BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN NGỌC THỂ

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MANG THUỐC VÀ TIÊU

DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỆ NANOGEL TRÊN

CƠ SỞ POLYSACCHARIDE SULFATE (HEPARIN, FUCOIDAN)

GHÉP CÁC COPOLYMER TƯƠNG HỢP SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH – 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN NGỌC THỂ

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 9 44 01 14

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH – 2021

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS.TS TRẦN NGỌC QUYỂN

2. TS. NGUYỄN THỊ THANH THỦY

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MANG THUỐC VÀ TIÊU

DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ HỆ NANOGEL TRÊN

CƠ SỞ POLYSACCHARIDE SULFATE (HEPARIN, FUCOIDAN)

GHÉP CÁC COPOLYMER TƯƠNG HỢP SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Công trình được thực hiện tại phòng Hóa dược - Viện Khoa học Vật liệu Ứng

dụng - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn

khoa học của PGS.TS Trần Ngọc Quyển và TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy. Các nội

dung nghiên cứu, kết quả trong luận án này là trung thực, được hoàn thành dựa trên

các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả này chưa được dùng cho bất kỳ luận án

cùng cấp nào.

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Ngọc Thể

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Ngọc Quyển và TS. Nguyễn Thị

Thanh Thủy đã định hướng khoa học, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện

luận án. Xin gởi đến Thầy và Cô những lời biết ơn chân thành nhất.

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của các anh chị và các em trong Viện Khoa học Vật

liệu Ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Học viện Khoa học

Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong suốt thời gian tôi

thực hiện luận án.

Sau cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động

viên, giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận án này.

i

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CÁM ƠN

MỤC LỤC................................................................................................................ ..i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT................................................vi

DANH MỤC CÁC BẢNG..................................................................................... viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.................................................................................. ix

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. GIỚI THIỆU VỀ MICELLE VÀ NANOGEL .................................................... 3

1.1.1. Giới thiệu micelle............................................................................................3

1.1.1.1. Cơ chế hình thành micelle ....................................................................... 3

1.1.1.2. Ưu điểm và nhược điểm của micelle ....................................................... 4

1.1.1.3. Sự đóng gói thuốc vào trong micelle ....................................................... 5

1.1.2. Giới thiệu nanogel...........................................................................................6

1.1.2.1. Sự hình thành nanogel ............................................................................. 6

1.1.2.2. Ưu điểm và nhược điểm của nanogel .................................................... 10

1.1.2.3. Sự đóng gói thuốc vào trong nanogel .................................................... 12

1.1.2.4. Phương cách phân phối thuốc của chất mang nano và nangel .............. 14

1.1.2.5. Sự giải phóng thuốc của nanogel ........................................................... 16

1.2. POLYSACCHARIDE SULFATE .................................................................... 19

1.2.1. Heparin..........................................................................................................19

1.2.2. Fucoidan.........................................................................................................20

1.3. PLURONIC ...................................................................................................... 22

1.3.1. Cấu tạo...........................................................................................................22

1.3.2. Tính chất........................................................................................................23

1.3.3. Ứng dụng.......................................................................................................23

1.4. UNG THƯ VÀ THUỐC CHỐNG UNG THƯCISPLATIN ............................. 24

1.4.1. Tổng quan về bệnh ung thư...........................................................................24

1.4.2. Cisplatin.........................................................................................................25

ii

1.5. CURCUMIN ..................................................................................................... 26

1.6. NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƯỚC ĐÂY .......................................................... 27

1.6.1. Nghiên cứu kết hợp thuốc chống ung thư cisplatin và chất mang nano.......29

1.6.2. Nghiên cứu kết hợp curcumin với thuốc chống ung thư cisplatin................32

CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU ................................................................................... 33

2.1. HÓA CHẤT ...................................................................................................... 33

2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ ................................................................................. 34

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................... 35

2.3.1. Phương pháp tổng hợp các copolymer ghép trên cơ sở polysacchride sulfate

(heparin, fucoidan) liên hợp pluronic........................................................................35

2.3.2. Phương pháp đánh giá cấu trúc, hình thái các copolymer ghép....................35

2.3.3. Phương pháp tổng hợp hệ nanogel mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate36

2.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng nhả thuốc của các hệ nanogel mang thuốc36

2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào thường)37

2.3.6. Thí nghiệm trên động vật..............................................................................38

2.3.6.1. Phương pháp ghép tế bào MCF-7 tạo mô hình chuột mang khối u ....... 38

2.3.6.2. Phương pháp tính thể tích khối u ........................................................... 39

2.3.6.3. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch bằng kháng thể SOD2 ............ 39

2.3.6.4. Phương pháp nhuộm Hemaoxylin - Eosin (H&E) ................................ 40

2.4. THỰC NGHIỆM .............................................................................................. 40

2.4.1. Tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-P123......................................................40

2.4.1.1. Tổng hợp Hep-P123 ............................................................................... 40

2.4.1.2. Tổng hợp nanogel Hep-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

............................................................................................................................... 43

2.4.1.3. Khảo sát khả năng nhả thuốc cisplatin hydrate của Hep-P123.............. 46

2.4.1.4. Đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào thường .......... 46

2.4.2. Tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68.................46

2.4.2.1. Tổng hợp Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 .......................................... 46

2.4.2.2. Tổng hợp nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 mang thuốc cisplatin

và cisplatin hydrate ............................................................................................... 47

2.4.3. Tổng hợp và khảo sát nanogel Fud-P123 .....................................................47

iii

2.4.3.1. Tổng hợp Fud-P123 ............................................................................... 47

2.4.3.2. Tổng hợp nanogel Fud-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

............................................................................................................................... 49

2.4.3.3. Khảo sát khả năng nhả thuốc cisplatin hydrate của Fud-P123 .............. 50

2.4.3.4. Đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào thường) ......... 50

2.4.4. Ứng dụng tổng hợp và đánh giá nanogel Hep-F127 mang thuốc cisplatin

hydrate kết hợp nanocurcumin (Hep-F127-CisOH-Cur) lên chuột mang khối u......50

2.4.4.1. Tổng hợp Hep-F127-CisOH-Cur ........................................................... 50

2.4.4.2. Đánh giá cấu trúc, hình thái Hep-F127-CisOH-Cur .............................. 52

2.4.4.3. Đánh giá độc tính dòng tế bào MCF-7 .................................................. 52

2.4.4.4. Khảo sát khả năng nhả thuốc của Hep-F127-CisOH-Cur ..................... 52

2.4.4.5. Quy trình tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch và ghép khối u dị loài

............................................................................................................................... 52

2.4.4.6. Quy trình thử nghiệm thuốc ................................................................... 53

2.4.4.7. Quy trình đánh giá hiệu quả của thuốc .................................................. 55

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................. 56

3.1. KẾT QUẢ TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT NANOGEL HEP-P123 ................... 56

3.1.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc các copolymer Hep-P123.................56

3.1.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-

P123-NPC và NPC-P123-Ami ............................................................................. 56

3.1.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian Hep-

DAB ...................................................................................................................... 60

3.1.1.3. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm Hep-P123 .... 62

3.1.1.4. Kết quả phân tích TGA của Hep-P123 .................................................. 65

3.1.1.5. Kết quả phân tích giá trị CMC của Hep-P123 ....................................... 66

3.1.1.6. Kết quả phân tích TEM và DLS của Hep-P123 .................................... 68

3.1.2. Kết quả tổng hợp nanogel Hep-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin

hydrate.......................................................................................................................70

3.1.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH 70

3.1.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH .. 73

3.1.3. Kết quả đánh giá khả năng nhả thuốc của Hep-P123....................................74

iv

3.1.4. Kết quả độc tính tế bào (trên dòng tế bào MCF-7 và nguyên bào sợi) .........77

3.2. KẾT QUẢ TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT NANOGEL HEP-F127, HEP-F87 VÀ

HEP-F68 .................................................................................................................... 78

3.2.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc các copolymer Hep-F127, Hep-F87 và

Hep-F68....................................................................................................................78

3.2.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-

F127-NPC, NPC-F127-Ami, NPC-F87-NPC, NPC-F87-Ami, NPC-F68-NPC,

NPC-F68-Ami ....................................................................................................... 78

3.2.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của Hep-F127, Hep-F87 và

Hep-F68 ................................................................................................................ 80

3.2.1.3. Kết quả phân tích TGA của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 .............. 81

3.2.1.4. Kết quả phân tích giá trị CMC của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 .. 82

3.2.1.5. Kết quả phân tích TEM của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 ............. 84

3.2.2. Kết quả tổng hợp nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 mang thuốc

cisplatin và cisplatin hydrate......................................................................................86

3.2.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH, Hep-

F87-Cis, Hep-F87-CisOH và Hep-F68-Cis, Hep-F68-CisOH ............................. 86

3.2.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH, Hep-

F87-Cis, Hep-F87-CisOH và Hep-F68-Cis, Hep-F68-CisOH ............................. 87

3.3. SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC NANOGEL HEP-P123, HEP-F127,

HEP-F87 VÀ HEP-F68 MANG CISPLATIN VÀ CISPLATIN HYDRATE ........... 89

3.4. KẾT QUẢ TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT NANOGEL FUD-P123 .................. 91

3.4.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc copolymer Fud-P123.......................92

3.4.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian Fud-

DAB ...................................................................................................................... 92

3.4.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của Fud-P123 ..................... 94

3.4.1.3. Kết quả phân tích TGA của Fud-P123 .................................................. 97

3.4.1.4. Kết quả phân tích giá trị CMC của Fud-P123 ....................................... 98

3.4.1.5. Kết quả phân tích TEM và DLS của Fud-P123 ..................................... 99

3.4.2. Kết quả tổng hợp nanogel Fud-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin

hydrate.....................................................................................................................100

v

3.4.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH

............................................................................................................................. 100

3.4.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH . 102

3.4.3. Kết quả quả đánh giá khả năng nhả thuốc của Fud-P123............................102

3.4.4. Kết quả độc tính tế bào (trên dòng tế bào MCF-7 và nguyên bào sợi) .......103

3.5. SO SÁNH KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CỦA NANOGEL HEP-P123 VÀ FUD-

P123 MANG CISPLATIN VÀ CISPLATIN HYDRATE ...................................... 104

3.6. KẾT QUẢ TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ NANOGEL HEP-F127 HEP-F127

MANG THUỐC CISPLATIN HYDRATE KẾT HỢP NANOCURCUMIN (HEP-

F127-CISOH-CUR) LÊN CHUỘT MANG KHỐI U ............................................. 106

3.6.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F127-CisOH-Cur...........................107

3.6.2. Kết quả phân tích TEM của Hep-F127-CisOH-Cur....................................108

3.6.3. Kết quả phân tích ICP-OES và UV-Vis của Hep-F127-CisOH-Cur...........109

3.6.4. Kết quả khảo sát khả năng nhả thuốc của Hep-F127-CisOH-Cur..............109

3.6.5. Kết quả độc tế bào trên dòng tế bào MCF-7 của Hep-F127 và Hep-F127-

CisOH-Cur bằng phương pháp nhuộm SRB............................................................110

3.6.6. Kết quả thử nghiệm nanogel Hep-F127-CisOH-Cur lên mô hình chuột mang

khối u ......................................................................................................................112

3.6.6.1. Kết quả tạo mô hình chuột mang khối u .............................................. 112

3.6.6.2. Kết quả đánh giá kích thước khối u chuột trong thời gian điều trị ...... 113

3.6.6.3. Kết quả nhuộm mô khối u đánh giá hiệu quả điều trị .......................... 116

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 119

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 121

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................... 122

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 123

PHỤ LỤC ................................................................................................................ 140

vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Ý nghĩa

Hep Heparin

Plu Pluronic

Fud Fucoidan

Cur Curcumin

Plu Pluronic

Cis Cisplatin

CisOH Cisplatin dạng hydrate

NPC p-nitrophenyl chloroformate

EDC 1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide

NHS N-hydroxysuccinimide

DAB 1,4-diaminobutane

Ami 3-amino-1-propanol

Da Dalton

DLS Dynamic Light Scattering: máy đo phân tán động học laser

TEM Transmission Electron Microscopy: Kính hiển vi điện tử truyền

qua

1H-NMR Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân

TGA Thermogravimetric Analyzer: Phân tích nhiệt trọng lượng

ICP-OES Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry:

quang phổ plasma phát xạ nguyên tử

FT-IR Fourier Transform Infrared spectroscopy

IU international unit

LMWH Low Molecular Weight Heparin: Heparin khối lượng phân tử

thấp

EPR Enhanced Permeability and Retention Effect

PEO-PPO-PEO poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene

oxide)

vii

PEG Polyethylene glycol

CMC Critical Micelle Concentration

HLB Hydrophilic-lipophilic balance: Cân bằng ưa nước - ưa béo

FDA Food and Drug Administration

SRB Sulforhodamine B colorimetric assay

PBS Phosphate buffered saline

DI Deionized

MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7

MWCO Molecular weight cut-off

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần của fucoidan ở các loài rong nâu .......................................... 21

Bảng 1.2. Thông số đặc trưng của một số pluronic .................................................. 24

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất ................................................................................... 33

Bảng 2.2. Số liệu tổng hợp Hep-DAB theo 4 tỉ lệ mol khác nhau ............................ 42

Bảng 2.3. Số liệu tổng hợp Hep-P123 theo 4 tỉ lệ mol khác nhau ............................ 43

Bảng 2.4. Số liệu Cis, AgNO3 dùng để tổng hợp Hep-P123 mang thuốc ................. 45

Bảng 2.5. Số liệu tổng hợp NPC-F127-NPC, NPC-F87-NPC, NPC-F68-NPC ....... 47

Bảng 3.1. Kết quả phổ FT-IR của P123, NPC-P123-NPC, NPC-P123-Ami............ 57

Bảng 3.2. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami ............. 59

Bảng 3.3. Kết quả phổ FT-IR của NPC-P123-Ami, Hep-DAB và Hep-P123 .......... 63

Bảng 3.4. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-P123-Ami, Hep-DAB và Hep-P123 ..... 65

Bảng 3.5. Kích thước của nanogel Hep-P123 bởi TEM và DLS .............................. 68

Bảng 3.6. Kết quả FT-IR của heparin, Hep-P123, Hep-P123-Cis, Hep-P123-

CisOH ........................................................................................................................ 72

Bảng 3.7. Phần Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%) ......................... 77

Bảng 3.8. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-Ami, Hep-DAB và Hep-F127. .... 80

Bảng 3.9. Phần trăm khối lượng pluronic được ghép vào heparin ........................... 82

Bảng 3.10. Kích thước của các nanogel Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68 .................. 85

Bảng 3.11. Kết quả phân tích các hệ nanogel mang thuốc trên cơ sở heparin liên hợp

pluronic P123, F127, F87 và F68 .............................................................................. 89

Bảng 3.12. Kết quả phổ FT-IR của NPC-P123-Ami, Fud-DAB, Fud-DAB ............ 95

Bảng 3.13. Kết quả phân tích 1H-NMR của NPC-P123-Ami, Fud-DAB, Fud-

P123 ........................................................................................................................... 97

Bảng 3.14. Kết quả phổ FT-IR của Fud-P123; Fud-P123-Cis; Fud-P123-CisOH . 101

Bảng 3.15. Hiệu quả mang thuốc Cis và CisOH của hệ nano Fud-P123 ................ 102

Bảng 3.16. Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%) .............................. 103

Bảng 3.17. Kết quả phân tích hệ nanogel Hep-P123 và Fud-P123 mang thuốc ..... 105

Bảng 3.18. Phần trăm ức chế MCF-7 của nanogel Hep-F127 ................................ 111

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Cấu trúc micelle ......................................................................................... 3

Hình 1.2. Các cấu trúc micelle polymer ...................................................................... 4

Hình 1.3. Sự kém ổn định của micelle do tương tác với protein huyết thanh. A.

Phóng thích thuốc; B. Hấp phụ protein; C. Thâm nhập protein ................................. 4

Hình 1.4. Các phương pháp tổng hợp nanogel ........................................................... 7

Hình 1.5. Tương tác kỵ nước ...................................................................................... 8

Hình 1.6. Tương tác ion .............................................................................................. 8

Hình 1.7. Sự hình thành nanogel từ polymer lưỡng tính ............................................ 9

Hình 1.8. Sự hình thành nanogel từ các polymer qua tương tác tĩnh điện .................. 9

Hình 1.9. Sự giải phóng thuốc từ nanogel ................................................................ 11

Hình 1.10. Các tương tác liên phân tử thúc đẩy tiến trình tự lắp ráp gồm tương tác

tĩnh điện và tương tác kỵ nước .................................................................................. 14

Hình 1.11. Sự hướng đích thụ động theo cơ chế EPR .............................................. 15

Hình 1.12. Quá trình giải phóng thuốc do sự thủy phân liên kết cholesteryl vinyl ete

ở pH 4,0 của nanogel acL-CHP ................................................................................ 17

Hình 1.13. Mô hình giải phóng thuốc của nanogel Gal-CS-g-PNIPAm .................. 17

Hình 1.14. Sự thay đổi cấu dạng của polymer PNIPAM theo LCST (32oC) trong

nước (nhiệt độ dưới 32oC polymer ở dạng trương nở, khi nhiệt độ lớn hơn 32oC

polymer NIPAM trở nên kỵ nước và co lại) ............................................................. 18

Hình 1.15. Cấu tạo heparin ....................................................................................... 19

Hình 1.16. Cấu trúc pluronic ..................................................................................... 22

Hình 1.17. Các chất phức hợp chứa platin: (A)-cisplatin; (B)-carboplatin; (C)-

oxaliplatin; (D)-ormaplatin; (E)-enloplatin ............................................................... 25

Hình 1.18. Cấu trúc curcumin ................................................................................... 27

Hình 1.19. Phức giữa cisplatin hydrate và carboxylate PAMAM G3.5 ................... 29

Hình 2.1. Tiêm tế bào MCF-7 trên lưng chuột đã suy giảm miễn dịch .................... 38

Hình 2.2. Hoạt hóa pluronic bằng NPC .................................................................... 41

Hình 2.3. Khóa một đầu sản phẩm hoạt hóa pluronic với Ami ................................ 41

Hình 2.4. Biến tính heparin với DAB ....................................................................... 42

x

Hình 2.5. Tổng hợp copolymer ghép Heparin-Pluronic ........................................... 43

Hình 2.6. Sơ đồ quy trình đưa CisOH vào Hep-P123 ............................................... 44

Hình 2.7. Tổng hợp Fud-DAB .................................................................................. 48

Hình 2.8. Tổng hợp copolymer ghép Fud-P123 ....................................................... 49

Hình 2.9. Nanogel Hep-F127 mang cisplatin hydrate kết hợp curcumin ................. 51

Hình 2.10. Mô hình thử thuốc trên chuột .................................................................. 54

Hình 2.11. Khối u được thu nhận sau khi kết thúc thí nghiệm ................................. 55

Hình 3.1. Phổ FT-IR của P123, NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami ...................... 56

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC ........................................................... 58

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-Ami ........................................................... 59

Hình 3.4. Phổ FT-IR của heparin và Hep-DAB ........................................................ 60

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của Hep-DAB ..................................................................... 61

Hình 3.6. Phổ FT-IR của Hep-DAB, NPC-P123-Ami và Hep-P123 ........................ 62

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của Hep-P123 ..................................................................... 64

Hình 3.8. Kết quả TGA của P123, heparin và các copolymer ghép Hep-P123 ........ 65

Hình 3.9. Kết quả đo CMC của các copolymer ghép Hep-P123 .............................. 67

Hình 3.10. Kết quả TEM của pluronic P123 ............................................................. 69

Hình 3.11. Kết quả TEM và DLS của (a): P123; (b): Hep-P123 (1:3); (c): Hep-P123

(1:7); (d): Hep-P123 (1:10); (e): Hep-P123 (1:14) ................................................... 70

Hình 3.12. Sự hình thành phức Hep-P123-CisOH và nanogel của nó...................... 71

Hình 3.13. Phổ FT-IR của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH .............................. 72

Hình 3.14. Hiệu quả mang thuốc của hệ chất mang Hep-P123 ................................ 73

Hình 3.15. Sự giải phóng CisOH từ nanogel platinum ở pH 5,5 và 7,4 ................... 75

Hình 3.16. Độc tính tế bào MCF-7 của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH .......... 77

Hình 3.17. Kết quả TGA của F127, F87, F68, heparin và copolymer ghép ............. 81

