zaloge hrane, vse ostale lastnosti soenake kot pri materi. Pri simulacijah, kjer upoštevam variabilnost totalnih koncentracijproteinov med celicami, je korelacija med koncentracijami proteinov matere in hčera 50%.Ena hčera je enaka kot mama, drugi pa se proteini določijo na novo, neodvisno od mame.Tako je prvi otrok enak mami (100 % korelacija), drugi pa popolnoma neodvisen (0%korelacija).

Če bakterija nič ne poje, bo porabila vso hrano, ki jo ima ob rojstvu (10 mM), vdobrih 5 urah. Ko ji zmanjka energije za delovanje, ne umre, ampak se ustavi (motorji senehajo vrteti). Tako hibernira in čaka, da bo mogoče po naključju od koder prišla hrana.Glede na to, da so simulacije trajale do 4 ure, nobena izmed bakterij ni mogla porabitivse zaloge hrane. Zato sem hibernacijo v modelu izpustil.

4 Izvedba simulacij in parametri

Vse simulacije so bile narejene v programu Matlab 7.5.0 (R2007b) in so tekle na domačemračunalniku (Core 2 Duo 2,67 GHz, 4GB Ram). Bakterije so postavljene na ravnino, z alibrez hrane, po kateri se gibljejo. Med seboj ne interagirajo in nimajo razsežnosti (lahkosta dve na istem mestu). Časovni korak pri gibanju je 20 ms. Sistem enačb (5)-(8), kiopisujejo reakcije med proteini sem reševal z Eulerjevo metodo s korakom 1 ms. V tabeli2 so podani parametri, ki sem jih uporabil v simulacijah.

Konstante kemijskih reakcij, totalne koncentracije proteinov in metilacija receptorjevso povzeti po [2], le konstante kR, KR, kB, KB sem malo spremenil. Originalne vrednostiso: kR = 0,39 s−1, KR = 0,099 µM, kB = 6,3 s−1 in KB = 2,5 µM. Te konstante niso dobroeksperimentalno izmerjene in so bile določene tako, da ima kemotaktični aparat adapta-cijski čas 100 s po nenadnem povečanju koncentracije liganda (α-metil-DL-aspartat) od0 do 35 µM in adaptacijski čas 25 s po odvzemu liganda. Eksperimentalna vrednost zaτ ≈0,2 [1, 2, 8], zato sem nastavil te konstante tako, da je povprečni τ simuliranih bakterij0,22. Graf na sliki 5a prikazuje odziv sistema na dodatek 35 µM aspartata po 100 s, terodvzem po 300 s. Vidi se, da praktično ni razlike v relaksacijskih časih med mojimi inoriginalnimi parametri.

Kadar motor obrne smer v desno in biček zapusti snop, bakterija spremeni smer.Eksperimentalni podatki [5] kažejo, da je povprečna sprememba smeri med 30◦ in 40◦.Meritev je premalo, da bi lahko natančno določil verjetnostno porazdelitev spremembesmeri, tako sem izbral gama porazdelitev s parametri kgam = 5 in θgam = 0,14, ki je

13

Konstante kem. reakcij Tot. konc. proteinov [µM]kR 0,37 s−1 AT 5,3kB 6,6 s−1 BT 0,28k

′B 3 µM−1 s−1 RT 0,16kA 50 µM−1 s−1 Y T 9,7kY 100 µM−1 s−1 ZT 3,8kZ 7,89 µM−1 s−1 Ostali parametriγB 1 µM−1 s−1 dt 1 msγY 0,1 µM−1 s−1 dtpos 20 msKR 0,105 µM Drot 0.15 rad2/sKB 2,7 µM vmax 30 µm/sHm 1,2 kgam 5Hc 10,3 θgam 0,14Kc 3,1 µM tcepitvemin 7 minT T 5,3 µM kpor 0,05 s−1

Lmax 500 µMMetilacija receptorjev

V0 0 K0 2,7 µMV1 0,25 K1 20 µMV2 0,5 K2 150 µMV3 0,75 K3 1,5 mMV4 1 K4 60 mM

Tabela 2. Paramteri in konstante, ki sem jih uporabil v simulacijah gibanja in razmnože-vanja E. coli

prikazana na sliki 5b. Izkaže se, da oblika porazdelitve ne vpliva bistveno na rezultatesimulacij. Lahko bi izbral Poissonovo, Gaussovo ali enakomerno porazdelitev, pomembnoje le, da ima povprečje ≈ 40◦.

