21

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN

1.1. Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris. Penelitian

eksperimental merupakan kegiatan percobaan (experiment) yang bertujuan untuk

mengetahui suatu pengaruh yang timbul akibat adanya perlakuan tertentu

(Notoatmojo, 2002).

1.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Parasitologi Fakultas

Kedokteran , Laboratorium Bologi Dasar Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Jember dan Laboratorium Biosains Poli Teknik

Jember. Waktu penelitian dilakukan selama bulan Agustus 2010 – februari 2011

1.3. Populasi dan Sampel Penelitian

Sampel penelitian ini menggunakan mencit galur BALB/c jantan yang

berusia sekitar 6-8 minggu. Mencit tersebut dikembangbiakan di Laboratorium

Hewan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. Jumlah mencit yang akan

digunakan yaitu sebanyak 30 mencit yang akan dibagi dalam 3 kelompok

perlakuan.

1.4. Definisi Operasional

a. Kelenjar saliva An. aconitus merupakan salah satu organ tubuh nyamuk

betina yang terdiri dari dua pasang dan disetiap bagian terdapat tiga lobus

yang menempel dibagian torak dan kepala nyamuk dengan fungsi sebagai

penghail saliva yang akan dimanfaatkan oleh Plasmodium sebagai

transportasi ke tubuh manusia yang diisolasi dengan metode diseksi dari

WHO (1975) dan Waitayakul, et al (2006) dengan modifikasi.

b. Derajat parasitemia menunjukkan infeksi parasit Plasmodium berghei

stadium aseksual dalam darah dengan indikasi dari rasio jumlah eritrosit

22

yang terinfeksi Plasmodium stadium trophozoit maupun scizont dalam 1000

eritosit dalam persen (Sutanto dan Pribadi, 2008).

c. Vaksin Pellet

Vaksin pellet adalah pellet kelenjar saliva Anopheles aconitus yang telah

melalui proses Freeze and Thaw, homogenisasi dengan water sonication,

sentrifuse dengan kecepatan 20.000g pada suhu 40C selama 15 menit

kemudian dicampurkan dengan Alumunium hydroxide adjuvant.

d. Vaksin Supernatan

Vaksin supernatan adalah supernatan kelenjar saliva Anopheles aconitus

yang telah melalui proses Freeze and Thaw, homogenisasi dengan water

sonication, sentrifuse dengan kecepatan 20.000g pada suhu 40C selama 15

menit kemudian dicampurkan dengan Alumunium hydroxide adjuvant.

e. Vaksin kontrol

Vaksin kontrol adalah vaksin yang dibuat dengan mencampurkan TBS dan

Alumunium hydroxide adjuvant kemudian di resuspensi dan vortex.

1.1.

2 minggu 4 hari2 minggu

S

K

SP

PIM 1 IM 2 IM 3

K1 K6K2 K7K3 K8K4 K9K5 K10

K1 K2K3 K4K5 K6K7 K8K9 K10

K1 K2K3 K4K5 K6K7 K8K9 K10

Inokulasi Plasmodium

berghei

Pemeriksaan derajat parasitemia

23

1.2. Rancangan Penelitian

24

1.1. Instrumen Penelitian

1.2.1. Alat Penelitian

Alat-alat yang diperlukan pada penelitian ini adalah eppendoft, water

sonicator, 1 set mikropipet, tabung valcon, cyrotube, microdissection kit,

mikroskop, alumonium foil, gelas ukur, gelas beaker, magnetic stirrer, auto clave,

disposable pipet, vortex, Laminar air flow, spuit, obyek glass, cover glass, gunting

bedah,jarum pentul, pinset, hemositometer, water sonicator,Heater, centrifuge, ph

Meter, dan tabung schoot, disposable pipet.

1.1.1. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 2000 pasang isolat

salivary gland A. Aconitus, TBS ( Tris Buffer Saline ), PBS (Phosphate Buffer

Saline), Aluminium hidroksida, Methanol, Alkohol, zat warna Giemsa,

chloroform, vacutainer heparin, complete medium, medium plus, freezing

solution.

1.2. Prosedur Penelitian

1.2.1. Preparasi Kelenjar Saliva Anopheles aconitus.

Penelitian ini membutuhkan ± 2000 pasang kelenjar saliva Anopheles

aconitus betina yang steril. Tahap isolasi kelenjar saliva nyamuk ini terdiri dari

proses mematikan nyamuk, proses diseksi kelenjar saliva, dan proses

penyimpanan. Proses mematikan nyamuk dilakukan dengan menggunakan

chloroform, setelah itu dilakukan diseksi kelenjar saliva yang prosesnya dikenal

dengan nama microdissection.

Pada proses microdissection, nyamuk diletakkan di sebelah kanan pada

disposable petri disk yang sebelumnya telah diberi 1 tetes PBS terlebih dahulu.

Jarum diseksi di tangan kiri menekan dengan lembut bagian thoraks nyamuk dan

jarum diseksi di tangan kanan menarik bagian kepala dengan perlahan-lahan

hingga tampak kelenjar saliva nyamuk yang melekat di bagian kepala (berbentuk

seperti sosis,berupa badan refraktil). Kemudian, kelenjar saliva tersebut disedot

25

dengan menggunakan mikropipet. Apabila kelenjar saliva nyamuk tidak terlihat,

maka dengan menggunakan jarum diseksi di tangan kanan, thoraks yang telah

terpisah dari kepala ditetesi 1 tetes PBS, kemudian thoraks ditekan dengan lembut

di lokasi sedikit diatas jarum diseksi kiri hingga kelenjar saliva keluar secara

perlahan,ambil kelenjar tersebut dengan menggunakan mikropipet.