Hình 3.18. Kết quả đo CMC của các pluronic F127, F87 và F68 ............................ 83

Hình 3.19. Kết quả CMC các copolymer Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68 ................ 84

Hình 3.20. Hình thái và kích thước của các nanogel bởi TEM ................................. 85

Hình 3.21. Phổ FT-IR của Hep-F127, Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH ................ 87

Hình 3.22. Hiệu quả mang Cis và CisOH của các hệ chất mang Hep-Plu ............... 88

Hình 3.23. Phổ FT-IR của fucoidan và Fud-DAB .................................................... 92

xi

Hình 3.24. Phổ 1H-NMR của Fud-DAB ................................................................... 93

Hình 3.25. Phổ FT-IR của Fud-DAB, NPC-P123-Ami và Fud-P123 ...................... 94

Hình 3.26. Phổ 1H-NMR của Fud-P123 ................................................................... 96

Hình 3.27. Kết quả TGA của P123, fucoidan và Fud-P123 ..................................... 97

Hình 3.28. Kết quả CMC của Fud-P123 ................................................................... 98

Hình 3.29. Kết quả TEM và DLS của Fud-P123 ...................................................... 99

Hình 3.30. Phổ FT-IR của Fud-P123, Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH............ 100

Hình 3.31. Sự giải phóng CisOH từ nanogel Fud-P123 ở pH 5,5 và 7,4................ 102

Hình 3.32. Độc tính tế bào MCF-7 của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH ......... 104

Hình 3.33. Phổ FT-IR của Hep-F127, Hep-F127-CisOH, Hep-F127-CisOH-Cur . 107

Hình 3.34. Kết quả đo TEM của Hep-F127 (a) và Hep-F127-CisOH-Cur (b) ....... 108

Hình 3.35. Kết quả nhả thuốc CisOH và Cur của Hep-F127-CisOH-Cur .............. 110

Hình 3.36. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của Hep-F127-CisOH, Hep-F127-Cur và

Hep-F127-CisOH-Cur ............................................................................................. 111

Hình 3.37. Chuột mang khối u ................................................................................ 112

Hình 3.38. Hình thái tế bào trong mô khối u cắt lát được nhuộm hóa mô miễn dịch

bằng kháng thể SOD2 ............................................................................................. 113

Hình 3.39. Khối lượng chuột theo quá trình thử nghiệm ........................................ 114

Hình 3.40. Sự thay đổi thể tích khối u theo thời gian ............................................. 115

Hình 3.41. Kết quả phân tích mô học H&E mô các khối u sau thời gian điều trị:

Hep-F127 (a), NaCl (b), nanogel Hep-F127-CisOH (c) và Hep-F127-CisOH-Cur

(d) ............................................................................................................................ 117

1

MỞ ĐẦU

Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum (II)) là hợp chất bạch kim đầu tiên

được FDA phê chuẩn đưa vào điều trị ung thư tinh hoàn và ung thư buồng trứng vào

năm 1978 [1-2]. Đây là một trong những thuốc chống ung thư chủ lực được sử dụng

rộng rãi và hiệu quả để điều trị nhiều loại khối u rắn. Tuy nhiên, nghiên cứu tác dụng

lâm sàng của cisplatin về sau bị hạn chế bởi tính chọn lọc kém của thuốc giữa mô

bình thường và mô khối u. Đồng thời, độc tính của thuốc cũng đã gây ra nhiều tác

dụng phụ trên thận, suy tủy, nhiễm độc thần kinh mãn tính,… từ đó dẫn đến tình trạng

kháng thuốc và hạn chế liều lượng trong quá trình điều trị [2-4]. Vì vậy, để khắc phục

những hạn chế trên, các chất mang thuốc dạng hạt nano đã được các nhà khoa học

trong và ngoài nước phát triển mạnh mẽ, trên cơ sở làm tăng sự tích tụ thuốc tại tế

bào ung thư và từ đó giảm được các tác dụng phụ bất lợi của thuốc.

Nanogel là hệ chất mang nanopolymer đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà

khoa học trên thế giới. Nanogel có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với các hệ chất

mang nano khác như: có hình dạng và kích thước nano linh hoạt, có khả năng đáp

ứng đồng thời với nhiều kích thích từ môi trường ngoài như nhiệt độ, pH, cường độ

ion, góp phần tăng cường hiệu quả trong việc giải phóng thuốc có kiểm soát [5-7].

Một số nanogel từ poly(lactide-co-glycolide)-polyethylene glycol, alginate, heparin-

polyethyleneimine đã được phát triển cho vận chuyển cisplatin. Các chất mang

nanogel này đã cho thấy khả năng mang thuốc tốt và có hiệu quả cao trong tiêu diệt

nhiều dòng tế bào ung thư [8-10].

Do đó, hướng nghiên cứu điều chế các chất mang nanogel nhằm tạo ra sự

tương thích sinh học cao của chất mang, giảm độc tính của thuốc, góp phần nâng cao

hiệu quả mang thuốc và điều trị sẽ có nhiều ý nghĩa khoa học và ứng dụng. Ngoài ra,

việc sử dụng cisplatin dạng hydrate tạo phức với chất mang cũng có thể làm tăng khả

năng mang thuốc và tiêu diệt hiệu quả tế bào ung thư.

Chính vì những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Tổng hợp

và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt tế bào ung thư của một số hệ nanogel

trên cơ sở polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép các copolymer tương hợp

sinh học”.

2

Mục tiêu của luận án:

Tổng hợp và đánh giá các đặc tính của chất mang nanogel trên cơ sở

polysaccharide sulfate (heparin, fucoidan) ghép với các pluronic khác nhau với mục

tiêu khảo sát hiệu quả mang thuốc chống ung thư cisplatin và cisplatin hydrate. Từ

đó, ứng dụng điều chế hệ nanogel trong dẫn truyền thuốc kết hợp cisplatin hydrate và

nanocurcumin nhằm mục đích giảm thể tích khối u ung thư vú trên mô hình chuột

(Mus musculus var. Albino) mang khối u ghép dị loài từ người.

Để đạt được những mục tiêu trên, luận án đã thực hiện các nội dung sau:

1. Tổng hợp và đánh giá cấu trúc, hình thái các nanogel trên cơ sở heparin liên

hợp pluronic P123, F127, F68 và F87 với các tỉ lệ ghép khác nhau.

2. Tổng hợp và khảo sát hiệu quả mang thuốc cisplatin và cisplatin dạng hydrat

của các nanogel tổng hợp được.

3. Khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng tế bào ung

thư vú MCF-7 của hệ nanogel Hep-P123 mang thuốc.

4. Tổng hợp và đánh giá cấu trúc, hình thái của nanogel trên cơ sở

polysaccharide sulfate fucoidan liên hợp pluronic P123.

5. Khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng tế bào ung

thư vú MCF-7 của hệ nanogel Fud-P123 mang thuốc.

6. Tổng hợp và khảo sát khả năng nhả thuốc cũng như hiệu quả tiêu diệt dòng

tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ nanogel Hep-F127 mang thuốc kết hợp cisplatin

hydrate và nanocurcumin.

7. Đánh giá hiệu quả tiêu giảm thể tích khối u ung thư vú trên mô hình chuột

mang khối u ghép dị loài từ người của hệ nanogel mang thuốc kết hợp.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:

Đề tài có giá trị trong việc nghiên cứu các hệ chất mang nano mới mang thuốc

chống ung thư kém tan trong nước. Và cho đến nay chưa có công bố nào dùng nanogel

từ heparin để mang cisplatin dạng hydrate kết hợp với nanocurcumin và cũng chưa

có bất kỳ công bố nào về nanogel từ fucoidan.

Kết quả của đề tài đã được ứng dụng thử nghiệm trên mô hình chuột mang

khối u ghép dị loài sẽ làm nền tảng ứng dụng cho các nghiên cứu sâu hơn trong lâm

sàng.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về micelle và nanogel

1.1.1. Giới thiệu micelle

1.1.1.1. Cơ chế hình thành micelle

Micelle được hình thành từ sự tự lắp ráp của các đơn vị lưỡng tính, bằng cách

kết hợp các phần kỵ nước hình thành lõi trung tâm và định vị các đầu cực ưa nước

của chúng với môi trường nước xung quanh tạo thành phần vỏ. Lớp vỏ ngoài của

micelle có thể giúp tăng độ hòa tan và khả năng tương thích sinh học cho hệ thống,

trong khi lõi bên trong có thể được sử dụng để chứa các thuốc kỵ nước [11-12].

Hình 1.1. Cấu trúc micelle [12]

Sự tương tác giữa các nhóm ưa nước và môi trường nước xung quanh, dẫn đến

sự tách biệt giữa phần ưa nước và kỵ nước, điều này làm cho các micelle có cấu trúc

xốp hơn. Vì thế các micelle được sử dụng như là mô hình cho các ứng dụng sinh học

và hệ phân phối thuốc.

Kích thước các micelle dao động từ 5-100 nm, tùy thuộc vào loại nhóm ưa

nước và chiều dài chuỗi kỵ nước tự lắp ráp thánh cấu trúc với nhiều hình thái khác

nhau như: hình cầu, hình tấm, hình trụ, hình túi đơn lớp, …

Gần đây, micelle được nghiên cứu rộng rãi bằng cách sử dụng các copolymer

lưỡng tính di-block (hydrophilic-hydrophobic), tri-block (hydrophilic-hydrophobic-

hydrophilic) hoặc các copolymer ghép để hình thành các micelle polymer tự lắp ráp

giúp phân phối thuốc tốt hơn. Các copolymer ghép lưỡng tính tự lắp ráp thành các

micelle với cấu trúc vỏ - lõi hình cầu, có đường kính khoảng 10 - 80 nm, bao gồm

một lõi kỵ nước để nạp thuốc và phần vỏ ưa nước hoạt động như một rào cản vật lý

ngăn chặn gắn kết với protein, và sự oposin hóa trong quá trình tiêm tĩnh mạch [12].

4

Hình 1.2. Các cấu trúc micelle polymer [12]

1.1.1.2. Ưu điểm và nhược điểm của micelle

a. Ưu điểm của micelle

Micelle có cấu trúc lõi - vỏ, có thể giữ được các thuốc kỵ nước trong phần lõi

kỵ nước, giúp tăng độ hòa tan của thuốc lên gấp 10 - 500 lần và kéo dài thời gian lưu

thông của thuốc trong máu.

Hầu hết các micelle ít độc hại và dễ dàng được đào thải qua thận.

b. Nhược điểm của micelle

Hiệu quả mang thuốc của micelle khá thấp, do phần lớn các micelle thông

thường dựa trên tương tác kỵ nước để mang các thuốc kém tan. Để tối ưu hóa hàm

lượng thuốc trong micelle, ngoài tương tác kỵ nước cần nghiên cứu phát triển tổng

hợp các micelle dựa trên cơ sở tương tác giữa polymer và thuốc như liên kết hydro,

tương tác tĩnh điện, …. [13].

Hình 1.3. Sự kém ổn định của micelle do tương tác với protein huyết thanh. A.

Phóng thích thuốc; B. Hấp phụ protein; C. Thâm nhập protein [13]

5

Micelle kém ổn định trong môi trường sinh học, phần lớn các micelle được

hình thành từ sự lắp ráp vật lý các polymer. Nồng độ của micelle bị giảm bởi sự pha

loãng trong dòng máu, các micelle dễ phân rã thành các unimer, dẫn đến sự giải phóng

thuốc không kiểm soát và giảm thời gian bán thải của thuốc. Savic cùng cộng sự cho

thấy micelle của poly(caprolactone)-b-poly(ethylene oxide) không ổn định trong môi

trường nuôi cấy chứa huyết thanh có hoặc không có tế bào [14]. Hơn nữa, các micelle

polymer thông thường dễ tương tác với các thành phần có trong máu như protein, tế

bào, ... sự hình thành phức giữa PEG và protein có thể gây ra sự kết tụ micelle hoặc

phân rã micelle thành các unimer, từ đó ảnh hưởng đáng kể đến sự ổn định của micelle

trong in vivo [15]. Do đó, việc cải thiện sự ổn định của micelle trong máu là mục tiêu

hàng đầu để tăng hiệu quả điều trị.

Sự tương tác giữa micelle và tế bào vẫn chưa được làm rõ, một số nghiên cứu

cho thấy cả tương tác tĩnh điện và kỵ nước đóng vai trò quan trọng trong việc vận

chuyển thuốc qua trung gian micelle vào các tế bào. Việc gắn thêm các phần tử hướng

đích trên bề mặt micelle như: biotin, folate, antibodies, growth factors,… hoặc kết

hợp với các yếu tố nhạy cảm kích thích là một trong những giải pháp có thể làm tăng

sự hấp thu tế bào của micelle [16].

1.1.1.3. Sự đóng gói thuốc vào trong micelle

Thuốc có thể được đóng gói vào trong micelle trên cơ sở các tương tác vật lý

hoặc liên kết hóa học. Thuốc được đóng gói bởi sự liên hợp hóa học sẽ được giải

phóng khỏi micelle bởi sự suy thoái phần lớn khối lượng của polymer, trong khi thuốc

được đóng gói bằng tương tác vật lý sẽ được giải phóng bằng cách khuếch tán [12].

Một số phương pháp được sử dụng rộng rãi để đóng gói thuốc vào bên trong

các micelle gồm: kỹ thuật nhũ tương dầu trong nước (O/W); kỹ thuật nhũ tương nước

trong dầu (W/O/W); thẩm tách; bay hơi đồng dung môi; và đông khô. Trong số các

phương pháp nêu trên, kỹ thuật nhũ tương dầu trong nước (O/W), thẩm tách và bay

hơi đồng dung môi phù hợp cho việc đóng gói các thuốc kỵ nước, trong khi kỹ thuật

nhũ tương nước trong dầu (W/O/W) thường được ưu tiên cho việc đóng gói các hợp

chất ưa nước.

Nhờ vào tính chất đặc trưng của micelle là có kích thước nhỏ, giúp chúng dễ

xâm nhập vào mạch máu của khối u một cách hiệu quả, do đó chúng được sử dụng

6

như hệ chất mang thuốc trong hóa trị ung thư. Doxorubicin và paclitaxel gần đây đã

được phê duyệt cho các thử nghiệm lâm sàng và là ví dụ điển hình của các micelle

được sử dụng làm hệ chất mang các thuốc hóa trị liệu. Paclitaxel được đóng gói vào

trong các micelle polymer cho thấy hiệu quả điều trị tốt ở những bệnh nhân có khối

u ác tính tiến triển, ung thư vú di căn và ung thư phổi tế bào không nhỏ [17-19].

Nishiyama và cộng sự đã báo cáo các micelle trên cơ sở PEG-b-poly(amino acid)

mang cisplatin để nhắm mục tiêu thuốc thụ động vào khối u. So với thuốc tự do, các

micelle đã mang được lượng lớn cisplatin đến vị trí các khối u rắn nhưng thuốc đồng

thời cũng được đưa vào gan và lá lách [20].

1.1.2. Giới thiệu nanogel

Thuật ngữ “nanogel” được định nghĩa là những hạt có kích thước nano được

tạo thành bởi các liên kết ngang có tính chất vật lý hoặc hóa học của các mạng lưới

polymer. Kích thước của các nanogel thường trong khoảng từ 20-200 nm, do đó giảm

được sự thanh thải của thận và kéo dài thời gian bán thải trong huyết thanh [21-22].

Các nanogel này có thể bẫy các phân tử kỵ nước (các thuốc chống ung thư),

các protein (enzyme, insulin, protein kháng nguyên), và các acid nucleic (plasmid

ADN), vì thế chúng được sử dụng như các nano polymer trong lĩnh vực điều trị ung

thư, phân phối protein và các vaccine nhân tạo [23].

1.1.2.1. Sự hình thành nanogel

Nanogel có khả năng hấp thụ một lượng nước lớn hoặc chất lỏng sinh học mà

không làm biến đổi cấu trúc của chúng, điều này được cho là trong cấu trúc có sự

hiện diện của các nhóm chức ưa nước như: -OH, -CONH-, -CONH2, -SO3H. Trong

môi trường nước nanogel có khả năng trương mà không tan, nhờ vào tính chất đặc

biệt này làm cho nanogel trở thành hệ chất mang tiềm năng cho rất nhiều ứng dụng.

Nhiều nghiên cứu cho thấy nanogel có khả năng vận chuyển thuốc cao, độ ổn định

tốt, và có khả năng đáp ứng với nhiều sự kích thích môi trường (cường độ ion, pH và

nhiệt độ) [24].

Khả năng trương trong nước là một trong những đặc tính quan trọng nhất của

nanogel, điều này có được là nhờ vào sự hình thành các liên kết ngang hóa học hoặc

vật lý giữa các polymer. Nói cách khác, bản chất của việc hình thành các nanogel là

7

sự hình thành các liên kết ngang thích hợp giữa các polymer, có 2 phương pháp để

tổng hợp nanogel:

- Nanogel được tổng hợp từ các tiền chất là polymer: tiền chất polymer có thể

là các copolymer lưỡng tính hoặc triblock copolymer, các copolymer này có thể tự

lắp ráp để hình thành nanogel hoặc trong cấu trúc các polymer có các vị trí phản ứng

có thể được sử dụng trực tiếp để hình thành liên kết ngang hóa học.

- Nanogel được tổng hợp thông qua quá trình trùng hợp không đồng nhất các

monomer gồm 2 bước: sự trùng hợp các monomer và sự hình thành nanogel.

Hình 1.4. Các phương pháp tổng hợp nanogel [24]

a. Sự hình thành liên kết ngang vật lý

Liên kết ngang vật lý trong chuỗi polymer có thể được hình thành từ các yếu

tố môi trường như: pH, nhiệt độ, lực ion, … hoặc các tương tác hóa lý khác gồm lực

Van der Waals (liên kết hydro, tương tác kỵ nước) và tương tác tĩnh điện [24].

● Tương tác kỵ nước: các phân tử polymer có chứa một đầu ưa nước và một

đầu kỵ nước có thể được tạo thành bằng phản ứng trùng hợp hoặc bằng cách trực tiếp

tạo ra một khối copolymer. Các phân tử polymer này có thể hòa tan trong nước ở

nhiệt độ thấp, nhưng khi nhiệt độ tăng các liên kết hydro bị cắt đứt, phần kỵ nước có

xu hướng xoay vào trong để giảm thiểu diện tích bề mặt tiếp xúc trực tiếp với nước.

Nhiệt độ mà tại đó xảy ra hiện tượng gel hóa phụ thuộc vào nồng độ của các polymer,

độ dài đầu kỵ nước và cấu trúc hóa học của polymer.

8

Hình 1.5. Tương tác kỵ nước [38]

● Tương tác ion: tương tác ion (tương tác tĩnh điện) đã được nghiên cứu rộng

rãi để hình thành liên kết ngang trong quá trình gel hóa. Một lợi thế của phương pháp

này là sự phân hủy sinh học có thể xảy ra như: sự phân ly ion trong ngoại bào, phá

vỡ mạng lưới liên kết ngang. Tương tác ion có thể xảy ra giữa một phân tử polymer

và một phân tử nhỏ hoặc giữa hai phân tử polymer trái dấu để tạo liên kết ngang trong

gel hạt nano, nhằm tạo ra chuỗi phân tử ba chiều thích hợp cho mang, nhả thuốc.

Hình 1.6. Tương tác ion [38]

Nanogel được hình thành bởi các liên kết ngang vật lý giữa các chuỗi polymer

sẽ cung cấp nhiều lợi ích cho sự vận chuyển các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc

biệt là các thuốc kỵ nước và thuốc sinh học. Các nanogel được hình thành bởi liên

kết ngang vật lý thường xảy ra trong môi trường nước và các điều kiện êm dịu. Các

thông số môi trường như: giá trị pH, lực ion và nhiệt độ nên được kiểm soát, vì có

ảnh hưởng lớn đến kích thước hạt.

Các polymer lưỡng tính thường có khung ngoài ưa nước và được ghép với một

số nhóm kỵ nước, sự liên kết của các nhóm kỵ nước giúp hình thành các điểm liên

kết ngang để tạo thành các nanogel ổn định. Lớp vỏ ngoài ưa nước không chỉ đóng

vai trò là hàng rào chống lại sự tương tác với các protein và các mô trong cơ thể mà

còn bảo vệ nanogel khỏi sự nhận biết và oposin hóa bởi hệ thống thực bào đơn nhân

9

giúp kéo dài thời gian lưu thông trong máu. Đồng thời, phần lõi kỵ nước có thể mang

và vận chuyển thuốc hiệu quả thông qua tương tác kỵ nước và tương tác tĩnh điện.