Na vsakem koraku se orientacija bakterije spremeni tudi zaradi rotacijske difuzije

θn+1 = θn +√

2Drotdtpos · ξ ≈ θn + 0.08 · ξ, (16)

kjer je ξ normalno porazdeljeno naključno število s povprečjem 0 in standartno deviacijo1.

Pri simulacijah so totalne koncentracije proteinov v bakterijah enake vrednostim iztabele 2, razen kjer je posebej poudarjeno drugače.

4.1 Meritve gibanja

Berg je že leta 1972 opazoval E. coli pod mikroskopom in karakteriziral njeno obnašanjes plavanji in vrtenji (angl. swimming & tumbling) [6]. Vsakih 80 ms se pogleda smerbakterije. Če se ta v dveh zaporednih korakih spremeni za več kot 35◦ ali se spremeniza ta kot v enem koraku in je skupno po dveh korakih tudi večja od 35◦, se to šteje zazačetek vrtenja. Po drugi strani se za konec vrtenja oz. začetek plavanja šteje, ko vsaj 3korake (na vsakem posebej) celica ohranja svojo smer. Ohranitev smeri pomeni, da se tane spremeni za več kot 35◦. E. coli potem plava, dokler ni izpolnjen pogoj za vrtenje, in

14

(a) (b)

Slika 5. a) Primerjava odzivnosti sistema (polna modra črta - moji parametri, rdečačrtkana - iz ref. [2]). b) Verjetnost (P ) za spremembo smeri bakterije, ko en motor obrnesmer in biček zapusti snop (gama porazdelitev s parametri kgam = 5 in θgam = 0,14 radoz. ≈ 8◦ )

se nato vrti, dokler spet ni izpolnjen pogoj za plavanje.

4.2 Časovna zahtevnost

Najbolj časovno zahtevno je numerično reševanje diferencialnih enačb (5)-(8), kar jesistem 8 navadnih diferencialnih enačb. Lahko ga zmanjšamo na 7 enačb, saj veljaT T =

∑4m=0 Tm, torej dT4 = −

∑3m=0 dTm, saj je T T koncentracija vseh receptorjev

in je konstantna.Simuliranje 1 min življenja 1000 bakterij traja na domačem računalniku okoli 40 min.

To ponavadi ni tako problematično, saj je za večino rezultatov dovolj 10 min življenjabakterij, razen ko vključim tudi razmnoževanje. Tedaj mora biti celoten čas simuliranegaživljenja nekajkrat večji, kot je povprečni čas delitve. Zato sem tudi umetno znižal naj-hitrejši možni čas delitve z 20 na 7 minut. Pri 7 minutah dobim povprečni čas delitveokoli 1 ure, in tako se po 4 urah že pokažejo rezultati. Za simuliranje teh 4 ur računalnikpotrebuje dobre 3 dni, če začnem s 50 bakterijami.

5 Rezultati in diskusija

5.1 Izotropno okolje

Najprej sem delal simulacije brez prisotnosti hrane in primerjal rezultate z eksperimenti.Trajektoriji dveh bakterij sta prikazani na sliki 6. Vzorčni čas med pikami je 0,1 s,zato lahko z grafa razberemo tudi hitrost. Vidimo značilno gibanje E. coli, ki ga lahkokarakteriziramo s plavanji, ko celica plava približno premo, ter vrtenji, ko je dokaj namiru in spreminja smer. Slika 7 kaže spreminjanje hitrosti bakterije v 10 s intervalu.Največja možna hitrost je 30 µM/s ter povprečna 21,5 µM/s. Oba grafa sta zelo podobnaeksperimentalnim podatkom [6], prav tako imajo simulirane celice enako maksimalno in

15

povprečno hitrost kot realne.