Kelenjar saliva yang telah dikumpulkan diletakkan dalam eppendoft yang

telah ditambahkan TBS (Tris Buffer Saline) kemudian disimpan dalam suhu

-20oC.

1.1.1. Pembuatan Vaksin

Persiapan imunisasi dilakukan dengan cara membuat vaksin yang berasal

dari kelenjar saliva yang telah diisolasi. Isolat kelenjar saliva Anopheles aconitus

tersebut dihomogenisasi terlebih dahulu, disentrifus dan ditambahkan Alumunium

hidroksida sebagai adjuvantnya.

Proses homogenisasi dilakukan dengan cara freeze and thaw yang

kemudian dilanjutkan dengan sonication. Isolat kelenjar saliva yang beku (-20oC)

direbus dalam air yang sudah mendidih ( 80-90 oC) selama 5 menit kemudian

dilakukan sonication dengan menggunakan water sonicator. Setelah homogenisasi

selesai, isolat tersebut disentrifus dengan kecepatan 20.000g pada suhu 4ºC

selama 15 menit sehingga didapatkan pellet (SG-1) sebagai vaksin I dan

supernatan (SG-2) sebagai vaksin II, yang keduanya dipakai untuk imunisasi.

Kontrol dibuat dengan tris buffer saline yang diinjeksikan pada kelompok kontrol.

Proses ini dilanjutkan dengan penambahan gel aluminium hidroksida

(alhydrogel,Sigma) dalam jumlah yang sama pada ketiga vaksin tersebut dan

disimpan dalam suhu ruangan selama 2 jam atau dalam suhu 4ºC overnight.

1.1.2. Preparasi Hewan Coba

Aklimatisasi pada mencit BALB/c dilakukan selama 2 minggu sebelum

imunisasi di Laboratorium Farmakologi FK UNEJ. Tiga puluh mencit BALB/c

dibagi menjadi 3 kelompok perlakuan dengan jumlah yang sama. Kelompok

pertama akan diimunisasi dengan vaksin I (berisi pellet kelenjar saliva), kelompok

26

kedua akan diimunisasi dengan vaksin II( berisi supernatan kelenjar saliva) dan

kelompok ketiga merupakan kontrol yang akan diinjeksi dengan adjuvant plus

tris-saline buffer.

1.1.3. Imunisasi Kelenjar Saliva Anopheles aconitus pada Mencit BALB/c

Imunisasi pada masing-masing kelompok mencit BALB/c dilakukan

selama 3 kali dengan interval waktu 2 minggu. Vaksin disuntikkan secara

subkutan pada bagian femur (paha) mencit dengan volume 100 µl. Setiap satu

minggu setelah proses imunisasi tersebut, dilakukan bedah kardial pada satu

mencit di setiap kelompok vaksin untuk diambil darahnya yang diperlukan untuk

uji serologis.

1.1.4. Preparasi Plasmodium berghei

Plasmodium berghei yang akan diinokulasikan didapat dari mencit

donor. Mencit BALB/c yang akan dijadikan donor diinokulasi dengan isolat

P.berghei dari isolat beku (Thawing). Mencit donor yang telah diinokulasi

dilakukan pemeriksaan hapusan darah tepi hingga mencapai derajat parasitemia

minimal 15% . Plasmodium berghei yang berada di darah mencit diambil dengan

pembedahan intracardial. darah yang telah diambil dimasukkan dalam heparin

vacutainner dan sebagian yang tersisa di ujung spuit diambil untuk pemeriksaan

jumlah eritrosit sebagai acuan pengambilan volume darah dari mencit untuk

memastikan jumlah Plasmodium berghei yang masuk adalah 5 X 106 dengan

hemositometer dibawah mikroskop. Setelah volume darah yang akan diambil

diketahui, ditambahkan medium complete hingga memenuhi jumlah untuk

diinokulasikan pada setiap mencit dengan volume 200µl.

1.1.5. Inokulasi Plasmodium berghei pada Mencit BALB/c

Inokulasi Plasmodium berghei pada masing-masing kelompok mencit

BALB/c dilakukan 2 minggu setelah imunisasi yang ketiga. Plasmodium berghei

disuntikkan secara intraperitoneal pada daerah peritoneal perut mencit.

27

1.1.6. Pemeriksaan Derajat Parasitemia

Pemeriksaan derajat parasitemia mencit BALB/c yang telah diinokulasi

dilakukan setelah empat hari inokulasi dan dilakukan selama tujuh hari berturut-

turut. Pemeriksaan menggunakan mikroskop perbesaran 100 x dengan hapusan

darah tepi mencit dengan pewarnaan giemsa.

1.2. Penyajian Data

Data yang diperoleh selama proses penelitian ini dicatat dalam buku catatan

harian (Log Book) dan disimpan dalam komputer. Penyajian data ditunjang

dengan adanya tabel dan gambar.

Koleksi Nyamuk Anopheles aconitus dan Preparasi Kelenjar Saliva

Pembuatan vaksin

Imunisasi kelenjar saliva

Kelompok pellet

Imunisasi I

Kelompok kontrolKelompok supernatan

Imunisasi III

Pembuatan Hapusan Darah Tepi 7 hari

berturut

Inokulasi Plasmodium berghei

Imunisasi II

Pengambilan Data

28

1.3. Alur Penelitian