Hình 1.7. Sự hình thành nanogel từ polymer lưỡng tính [24]

Các polysaccharide liên hợp cholesterol đã được quan tâm sử dụng để tạo các

nanogel ổn định với kích thước dưới 100 nm. Pullulan khi được liên hợp với các

nhóm cholesterol có thể tạo nanogel tự lắp ráp với đường kính khoảng 50 nm thông

qua tương tác kỵ nước giữa các nhóm cholesterol [25]. Wei và cộng sự cũng đã tổng

hợp hệ chất mang nano CHA-thuốc (Cholesterol-modified hyaluronic acid), hệ liên

hợp này có thể tạo nanogel có đường kính trong khoảng từ 20 - 40 nm bằng cách siêu

âm trong môi trường nước thông qua các liên kết ngang vật lý [26].

Các dung dịch của cation dextran và anion dextran đã được Takeo và cộng sự

thực hiện điều chế và phối trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp để hình thành nanogel

phức polyion (PIC-NG). Các nanogel PIC-NG được hình thành nhờ vào cầu muối

liên kết ngang vật lý giữa các nhóm cation và anion [27].

Hình 1.8. Sự hình thành nanogel từ các polymer qua tương tác tĩnh điện [24]

b. Sự hình thành liên kết ngang hóa học

Nanogel hình thành bởi liên kết ngang hóa học bền hơn so với nanogel hình

thành bởi liên kết ngang vật lý. Các liên kết ngang hóa học thường có bản chất là liên

kết cộng hóa trị được hình thành trong điều kiện pha loãng của các polymer tan trong

nước, dẫn đến hình thành mạng lưới polymer không hòa tan [24].

10

Nanogel được tổng hợp bằng phương pháp trùng hợp các monomer trong đó

các liên kết ngang hóa học đóng vai trò quan trọng trong tiến trình này. Zhou cùng

cộng sự đã tổng hợp thành công nanogel dextran-PAAPBA bằng phương pháp trùng

hợp các monomer sử dụng dextran, 3-acrylamidophenylboronic acid (AAPBA) và

N,N′-methylene bisacrylamide (MBA). Trong đó, ceric ammonium nitrate (CAN)

đóng vai trò là chất khơi màu và N,N’-methylene bisacrylamide (MBA) là các liên

kết ngang. Các nhóm carboxyl của AAPBA và các nhóm proton-accepting của

dextran đã dẫn đến sự tự lắp ráp thông qua liên kết hydro [28].

Liên kết disunfide cũng có thể được sử dụng để tạo liên kết ngang các polymer

để hình thành nanogel. Nanogel trên cơ sở các dẫn xuất dextran–lipoic acid đã được

Li và cộng sự tổng hợp thành công. Các nanogel này dễ dàng hình thành liên kết

ngang bởi việc sử dụng một lượng xúc tác dithiothreitol (DTT) [29].

1.1.2.2. Ưu điểm và nhược điểm của nanogel

a. Ưu điểm của nanogel

Nanogel gây chú ý với khả năng vận chuyển thuốc và các hoạt chất sinh học,

trở thành hệ mang, nhả thuốc vượt trội với các ưu điểm sau:

- Khả năng mang thuốc của nanogel tương đối cao khi so sánh với các vật liệu

nano và các hệ thống phân phối thuốc khác. Khả năng mang thuốc cao và có thể

không nhất thiết có bất kỳ phản ứng hóa học nào, do đó có thể giúp giữ được nguyên

các hoạt tính của thuốc. Điều này là do ảnh hưởng của các nhóm chức hiện diện trên

mạng lưới polymer, các nhóm chức này có ảnh hưởng lớn đến đặc tính mang và nhả

thuốc của nanogel, trong đó một số nhóm chức có thể liên hợp với thuốc/kháng thể

cho tiềm năng điều trị hướng đích. Theo báo cáo của TSoni và Yadav (2016) đã chỉ

ra rằng so với các hạt nano như micelle, hạt nano phân hủy sinh học, liposome hoặc

nanocapsules, nanogel có khả năng mang thuốc cao và sự giải phóng thuốc có kiểm

soát được điều chế bằng cách thay đổi mật độ liên kết ngang của các polymer (đạt

hiệu quả mang thuốc lên đến 50%) [30].

- Các nanogel ổn định tương đối tốt trong điều kiện sinh học so với các micelle

chất hoạt động bề mặt và các micelle polymer thông thường. Các nanogel được tổng

hợp bằng cách thay đổi điện tích bề mặt, dẫn đến lực đẩy lớn hơn giữa các hạt, giúp

tránh sự kết tụ của nanogel trong máu.

11

- Các nanogel được tổng hợp với cấu trúc lớp nước xung quanh chuỗi polymer,

giúp giảm thiểu sự liên kết không đặc hiệu với các protein trong huyết thanh và tồn

tại lâu hơn trong dòng máu. Các polymer ưa nước này có thể hoạt động như một lá

chắn cản trở giúp nanogel tránh sự loại bỏ nhanh chóng bởi hệ thống thực bào đơn

nhân thông qua quá trình oposin hóa. Pluronic liên hợp với heparin thông qua liên kết

ngang disulfide, có khả năng giúp tăng cường hiệu quả đóng gói thuốc sinh học, tăng

tính ổn định của chất mang và tránh sự hấp thu protein trong dòng máu [31]. Nanogel

zwitterionic poly(aspartamide) mang thuốc doxorubicin đã được báo cáo bởi Caicai

Lu và cộng sự cho thấy các tính năng tương thích sinh học, giảm sự hấp thu protein

trong máu và đáp ứng pH [32].

- Nanogel có kích thước hạt nhỏ và các đặc tính bề mặt giúp làm tăng khả năng

vận chuyển cũng như sinh khả dụng của thuốc. Nhờ vào thể tích nhỏ các nanogel có

khả năng tiếp cận được đến các mao mạch nhỏ nhất, từ đó giúp tránh sự đào thải qua

thận, kéo dài thời gian bán thải trong huyết thanh, dễ dàng thâm nhập vào các mô

cũng như xuyên qua giữa các tế bào nội mô ở các vị trí bệnh lý như: khối u rắn, mô

viêm và vùng bị nhiễm trùng. Các mô khối u có tính thấm mao mạch cao, các hạt

nano thấm vào mô khối u và tích lũy ở đó, làm tăng lượng thuốc và sự chọn lọc của

hệ chất mang thuốc.

- Nanogel có thể phân phối thuốc hướng đích cả thụ động và chủ động do có

khả năng đáp ứng ứng nhanh với những thay đổi của môi trường như pH và nhiệt độ,

từ đó giúp kiểm soát được khả năng nhả thuốc và tích lũy tại tế bào ung thư.

Hình 1.9. Sự giải phóng thuốc từ nanogel [21]

- Nanogel có thể phân phối thuốc nhắm mục tiêu do sự hiện diện của các nhóm

chức liên hợp với kháng thể/thuốc. Từ đó, dẫn đến tính chọn lọc cao và ngăn ngừa sự

12

tích tụ của thuốc trong các mô không hướng đích như mô cơ và mô mỡ, giúp cải thiện

hiệu quả điều trị và giảm các tác dụng phụ không mong muốn của thuốc,….

- Nanogel được hình thành từ các polymer tự nhiên hoặc tổng hợp có độ tương

hợp sinh học cao và có thể bị phân hủy sinh học, do đó tránh được sự tích lũy ở các

cơ quan trong cơ thể. Chitosan, ethyl cellulose, methyl cellulose và các polymer trên

cơ sở polysaccharide như heparin, dextran, pullulan và dextrin có thể được dùng để

tổng hợp nanogel.

- Nanogel có ái lực cao với dung dịch nước, dẫn đến khả năng trương nở hoặc

thấm nước khi ở trong môi trường nước. Đây là đặc tính có lợi nhất của nanogel, nó

làm cho chúng trở thành vật liệu lý tưởng cho sự hấp thu và mang protein, peptide,

đại phân tử sinh học cũng như các thuốc cồng kềnh.

- Việc đưa thuốc vào nanogel là dễ dàng, tự phát, và đôi khi không nhất thiết

có bất kỳ phản ứng hóa học nào, điều này làm cho tiến trình chuẩn bị nanogel hiệu

quả.

- Các đại phân tử sinh học cũng như các hợp chất nhạy cảm có thể được đóng

gói hiệu quả trong các nanogel cho mục đích kéo dài hoạt động của các phân tử này

trong môi trường sinh học.

b. Nhược điểm của nanogel

Hạn chế duy nhất của nanogel là tốn kém trong việc loại bỏ các chất hoạt động

bề mặt và dung môi trong quá trình điều chế. Các tác dụng phụ có thể xảy ra nếu còn

tồn động dung môi, polymer và chất hoạt động bề mặt có hại trong cơ thể.

1.1.2.3. Sự đóng gói thuốc vào trong nanogel

Vật liệu nano và nanogel có khả năng tương tác với nhiều thành phần vô cơ

và hữu cơ, sự tương tác giữa các thành phần này chủ yếu thông qua liên kết hydro,

liên kết cộng hóa trị, lực tĩnh điện và lực Van Der Waals. Những tương tác này xác

định hiệu quả đóng gói thuốc của nanogel, sự đóng gói thuốc vào nanogel được thực

hiện thông qua 3 cơ chế sau đây:

a. Bẫy vật lý

Việc đóng gói thuốc vào trong nanogel có thể đạt được thông qua các tương

tác không cộng hóa trị như: liên kết ion, tương tác kỵ nước và liên kết hydro. Trong

hầu hết các trường hợp, thuốc được đóng gói vào trong nanogel bằng bẫy vật lý nhờ

13

vào tương tác kỵ nước giữa các phân tử thuốc với nanogel dẫn đến hiệu quả mang

thuốc thấp.

Một ví dụ về sự tự lắp ráp của cholesteryl-6-aminohexylcarbamate kết hợp với

acid hyaluronic hình thành nanogel mang protein. Gel này kết hợp với hormone tăng

trưởng người tái tổ hợp (rhGH) được tiêm vào chuột, cũng cho thấy sự giải phóng

thuốc bền vững trong hơn một tuần [33]. Chitin được sử dụng nhiều trong tổng hợp

nanogel vì nó có khả năng phân hủy sinh học cao, tương thích sinh học, không gây

kích ứng da, dễ dàng sử dụng, ít tốn chi phí. Nó có thể hình thành phức hợp

polyelectrolyte do có số lượng lớn các nhóm phản ứng -OH và -NHCOCH3. Sabitha

Mangalathillam và cộng sự đã báo cáo hệ nanogel chitin mang curcumin có độ ổn

định và phân tán tốt trong nước, được hình thành thông qua liên kết hydro giữa

curcumin và nanogel chitin. Hệ nanogel này được ứng dụng trong điều trị ung thư da

nhờ vào điện tích cation của chitin và bản chất ưa béo của cả chitin và curcumin tạo

điều kiện cho sự thấm vào da [34].

b. Sự liên hợp cộng hóa trị

Sự liên hợp cộng hóa trị của thuốc với nanogel có thể giúp ổn định thêm sự

đóng gói thuốc vào nanogel. Các nanogel phân hủy sinh học được hình thành trên cơ

sở polysaccharide chứa các nhóm hydroxyl dễ dàng tương tác với nhóm carboxyl

trong thuốc bằng cách hình thành các liên kết ester. Trong những trường hợp như

vậy, việc giải phóng thuốc là do sự phân cắt các liên kết nhóm chức bởi các enzyme

như esterase [35-36].

c. Sự tự lắp ráp kiểm soát

Sự tự lắp ráp về cơ bản chứa các liên kết không cộng hóa trị với thuốc, các

phân tử tự lắp ráp được đặc trưng bởi sự khuếch tán, theo sau là sự liên kết giữa các

phân tử thông qua các tương tác như liên kết tĩnh điện hoặc tương tác kỵ nước. Các

nanogel trên cơ sở polyelectrolyte có xu hướng tự lắp ráp với sự có mặt của các chất

tan tích điện trái dấu như: chất hoạt động bề mặt, polynucleotide, protein và polyion

tổng hợp [37]. Sự liên hợp thuốc có tiềm năng được thực hiện bởi các liên kết disulfide

giúp thuốc tương tác với các hạt nano, đôi khi được kích thích để giải phóng thuốc,

trong đó các nanogel liên kết ngang disulfide có khả năng mang thuốc doxorubicin

và paclitaxel cao thì nhạy cảm với pH và nhiệt độ.

14

Hình 1.10. Các tương tác liên phân tử thúc đẩy tiến trình tự lắp ráp gồm tương tác

tĩnh điện và tương tác kỵ nước [21]

Tương tác giữa các polysaccharide trung tính thường yếu hoặc không tồn tại,

một sự biến tính hóa học là cần thiết để kích hoạt sự tự lắp ráp. Polysaccharide được

liên kết với phần kỵ nước, trong môi trường nước các polymer ghép lưỡng tính hình

thành các hạt nano tự lắp ráp thông qua các liên kết nội phân tử hoặc liên phân tử

giữa các phần kỵ nước. Các phân tử này có thể tự định hướng vùng ưa nước tiếp xúc

với môi trường phân cực (thường là nước), các phần kỵ nước sẽ tập hợp tại bên trong

tạo lõi kỵ nước mang thuốc [21].

Một số yếu tố khác cũng góp phần vào hiệu quả mang thuốc như: thành phần,

trọng lượng phân tử, tương tác giữa thuốc và polymer hoặc các nhóm chức khác nhau

trong cấu trúc polymer.ol of Pharmacy andPharmaceutical

1.1.2.4. Phương cách phân phối thuốc của chất mang nano và nangel

Nhằm nâng cao hiệu quả vận chuyển thuốc, đặc biệt là việc đưa thuốc đến

đúng vị trí khối u trong cơ thể, các phân tử sinh học như gene, protein, peptide đã

được ứng dụng. Tuy nhiên, các phân tử sinh học này không bền, thời gian phân hủy

nhanh dẫn đến chúng bị phân hủy trước khi đến khối u và ảnh hưởng nghiêm trọng

đến môi trường ngoại bào ở những nơi chúng đi qua. Do vậy, hệ chất mang nanogel

được lựa chọn thay thế vì chúng có kích thước nano, có thể mang được lượng thuốc

lớn, thời gian lưu thông trong dòng máu lâu, tích lũy nhiều trong khối u ung thư, giảm

thiểu các độc tính có hại cho môi trường nội bào và các tế bào bình thường. Có 2 cách

mà chất mang nano có thể phân phối thuốc đến các mô ung thư:

a. Phân phối thuốc tới đích thụ động

Sự định hướng thụ động xuất phát từ hiện tượng tăng tính thấm và tăng hiệu

quả lưu giữ (Enhanced Permeability and Retention Effect - hiệu ứng EPR) đặc trưng

15

ở các mô ung thư. Tại hầu hết các mô khỏe mạnh, kích thước các khe hở lớp nội mô

thành mạch máu thường nhỏ hơn 2 nm. Với khe hẹp giữa các lớp nội mô thành mạch

máu, các phân tử thuốc có khối lượng phân tử nhỏ cũng có thể lọt qua, gây độc cho

tế bào lành. Tuy nhiên các khe hở này quá nhỏ so với kích thước của chất mang

nanogel. Còn tại mô ung thư, do sự phát triển của tế bào ung thư đòi hỏi sự tăng sinh

mạch máu, các vi mạch máu mới được hình thành tại các mô ung thư và có kích

thước từ 100 – 800 nm. Do đó các hạt nanogel mang thuốc tồn tại trong hệ tuần hoàn

máu với kích thước 10 – 100 nm có thể vượt qua dễ dàng và đi vào mô ung thư. Các

phức hợp chất mang - thuốc sau khi đã đi vào các khe hở tế bào này sẽ bị kẹt giữ lại

khi các tế bào ung thư phát triển. Thêm vào đó, do không có hệ bạch huyết cần thiết,

tốc độ đào thải các phức hợp này ra khỏi tế bào ung thư là rất hạn chế. Vì thế trong

chữa trị bệnh ung thư, thuốc được mang trên chất mang biến tính có nhiều lợi thế hơn

thuốc không có chất mang [38].

Hình 1.11. Sự hướng đích thụ động theo cơ chế EPR [38]

b. Phân phối thuốc tới đích chủ động

Chất mang thuốc được gọi là lý tưởng nếu như nó là chất mang thuốc “thông

minh” tức là mang và phân phối thuốc hoặc các hoạt chất đến đúng nơi cần chữa trị

mà không tới các tế bào bình thường. Phân phối thuốc tới đích chủ động được thực

hiện bằng cách trên bề mặt của chất mang được gắn thêm các phần tử định hướng.

Các phần tử định hướng có thể là các kháng thể, các peptide hoặc là các ligand

carbohydrate đặc hiệu với các kháng nguyên và thụ thể trên bề mặt tế bào ung thư.

Phương cách này được chứng minh là giúp khắc phục tình trạng đa kháng thuốc của

các tế bào ung thư [38].

16

1.1.2.5. Sự giải phóng thuốc của nanogel

Sự giải phóng thuốc của nanogel dựa trên cơ sở các đặc tính của polymer có

thể đáp ứng cao với sự thay đổi của môi trường. Nhờ cấu trúc mạng lưới 3D, nanogel

dễ dàng thay đổi trạng thái để vận chuyển và kiểm soát việc giải phóng thuốc trong

các môi trường khác nhau, đặc biệt của môi trường vi khối u, chủ yếu bao gồm: độ

pH và nhiệt độ.

a. Cơ chế nhạy pH

Nanogel trên cơ sở polymer nhạy pH có thể đáp ứng với sự thay đổi giá trị pH

của môi trường trong cả in vitro và in vivo. Các nanogel này cho thấy hiệu quả giải

phóng thuốc chậm trong hệ tuần hoàn máu và phóng thích thuốc nhanh ở vị trí đích.

Trong điều kiện pH acid sự thay đổi trạng thái ion hóa của nanogel dẫn đến sự trương

nở của chúng, kết quả này giúp cho nanogel có thể mang cũng như nhả các phân tử

sinh học [39].

Nhiều nghiên cứu đã báo cáo rằng pH ngoại bào của các biểu mô ung thư (pH

6,5 - 7,2) thấp hơn so với biểu mô tế bào thường và các dịch sinh học khác (pH 7,4),

nó giảm mạnh trong tế bào khối u (hạt nội chất pH 5,0 - 6,5 và trong lysosome pH

4,5 - 5,0) [5, 40]. Nhờ khoảng pH rộng trong hệ thống sinh lý, các nanogel nhạy pH

đã được ứng dụng để vận chuyển và kiểm soát sự giải phóng thuốc đến các mô ung

thư bằng cách điều chỉnh sao cho bị phá vỡ cấu trúc và phóng thích thuốc tại giá trị

pH thấp trong vùng lân cận của các mô ung thư.

Các nanogel nhạy pH được cấu thành từ các polysaccharide tự nhiên có tính

tương hợp sinh học với sự biến đổi trạng thái co lại hoặc giãn nở đã được thiết kế để

giải phóng thuốc kiểm soát. Nanogel trên cơ sở polymer pullulan ghép vinyl ether-

cholesterol được thực hiện bởi Nobuyuki Morimoto và nhóm cộng sự [41]. Họ đã

tổng hợp ra nanogel acid-labile cholesterol-bearing pullulan (acL-CHP) trên cơ sở tự

lắp ráp ở pH trung tính để hình thành cấu trúc mạng lưới ổn định mang cholesterol.

Ở pH 4,0 và trong điều kiện xúc tác acid xảy ra quá trình thủy phân các liên kết

cholesteryl vinyl ete, dẫn đến sự trương nở của các nanogel acL-CHP và cuối cùng là

sự phân rã của các nanogel để giải phóng thuốc.

17

Hình 1.12. Quá trình giải phóng thuốc do sự thủy phân liên kết cholesteryl vinyl ete

ở pH 4,0 của nanogel acL-CHP [41]

Y. Li và cộng sự đã báo cáo hệ nanogel nhạy pH trên cơ sở polypeptid mang

thuốc kỵ nước doxorubicin (DOX). Nanogel này được tổng hợp từ methoxy

poly(ethylene glycol)-b-poly[N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]-L-glutamate]

(MPEG-b-PNLG) ưa nước và terephthalaldehyde (TPA) kỵ nước có vai trò như các

liên kết ngang. Nanogel được tổng hợp ở điều kiện pH 7,4 có độ ổn định cao. Trong

điều kiện pH acid ở mô khối u (pH 6,4) liên kết benzoic imine bị phân cắt dẫn đến sự

phân hủy cấu trúc nanogel và giải phóng thuốc DOX [42].