Slika 6. Trajektorij dveh bakterij v okolju brez ligandov v 30 s intervalu, vzorčni čas je0,1 s

Slika 7. Hitrost ene bakterije v 10 s intervalu

Na sliki 8a vidimo porazdelitev trajanja posameznega vrtenja. Porazdelitev je ekspo-nentna s povprečjem 0,13 s. Slika 8b nato prikazuje porazdelitev sprememb smeri prienem vrtenju, z povprečno vrednostjo 63◦. Dalje slika 9 prikazuje distribucijo trajanjaplavanj za eno bakterijo in za populacijo z variabilnimi proteini. Porazdelitev populacijes konstantnim proteini (vse bakterije se obnašajo enako) je identična kot pri samo enibakteriji, saj je vsota enakih eksponentnih funkcij še vedno eksponentna funkcija. Čenato pogledamo populacijo z variabilnimi proteini, je porazdelitev spet za vsako posame-zno bakterijo eksponentna, vendar z različnimi parametri (povprečna vrednost, strmina)pri različnih bakterijah. Ko seštejemo med seboj te različne eksponentne funkcije, do-bimo potenčno porazdelitev. Porazdelitvi obeh, plavanj in vrtenj, sta za eno bakterijoeksponentni. Statistika je Poissonova, saj je v vsakem trenutku verjetnost, da bakterijapreklopi med vrtenjem in plavanjem, konstantna.

16

(a) (b)

Slika 8. Porazdelitev trajanja posameznega vrtenja in spremembe orientacije pri vrtenju.a)Porazdelitev posameznega trajanja je eksponentna s povprečjem 0,13 s. N predstavljaštevilo dogodkov znotraj 0,8 s intervala, rdeča premica je teoretična eksponentna poraz-delitev. b)Porazdelitev spremembe orientacije pri posameznem vrtenju. N predstavlja št.dogodkov v 9◦ intervalu. Povprečna sprememba smeri je 63◦

Populacija E. coli je difuzivna. Difuzijski koeficient se lahko oceni, tako da bakterijeprimerjamo z molekulami plina. Vrtenje bakterij primerjamo s trki. Za idealni plin velja[11], da je difuzijska konstanta

D =τpp v

2

3, (17)

kjer je v povprečna hitrost ter τpp povprečen čas med trki. V enačbo vstavimo podatkeza E. coli, v ≈ 20µm/s in τpp ≈ 2 s, ter dobimo D ≈ 300 µm2/s. Predpostavka vkinetični teoriji plinov je, da po trku molekula izbere novo smer popolnoma naključno.Po enem vrtenju se smer E. coli spremeni za ≈ 62◦, torej še obstaja korelacija medsmerjo zaporednih plavanj. Tako sem ocenil, da se orientacija skoraj popolnoma pozabipo približno dveh trkih, torej po ≈ 2 s.

Difuzijo simulirane populacije predstavlja slika 10. Vse celice so ob začetku simulacije vsredini in se nato razpršijo. Zaradi naključnega (Brownovega) gibanja v dveh dimenzijah,velja, da je ⟨

r2⟩

= 4Dt, (18)

kjer je 〈r2〉 povprečni kvadrat odmika od začetne lege po času t. Naklon premice na sliki10a je približno 1200 µm/s, kar da D ≈ 300 µm/s. Ujemanje z ocenjeno vrednostjo jezelo dobro.