Cunxian Duan và cộng sự đã báo cáo hệ nanogel nhạy pH được tổng hợp từ

polymer chitosan-graft-poly (N-isopropylacrylamide) được galactosyl hóa (Gal-CS-

g-PNIPAm) làm chất mang oridonin (ORI) để nhắm mục tiêu khối u. Các nanogel

duy trì cấu trúc ổn định ở pH 7,4 trong suốt quá trình vận chuyển thuốc trong máu. Ở

điều kiện pH có tính acid của tế bào ung thư (trong hạt nội chất pH 5,0 - 6,5 và trong

lysosome pH 4,5 - 5,0), nanogel trở nên xốp hơn, do lực đẩy tĩnh điện tăng lên giữa

các nhóm amin được proton hóa trên nanogel, dẫn đến sự phóng thích thuốc [43].

Hình 1.13. Mô hình giải phóng thuốc của nanogel Gal-CS-g-PNIPAm [43]

18

b. Cơ chế nhạy nhiệt

Nanogel nhạy nhiệt là nanogel có biểu hiện chuyển trạng thái co rút - trương

nở do thay đổi của nhiệt độ môi trường. Sự thay đổi nhiệt độ có thể tạo ra sự thay đổi

bên trong mạng lưới nanogel, từ đó giúp kiểm soát được tốc độ giải phóng thuốc bên

trong nanogel.

Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) là một trong những polymer nhạy

nhiệt tiêu biểu được ứng dụng rộng rãi trong y sinh. Nhờ có nhiệt độ dung dịch tới

hạn thấp (LSCT-the lower critical solution temperature) trong khoảng nhiệt độ cơ thể

và nhiệt độ phòng. Cấu trúc của polymer này đặc trưng bởi sự cân bằng tinh vi giữa

các phần ái nước và ái dầu, do đó chỉ cần có sự thay đổi rất nhỏ của nhiệt độ cũng có

thể dẫn đến sự biến đổi lớn trong lớp hydrat. Ở nhiệt độ dưới 32oC (LSCT của

PNIPAM là 32oC) PNIPAM thì ưa nước, polymer ở dạng trương nở. Ở nhiệt độ lớn

hơn 32oC PNIPAM trở nên kỵ nước làm co mạch polymer lại và xảy ra hiện tượng

tách pha [44-45].

Hình 1.14. Sự thay đổi cấu dạng của polymer PNIPAM theo LCST (32oC) trong

nước (nhiệt độ dưới 32oC polymer ở dạng trương nở, khi nhiệt độ lớn hơn 32oC

polymer NIPAM trở nên kỵ nước và co lại) [44]

Các nanogel nhạy nhiệt được phát triển trên cơ sở PNIPAM với các đặc tính

nhạy cảm với nhiệt độ đã được nghiên cứu tổng hợp. Shin và cộng sự đã báo cáo ở

nhiệt độ trên LSCT của PNIPAM, dẫn đến sự co lại đột ngột của gel và giải phóng

indomethacin [46]. Chunyan Wang và cộng sự đã phát triển nanogel nhạy nhiệt trên

cơ sở poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAM) mang doxorubicin (DOX-CGN) được

19

chuẩn bị từ chitosan biến đổi hóa học với graphene oxit (CRGO). Graphene được sử

dụng làm vật liệu quang nhiệt để phản ứng với tia hồng ngoại gần NIR (near infrared).

Hệ phân phối thuốc nanogel graphene được kích hoạt bắt đầu giải phóng doxorubicin

ở 42°C bằng NIR sau khi polymer NIPAM co lại [47].

1.2. Polysaccharide sulfate

1.2.1. Heparin

Heparin là một polysaccharide sulfate có cấu trúc là sự lặp lại của các

disaccharide gồm các đơn vị uronic acid và glucosamine xen kẽ với nhau và liên kết

với nhau bằng liên kết 1,4-glycoside [48].

Hình 1.15. Cấu tạo heparin [48]

Heparin được tìm thấy trong các hạt của các dưỡng bào (mast cells) và các tế

bào bạch cầu đa nhân ái kiềm của động vật có vú. Heparin được trích ly từ mô gan

của chó thí nghiệm, do đó nó đã được Howell đặt tên là heparin (hepar tiếng Hy Lạp

có nghĩa là gan).

Từ năm 1935 heparin được sử dụng trong lâm sàng như một chất chống đông

máu, heparin có hoạt tính chống đông tức thời, mạnh, không chỉ phụ thuộc vào nồng

độ heparin mà còn phụ thuộc vào nồng độ antithrombin và các yếu tố đông máu.

Heparin có thời gian bán thải khá ngắn nên cần phải tiêm nhiều lần trong ngày.

Heparin quá liều hoặc quá mẫn cảm có thể dẫn đến chảy máu quá mức, do vậy heparin

được sử dụng kết hợp với thuốc để hỗ trợ việc điều trị ung thư, bên cạnh đó heparin

cũng có tác dụng ức chế một số loại tế bào ung thư [49].

Nhiều nghiên cứu cho thấy heparin là polymer sinh học có tính ổn định, không

độc, ưa nước, phân hủy sinh học và có nhiều chức năng quan trọng khác như: chống

đông máu, chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm và chống tăng sinh mạch máu

góp phần như một yếu tố giúp giảm việc tăng sinh của khối u [50]. Tuy nhiên, thời

gian bán thải của heparin trong cơ thể quá ngắn cho nhiều ứng dụng tiềm năng, vì

vậy heparin thường được kết hợp với nhiều chất hỗ trợ để giảm tỷ lệ biến tính của nó.

20

Trên cơ sở đó, các hệ dẫn truyền thuốc trên nền heparin đã được phát triển trong các

thử nghiệm mang thuốc kháng khối u và sự di căn của khối u đạt được nhiều kết quả

khả quan trong in vitro [51-53].

a. Heparin chưa phân đoạn

Heparin chưa phân đoạn (heparin tiêu chuẩn, heparin tự nhiên, unfractionated

heparin) là một hỗn hợp không đồng nhất những chuỗi mucopolysaccharide có chiều

dài khác nhau (trọng lượng phân tử lớn từ 3000 Da đến 30000 Da, trung bình 15000

Da). Heparin chưa phân đoạn dùng trong y khoa được trích ly từ màng nhày ruột heo

hoặc bò [48].

b. Heparin khối lượng phân tử thấp

Heparin khối lượng phân tử thấp (Low Molecular Weight Heparin=LMWH)

thu được bằng cách khử polymer hóa heparin chưa phân đoạn (bằng tác nhân hóa học

hoặc enzyme). Kết quả của quá trình khử polymer là các chuỗi mucopolysaccharide

ngắn, có trọng lượng phân tử trong khoảng từ 2000 Da đến 9000 Da (trung bình 4000

– 5000 Da). So với các chuỗi dài của heparin chưa phân đoạn, các chuỗi ngắn này có

ái lực thấp hơn với nhiều protein và tế bào. Heparin khối lượng phân tử thấp có thành

phần hóa học tốt hơn có hoạt tính chống nhân tố Xa cao hơn so với hoạt tính chống

thrombin, thời gian bán thải dài hơn và giảm tác dụng phụ.

1.2.2. Fucoidan

Fucoidan là một polysaccharide sulfate tự nhiên nằm trong thành tế bào của

nhiều loài rong biển nâu. Các loại rong biển màu nâu có chứa fucoidan được sử dụng

rộng rãi như là một phần của chế độ ăn uống bình thường ở các nước Đông Á, đặc

biệt là Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc. Ngoài ra, fucoidan còn được tìm thấy ở

một số loài động vật không xương sống khác như nhím biển và hải sâm [54].

Thành phần và cấu trúc của fucoidan cực kỳ phức tạp và thay đổi ở các loài

rong nâu khác nhau. Fucoidan ngoài 2 thành phần chính là L-fucose và nhóm sulfate,

còn chứa các thành phần khác như D-xylose, D-mannose, D-galactose, L-rhamnose,

arabinose, glucose, D-glucuronic acid và các nhóm acetyl khác nhau [55-56].

21

Bảng 1.1. Thành phần của fucoidan ở các loài rong nâu [56]

Rong nâu Thành phần hóa học (tỉ lệ mol)

F. vesiculosus fucose, sulfate

F. evanescens C.Ag. fucose/sulfate/acetate (1/1.23/0.36)

F. distichus fucose/sulfate/acetate (1/1.21/0.08)

F. serratus L. fucose/sulfate/acetate (1/1/0.1)

Lessonia vadosa fucose/sulfate (1/1.12)

Macrocytis pyrifera fucose/galactose (18/1), sulfate

Pelvetia wrightii fucose/galactose (10/1), sulfate

Undaria pinnatifida

(Mekabu)

fucose/galactose (1/1.1), sulfate

Ascophyllum nodosum Fucose (49%), xylose (10%), GlcA (11%), sulfate

Himanthalia lorea and

Bifurcaria bifurcate

fucose, xylose, GlcA, sulfate

Padina pavonia fucose, xylose, mannose, glucose, galactose, sulfate

Laminaria angustata fucose/galactose/sulfate (9/1/9)

Ecklonia kurome fucose, galactose, mannose, xylose, GlcA, sulfate

Sargassum stenophyllum fucose, galactose, mannose, GlcA, glucose, xylose,

sulfate

Adenocytis utricularis fucose, galactose, mannose, sulfate

Hizikia fusiforme fucose, galactose, mannose, xylose, GlcA, sulfate

Dictyota menstrualis fucose/xylose/uronic acid/galactose/sulfate

(1/0.8/0.7/0.8/0.4) và (1/0.3/0.4/1.5/1.3)

Spatoglossum schroederi fucose/xylose/galactose/sulfate (1/0.5/2/2)

Fucoidan thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như: chống ung thư, chống viêm,

chống đông máu, chống virus, chống oxy hóa, giảm lipid máu, ... Một số nghiên cứu

cho thấy rằng fucoidan gây ra sự tự chết theo chu trình của tế bào để loại bỏ các tế

bào ung thư. Đặc tính chống ung thư của fucoidan đã được đánh giá in vitro và in

vivo ở nhiều loại tế bào ung thư khác nhau [57]. Tuy nhiên, các ứng dụng y sinh trên

cơ sở sử dụng fucoidan làm hệ chất mang thuốc vẫn còn ở giai đoạn đầu phát triển.

22

Năm 2010, Jung Han Yoon Park và cộng sự nghiên cứu cho thấy ở một liều

rất thấp của fucoidan từ F. vesiculus (20 µg/mL) đã ức chế tăng trưởng và gây ra sự

tự chết theo chu trình của tế bào dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 thông

qua sự kích hoạt các caspase [58]. Năm 2014, Zhongyuan Zhang và cộng sự đã đánh

giá thử nghiệm các dòng tế bào ung thư vú MDA-MB231với 820 µg/ml fucoidan

trọng lượng phân tử thấp, kết quả làm giảm đáng kể các protein chống apoptotic Bcl-

2, Bcl-xl và Mcl-1 [59].

Fucoidan được phát hiện có khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào

trong dòng tế bào u lympho HS-Sultan của người [60]. Fucoidan từ các loài rong L.

saccharina, L. digitate, F. serratus, F. distichus và F. vesiculosus có tác dụng khóa

chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn kết dính với các tiểu cầu, điều này có ý

nghĩa quan trọng trong quá trình di căn khối u [61-63].

Khả năng phục hồi các chức năng miễn dịch của fucoidan cũng đã được nghiên

cứu và thử nghiệm in vitro và in vivo. Fucoidan giúp tăng hoạt động và số lượng tế

bào giết tự nhiên (NK, natural killer) trong in vivo [64-65]. Fucoidan trọng lượng

phân tử cao (200 - 300 kDa) được điều chế từ Cladosiphon okamuranus thúc đẩy sự

gia tăng tỷ lệ gây độc tế bào T ở chuột [66].

1.3. Pluronic

1.3.1. Cấu tạo

Pluronic là polymer nhạy nhiệt và có tính tương hợp sinh học cao, được FDA

chứng nhận và cho phép sử dụng rộng rãi. Pluronic còn được gọi là poly(ethylene

oxide) - poly(propylene oxide) - poly(ethylene oxide) được sắp xếp theo dạng khối

ba A–B–A: PEO - PPO - PEO có cấu trúc đặc biệt với hai nhóm ưa nước ở ngoài,

còn ở giữa là nhóm kỵ nước đây cũng là thành phần nhạy nhiệt của pluronic [67].

Hình 1.16. Cấu trúc pluronic [67]

23

1.3.2. Tính chất

Tất cả các pluronic đều có cấu tạo hóa học giống nhau, chỉ khác nhau ở số

lượng tương đối của poly(ethylene oxide) - poly(propylene oxide) nên trọng lượng

phân tử cũng như đặc tính hoạt động bề mặt của mỗi loại là khác nhau. Hầu hết các

pluronic là các chất rắn có khả năng tan trong nước và chúng hòa tan trong nước lạnh

nhiều hơn trong nước nóng, đó là kết quả của việc gia tăng sự solvat hóa và liên kết

hydro ở nhiệt độ thấp. Điều này được giải thích bởi ở nhiệt độ thấp sẽ tồn tại một lớp

hydrat hóa bao quanh các phân tử pluronic trong dung dịch nước, làm phân tán chúng

và kết quả là các pluronic được hòa tan vào trong nước. Khi nhiệt độ nâng lên các

chuỗi ưa nước của pluronic không solvat hóa nữa do sự đứt gãy các liên kết hydro đã

được thiết lập giữa dung môi và các chuỗi này, do đó mà pluronic không tan tốt trong

nước có nhiệt độ cao (> 20oC).

Các poloxamer thường có tính chất đặc trưng là phản ứng lại với nhiệt độ và

được dùng rộng rãi trong các hệ thống gel nhiệt. Khi ở nhiệt độ thấp (0oC - 4oC), dung

dịch pluronic với một nồng độ thích hợp sẽ tồn tại ở trạng thái lỏng, nhưng khi tăng

nhiệt độ lên nhiệt độ phòng (20oC ~ 25oC) thì lại chuyển sang dạng gel rắn. Tuy nhiên,

dạng gel này sẽ bị thoái biến và chuyển về dạng lỏng ban đầu nếu hạ nhiệt độ xuống.

Nguyên nhân của sự biến đổi thể chất này là do sự hình thành các micelle khi

tăng nồng độ dung dịch pluronic và nhiệt độ môi trường xung quanh. Trong môi

trường nước ở nồng độ thấp (dưới 12% - 15%) chúng tạo thành các micelle đơn phân

tử gồm các phân tử pluronic đơn lẻ, nhưng khi ở nồng độ cao hơn thì nhiều phân tử

tập hợp lại thành các micell hình cầu gồm một lõi trung tâm kỵ nước ở giữa chứa các

chuỗi PPO.

1.3.3. Ứng dụng

Một số pluronic là copolymer không độc, ưa nước, được sử dụng rộng rãi như

một tá dược để làm tăng tính ổn định và độ hòa tan của thuốc. Sự kết hợp của các loại

thuốc kém tan vào trong các hạt micelle pluronic có thể cải thiện được dược tính của

thuốc và tăng sự phân tán sinh học [50].

Pluronic còn có tiềm năng lớn trong việc mang các thuốc khó tan trong nước,

đặc biệt là thuốc trị ung thư và nó dễ dàng kết hợp với một chất khác để tạo ra hệ

nano mang thuốc hiệu quả hơn (do có nhóm -OH đầu mạch).

24

Một số pluronic còn được sử dụng rộng rãi trong đời sống, dùng làm dầu bôi

trơn, mỹ phẩm, ứng dụng làm chất ổn định của màng tế bào, công nghiệp tẩy rửa.

Bảng 1.2. Thông số đặc trưng của một số pluronic

Pluronic Trạng

thái

Tổng số

nhóm PEO

Tổng số

nhóm PPO

Giá trị

HLB

Khối lượng

phân tử (Da)

CMC

L121 Lỏng 10,00 68,28 1 4400 1.0x10−6

L61 Lỏng 4.55 31.03 3 1950 1.1x10−4

P123 Hồ keo 39,20 69,40 8 5750 4.4x10−6

P105 Hồ keo 73.86 56.03 15 6500 6.2x10−6

F127 Rắn 200,45 65,17 22 12600 2.8x10−6

F87 Rắn 122.50 39.83 24 7700 9.1x10−5

F68 Rắn 152.73 28.97 29 8400 4.8x10−4

1.4. Ung thư và thuốc chống ung thư cisplatin

1.4.1. Tổng quan về bệnh ung thư

Theo số liệu thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tháng 9/2018, bệnh

ung thư là nguyên nhân hàng đầu gây nên cái chết của 9,6 triệu người trên toàn thế

giới. Trong số các loại ung thư có 6 loại phổ biến, gây tử vong hàng đầu gồm: (1) ung

thư phổi - 1,76 triệu ca tử vong, (2) ung thư ruột kết tràng - 862 ngàn ca tử vong, (3)

ung thư dạ dày – 783 triệu ca tử vong, (4) ung thư gan - 782 ngàn ca tử vong, (5) ung

thư vú - 627 ngàn ca tử vong và các loại bệnh ung thư nói chung, được dự đoán sẽ

tăng lên 70% trong 2 thập niên tới.

Ung thư xảy ra do sự đột biến trong ADN, dẫn đến tế bào tăng sinh vô hạn độ,

vô tổ chức, không tuân theo các cơ chế kiểm soát về phát triển cơ thể. Vấn đề quan

trọng nhất trong bệnh lý ung thư là sự phân biệt giữa các khối u lành tính và ác tính.

Nếu là khối u ác tính, chúng có khả năng xâm nhập quanh các mô bình thường và lan

truyền khắp cơ thể thông qua hệ thống tuần hoàn. Thông qua các nghiên cứu trong

thời gian gần đây, ung thư được chứng minh có liên quan đến yếu tố di truyền, nghĩa

là do sự biến đổi trong các gene dẫn đến những thay đổi trong chức năng và sự phân

chia tế bào. Những thay đổi này là kết quả của sự tương tác giữa các yếu tố di truyền

và các tác nhân bên ngoài, bao gồm: các tác nhân vật lý như tia cực tím, bức xạ ion

25

hóa; các tác nhân hóa học như arsenic, aflatoxin và đặc biệt là khói thuốc lá, các tác

nhân sinh học như nhiễm trùng bởi virus, vi khuẩn, ký sinh trùng [68].

1.4.2. Cisplatin

Cisplatin hay còn được gọi là cis-diamminedichloroplatinum (II), là một hợp

chất phức hợp của kim loại platin với các nhóm clo (-Cl) và amoniac (-NH3). Cisplatin

ít hòa tan trong nước và hòa tan tốt trong dimethylprimanide và N,N-

dimethylformamide.

Cisplatin lần đầu tiên được tổng hợp bởi M. Peyrone vào năm 1844 và cấu trúc

hóa học lần đầu tiên được Alfred Werner làm sáng tỏ vào năm 1893. Tuy nhiên, hợp

chất này không nhận được nhiều chú ý cho đến những năm 1960, khi những quan sát

ban đầu của Rosenberg và cộng sự (1965) tại Đại học bang Michigan chỉ ra rằng một

số sản phẩm điện phân của lưới điện cực platin có khả năng ức chế phân chia tế bào

Escherichia coli, kết quả đó tạo ra nhiều sự quan tâm trong việc ứng dụng các sản

phẩm này trong hóa trị ung thư. Và kể từ khi xác định được cisplatin là nhân tố đóng

vai trò trong khả năng ức chế phân chia tế bào thì các chất phức hợp của platin, và

các kim loại quý khác đã được ứng dụng trong điều trị ung thư [2].

Hình 1.17. Các chất phức hợp chứa platin: (A)-cisplatin; (B)-carboplatin; (C)-

oxaliplatin; (D)-ormaplatin; (E)-enloplatin [2]

Cisplatin đã được sử dụng sớm trong lâm sàng để điều trị nhiều bệnh ung thư

như: ung thư tinh hoàn, ung thư buồng trứng, bàng quang, ung thư vú, u não, u não

ác tính, ung thư tiểu bào phổi (SCLC), u lympho và myelomas [69]. Tuy nhiên, bên

26

cạnh tác dụng điều trị tốt cisplatin cũng gây ra nhiều tác dụng phụ đáng kể như: gây

độc thận, gây độc thần kinh, gây ù tài, nghe kém ở tần số cao, suy tủy, … Đồng thời

khả năng kém tan của cisplatin và sự kháng thuốc của các tế bào ung thư cũng là

những hạn chế lớn làm cho việc sử dụng cisplatin trong điều trị ung thư bị hạn chế.

Do đó, nhiều phức platinum (II) cũng đã được tổng hợp và thử nghiệm, tất cả đều có

cấu trúc tương tự với cisplatin gồm carboplatin, oxaliplatin, ormaplatin và enloplatin.

Sau khi đưa vào cơ thể, cisplatin đi theo dòng máu đến khối u và được đưa

vào tế bào thông qua ba cơ chế: sự khuếch tán thụ động, các protein vận chuyển đồng

(Cu), và các chất vận chuyển cation hữu cơ. Khi cisplatin vào bên trong tế bào, chúng

liên kết với guanine ở vị trí N7, làm ADN bị biến tính dẫn đến mất khả năng phiên

mã, dịch mã và dẫn đến hiện tượng tế bào tự chết. Cisplatin cũng liên kết và làm biến

tính ARN, ngăn chặn ARN tham gia vào các hoạt động tế bào, giúp tăng hiệu quả tác

động của cisplatin nhằm tiêu diệt các tế bào ung thư. Bên cạnh các tác động tích cực,

cisplatin cũng có những hạn chế vì gây độc tế bào, không chỉ ảnh hưởng đến tế bào

ung thư mà còn ảnh hưởng đến tế bào bình thường, gây nhiều tác dụng phụ [69].

Đến nay, cisplatin được chứng minh là một trong những thuốc hóa trị liệu

chống ung thư hiệu quả nhưng cần kết hợp với các thuốc khác trong quá trình điều trị

và cần nhiều nghiên cứu thêm để cải thiện các phương pháp điều trị nhằm cắt giảm

tác dụng phụ của thuốc. Trong đó, hướng nghiên cứu chất mang vận chuyển nhả chậm

thuốc với kích thước nano được xem là một trong những giải pháp hiệu quả nhất

nhằm giải quyết những hạn chế do các tác dụng phụ và sự kháng thuốc của cisplatin.

1.5. Curcumin

Vào năm 1815, Vogel và Pelletier đã phân lập được hoạt chất có trong củ nghệ

và đặt tên là curcumin, (chiếm 2 - 5%). Đến năm 1910, Milobedzka và cộng sự đã

xác định được curcumin là một polyphenol kỵ nước có cấu trúc diferuloylmethan, là

thành phần có hoạt tính sinh học chính, làm nên màu vàng của nghệ. Curcumin không

tan trong nước nhưng tan trong ethanol, kiềm, cetone, acid acetic và chloroform.

Curcumin gồm có 3 hoạt chất chính: curcumin I (curcumin) chiếm chủ yếu,

curcumin II (demethoxycurcumin), curcumin III (bis - demethoxycurcumin).

27

Hình 1.18. Cấu trúc curcumin

Curcumin có nhiều hoạt tính sinh học như: chống tăng đường huyết, chống

viêm, chống oxy hóa mạnh, kháng khuẩn, tác dụng bảo vệ thận, tác dụng chống viêm

loét dạ dày, ... Trong những nghiên cứu gần đây, curcumin đã được chứng minh có

hoạt tính ngăn ngừa ung thư mạnh mẽ, ngay từ giai đoạn khối u khởi phát, phát triển,

di căn, và tăng sinh tạo mạch máu, chống lại sự lan rộng của khối u. Curcumin có tác

dụng bất hoạt phân tử NF-κB và các con đường truyền tín hiệu liên quan đến phân tử

này. NF-κB đóng vai trò quan trọng đối với sự sinh tồn, tăng trưởng, phân chia và di

căn của rất nhiều loại tế bào ung thư. Vì vậy khi phân tử NF-κB bị ức chế, tế bào ung

thư sẽ tự chết, giảm hoặc mất khả năng tăng trưởng và di căn [70].

Năm 2016, nghiên cứu của Sunhui Chen và cộng sự đã cho thấy khi kết hợp

curcumin với 4 loại thuốc chống ung thư docetacel, erlotinib, sunitinib và sorafenib

có thể tạo sự cộng hợp làm tăng hiệu quả của mô hình điều trị, khả năng ức chế sự

tăng trưởng của khối u cao hơn khi sử dụng thuốc riêng lẻ [71]. Tuy nhiên curcumin

có hạn chế do độ hòa tan kém dẫn đến khả năng hấp thụ kém, do đó, hướng nghiên

cứu tạo nanocurcumin để tăng cường sinh khả dụng cũng đang được quan tâm.

1.6. Những nghiên cứu trước đây

Các hướng nghiên cứu vận chuyển, nhả chậm thuốc đã được nghiên cứu và

phát triển mạnh trong những năm gần đây, trong đó sử dụng chất mang nano là một

trong những giải pháp hiệu quả nhất. Nhiều kết quả thử nghiệm chỉ ra rằng, thuốc khi

được mang trong các hệ chất mang nano giúp kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu

và tích lũy nhiều trong khối u ung thư thông qua hiệu ứng tăng cường thẩm thấu và

lưu trữ (EPR effect) đặc trưng ở các mô ung thư [38].

Với các ưu điểm trên, nhiều loại chất mang nano đã được nghiên cứu ứng dụng

trong điều trị ung thư, trong đó hướng nghiên cứu về nanogel đang được nhiều nhà

khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu, tuy nhiên các công bố khoa học cũng

28

còn rất ít [72-74]. Gần đây, việc điều chỉnh các dạng oxy hoạt động (ROS) bằng quá

trình oxy hóa sinh học tại vùng khối u là một hướng nghiên cứu mới nổi để điều chỉnh

quá trình oxy hóa khử của tế bào trong điều trị ung thư. Nanogel siêu phân tử MNP-

CPO lấy cảm hứng từ bạch cầu trung tính đã được Q. Zhang và cộng sự báo cáo năm

2020, nanogel này có thể hoạt động và được lập trình giống như một bạch cầu trung

tính nhân tạo cho liệu pháp điều trị ung thư bằng cách tự lắp ráp các peptid qua hệ

thống enzym thủy phân (Fmoc-Tyr (H2PO3)-OH) với các hạt nano từ tính (MNP) và

mang chloroperoxidase (CPO). Các MNP trong nanogel có thể nâng cao mức độ H2O2

trong các tế bào ung thư dưới từ trường xoay chiều được lập trình (AMF) tương tự

như một bạch cầu trung tính và CPO được bảo vệ trong lớp nano peptide liên tục

chuyển đổi H2O2 thành oxy singlet (1O2) để điều trị khối u [75].

Một số nanogel đã được nghiên cứu cho ứng dụng để vận chuyển thuốc chống

ung cisplatin như các hạt nanogel từ glycol chitosan, poly(lactide-co-glycolide)-

polyethylene glycol và nanocapsules từ liposome. Các chất mang này đã cho thấy khả

năng mang tốt cisplatin và có hiệu quả cao trong tiêu diệt nhiều dòng tế bào ung thư

[76-77]. Tuy nhiên các hệ chất mang trên có kích thước tương đối lớn khoảng 100 -

600 nm và nhả cisplatin nhanh vì tương tác giữa hệ chất mang nano và cisplatin yếu,

điều này có thể không đưa đến hiệu quả cao trong các thử nghiệm trên động vật. Một

chiều hướng mới gần đây được phát triển để khắc phục hạn chế trên là sử dụng dạng

phức hydrate của cisplatin và chất mang polymer có các nhóm carboxylate như

dendrimer-carboxylate [78-79]. Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy dendrimer-

carboxylate có thể mang một lượng lớn thuốc và nhả chậm cisplatin dạng hydrate từ

chất mang.

Ở Việt Nam, đã có một vài nhóm nghiên cứu đối với chất mang nano để vận

chuyển thuốc cisplatin hoặc phức platin (II).

Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Lê Mai Phương và Hà Phương Thư đã công

bố một hệ thuốc nano gồm phức bis(menthone thiosemicarbazonato) Platinum (II)

được bao bọc trong block copolymer polylactide-tocopheryl polyethylene glycol

1000 succinate (PLA-TPGS). Kết quả là các hạt core-shell với kích thước 50 nm có

khả năng ức chế một số vi khuẩn gram âm và gram dương, đặc biệt có độc tính với tế

bào Hep-G2 [80].

29

Năm 2013-2014, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Cửu Khoa và Trần Ngọc

Quyển cũng đã có một vài công bố trên các tạp chí ISI về các hạt nano dendrimer

mang thuốc chống ung thư 5-fluouroacil và cisplatin. Trong đó chất mang pegylated

dendrimer đã vận chuyển và nhả chậm hiệu quả thuốc 5- fluouroacil tiêu diệt tế bào

ung thư vú và khối u trên chuột [81]. Đối với vận chuyển và nhả chậm cisplatin, nhóm

nghiên cứu đã sử dụng phương pháp cải tiến trong đó dạng hydrate cisplatin được tạo

phức với dendrimer. Kết quả hiệu suất mang cisplatin tăng lên 10% so với các nghiên

cứu đã được công bố trước đó, đồng thời hệ chất mang nano dendrimer-cisplatin có

hoạt tính cao trong tiêu diệt tế bào ung thư phổi [82-83].

Hình 1.19. Phức giữa cisplatin hydrate và carboxylate PAMAM G3.5 [83]

Đối với chất mang nanogel heparin, Trần Ngọc Quyển, Nguyễn Đại Hải và

nhóm nghiên cứu ở Hàn Quốc đã tổng hợp thành công chất mang nanogel âm điện –

nhạy nhiệt trên cơ sở heparin mang nhả chậm các protein dương điện tích hoặc các

tác nhân kích thích phát triển sinh học (growth factors) nhằm ứng dụng trong y sinh

[84-85].

Đối với chất mang nanogel fucoidan, mặc dù có nhiều chất mang nanogel ứng

dụng trong y sinh trên cơ sở một số các polysaccharide như chitosan, alginate được

công bố trong vài năm gần đây [86-88], nhưng hiện nay chưa có bất kỳ công bố nào

về điều chế và ứng dụng nanogel từ fucoidan.

1.6.1. Nghiên cứu kết hợp thuốc chống ung thư cisplatin và chất mang nano

Nhiều nghiên cứu cho thấy heparin và fucoidan là 2 polymer sinh học có nhiều

hoạt tính sinh học có lợi như: kháng khối u ung thư, chống tăng sinh mạch máu (góp

phần giảm sự phát triển khối u), kháng viêm, chống đông máu và tính kháng oxy hóa

[89-90].

30

- Năm 2011, Xiang-Hong Peng và cộng sự đã tạo hệ phân phối thuốc cisplatin

trên nền heparin có gắn tác nhân hướng đích ScFvEGFR được đánh giá qua kết quả

kháng ung thư phổi cho thấy tiềm năng điều trị trúng đích hiệu quả [91].

- Năm 2012, Liu và cộng sự đã công bố copolymer heparin-polyethyleneimine

mang Hsulf-1 gene tăng cường hoạt tính kháng ung thư cổ tử cung khi điều trị kết

hợp với cisplatin [92].

- Năm 2013, Yoon Ki Joung và cộng sự kết hợp hệ nanogel gồm heparin và

pluronic để tạo hệ mang đa thuốc đem lại kết quả khả quan, từ đó cho thấy tiềm năng

hứa hẹn cho hóa trị liệu kết hợp để tăng cường hiệu quả điều trị khối u [93].

- Năm 2014, Lili Liu và cộng sự đã kết hợp plasmid tái tổ hợp mang shRNA với

cisplatin liều thấp, và hai thành phần này được đưa vào hệ nanogel Heparin–

polyethyleneimine (HPEI). Claudin-3 (CLDN3) được biết đến là một gene giúp tăng

cường biểu hiện của tế bào ung thư buồng trứng; shRNA là ARN dạng kẹp tóc có khả

năng nhắm mục tiêu gene CLDN3. Sau đó hệ nanogel này thử nghiệm trên mô hình

chuột mang khối u ung thư buồng trứng và kết quả cho thấy thể tích khối u giảm, hệ

nanogel mang thuốc có hiệu quả trong việc tiêu giảm thể tích khối u [94] .

Một loạt các nghiên cứu tổng hợp các hệ chất mang nano khác mang thuốc

chống ung thư cisplatin nhằm mục đích giảm độc tính tế bào, tăng hiệu quả điều trị

khối u cũng đã được công bố [95-98]. Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Yi Zhang và

cộng sự đã tổng hợp nanogel trên cơ sở acid hyaluronic (HA) liên kết ngang với

cisplatin (CDDP) vận chuyển doxorubicin (DOX) để điều trị bệnh xương khớp.

Cisplatin hoạt động như một chất liên kết ngang và chất chống ung thư phụ trợ để

ngăn chặn sự giải phóng sớm của DOX và đạt được hiệu quả điều trị hiệp đồng so

với các thuốc tự do [99]. Năm 2019, Seyed Ebrahim Alavi và cộng sự tổng hợp hệ

nano polybutylcyanoacrylate (PBCA) chứa cisplatin để điều trị ung thư phổi, sự giải

phóng thuốc chậm (10% trong 48 giờ) từ hệ nano góp phần làm tăng hiệu quả điều

trị của thuốc [100].

- Năm 2013, báo cáo từ các nhà khoa học Nhật Bản cho thấy dịch trích fucoidan

tăng cường hoạt tính chống khối u với tế bào ung thư vú MCF-7 khi kết hợp với tác

chất hóa trị (cisplatin, tamoxifen hoặc paclitaxel) [101].

31

- Năm 2017, Pai-An Hwang và cùng cộng sự đã điều chế hạt nano Fucoidan-

cisplatin (FCNP) bằng cách phối trộn dung dịch fucoidan với cisplatin. Trong đó

Fu100Cis20 (10 mg fucoidan trộn với 2 mg cisplatin) cho hiệu quả mang thuốc cao

nhất với 18,9 ± 2,7% cisplatin. Thử nghiệm bảo vệ miễn dịch cho thấy Fu100Cis20

được điều trị trên dòng tế bào RAW264.7 được bảo vệ khỏi độc tính của cisplatin.

Hơn nữa, thử nghiệm đánh giá hoạt động chống ung thư của Fu100Cis20 trên dòng

tế bào HCT-8 cho thấy độc tính tế bào mạnh hơn so với các tế bào được điều trị bằng

cisplatin tự do. Những kết quả này cho thấy các hạt nano trên cơ sở fucoidan có hiệu

quả mang thuốc cao, và Fu100Cis20 có ứng dụng tiềm năng trong cả liệu pháp miễn

dịch và hóa trị [102].

- Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Merve Tutuncu và cộng sự đã nghiên cứu tác

dụng bảo vệ của fucoidan trên mô tinh hoàn chuột và đánh giá hiệu quả làm giảm tổn

thương tinh hoàn do cisplatin gây ra. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng fucoidan làm

giảm đáng kể tổn thương tinh hoàn và đáp ứng với điều trị bằng cisplatin. Theo những

phát hiện này, điều trị bằng fucoidan sau khi dùng cisplatin có thể được coi là một

lựa chọn điều trị chống lại vô sinh thứ phát do cisplatin gây ra [103].

Trong vài năm gần đây nhiều nghiên cứu khác về điều chế hệ chất mang nano

có sử dụng kết hợp fucoidan nhằm mục đích giảm độc tính và tăng hiệu quả điều trị

của thuốc cũng đã được báo cáo [104-107].

Những thông tin trên góp phần khẳng định việc đề ra hướng nghiên cứu tổng

hợp chất mang nanogel từ các polysaccharide sulfate để vận chuyển và nhả chậm

cisplatin sẽ có nhiều ý nghĩa khoa học và ứng dụng.

So sánh với các hệ chất mang nano vận chuyển thuốc cisplatin đã nghiên cứu

trước đây, trong đề tài này chúng tôi tiến hành tổng hợp các hệ chất mang nanogel từ

heparin cũng như fucoidan để vận chuyển - nhả chậm cisplatin và cisplatin dạng

hydrate. Trong đó, nanogel trên cơ sở heparin cũng như fucoidan và sử dụng dạng

hydrate cisplatin mang trong chất mang nano có nhóm carboxylate là 2 khái niệm

mới được công bố. Fucoidan được cô lập từ rong nâu ở Việt Nam có nhiều hoạt tính

sinh học quý có thể dùng như là vật liệu điều chế nanogel trong nội dung nghiên cứu

của đề tài, nên sự thành công của nghiên cứu có thể mở đường cho việc sử dụng

fucoidan từ Việt Nam trong nhiều lĩnh vực y dược khác.

32

1.6.2. Nghiên cứu kết hợp curcumin với thuốc chống ung thư cisplatin

Nhiều nghiên cứu trên động vật cho thấy curcumin có tác dụng giúp ngăn ngừa

ung thư da, ung thư dạ dày, ung thư ruột ở chuột. Mặc dù có nhiều hoạt tính sinh

học và dược động học tốt nhưng curcumin vẫn không gây độc đối với động vật có

kích thước nhỏ và lớn, ngay cả khi được thử nghiệm với nồng độ curcumin cao. Qua

đó cho thấy, curcumin là nhân tố tiềm năng dùng kết hợp với các thuốc chống ung

thư khác nhằm ngăn ngừa và tiêu diệt khối u ung thư ở người.

- Năm 2013, Mendonça và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá sự ảnh hưởng của

curcumin lên dược động học của cisplatin thông qua phân tích sự biểu hiện gen p53

và làm giảm độc tính của cisplatin trên tế bào khối u HepG2. Qua đó, nhóm nghiên

cứu chỉ ra rằng curcumin cũng góp phần làm giảm độc tính của cisplatin trong in vitro

và cần tiếp tục nghiên cứu thêm ở cấp độ lâm sàng [108].

- Năm 2016, Baharuddin và cộng sự đã kết hợp curcumin (10 – 40 μM) với

lượng nhỏ cisplatin (3 μM) và thử nghiệm khả năng tiêu diệt các dòng tế bào ung

thư phổi (NSCLC). Kết quả cho thấy, curcumin đã góp phần nâng cao dược động

học của cisplatin trong việc làm giảm sự di cư của dòng tế bào A549, H2170 [109].

- Năm 2017, Parveen Kumar cùng cộng sự đã kết hợp curcumin với cisplatin để

làm giảm độc tính đối với thận và góp phân nâng dược động học của cisplatin. Qua

nghiên cứu, curcumin làm giảm các dấu hiệu viêm do cisplatin gây ra và góp phần

điều trị khối u qua việc tăng biểu hiện PPAR-γ, giảm biểu hiện BDNF [110].

Nhìn chung trong những năm gần đây, nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới

đã sử dụng curcumin kết hợp với các chất hóa trị liệu với mục tiêu giảm tác dụng phụ

của thuốc, góp phần tăng hiệu quả điều trị ung thư.

Khác với các công bố sử dụng cisplatin kết hợp curcumin đã nghiên cứu, trong

đề tài này chúng tôi sử dụng hệ chất mang nanogel trên cơ sở heparin - pluronic tạo

phức trực tiếp với cisplatin dạng hydrate, đồng thời kết hợp với nanocurcumin thông

qua tương tác tĩnh điện và tương tác kỵ nước giữa hạt nanocurcumin và nanogel nhằm

làm tăng hiệu quả mang thuốc và giảm khả năng gây độc tế bào của cisplatin.

33

CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU

2.1. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng cho tổng hợp và phân tích được cung cấp từ các hãng

Acros, Sigma Aldrich, Merck, Fisher, RCI Labscan, B. Braun.