Za primerjavo med simuliranimi in realnimi bakterijamu podajam nekaj eksperimen-talnih podatkov v izotropnem okolju:

• maksimalna hitrost je 30 µm/s ter povprečna približno 20 µm/s [6, 8],

• porazdelitev trajanj vrtenj je eksponentna s povprečjem 0,14 s, povprečna spre-memba smeri je približno 60o [6, 8],

• plavanja posamezne celice so porazdeljena eksponentno s povprečjem 0,88 s, celotnapopulacija ima dolg rep (long tail) [6],

17

(a) (b)

Slika 9. Porazdelitev trajanja posameznih plavanj. Rdeči premici sta vodilo očem, da seopazita ekspontna in potenčna porazdelitev a) Porazdelitev trajanj posameznih plavanj za1 bakterijo, s povprečno koncentracijo kemotaktičih proteinov iz tabele 2, je eksponentnas povprečjem ≈ 1 s. N pomeni število dogodkov v 0,24 s intervalu b) Porazdelitev trajanjposameznih plavanj za 300 bakterij, z različnimi koncentracijami proteinov, izračunanihpo enačbi (10), je potenčna s povprečjem ≈ 1,5 s. N pomeni število dogodkov v 0,5 sintervalu

• difuzijska konstanta za populacijo znaša D ≈ 400 µm2/s [1].

Moje simulacije potekajo v dveh dimenzijah, medtem ko so eksperimentalni podatkipridobljeni seveda iz 3D. Kljub temu se rezultati kar lepo ujemajo. Pri teh simulacijah jenajpomembneje, da imajo rezultati enako obliko porazdelitve (eksponentno, potenčno),kot eksperimentalni podatki. Tako lahko rečem, da se simulirane bakterije obnašajo zelopodobno realnim. Ocenjujem, da je model, ki opisuje gibanje bakterij, dokaj dober.

5.2 Odziv na gradient hrane

Obnašanje E. coli sem simuliral v linearnih in eksponentnih gradientih hrane. 300 bakterijje ob začetku simulacije na ravnini v točki [0, 0], ter se nato prosto giblje. Odziv se merikot povprečna hitrost populacije proti gradientu. Vsi parametri so enaki kot v prejšnjemsklopu, med bakterijami ni variabilnosti proteinov, ne jejo hrane in se ne razmnožujejo.Koncentracijo hrane pri linearnem gradientu definiram kot

L = kabsL x+ L0 (19)

za x ≥ −L0/kabsL in L = 0 za x ≤ −L0/k

absL , kjer je L koncentracija hrane, kabsL velikost

gradienta, L0 začetna koncentracija hrane v izhodišču in x pomeni x-koordinato. Takokoncentracija nikdar ni negativa. V eksponentnem gradientu je koncentracija hrane

L = L0 exp[krelL x], (20)

kjer je krelL velikost relativnega gradienta. V eksponentno porazdeljeni hrani je gradientprav tako eksponenten, relativni gradient krelL = ∇L/L je tako v vseh točkah konstanten.Slika 11a prikazuje dve bakteriji, ki se gibljeta v ravnini, kjer se koncentracija liganda

18

(a) (b)

Slika 10. Difuzija 500 bakterij v izotropnem okolju. a) Povprečje kvadrata oddaljenostiod izhodišča v odvisnosti od časa. Rdeča črta kaže teoretično napoved po enačbi (18) zaD=1250 µm/s. b) Prostorska porazdelitev bakterij po 10 minutah, vsak krogec predstavljaeno bakterijo.

linearno spreminja. Obnašanje je podobno kot v izotropnem okolju (slika 6) le da v pov-prečju bakteriji potujeta desno, proti višji koncentraciji liganda. Na sliki 11b je primerjavamed odzivnostjo v linearnem in eksponentnem gradientu. Parametri so nastavljeni tako,da sta v obeh primerih v izhodišču absolutni in relativni gradient enaka. Vidi se, daostaja hitrost populacije konstantna v eksponentnem gradientu, torej simulirana E. colise odziva na relativni gradient, enako kot resnična [7].