Bảng 2.1. Danh mục hóa chất

Hóa chất Nguồn gốc

Heparin sodium (Mw = 12000) Acros Organics, Mỹ

Pluronic P123 (Mw = 5800) Sigma - Aldrich, Mỹ

Pluronic F127 (Mw = 12600) Sigma - Aldrich, Mỹ

Pluronic F87 (Mw = 7700) Sigma - Aldrich, Mỹ

Pluronic F68 (Mw = 8400) Sigma - Aldrich, Mỹ

Cisplatin, 99,99% (Mw = 300,05) Sigma - Aldrich, Mỹ

p-nitrophenyl chloroformate, 97% (Mw = 201,56) Acros Organics, Mỹ

3-amino-1-propanol, 99% (Mw = 75,11) Acros Organics, Mỹ

N-hydroxysuccinimide, 98+% (Mw = 115,09) Acros Organics, Mỹ

1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide, 97%

(Mw = 191,70)

Acros Organics, Mỹ

1,4-diaminobutane, 99% (Mw = 88,15) Acros Organics, Mỹ

Curcumin, 98+% (Mw = 368,38) Merck, Đức

Fucoidan (from Fucus vesiculosus) Sigma - Aldrich, Mỹ

Chloroform, 99,8+% RCI Labscan, Thái Lan

Dichloromethane, for analysis, stabilized with amylene RCI Labscan, Thái Lan

Diethyl ether, 99,5% RCI Labscan, Thái Lan

n-Hexan RCI Labscan, Thái Lan

Busulfan Sigma - Aldrich, Mỹ

Cyclophosphamide Sigma - Aldrich, Mỹ

Xylazine ≥ 99% Sigma - Aldrich, Mỹ

Ethanol, 99,8+%, for analysis, absolute Fisher Chemical, Mỹ

Dimethyl sulfoxide, 99,9+%, for analysis Fisher Chemical, Mỹ

Bạc nitrat Fisher Chemical, Mỹ

34

2.2. Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ

Bình cầu cổ nhám một cổ, bình cầu cổ nhám ba cổ.

Falcon, ống đong, micropipette, cá từ.

Khóa nhám cung cấp nitrogen.

Thước kẹp Mitutoyo (Nhật Bản) với độ chia nhỏ nhất 0,02 mm.

Túi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane MWCO 3500

Da, 6000 - 8000 Da, 12000 - 4000 Da và các dụng cụ khác.

Thiết bị

Cân điện tử, 4 số lẻ (A&D company-Nhật), máy khuấy từ có hiệu chỉnh nhiệt

(VELP Scientifica - Ý), máy đông khô (FDU-1200 EYELA - Nhật), máy ly tâm

(Hermle Labortechnik GmbH - Đức), máy cô quay chân không (Hahnvapor-Hàn

Quốc), tại phòng thí nghiệm Hóa dược, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Máy phân tích nhiệt lượng TGA - DSC (Mettler Toledo - Thụy Sĩ), máy đo sự

phân bố kích thước hạt DLS (Horiba SZ-100 - Nhật Bản), máy quang phổ hồng ngoại

biến đổi FT-IR (PerkinElmer Frontier - Úc), máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến

(UV-1800 UV-VIS Spectrophotometer) - Nhật Bản, tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng

dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Xác định hình thái, kích thước hạt bằng ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

được chụp bằng máy JEOL JEM 1400 ở 140 kV - Nhật Bản, tại Trường Đại học Bách

Khoa, Thành phố Hồ Chí Minh.

Phổ 1H-NMR đo trên máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR, Bruker Avance

500MHz, tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Xác định phần trăm platinum bằng máy quang phổ phát xạ plasma (ICP-OES

- Inductively Coupled Plasma - Optical Emission Spectrometry), tại Trung tâm dịch

vụ phân tích thí nghiệm, Thành phố Hồ Chí Minh.

Đánh giá độc tính tế bào MCF-7 và độc tính nguyên bào sợi đo tại Đại học

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia, Thành phố Hồ Chí Minh.

35

Mô hình thí nghiệm chuột mang khối u được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ

môn Sinh lý học và Công nghệ Sinh học Động vật, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại

học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Đánh giá mô học mẫu khối u bằng phương pháp nhuộm Hemaoxylin – Eosin

(H&E) và hóa mô miễn dịch tại khoa Giải phẫu bệnh thuộc Bệnh viện Nhi đồng 1,

Thành phố Hồ Chí Minh.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp tổng hợp các copolymer ghép trên cơ sở polysacchride sulfate

(heparin, fucoidan) liên hợp pluronic

Quá trình tổng hợp các copolymer ghép trên cơ sở polysacchride sulfate

(heparin, fucoidan) liên hợp pluronic gồm: Hep-P123, Hep-F127, Hep-F68, Hep-F87

và Fud-P123 với các tỉ lệ ghép khác nhau, được thực hiện bằng cách sử dụng tác chất

p-nitrophenyl chloroformate (NPC) và 3-aminopropan-1-ol (Ami) để hoạt hóa

pluronic. Sau đó dùng 1,4-diaminobutane (DAB) và tác chất ghép cặp EDC/NHS để

biến tính và gắn nhóm amine vào polysacchride sulfate.

Quy trình tổng hợp các copolymer ghép trên được thực hiện qua 4 giai đoạn,

phương pháp được tham khảo theo công bố trước đây của nhóm nghiên cứu [50].

2.3.2. Phương pháp đánh giá cấu trúc, hình thái các copolymer ghép

- Cấu trúc các copolymer ghép Hep-P123, Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68 và

Fud-P123 được xác định bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và

quang phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR.

- Sử dụng phương pháp TGA để xác định phần trăm lượng pluronic P123,

F127, F7, F68 được ghép vào heparin, fucoidan. Mẫu được sử dụng 10 mg, ở nhiệt

độ 25oC – 700 oC với tốc độ 10oC/phút, dưới điều kiện khí nitrogen

- Hình thái, kích thước các nanogel được xác định bằng ảnh hiển vi điện tử

truyền qua (TEM).

- Sử dụng iodine và phương pháp quang phổ UV-Vis để xác định giá trị CMC

của các nanogel trong nước DI, phương pháp được thực hiện theo báo cáo của Zhang

Wei, 2009 [111].

Dung dịch chuẩn KI/I2 được điều chế bằng cách hòa tan 0,25 g iodine và 0,5

g kali iodua (KI) trong 25 ml nước DI. Chuẩn bị 20 mẫu dung dịch copolymer ghép

36

có nồng độ dao động từ 0,00001% đến 0,1% với thể tích 10 ml được thêm vào 10 μl

dung dịch chuẩn KI/I2. Các mẫu sẽ được ủ trong 12 giờ trong phòng tối ở nhiệt độ

phòng trước khi đo. Giá trị độ hấp thụ tử ngoại của các dung dịch polymer ở các nồng

độ khác nhau ở số sóng 366 nm được đo bằng máy quang phổ UV-Vis. Cường độ

hấp thụ được vẽ trên logarit của nồng độ polymer. Các giá trị CMC được xác định

tương ứng với nồng độ của polymer mà tại đó độ hấp thụ tăng mạnh được quan sát

thấy.

2.3.3. Phương pháp tổng hợp hệ nanogel mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

Các copolymer ghép Hep-P123, Hep-F127, Hep-F68, Hep-F87, Fud-P123 có

thể tự lắp ráp thành các nanogel có kích thước nano trong dung dịch nước nhờ vào

đặc tính lưỡng tính của polymer và giá trị CMC thấp, từ đó có thể hình thành vật liệu

nanogel mang thuốc ổn định.

Sau khi các nanogel được tổng hợp thành công chúng tôi tiến hành đánh giá

hiệu quả mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate của các hệ nanogel này trên cơ sở

tương tác kỵ nước và sự hình thành phức giữa hệ chất mang và thuốc, quy trình được

tham khảo theo báo cáo trước đây của nhóm nghiên cứu [50].

Cấu trúc các nanogel mang thuốc được xác định bằng phương pháp quang phổ

hồng ngoại biến đổi FT-IR.

Phần trăm lượng thuốc được mang trong nanogel sẽ được xác định bằng máy

quang phổ phát xạ plasma ICP-OES thông qua phần trăm lượng platinum có trong

mẫu theo công thức:

%cisplatin = %Pt × 300,05

195,084 (%wt/wt)

2.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng nhả thuốc của các hệ nanogel mang thuốc

Sử dụng phương pháp đo quang phổ phát xạ plasma ICP-OES để xác định

phần trăm lượng platinum có trong mẫu. Từ đó ta có thể tính toán được tổng lượng

thuốc đã giải phóng ra theo công thức [112]:

n 1

n s t n 1

i 1

Q C V V C

Trong đó, Q là tổng lượng thuốc đã giải phóng

Cn là nồng độ đo được tại thời điểm n

Vs là thể tích PBS trong ống thủy tinh

37

Cn-1 là tổng nồng độ đo được từ mốc đầu tiên cho đến thời điểm n-1

Vt là thể tích thu nhận để đánh giá.

2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào

thường)

Đánh giá độc tính tế bào trên dòng tế bào MCF-7 của hệ nanogel mang thuốc

và đánh giá độc tính tế bào của hệ nanogel trên nguyên bào sợi được thực hiện bằng

phương pháp nhuộm Sulforhodamine B (SRB), tại trừờng Đại học Khoa học Tự

nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Đây là phương pháp được Viện

Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) đưa ra năm 1985 và xác nhận là phương pháp đánh

giá chuẩn về độc tính trên tế bào của các thuốc có khả năng ức chế và tiêu diệt tế bào

ung thư [113].

● Nguyên tắc

Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định

độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh

điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ

phản ánh lượng protein tổng của tế bào.

Trong thử nghiệm này, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó

SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng.

Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng

tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất

nghiên cứu.

● Chuẩn bị tế bào MCF-7

Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 do ATCC (Hoa Kỳ) cung cấp, được nuôi cấy

trong môi trường E’MEM có bổ sung L-glutamine (2 mM), HEPES (20 mM),

amphotericin B (0,025 μg/ml), penicillin G (100 UI/ml), streptomycin (100 μg/ml),

10% (v/v) huyết thanh bào thai bò FBS và ủ ở 37oC, 5% CO2.

● Quy trình khảo sát hoạt tính gây độc bằng phương pháp nhuộm SRB

Tế bào đơn được cấy trên những đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ là 104 tế

bào/giếng. Sau 24 giờ nuôi cấy, quần thể tế bào được ủ với chất khảo sát ở các nồng

độ trong 48 giờ. Sau đó, protein tổng từ tế bào thử nghiệm được cố định bằng dung

dịch trichloroacetic acid (Sigma) 50% lạnh và nhuộm với dung dịch sulforhodamine

38

B 0,2% (Sigma). Kết quả được đọc bằng máy ELISA reader ở hai số sóng 492 nm và

620 nm. Các thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá

trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

2.3.6. Thí nghiệm trên động vật

2.3.6.1. Phương pháp ghép tế bào MCF-7 tạo mô hình chuột mang khối u

Mô hình chuột mang khối u ghép dị loài bao gồm các tế bào khối u có nguồn

gốc từ người được cấy vào chuột nhắt trắng Mus musculus var. Albino. Mô hình thí

nghiệm chuột mang khối u được thực hiện theo quy trình tại phòng Công nghệ Động

vật - Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ

Chí Minh. Chuột sau khi đã được làm suy giảm miễn dịch để có thể tiếp nhận những

tế bào khối u từ người nên những khối u có đặc điểm tương tự khối u ở người. Trong

nghiên cứu này, dòng tế bào MCF-7 được tiêm trực tiếp vào bên dưới da, tại vị trí

lưng chuột [114].

Hình 2.1. Tiêm tế bào MCF-7 trên lưng chuột đã suy giảm miễn dịch

● Quy trình ghép tế bào tạo khối u:

MCF-7 được nuôi trong môi trường Gibco™ Dulbecco's Modified Eagle

Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) bổ sung 5% Fetal Bovine Serum

(FBS), 1% kháng sinh. Các tế bào được nuôi trong các Roux 25 cm2 ở 37°C, 5% CO2.

Thay môi trường 2 - 3 ngày mỗi lần và cấy chuyền khi tế bào phủ 70 - 80% bề

mặt nuôi cấy.

Đổ bỏ môi trường cũ, rửa lại bình nuôi tế bào MCF-7 bằng dung dịch

phosphate-buffered saline (PBS). Bổ sung 1ml Trypsin/EDTA 0,25%. Tráng đều, ủ

37oC, 5% CO2 trong 1 phút.

Tách các tế bào MCF-7 lên khỏi bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch

trypsin/EDTA 0,25%.

Ly tâm, thu lại cặn tế bào, loại bỏ trypsin.

Rửa lại cặn bằng dung dịch PBS.

39

Huyền phù cặn tế bào vào dung dịch PBS. Xác định số lượng tế bào đạt 107 tế

bào/100 μl và pha loãng đến nồng độ ghép.

Gây mê chuột, tiêm thuốc mê vào ổ bụng với mỗi liều chích là 80μl/36g chuột,

tỉ lệ thuốc trong mỗi liều (Xylazil : Ketamil : NaCl = 2 : 3 : 3). Trước mỗi đợt tiêm,

chuột được cân khối lượng và sau đó thuốc được lấy đúng liều tương ứng với khối

lượng chuột.

Cố định chuột, làm sạch lông, sát trùng vùng da ghép bằng ethanol 70o.

Dùng ống tiêm 1 ml, hút dịch huyền phù tế bào. Xuyên kim vào bên dưới da

chuột ở một bên lưng khoảng 3 - 5 mm và tiêm 100 ul dịch tế bào.

Mô hình dị ghép có lợi thế là ít tốn kém, dễ thực hiện, khối u nhanh chóng

xuất hiện. Vì thế, mô hình này có thể đáp ứng được phần lớn các mục tiêu thử nghiệm

thuốc cận lâm sàng điều trị cho các cơ quan có tỉ lệ mắc bệnh ung thư cao ở người.

2.3.6.2. Phương pháp tính thể tích khối u

Phương pháp đo kích thước và tính thể tích khối u được thực hiện bằng thước

kẹp Mitutoyo (Nhật Bản) với độ chia nhỏ nhất 0,02 mm. Dùng thước kẹp đo khối u

nổi lên tại vị trí lưng chuột, sau đó tính thể tích khối u theo công thức [115].

23 a b

V(mm )2

Trong đó: a là đường kính lớn nhất của khối u

b là đường kính nhỏ nhất của khối u

Khi kết thúc thời gian thí nghiệm, các khối u được thu nhận và bảo quản trong

dung dịch formalin 10% qua đêm. Sau đó, các mẫu khối u được gửi đến Khoa Giải

phẫu bệnh thuộc Bệnh viện Nhi đồng 1, Thành phố Hồ Chí Minh để nhuộm

Hemaoxylin – Eosin (H&E) và hóa mô miễn dịch.

2.3.6.3. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch bằng kháng thể SOD2

Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch bằng kháng thể SOD2 (Superoxide

dismutase 2) nhằm xác định khối u ung thư vú vừa gây tạo trên mô hình chuột suy

giảm miễn dịch có nguồn gốc là tế bào MCF-7 từ người, không chứa các loại tế bào

khác có nguồn gốc từ chuột với mục tiêu tạo mô hình khối u ung thư có thành phần

tế bào tương tự như khối u phát triển trên cơ thể người.

40

SOD2 là enzyme kháng oxy hóa, nằm trong ty thể, được biểu hiện rất cao trong

ung thư biểu mô cổ tử cung, ung thư vú, ung thư dạ dày, ruột kết. Nhiều nghiên cứu

cho thấy SOD2 đóng vai trò như một gene gây ung thư, SOD2 được xem như một

biomarker, là dấu hiệu để dự đoán tiến trình di căn của khối u vú, bởi vì sự biểu hiện

gen của SOD2 có sự khác biệt giữa tế bào ung thư vú và tế bào ở tuyến vú bình

thường.

Để nhận biết đặc hiệu cho tế bào ung thư vú ở người, kháng thể SOD2 được

sử dụng để quan sát sự bắt màu của nhân và chất nền tế bào, hình thái mô học của

khối u. Trong nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể SOD2, tế bào chất sẽ có màu

nâu và nhân có màu tím nhạt.

2.3.6.4. Phương pháp nhuộm Hemaoxylin - Eosin (H&E)

Phương pháp này dựa trên cơ sở là khả năng bắt màu khác nhau của nhân tế

bào và tế bào chất khi nhuộm bằng cặp thuốc nhuộm hematoxylin và eosin.

Hematoxylin có màu xanh đậm và bắt màu với acid nucleic bằng một phản ứng phức

tạp, chưa hoàn chỉnh, còn Eosin có màu hồng và có khả năng kết hợp với các protein

không đặc hiệu. Phương pháp nhuộm H&E cho ta một cái nhìn tổng quát về cấu trúc

mô học, đồng thời giúp phân biệt được các cấu trúc mô bình thường, viêm hoặc có

sự bất thường hay vùng mô chứa nhiều tế bào ung thư để chẩn đoán bệnh.

2.4. Thực nghiệm

2.4.1. Tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-P123

2.4.1.1. Tổng hợp Hep-P123

Quy trình tổng hợp các copolymer Hep-P123 với 4 tỉ lệ ghép (Hep:P123=1:3;

1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol) được thực hiện qua 4 bước:

● Bước 1: Tổng hợp NPC-P123-NPC

NPC-P123-NPC được tổng hợp thông qua sự hoạt hóa 2 nhóm hydroxyl -OH

ở 2 đầu trên phân tử pluronic P123 bằng chất hoạt hóa NPC để hình thành liên liên

kết ester giữa nhóm -OH trên phân tử pluronic P123 và nhóm acyl (–C=O-Cl) trên

phân tử NPC (hình 2.2).

Cân pluronic P123 (2,60 mmol) cho vào bình cầu ba cổ, khuấy 30 phút trong

môi trường chân không ở nhiệt độ 65oC nhằm giúp pluronic nóng chảy và loại bỏ

hoàn toàn hơi ẩm. Sau đó pluronic nóng chảy được cho phản ứng với NPC (5,72

41

mmol) trong 6 giờ, môi trường khí N2. Sau đó dừng phản ứng, hòa tan sản phẩm phản

ứng với 20 ml chloroform. Dung dịch thu được đem tủa 2 lần trong dung môi

hexane:diethylether (1:1) ở 0oC và cô quay đến khối lượng không đổi để thu được sản

phẩm NPC-P123-NPC có màu trắng. Cấu trúc sản phẩm NPC-P123-NPC được xác

định bằng phương pháp đo phổ 1H-NMR và FT-IR.

Hình 2.2. Hoạt hóa pluronic bằng NPC [50]

● Bước 2: Tổng hợp NPC-P123-Ami

Phương pháp tổng hợp NPC-P123-Ami dựa trên nguyên tắc tạo liên kết

urethane giữa NPC-P123-NPC và aminopropanol (Ami) (hình 2.3).

Hình 2.3. Khóa một đầu sản phẩm hoạt hóa pluronic với Ami [50]

NPC-P123-NPC (0,0021 mol) được hòa tan hoàn toàn trong 50 ml chloroform.

Sau đó 0,16 ml dung dịch Ami trong chloroform (50 ml) được nhỏ vào hỗn hợp phản

ứng và khuấy từ trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng. Dừng phản ứng, dung dịch thu được

(20 ml) đem tủa 2 lần trong hệ dung môi hexane:diethylether (1:1) ở 0oC và cô quay

đến khối lượng không đổi để thu được sản phẩm NPC-P123-Ami màu trắng. Cấu trúc

NPC-P123-Ami được xác định bằng phương pháp đo phổ 1H-NMR và FT-IR.

Bước 3: Tổng hợp Hep-DAB (Hep:DAB = 1:3; 1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol)

42

4 dẫn xuất heparin amin hóa (Hep-DAB) với 4 tỉ lệ khác nhau (Hep:DAB =

1:3; 1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol) được tổng hợp trên cơ sở tạo liên kết amide (-

NHCO-) giữa heparin và DAB, thông qua tác nhân ghép cặp EDC/NHS (hình 2.4).

Hình 2.4. Biến tính heparin với DAB [50]

Heparin (0,08 mmol) cho vào bình cầu một cổ, khuấy tan trong 50 ml nước DI

ở nhiệt độ phòng. Tác chất ghép cặp EDC/NHS được thêm vào và khuấy 15 phút.

Dung dịch DAB được nhỏ giọt từ từ vào hỗn hợp phản ứng và khuấy từ 24 giờ ở nhiệt

độ phòng. Sản phẩm sau phản ứng được đem đi thẩm tách với nước cất qua màng

Cellulose MWCO 3500 Da trong 4 ngày và cuối cùng đông khô để thu được 4 dẫn

xuất Hep-DAB. Số liệu các tác chất được thể hiện trong bảng 2.2. Cấu trúc các sản

phẩm được xác định bằng phương pháp đo phổ 1H-NMR và FT-IR.