Dalje me je zanimalo, kako je povprečna hitrost populacije odvisna od velikosti re-lativnega gradienta. Rezultate prikazuje slika 12. Hitrost narašča približno linearno zrelativnim gradientom (med 0 in 1,5 mm−1), tako v tem območju približno velja Weber-Fencherjev zakon. Zapišemo lahko

vpop = 6300 µm2/s ·(krelL − 0, 1 mm−1

), (21)

kar velja za relativne gradiente od 0,1 mm−1 do 1,5 mm−1. Na relativne gradiente manjšeod 0,1 mm−1 se bakterije ne morejo odzvati, pri večjih od 1,5 mm −1 pa je povprečnahitrost populacije konstantna in znaša približno 8 µm/s.

Eksperimentalni podatki [7] dajo graf enake oblike. Hitrost najprej narašča ter senato ustali pri konstantni vrednosti za relativne gradiente večje od 1,5 mm−1. Vendarobstaja razlika, saj je povprečna izmerjena hitrost populacije okoli 2-krat manjša. Tolahko pojasnim z dejstvom, da sam delam simulacije v dveh dimenzijah, medtem ko soeksperimenti delani v treh dimenzijah. Pri gibanju v treh dimenzijah bakterija težje najdepravo smer gradienta, saj obstajata dve drugi nepravi smeri, po katerih se lahko giblje.V 2D ima bakterija na voljo le eno dimenzijo pravokotno na gradient, tako je verjetnost,da se v poljubnem trenutku giblje v pravi smeri, večja. Podobno velja za situacijo, ko jebakterija pravo smer zadela in želi na njej ostati. V 3D deluje rotacijska difuzija okolivseh treh osi, medtem ko pri 2D le okoli ene. Tako 3D bakterija težje ohranja pravosmer. Bakterija simulirana v 3D bi bila manj kemotaktična in lahko pričakujem, da bi sevredosti za povprečno hitrost populacije zelo približala eksperimentalni. Poleg tega sem

19

(a) (b)

Slika 11. Odziv na gradient koncentracije hrane. a) Trajektoriji dveh bakterij v linearnemgradientu z kabsL =100 µM/mm in L0=100 µM v 60 s intervalu. b) Časovna odvisnostpovprečne pozicije 300 bakterij v linearnem (modra črta, L0=100 µM, kabsL =100 µM/mm)in eksponentnem (rdeča črta, L0=100 µM, krelL =1 mm−1) gradientu hrane.

predpostavil, da se motor takoj odzove na spremembo koncentracije CheY-P, kar ni nujnores. Odzivni čas večji od koraka v simulacijah (20 ms), bi tako zmanjšal učinkovitostsimulirane kemotakse.

5.3 Uspešnost populacij

Na koncu sem se ukvarjal še z simuliranjem porabe hrane in razmnoževanjem. Idejain parametri so zapisani v poglavju 3.4. Zanimala me je uspešnost populacij z in brezvariabilnosti v totalnih koncentracijah proteinov. Simuliral sem vsako populacijo posebej,a v enakih pogojih. Slika 13a prikazuje porazdelitev Gausovih hribčkov hrane po ravniniin bi naj predstavljala neko realno okolje, v katerem E. coli živi. Na začetku 50 bakterijpostavim v točko na sredini, označeni z belo piko, ter jih pustim, da se prosto gibljejo,porabljajo hrano in se razmnožujejo. Iz te 3 krat 3 cm ravnine ne morej pobegniti.Začetna zaloga hrane pri vseh je 10 mM.