Bảng 2.2. Số liệu tổng hợp Hep-DAB theo 4 tỉ lệ mol khác nhau

Tỉ lệ ghép Hep-DAB

(mmol/mmol)

Heparin

(mmol)

NHS

(mmol)

EDC

(mmol)

DAB

(µl)

1:3 0,08 4,34 0,25 37,54

1:7 0,08 4,34 0,58 87,6

1:10 0,08 4,34 0,83 125,14

1:14 0,08 4,34 1,16 175,19

● Bước 4: Tổng hợp copolymer Hep-P123

4 copolymer Hep-P123 (Hep:P123=1:3; 1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol) được

tổng hợp dựa trên sự hình thành liên kết amide (-NHCO-) giữa NPC-P123-Ami và 4

43

dẫn xuất Hep-DAB (Hep:DAB=1:3; 1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol) tương ứng (hình

2.5).

Hình 2.5. Tổng hợp copolymer ghép Heparin-Pluronic [50]

Cho Hep-DAB (Hep:DAB = 1:3; 1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol) vào bình cầu

một cổ, thêm 50 ml nước DI, khuấy tan ở nhiệt độ phòng. Sau đó dung dịch nước

lạnh của NPC-P123-Ami tương ứng được nhỏ từ từ vào bình cầu chứa dung dịch

Hep-DAB và khuấy từ trong 24 giờ ở nhiệt độ dưới 20oC. Số liệu các tác chất phản

ứng được thể hiện trong bảng 2.3. Sản phẩm sau phản ứng được đem đi thẩm tách

trong nước cất lạnh qua màng Cellulose MWCO 12000 - 14000 Da, trong 7 ngày và

cuối cùng đông khô để thu được 4 copolymer ghép Hep-P123 dạng keo màu trắng.

Bảng 2.3. Số liệu tổng hợp Hep-P123 theo 4 tỉ lệ mol khác nhau

Tỉ lệ ghép Hep-P123

(mmol/mmol)

Hep-DAB

(mmol)

NPC-P123-Ami

(mmol)

1:3 0,0244 0,0732

1:7 0,0237 0,1708

1:10 0,0233 0,2440

1:14 0,0227 0,3416

2.4.1.2. Tổng hợp nanogel Hep-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

a. Tổng hợp Hep-P123 mang thuốc cisplatin hydrate (Hep-P123-CisOH)

44

Hình 2.6. Sơ đồ quy trình đưa CisOH vào Hep-P123

Nanogel Hep-P123 mang thuốc cisplatin dạng hydrate được tổng hợp bằng

phản ứng tạo phức giữa cispaltin hydrate và các nhóm carboxylate/sulfate có trên

sườn heparin, quy trình tổng hợp được thực hiện qua 2 bước (hình 2.6).

Bước 1: hydrate cisplatin bằng AgNO3

Giai đoạn chuẩn bị 4 mẫu cisplatin hydrate (CisOH) bằng AgNO3 theo 4 tỉ lệ

tương ứng với 4 mẫu Hep-P123 (Hep:P123 = 1:3; 1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol) được

thực hiện theo báo cáo của Kirkpatrick [116].

Cho cisplatin vào bình cầu ba cổ (bọc giấy bạc ngoài bình cầu nhằm tránh ánh

sáng), khuấy trong 10 ml DI. Tiếp tục cho AgNO3 vào dung dịch phản ứng, khuấy

trong 48 giờ, điều kiện môi trường khí N2 (Cis:AgNO3 = 1:2 mmol/mmol). Số liệu

các tác chất phản ứng được thể hiện trong bảng 2.4. Kết tủa AgCl được loại bỏ bằng

cách ly tâm 2 lần ở 3500 vòng/phút, 10 phút. Sản phẩm thu được dưới dạng dung dịch

trong suốt, dung dịch này được sử dụng để tạo phức với 4 mẫu Hep-P123.

45

Bảng 2.4. Số liệu Cis, AgNO3 dùng để tổng hợp Hep-P123 mang thuốc

Cis (mmol) AgNO3 (mmol)

0,44 0,89

0,23 0,46

0,17 0,33

0,12 0,23

Bước 2: tạo phức giữa Hep-P123 và cisplatin hydrate

4 mẫu dung dịch cisplatin hydrate thu được ở trên được nhỏ giọt vào 4 mẫu

dung dịch Hep-P123 (100 mg Hep-P123 đã được hòa tan trong 10 ml DI) theo các tỉ

lệ tương ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy 24 giờ (điều kiện phản ứng tối, sục khí

N2, nhiệt độ dưới 20oC). Sản phẩm được tiến hành thẩm tách 2 lần với màng Cellulose

MWCO 3500 Da, ở 37oC trong 20 phút. Cuối cùng tiến hành đông khô, các sản phẩm

thu được Hep-P123-CisOH tương ứng với 4 tỉ lệ 1:3; 1:7; 1:10; 1:14 có dạng keo hơi

vàng.

b. Tổng hợp hệ Hep-P123 mang thuốc cisplatin (Hep-P123-Cis)

Hệ nanogel mang thuốc cisplatin được thực hiện dựa trên tương tác kỵ nước

giữa các phân đoạn kỵ nước trên pluronic P123, khi nhiệt độ tăng các phân đoạn kỵ

nước xuất hiện tương tác kỵ nước tạo khối polymer và sẽ mang thuốc để hình thành

các hạt nanogel mang thuốc.

Quy trình tổng hợp nanogel Hep-P123 mang cisplatin được thực hiện tương

tự như trên bằng cách cho trực tiếp cisplatin vào 4 mẫu dung dịch Hep-P123

(Hep:P123 = 1:3; 1:7; 1:10; 1:14 mmol/mmol). Phản ứng được thực hiện trong 24 giờ

(điều kiện phản ứng tối, sục khí N2, nhiệt độ dưới 20oC). Sau đó được tiến hành ly

tâm và thẩm tách 2 lần với màng Cellulose MWCO 3500 Da, ở 37oC trong 20 phút.

Cuối cùng tiến hành đông khô, các sản phẩm thu được Hep-P123-Cis tương ứng với

4 tỉ lệ 1:3; 1:7; 1:10; 1:14 có dạng keo hơi vàng.

Cấu trúc các nanogel Hep-P123 mang cisplatin và cisplatin hydrate được xác

định bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR.

Lượng cisplatin và cisplatin hydrate được mang vào các chất mang Hep-P123

được xác định bằng phương pháp đo phổ plasma phát xạ nguyên tử ICP-OES.

46

2.4.1.3. Khảo sát khả năng nhả thuốc cisplatin hydrate của Hep-P123

Quy trình giải phóng cisplatin hydrate (CisOH) từ hệ chất mang Hep-P123

được thực hiện bằng cách cho 2 mẫu Hep-P123-CisOH (1:3) có khối lượng bằng nhau

(12 mg), được hòa tan hoàn toàn trong 3 ml nước cất. Mỗi mẫu cho vào 3 túi thẩm

tách MWCO 3500 Da (1 ml/túi). Tiến hành thẩm tách trong đệm PBS (10 ml) ở 37oC

ở 2 điều kiện pH 5,5 và 7,4. Sau mỗi khoảng thời gian nhất định là 0,25 giờ, 0,5 giờ,

1 giờ, 3 giờ, 7 giờ, 12 giờ và 24 giờ sẽ lấy mẫu một lần, mỗi lần lấy 1 ml sau đó thêm

vào tương ứng 1 ml dung dịch đệm PBS cho đủ 10 ml như ban đầu. Hàm lượng

platinum (mg/l) có trong các mẫu theo thời gian được xác định bằng phương pháp đo

ICP-OES.

2.4.1.4. Đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào thường

Độc tính tế bào của Hep-P123 (1:3) mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

được thực hiện trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 bằng phương pháp nhuộm SRB.

Đồng thời Hep-P123 (1:3) cũng được thử nghiệm độc tính trên nguyên bào sợi

để đánh giá tính tương hợp sinh học.

2.4.2. Tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

2.4.2.1. Tổng hợp Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

Quy trình tổng hợp Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 được thực hiện qua các

bước tương tự như quy trình tổng hợp Hep-P123.

● Tổng hợp NPC-F127-NPC, NPC-F87-NPC, NPC-F68-NPC

Cân pluronic F127, F87, F68 cho vào bình cầu ba cổ, khuấy 30 phút trong môi

trường chân không ở nhiệt độ 65oC nhằm giúp pluronic nóng chảy và loại bỏ hoàn

toàn hơi ẩm. Sau đó pluronic nóng chảy được cho phản ứng với NPC trong 6 giờ, môi

trường khí N2. Số liệu các tác chất phản ứng được thể hiện trong bảng 2.5. Sau đó tắt

chân không và hòa tan sản phẩm phản ứng với 20 ml chloroform. Dung dịch thu được

đem tủa 2 lần trong dung môi diethylether ở 0oC và cô quay đến khối lượng không

đổi để thu được các sản phẩm NPC-F127-NPC, NPC-F87-NPC, NPC-F68-NPC có

màu trắng. Sử dụng phương pháp đo phổ 1H-NMR và FT-IR để xác định cấu trúc các

sản phẩm.

47

Bảng 2.5. Số liệu tổng hợp NPC-F127-NPC, NPC-F87-NPC, NPC-F68-NPC

Pluronic NPC (mmol)

Tên mmol

F127 1,19 2,62

F68 1,79 3,94

F87 1,95 4,29

● Tổng hợp NPC-F127-Ami, NPC-F87-Ami, NPC-F68-Ami

Quy trình tổng hợp NPC-F127-Ami, NPC-F87-Ami, NPC-F68-Ami được

thực hiện tương tự như NPC-P123-Ami bằng cách cho các sản phẩm NPC-F127-

NPC, NPC-F87-NPC, NPC-F68-NPC hòa tan hoàn toàn trong chloroform. Sau đó,

dung dịch Ami được nhỏ từ từ vào hỗn hợp phản ứng và khuấy từ trong 12 giờ ở nhiệt

độ phòng. Dung dịch thu được đem tủa 2 lần trong dung môi diethylether ở 0oC và

cô quay đến khối lượng không đổi để thu được các sản phẩm NPC-F127-Ami, NPC-

F87-Ami, NPC-F68-Ami màu trắng. Sử dụng phương pháp đo phổ 1H-NMR và FT-

IR để xác định cấu trúc các sản phẩm.

● Tổng hợp copolymer Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

Từ kết quả hiệu quả mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate của 4

copolymer Hep-P123, chúng tôi tiến hành chọn 2 tỉ lệ ghép Hep:Pluronic=1:3 và

1:14 mmol/mmol để tổng hợp các copolymer Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 và

so sánh hiệu quả mang thuốc với hệ chất mang Hep-P123 với tỉ lệ ghép tương ứng.

Quy trình tổng hợp Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 được thực hiện tương

tự Hep-P123.

2.4.2.2. Tổng hợp nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 mang thuốc cisplatin

và cisplatin hydrate

Quy trình tổng hợp nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 mang thuốc

cisplatin và cisplatin hydrate được thực hiện tương tự quy trình Hep-P123 mang

thuốc.

Lượng thuốc mang vào các chất mang Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 được

xác định bằng phương pháp đo ICP-OES.

2.4.3. Tổng hợp và khảo sát nanogel Fud-P123

2.4.3.1. Tổng hợp Fud-P123

48

Từ kết quả hiệu quả mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate của các

copolymer Hep-P123, chúng tôi tiến hành tổng hợp copolymer Fud-P123 với tỉ lệ

ghép Fud:P123=1:3 mmol/mmol để so sánh hiệu quả mang thuốc tương ứng. Quy

trình tổng hợp Fud-P123 được thực hiện qua các bước tương tự quy trình tổng hợp

Hep-P123.

● Tổng hợp Fud-DAB

Fud-DAB được tổng hợp từ fucoidan và DAB (Fud:DAB=1:3 mmol/mmol)

sử dụng tác chất ghép cặp EDC/NHS theo hình 2.7.

Cân fucoidan (0,025 mmol) vào bình cầu một cổ, khuấy tan trong 50 ml nước

DI ở nhiệt độ 40oC. Sau đó tác chất ghép cặp EDC/NHS (0,075 mmol/2,170 mmol)

được thêm vào và khuấy 15 phút, nhiệt độ phòng. Dung dịch DAB (11,310 µl) được

nhỏ giọt từ từ vào hỗn hợp phản ứng và khuấy từ 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm

sau phản ứng được đem đi thẩm tách với nước cất qua màng Cellulose MWCO 3500

Da, trong 4 ngày và cuối cùng đông khô để thu được dẫn xuất Fud-DAB. Sản phẩm

được đem đo phổ 1H-NMR và FT-IR để xác định cấu trúc.

Hình 2.7. Tổng hợp Fud-DAB

49

● Tổng hợp Fud-P123

Copolymer Fud-P123 (Fud:P123=1:3 mmol/mmol) được tổng hợp dựa trên sự

liên hợp giữa NPC-P123-Ami và dẫn xuất Fud-DAB (hình 2.8).

Cho Fud-DAB (0,025 mmol) vào bình cầu một cổ, thêm 50 ml nước DI, khuấy

tan ở nhiệt độ phòng. Sau đó dung dịch nước lạnh của NPC-P123-Ami (0,074 mmol)

tương ứng được nhỏ từ từ vào bình cầu chứa dung dịch Fud-DAB và khuấy từ trong

24 giờ ở nhiệt độ dưới 25oC. Sản phẩm sau phản ứng được đem đi thẩm tách trong

nước cất lạnh qua màng Cellulose MWCO 12000-14000 Da, trong 7 ngày và cuối

cùng đông khô để thu được copolymer Fud-P123.

Fud-DAB

O

OH

CH3OH

O

CH3OH

O

-O3SO

O

CH3OH

O

-O3SO

O

CH3

O

-O3SO

O O

OH

OH

OC

OH

O

n

NH

O

O

CH3

O

O

20 70 20HN

O

HOO

OO2N

CO

NH

HN

O

CH3

OO

O20 70

O

NH

O

HO 20

Fud-P123

O

OH

CH3OH

O

CH3OH

O

-O3SO

O

CH3OH

O

-O3SO

O

CH3

O

-O3SO

O O

OH

OH

OH

O

n

HN

NPC-P123-Ami

Hình 2.8. Tổng hợp copolymer ghép Fud-P123

2.4.3.2. Tổng hợp nanogel Fud-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

Quy trình tổng hợp nanogel Fud-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

được thực hiện theo các bước tương tự quy trình tổng hợp Hep-P123 mang thuốc.

50

Lượng thuốc mang vào chất mang Fud-P123 được xác định bằng phương pháp

đo ICP-OES.

2.4.3.3. Khảo sát khả năng nhả thuốc cisplatin hydrate của Fud-P123

Quy trình khảo sát khả năng nhả thuốc cisplatin hydrate của nanogel Fud-P123

được thực hiện tương tự quy trình nhả thuốc của Hep-P123.

Hàm lượng platinum (mg/l) có trong các mẫu theo thời gian được xác định

bằng phương pháp đo ICP-OES.

2.4.3.4. Đánh giá độc tính tế bào (dòng tế bào MCF-7 và tế bào thường)

Độc tính tế bào của Fud-P123 (1:3) mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate

được thực hiện trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 bằng phương pháp nhuộm SRB.

Đồng thời Fud-P123 (1:3) cũng được thử nghiệm độc tính trên nguyên bào sợi

để đánh giá tính tương hợp sinh học.

2.4.4. Ứng dụng tổng hợp và đánh giá nanogel Hep-F127 mang thuốc cisplatin

hydrate kết hợp nanocurcumin (Hep-F127-CisOH-Cur) lên chuột mang khối u

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu hiệu quả mang thuốc của các hệ nanogel Hep-

P123, Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68 và Fud-P123 với các tỉ lệ ghép khác nhau, chúng

tôi tiến hành chọn hệ nanogel Hep-F127 với tỉ lệ ghép 1:3 (mmol/mmol) để ứng dụng

mang thuốc cisplatin hydrate kết hợp với nanocurcumin và đánh giá hiệu quả điều trị

lên chuột mang khối u dòng tế bào MCF-7 ghép dị loài từ người.

Curcumin là một polyphenol có nguồn gốc từ nghệ và có nhiều dược tính như

chống oxy hóa, chống viêm, khử trùng và không gây độc cho cơ thể. Trong những

nghiên cứu gần đây, curcumin còn cho thấy khả năng chống ung thư, do đó việc kết

hợp curcumin vào thuốc chống ung thư cisplatin nhằm mục đích giảm độc tính của

thuốc và tăng hiệu quả điều trị.

2.4.4.1. Tổng hợp Hep-F127-CisOH-Cur

Quy trình tổng hợp Hep-F127-CisOH-Cur được thực hiện qua 2 bước:

● Bước 1: Tổng hợp Hep-F127-Cur

Cho Hep-F127 (0,004 mmol) vào lọ thủy tinh. Sau đó thêm 10 ml nước cất

lạnh, khuấy đều cho Hep-F127 tan hoàn toàn. Cho 14 mg curcumin vào lọ thủy tinh,

nhỏ từ từ 14 ml dung môi ethanol:dichloromethane (DCM) với tỉ lệ 7:3 (v/v) vào và

lắc đều cho đến khi các hạt curcumin tan hoàn toàn. Tiến hành siêu âm để tạo ra Hep-

51

F127-Cur. Vừa siêu âm dung dịch Hep-F127 vừa nhỏ từ từ dung dịch curcumin vào

bằng kim tiêm trong vòng 2 phút, tất cả dung dịch phải để ở điều kiện lạnh dưới 25oC.

Tiến hành li tâm mẫu với tốc độ 3500 vòng/phút, trong 10 phút và cô quay để loại bỏ

hết dung môi trong dung dịch sản phẩm thu được. Sau đó, đem đi đông khô thu được

sản phẩm là Hep-F127-Cur. Để giữ cấu trúc nano ổn định sản phẩm Hep-F127-Cur

được phân tán lại trong nước DI, ở 25oC, sau đó nanocurcumin tiếp tục được thẩm

tách 3 lần trong nước cất sử dụng màng Cellulose 3500 Da, trong 3 lần, ở 37oC. Cuối

cùng sản phẩm được đông khô và lưu trữ. Cấu trúc sản phẩm được xác định bằng phổ

FT-IR.

● Bước 2: Tổng hợp Hep-F127-CisOH-Cur

Hình 2.9. Nanogel Hep-F127 mang cisplatin hydrate kết hợp curcumin [50]

Sản phẩm Hep-F127-Cur sau khi được tổng hợp sẽ được sử dụng để tạo phức

với cisplatin hydrate trên cơ sở hình thành phức giữa cispaltin hydrate và các nhóm

carboxylate/sulfate có trên sườn heparin (hình 2.9).

Cân 200 mg Hep-F127-Cur cho vào lọ thủy tinh và nhỏ từ từ dung dịch

cisplatin sau khi hydrate vào tiến hành khuấy bằng máy khuấy từ ở điều kiện dưới

Hep-F127

Hep-F127-CisOH-Cur

52

20oC, môi trường khí nitrogen trong 24 giờ. Tiến hành thẩm tách 3 lần trong nước cất

ở nhiệt độ phòng, sử dụng màng Cellulose MWCO 3500 Da, mỗi lần cách nhau 20

phút, sau đó tiến hành đông khô để thu được sản phẩm Hep-F127-CisOH-Cur.

2.4.4.2. Đánh giá cấu trúc, hình thái Hep-F127-CisOH-Cur

Cấu trúc sản phẩm Hep-F127-CisOH-Cur được xác định bằng phổ FT-IR.

Phần trăm thuốc cisplatin hydrate và nanocurcumin được mang vào nanogel

Hep-F127 được xác định bằng phương pháp đo ICP-OES và UV-Vis.

Hình thái, kích thước nanogel Hep-F127-CisOH-Cur được xác định bằng kính

hiển vi điện tử truyền qua TEM.

2.4.4.3. Đánh giá độc tính dòng tế bào MCF-7

Độc tính tế bào của Hep-F127, Hep-F127-CisOH và Hep-F127-CisOH-Cur

được thực hiện trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 bằng phương pháp nhuộm SRB.

2.4.4.4. Khảo sát khả năng nhả thuốc của Hep-F127-CisOH-Cur

Quy trình giải phóng cisplatin hydrate và nanocurcumin được thực hiện bằng

cách cho 2 mẫu Hep-F127-CisOH-Cur (12 mg) hòa tan hoàn toàn trong 3 ml nước

cất. Mỗi mẫu cho vào 3 màng thẩm tách Cellulose MWCO 3500 Da. Tiến hành thẩm

tách trong đệm PBS (12 ml) ở 37oC trong 2 điều kiện pH khác nhau (5,5 và 7,4). Sau

mỗi khoảng thời gian nhất định là 0,5 giờ, 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 96

giờ sẽ lấy mẫu một lần, mỗi lần lấy 1 ml, sau đó thêm vào tương ứng 1 ml dung dịch

đệm PBS cho đủ 12 ml như ban đầu. Hàm lượng cisplatin liên hợp và curcumin có

trong mẫu theo thời gian được xác định bằng phương pháp đo ICP-OES và UV-Vis.