Slika 13b kaže število bakterij vsake izmed populacij v odvisnosti od časa, slika 14pa distribucijo bakterij in hrane po 40, 120 in 240 minutah. Na začetku je populacija zvariabilnimi proteini manj uspešna, saj vsebuje tudi bakterije, kjer se proteini namešajo vtakšnih razmerjih, da pade koncentracija CheY-P izven občutljivosti motorja. Takšne bak-terije samo plavajo ali se samo vrtijo in niso sposobne kemotakse. Tako je kemotaktičnaučinkovitost celotne variabilne populacije manjša kot učinkovitost konstantne populacije.Namenoma sem postavil začetno lego bakterij v gradient, da se opazi ta razlika.

Na dolgi rok pa je variabilna populacija veliko uspešnejša. Bakterije, ki samo plavajooz. delajo zelo dolge skoke, že kar hitro zapustijo kolonijo (slika 14b). Tu in tam ponaključju katera najde novo gručo hrane in mogoče ostane tam dovolj dolgo, da se razcepi.Obstaja znatna verjetnost, da bo vsaj ena izmed hčera, kemotaktična. Tako bo ostala nagruči hrane in ustvarila novo kolonijo. Po drugi strani konstantna populacija hitro pojevso hrano v prvi gruči ter nato počasi (vendar zanesljivo) difundira narazen. Velikokratse zgodi, da bakterije iz variabilne populacije, zaradi slabše kemotakse, zapustijo gručo,še preden so jo kolonializirale. A je ta kljub temu uspešnejša, saj konstantna populacija

20

Slika 12. Odvisnost povprečne hitrosti (proti gradientu) od relativnega gradienta hrane.Hitrost je izračunana kot povprečna lega 300 bakterij po 60 sekundah v hrani definiranipo enačbi (20) z L0=100 µM in krelL je relativni gradient. Rdeča črta predstavlja linearnoaproksimacijo med 0 in 1,5 mm −1. Strmina premice je 6300 µm2/s in predstavlja spre-membo povprečne hitrosti populacije glede na spremembo relativnega gradienta hrane.

večine gruč v času simulacije ne najde (slika 14e).Simuliral sem vsako populacijo posebej. Lahko bi ju tudi združil, in gledal, kako

tekmujeta med seboj. Pričakujem, da bi bil rezultat podoben. Na začetku bi močnejeprevladala konstantna populacija, vendar bi variabilni verjetno uspelo dokaj hitro kolo-niazirat kako bližnjo gručo. Tako je možno, da bi bile razlike v uspešnosti na koncu ševečje, saj bi variabilna populacija pojedla druge gruče, še preden bi jih konstantna splohnašla. Vsekakor bi bilo treba napoved preveriti z dejanskimi simulacijami.

Če še enkrat pogledamo sliko 9, vidimo da je značilna razlika med konstantno invariabilno populacijo v porazdelitvi dolžin posameznih plavanj. Pri konstantni populacijije porazdelitev eksponentna, pri variabilni pa potenčna. Analitično je bilo pokazano, daje naključni sprehajalec s potenčnimi skoki pri iskanju uspešnejši od eksponentnega [12].To velja za okolje, kjer je hrana redka in jo je treba najti. Variabilna populacija ima kotcelota potenčno porazdeljene skoke in je tako uspešnejša pri iskanju hrane.

Podoben rezultat so dobili tudi pri simuliranju stohastičnih variacij v metilaciji re-ceptorjev s CheR [13]. V eni celici je vsega skupaj le okoli 140 proteinov CheR [14], kise vežejo na receptor (ga metilirajo) ali prosto difundirajo po notranjosti celice. Številovezanih CheR fluktuira, zato se spreminjata tudi metilacija in posledično aktivnost recep-torjev. Ta skozi kemotaktični aparat povzroči fluktuacije v CheY-P. Bakterija spreminjasvoje razpoloženje: obstajajo obdobja z daljšimi in obdobja s krajšimi skoki. Porazde-litev trajanj skokov v dovolj dolgem časovnem obdobju je potenčna. Enako kot jaz, sougotovili, da populacija potenčnih bakterij hitreje najde hrano.

Za delovanje kemotaktičnega aparata je potrebna energija. Bakterije, ki proizvajajozelo malo proteinov odgovornih za kemotakso in tako prihranijo energijo, lahko hitreje

21

(a) (b)

Slika 13. a) Začetna porazdelitev hrane, barvna skala sledi mavrici od temno modre(0 µM) preko rumene (1000 µM) do temno rdeče (1600 µM). Vse bakterije so na začetkupostavljene v sredino označeno z belo piko; b) Časovni potek številčnostiN dveh populacij.Rdeča črta predstavlja variabilno populacijo, modra pa konstantno.

rastejo in se razmnožujejo. V homogenem okolju, ki je zelo bogato s hrano, kjer kemotaksani potrebna, bi zaradi tega najbolj prosperirale "neumne" bakterije, ki niso sposobnekemotakse. Tako bi se verjetno pokazalo, da je variabilna populacija uspešnejša tudi vizobilju hrane. Tega v svojem modelu nisem upošteval, saj sem določil, da vse bakterijeza delovanje potrebujejo enako količino energije.

Uspešnost populacij lahko pojasnim tudi na bolj "življenski način". Variabilno po-pulacijo sestavljajo bakterije, ki se obnašajo različno. Tako je ta bolj prilagodljiva narazlična okolja. Nekatere bakterije so dobre v iskanju hrane, druge v hitrem razmnoževa-nju. Končni efekt je večja uspešnost v spremenljivem okolju.

6 Zaključek

V seminarju sem opisal princip delovanja kemotakse E. coli bakterij. Model, ki opisujemolekularne procese, sem razširil, da vključuje tudi gibanje bakterij po ravnini. Pri-merjave rezultatov simulacij z eksperimenti kažejo, da je obnašanje simuliranih bakterijv izotropnem okolju primerljivo z obnašanjem resničnih. Povprečni čas plavanja je 1 s,ter povprečni čas vrtenja 0,13 s. Porazdelitvi trajanj posameznih plavanj in vrtenj staeksponenti, statistika preklapljanja med njima pa Poissonova. Povprečna hitrost bakte-rij je 21,5 µm/s, povprečna sprememba orientacije pri enem vrtenju pa 63◦. Bakterijedifundirajo z D ≈ 300µm/s.

Odzivi v gradientih kažejo, da je povprečna migracijska hitrost konstantna v eksponen-tno porazdeljeni hrani, kar kaže da se E. coli odziva na relativni gradient koncentracijeligandov. Hitrost je pri relativnih gradientih manjših od 1,5 mm−1 približno linearnoodvisna od vrednosti relativnega gradienta, kar je konsistentno z Weber-Fencherjevimzakonom.

Na koncu sem se ukvarjal še s simuliranjem porabe hrane in razmnoževanjem. Pokazalsem, da naravna variabilnost med obnašanjem bakterij poveča uspešnost celotne popula-

22

(a) 40 min, konst. (b) 40 min, var.

(c) 120 min, konst. (d) 120 min, var.

(e) 240 min, konst. (f) 240 miin, var.

Slika 14. Bakterije (bele pike) in hrana po 40, 120 in 240 minutah. Slike a), c) in e)prikazujejo populacijo, kjer imajo vse celice enako totalno koncentracijo kemotaktičnihproteinov. Na b), d) in f) se totalne koncentracije proteinov med celicami razlikujejo in seizračunajo po enačbi (10). Barvna skala (enako kot na sliki 13a) sledi mavrici od temnomodre (0 µM) preko rumene (1000 µM) do temno rdeče (1600 µM).

23

cije. Ta lastnost je verjetno splošna in mogoče velja za vse biološke vrste, tudi ljudi. Vvariabilni populaciji so posamezniki med seboj različni. Tako v spremenljivem okolju vesčas obstaja nek delež populacije, ki v trenutnem stanju prosperira bolj od povprečnegačlana te populacije. Izkaže se, da na dolgi rok neka (ne prevelika) variabilnost pozitivnovpliva na uspeh celotne populacije.

Kemotaktični aparat E. coli se je razvil tako, da lahko kar najbolje opravlja svojofunkcijo. Je neodvisen na velik koreliran šum v sintezi proteinov, manjši nekoreliran šumpa povzroči za populacijo ugodne razlike med posamezniki. Če aparat ne bi bil neodvisenna velik koreliran šum, bi bila variabilnost verjetno prevelika. Pri velikem delu bakterij bikoncentracija CheY-P padla izven občutljivosti motorja in takšna populacija bi bila kotcelota manj uspešna, saj večina posameznikov ne bi bila kemotaktična.

Tako zaključujem, da v vsaki biološki populaciji verjetno obstaja neka optimalna va-riabilnost med posamezniki, glede na okolje, v katerem populacija živi. Predvidevam,da je ta optimalna variabilnost skoraj enaka variabilnosti, ki jo dejansko opazimo v na-ravi, saj so se biološke vrste skozi evolucijo razvile tako, da so kar najbolj prilagojene naspremenljive življenske pogoje, ki vladajo v naravi.

24

Literatura[1] H. C. Berg, E. coli in Motion (Springer-Verlag, New York, 2004).

[2] M. Kollmann, L. Løvdok, K. Bartholomé, J. Timmer in V. Sourjik, Design Principlesof a bacterial signalling network, Nature 438, 504 (2005).

[3] P. Cluzel, M Surette in S. Leibler, An Ultrasensitive Bacterial Motor Revealed byMonitoring Signaling Proteins in Single Cells, Science 287, 1652 (2000).

[4] E. A. Korobkova, T. Emonet, H. Park in P. Cluzel, Hidden Stochastic Nature of aSingle Bacterial Motor, Physical Review Letters 96(5), 058105 (2006).

[5] L. Turner, W. S. Ryu in H. C. Berg, Real-Time Imaging of Fluorescent FlagellarFilaments, Journal of Bacteriology 182, 2793 (2000).

[6] H. C. Berg in D. A. Brown, Chemotaxis in Escherichia coli analyzed by Three-dimensional Tracking, Nature 239, 500 (1972).

[7] Y. V. Kalinin, L. Jiang, Y. Tu in M. Wu, Logarithmic Sensing in Escherichia coliBacterial Chemotaxis, Biophysical Journal 96(6), 2439 (2009).

[8] University of Cambridge Department of Physiology, Development and Neurosci-ence, Bacterial Chemotaxis in Silico, Biophysical data. Pridobljeno 22. 9. 2010, izhttp://www.pdn.cam.ac.uk/groups/comp-cell/Biophysics.html .

[9] Wikipedia, Flagellum base diagram. Pridobljeno 22. 9. 2010, izhttp://en.wikipedia.org/wiki/File:Flagellum_base_diagram_en.svg .

[10] S. P. Strong, B. Freedman, W. Bialek in R. Koberle, Adaptation, and optimal che-motactic strategy for E. coli, Physical Review E 57(4), 4604 (1998).

[11] R. P. Feynman, R. B. Leighton, M. Sands, Lectures on Physics, vol. 1 (Addison-Wesley, Reading, Massachusetts, 1977).

[12] G. M. Vishwanathan, S. V. Buldyrev, S. Havlin, M. G. E. da Luz, E. P. Raposo inH. E. Stanley, Optimazing the success of random searches, Nature 401, 911 (1999).

[13] F. Matthäus, M, Jagodič in J. Dobnikar, E. coli Superdiffusion and Chemotaxis -Search Strategy, Precision and Motility, Biophysical Journal 97, 946 (2009).

[14] University of Cambridge Department of Physiology, Development and Neurosci-ence, Bacterial Chemotaxis in Silico, Biochemical data. Pridobljeno 22. 9. 2010, izhttp://www.pdn.cam.ac.uk/groups/comp-cell/Data.html .

25