2.4.4.5. Quy trình tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch và ghép khối u dị loài

Phương pháp và các bước tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch và mang khối

u ghép dị loài được thực hiện theo quy trình tại phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lí học

và Công nghệ sinh học động vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc

gia, Thành phố Hồ Chí Minh.

Chuột nhắt trắng (Mus musculus Var. Albino) được mua từ viện Pasteur Thành

phố Hồ Chí Minh với số lượng 30 con (đực), khoảng 35 - 37 g/con. Chuột được phân

thành 6 chuồng (5 con/chuồng) và được nuôi ổn định 2 - 3 ngày trước khi gây suy

giảm miễm dịch.

a. Quy trình gây suy giảm miễn dịch

53

Mô hình chuột bị ức chế miễn dịch phục vụ cho việc ghép tế bào ung thư

MCF-7 được tiến hành bằng busulfan kết hợp với cyclophosphamide liều cao kéo dài

trong nhiều ngày như sau:

Ngày N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9

Tiêm BU CY CY CY CY Tế bào CY*

BU: Tiêm Busulfan liều 20 mg/kg

CY: Tiêm Cyclophosphamide liều 50 mg/kg

CY*: Tiêm Cyclophosphamide liều 25 mg/kg

Thời gian xử lí thuốc trên chuột trước khi ghép tế bào ung thư là 7 ngày, từ

ngày N1 N7. Ngày N1 tiêm 1 liều busulfan 20 mg/kg. Bốn ngày tiếp theo, từ ngày

N2 N5, mỗi ngày tiêm 1 liều cyclophosphamide 50 mg/kg, tiêm tại vùng bụng.

Kiểm tra chuột ở ngày thứ 6 (đảm bảo chuột đã suy giảm miễn dịch), đánh giá

hiệu quả suy giảm miễn dịch bằng phương pháp bạch cầu tổng.

b. Ghép tế bào MCF-7 tạo khối u

Ngày ghép tế bào MCF-7 là ngày N8, tiêm tế bào MCF-7 tạo khối u trên lưng

chuột, các ngày từ N8 trở đi được xem là khoảng thời gian sau khi ghép. Từ ngày N9

trở đi, cách 3 ngày tiêm 1 liều cyclophosphamide 25 mg/kg nhằm duy trì tình trạng

ức chế miễn dịch cho chuột trong suốt thời gian thí nghiệm.

Để theo dõi sự phát triển của mô hình, khối u được tiến hành đo kích thước,

ghi nhận đường kính lớn nhất, đường kính nhỏ nhất 2 ngày một lần trong suốt thời

gian thí nghiệm.

2.4.4.6. Quy trình thử nghiệm thuốc

Sau quá trình gây suy giảm miễn dịch và tạo khối u, 14 ngày tiếp theo là quá

trình thử nghiệm thuốc như sau:

Ngày N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8

Tiêm Thuốc CY* Thuốc CY* Thuốc CY*

N9 N10 N11 N12 N13 N14

Thuốc CY* Thuốc CY*

Thuốc: Tiêm thuốc vào tĩnh mạch đuôi

CY*: Tiêm duy trì cyclophosphamide liều 25 mg/kg

54

Số lượng chuột 25 con đã gây tạo khối u thành công được lựa chọn ngẫu nhiên

chia làm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 con.

♦ Nghiệm thức 1: nước muối sinh lý NaCl 0,9% (100 µl/liều).

♦ Nghiệm thức 2: Hep-F127 (12 mg/kg thân trọng)

♦ Nghiệm thức 3: Cisplatin (3mg/kg thân trọng).

♦ Nghiệm thức 4: Hep-F127-CisOH (3 mg cisplatin/kg thân trọng).

♦ Nghiệm thức 5: Heparin-F127-CisOH-Cur (3 mg cisplatin/kg thân trọng).

Thuốc được tiêm qua tĩnh mạch đuôi 3 ngày/lần trong 14 ngày, và thuốc được

lấy chính xác theo khối lượng chuột sao cho trong mỗi liều tiêm luôn có lượng

cisplatin 3 mg/kg.

Thao tác tiêm: đâm kim từ vị trí xa gốc đuôi trước vào tĩnh mạch đuôi chuột

nằm ngay dưới da. Kim sau khi đâm vào tĩnh mạch phải luồn kim vào sâu trong mạch

ít nhất 2/3 cây kim để tránh dịch trào ngược ra ngoài (hình 2.10).

Hình 2.10. Mô hình thử thuốc trên chuột

Thực hiện tiêm cyclophosphamide 25 mg/kg vào các ngày kế tiếp sau tiêm

thuốc để duy trì tình trạng suy giảm miễn dịch.

Theo dõi đo khối lượng chuột và kích thước khối u hàng ngày. Ghi nhận các

thông số đường kính lớn nhất, đường kính nhỏ nhất khối u để tính thể tích khối u.

Kết thúc 14 ngày thử nghiệm thuốc, các khối u được thu nhận, bảo quản trong

dung dịch formalin 10% (hình 2.11).

55

Hình 2.11. Khối u được thu nhận sau khi kết thúc thí nghiệm

2.4.4.7. Quy trình đánh giá hiệu quả của thuốc

Quy trình đánh giá hiệu quả của thuốc dựa trên độ suy giảm thể tích của khối

u và kết quả nhuộm mô quan sát tế bào khối u.

Sau khi ghép tế bào MCF-7 lên chuột, tại vị trí ghép sẽ có sự thay đổi về hình

thái và cấu trúc mô. Sự xuất hiện chấm trắng nhỏ là dấu hiệu sự phát triển khối u đầu

tiên mà ta có thể quan sát được bằng mắt thường.

Các chỉ tiêu đánh giá gồm: kích thước khối u được đo bằng thước kẹp Mitutoyo

(Nhật Bản) với độ chia nhỏ nhất 0,02 mm và đánh giá hiệu quả điều trị của thuốc

bằng phương pháp nhuộm mô khối u, tại Khoa Giải phẫu bệnh thuộc Bệnh viện Nhi

đồng 1, Thành phố Hồ Chí Minh.

56

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-P123

Cấu trúc của các copolymer Hep-P123 được xác định bằng quang phổ hồng

ngoại biến đổi FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, TGA, TEM và CMC.

3.1.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc các copolymer Hep-P123

Trong tổng hợp các copolymer Hep-P123 các thành phần cấu trúc của sản

phẩm trung gian NPC-P123-NPC, NPC-P123-Ami, Hep-DAB cũng được xác định

qua kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR.

3.1.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-

P123-NPC và NPC-P123-Ami

Các sản phẩm NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami được tổng hợp từ P123,

NPC và Ami có dạng keo màu trắng. Đầu tiên hoạt hóa 2 nhóm -OH đầu và cuối

mạch của P123 bởi NPC tạo sản phẩm NPC-P123-NPC. Sau đó NPC-P123-NPC

được dùng làm tác chất cho phản ứng ghép với Ami. Trong phản ứng này liên kết

urethane được tạo thành từ phản ứng giữa nhóm amine trong phân tử Ami và nhóm -

-C=O của hợp chất NPC-P123-NPC tạo sản phẩm là NPC-P123-Ami.

a. Kết quả phân tích phổ FT-IR của NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami

Hình 3.1. Phổ FT-IR của P123, NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami

57

Tín hiệu peak ở 2972 cm-1 và 2887 cm-1 trên phổ FT-IR của pluronic P123

trong hình 3.1 là dao động hóa trị đặc trưng liên kết -CH của nhóm -CH2 và -CH3 trên

pluronic P123. Đồng thời, trên phổ đồ của NPC-P123-NPC, nhóm -NO2 liên kết trực

tiếp với nhân thơm trên phân tử NPC xuất hiện tại số sóng 1593 cm-1 và có sự dịch

chuyển dao động xuất hiện peak 1769 cm-1, đây là dao động hóa trị liên kết -C=O của

nhóm ester do sự hình thành liên kết ester giữa pluronic P123 với NPC tạo sản phẩm

NPC-P123-NPC.

Trong phổ đồ FT-IR của NPC-P123-Ami ở hình 3.1 xuất hiện tín hiệu mới tại

độ chuyển dịch 1642 cm-1, do sự thay thế một phần gốc p-nitrophenyl chloroformate

bằng 3-aminopropan-1-ol (Ami) thông qua nối ureathan (-NHCOO-), điều này chứng

tỏ đã tổng hợp thành công sản phẩm NPC-P123-Ami.

Dữ liệu phổ FT-IR của P123, NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami theo hình

3.1 được thống kê qua bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả phổ FT-IR của P123, NPC-P123-NPC, NPC-P123-Ami

Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1)

P123 NPC-P123-NPC NPC-P123-Ami

a -CH (-CH2 và -

CH3) 2972-2887 2972-2887 2972-2887

b C-O-C 1108 1108 1108

c -NO2 1593 1593

d -COO-NPC 1769 1769

e -NHCOO- 1642

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của các chất (bảng 3.1), cho thấy tín hiệu dao

động đặc trưng ở vị trí a, b luôn xuất hiện trong phân tử P123, NPC-P123-NPC và

NPC-P123-Ami. Tín hiệu dao động ở vị trí e chỉ xuất hiện ở sản phẩm NPC-P123-

Ami do sự hình thành liên kết urethane từ sự thay thế một đầu NPC của phân tử NPC-

P123-NPC thành Ami.

b. Kết quả phân tích 1H-NMR của NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami

Kết quả phân tích cấu trúc của NPC-P123-NPC được thể hiện qua phổ cộng

hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm). Phổ đồ ở hình 3.2 có tín hiệu

các proton của P123 trong NPC-P123-NPC như: ở độ dịch chuyển hóa học δH = 1,20-

58

1,26 ppm là dao động đặc trưng proton của nhóm methyl -CH3 (a) trên PPO của P123;

δH = 3,60-3,69 ppm là dao động proton methylene -OCH2-CH2O- (b) của PEO. Đặc

biệt, sự xuất hiện của tín hiệu ở δH = 4,43-4,45 ppm được coi là tín hiệu pronton

methylene -CH2-O-NPC (e) liên kết trực tiếp với nhóm carbonate trên NPC.

Đồng thời, còn có sự xuất hiện của hai tín hiệu đôi ở δH = 7,38-7,40 ppm và

δH = 8,27-8,28 ppm là hai tín hiệu đặc trưng của proton vòng thơm nhóm (-CH=CH)

của NPC. Độ hoạt hóa P123 đạt trên 90% được tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm

(NPC) và proton methyl (pluronic P123) theo công thức của Thi Bich Tram Nguyen

và Ngoc Quyen Tran [117]. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước [84]. Từ phổ

1H-NMR ở hình 3.2 cho thấy đã tổng hợp thành công NPC-P123-NPC.

Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC

NPC-P123-NPC được dùng làm tác chất cho phản ứng ghép với Ami tạo sản

phẩm là NPC-P123-Ami.

Trên phổ đồ 1H-NMR của NPC-P123-Ami (500 MHz, CDCl3, ppm) ờ hình

3.3 ngoài các tín hiệu proton đặc trưng có trên pluronic P123 như: δH = 1,12-1,14

ppm là dao động đặc trưng proton của nhóm methyl -CH3 (a) trên PPO của P123; δH

= 3,61-3,63 ppm là dao động proton methylene -OCH2-CH2O- (b) của PEO. Sự xuất

59

hiện của hai tín hiệu đôi ở δH = 7,38-7,40 ppm và δH = 8,27-8,28 ppm là hai tín hiệu

đặc trưng của proton thơm trên NPC (-CH=CH-). Đặc biệt, proton methylene liên kết

trực tiếp với nhóm carbonate của NPC xuất hiện tại tín hiệu δH = 4,43 ppm (-CH2-O-

NPC) (e) dịch chuyển một phần đáng kể về vùng δH = 4,22 ppm (f), đây là tín hiệu

proton methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của Ami (-CH2-O-Ami), do

phản ứng thay thế một phần gốc NPC bằng Ami [58, 96]. Khoảng 50% gốc NPC đã

được thay thế bởi Ami, kết quả này thu được từ phép tính tỷ lệ tích phân của proton

trên NPC và proton của Ami theo công thức của Thi Bich Tram Nguyen và Ngoc

Quyen Tran [117].

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của NPC-P123-Ami

Dữ liệu phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami theo hình 3.2

và hình 3.3 được thống kê qua bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami

Vị trí

H H của nhóm

Độ dịch chuyển hóa học (δ, ppm)

NPC-P123-NPC NPC-P123-Ami

a -CH3 (PPO) 1,20-1,26 1,12-1,14

60

b -OCH2-CH2O- (PEO) 3,60-3,69 3,61-3,63

c, d -CH=CH- 7,38-7,40 và 8,27-8,28 7,38-7,40

và 8,27-8,28

e -CH2-O-NPC 4,43-4,45 4,43

f -CH2-O-Ami 4,22

Qua bảng thống kê 3.2, một lần nữa cho thấy sản phẩm tổng hợp NPC-P123-

Ami ngoài sự lặp lại các tín hiệu proton từ NPC-P123-NPC ở vị trí a, b, c, d, e còn

có sự xuất hiện thêm tín hiệu mới tại vị trí f do sự thay thế một đầu NPC từ NPC-

P123-NPC thành Ami.

3.1.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian Hep-

DAB

Các sản phẩm Hep-DAB được tổng hợp từ heparin và 1,4-diaminbutane

(DAB), sử dụng tác chất ghép cặp EDC/NHS, có dạng bột màu trắng.

Trong đó, EDC được sử dụng để hoạt hóa nhóm cacboxylate/sulfate trên sườn

heparin. Sản phẩm O-acylisourea được sinh ra kém ổn định, dễ bị thủy phân trong

môi trường nước và bị chuyển vị thành thành N-acylurea, chất này không phản ứng

với các amine bậc 1. NHS được thêm vào nhằm tạo ra sản phẩm succinimidyl ester

ổn định hơn, ngăn cản quá trình chuyển vị của O-acylisourea thành N-acylurea, giúp

tăng hiệu suất phản ứng. Sơ đồ phản ứng được thực hiện theo phụ lục 1.

a. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-DAB

Hình 3.4. Phổ FT-IR của heparin và Hep-DAB

61

Ở hình 3.4 trên phổ đồ của heparin có các peak dao động đặc trưng như: tín

hiệu peak ở số sóng 3453 cm-1 là dao động hóa trị -OH trên heparin; 1632 cm-1 là dao

động hóa trị C=O của nhóm carboxylate; 1238 cm-1 là dao động hóa trị đối xứng

O=S=O của nhóm sulfate; 817 cm-1 là dao động của sulfonate-glucosamine C-O-S.

Khi DAB gắn lên heparin trên phổ đồ FT-IR của Hep-DAB ở hình 3.4 ta thấy

xuất hiện 2 tín hiệu mới, peak 3093 cm-1 là dao động hóa trị của liên kết –NH2 trên

phân tử DAB không liên kết với heparin. Đồng thời tín hiệu tại số sóng 1469 cm-1;

1448 cm-1 là dao động N-H của nhóm amide (-NHCO-) do DAB liên kết với nhóm

carboxylate trên heparin, điều này chứng tỏ đã tổng hợp thành công sản phẩm Hep-

DAB.

b. Kết quả phân tích 1H-NMR của Hep-DAB

Hình 3.5. Phổ 1H-NMR của Hep-DAB

Kết quả phân tích cấu trúc Hep-DAB được thể hiện qua phổ 1H-NMR (500

MHz, D2O, ppm) ở hình 3.5. Phổ đồ có xuất hiện các tín hiệu proton trên phân tử

heparin tại δH = 1,99 ppm (m) và δH = 3,22-5,32 ppm (n). Tín hiệu ở δH = 1,70-1,74

ppm (i) là dao động proton methylene -CH2-CH2- trên dây DAB. Sự kết hợp giữa

heparin và DAB dẫn đến xuất hiện tín hiệu proton methlylene -CH2-NH- tại δH =

3,11-3,22 ppm (j), đây được xem là tín hiệu tại vị trí mà nhóm amine trên DAB liên

62

kết với nhóm carboxylate trên heparin để hình thành liên kết amide. Từ kết quả phổ

1H-NMR cho thấy đã tổng hợp thành công Hep-DAB.

3.1.1.3. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm Hep-P123

Copolymer Hep-P123 được tổng hợp bằng phản ứng ghép giữa Hep-DAB và

NPC-P123-Ami. Trong giai đoạn phản ứng này, nhóm -NH2 trên phân tử Hep-DAB

sẽ tấn công vào liên kết -C=O của hợp chất NPC-P123-Ami tạo sản phẩm Hep-P123.

a. Kết quả phân tích FT-IR của Hep-P123

Hình 3.6. Phổ FT-IR của Hep-DAB, NPC-P123-Ami và Hep-P123

Từ kết quả phổ FT-IR của Hep-P123 ở hình 3.6 ta thấy xuất hiện đồng thời

các dao động đặc trưng của cả heparin và P123 như: tín hiệu peak 2972-2887 cm-1 là

dao động hóa trị -C-H của nhóm -CH2 và -CH3 trên pluronic P123; peak 1107 cm-1 là

dao động hóa trị đối xứng C-O-C trên pluronic P123; peak 3453 cm-1 là dao động hóa

trị -OH trên phân tử heparin; peak 1238 cm-1 là dao động hóa trị đối xứng O=S=O

của nhóm sulfate trên heparin [31, 50, 84, 85]. Đặc biệt, ở đây ta thấy có sự dịch

chuyển peak dao động của nhóm -COO từ vùng số sóng 1769 cm-1 vể vùng số sóng

1634 cm-1 là do phản ứng hình thành liên kết giữa Hep-DAB và NPC-P123-Ami.

63

Dữ liệu phổ FT-IR của sản phẩm Hep-P123 được tổng hợp từ NPC-P123-Ami

và Hep-DAB theo hình 3.6 được thống kê qua bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả phổ FT-IR của NPC-P123-Ami, Hep-DAB và Hep-P123

Vị

trí Nhóm chức

Số sóng (cm-1)

NPC-P123-Ami Hep-DAB Hep-P123

a -OH (Hep) 3453 3453

b O=S=O (Hep) 1238 1238

c -C-H (-CH2 và -CH3) 2972-2887 2972-2887

d C-O-C (P123) 1107 1107

e -NO2 (NPC) 1593

f -COO-NPC 1769

g -NHCOO- 1634

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của các chất ở bảng 3.3, có sự lặp lại các tín

hiệu dao động đặc trưng trên phân tử heparin ở vị trí a, b và trên phân tử P123 ở vị trí

c, d luôn xuất hiện trong phân tử Hep-P123 sau khi tổng hợp. Sự dịch chuyển tín hiệu

dao động ở vị trí f về vị trí g cho thấy sự hình thành liên kết urethane từ phản ứng

giữa Hep-DAB và NPC-P123-Ami, và đi theo là sự biến mất của tín hiệu e.

b. Kết quả phân tích 1H-NMR của Hep-P123

Kết quả phân tích cấu trúc của Hep-P123 được thể hiện qua phổ 1H-NMR (500

MHz, D2O, ppm) ở hình 3.7. Phổ đồ xuất hiện các tín hiệu proton đặc trưng trên phân

tử P123 như: δH = 1,09 ppm là dao động đặc trưng proton của nhóm methyl -CH3 (a)

trên PPO của P123; δH = 3,67 ppm là dao động proton methylene –OCH2-CH2O- (b)

của PEO. Tín hiệu proton trên phân tử heparin tại δH = 1,99 ppm và δH = 3,22-5,32

ppm, tuy nhiên vẫn chưa quan sát rõ [31, 50, 84-85].

64

Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của Hep-P123

Đặc biệt, ở δH = 1,74 ppm (i) là dao động của proton methylene ở vị trí –CH2-

CH2- trên DAB và ở δH = 3,11 ppm là dao động của proton methylene ở vị trí -CH2-

NH- (j), cho thấy có sự liên hợp giữa Hep-DAB và NPC-P123-Ami. Ngoài ra, trên

phổ không còn xuất hiện các tín hiệu của proton thơm của NPC (-CH=CH-) ở δH =

7,38-7,40 ppm và δH = 8,27-8,28 ppm và tín hiệu proton methylene liên kết trực tiếp

với nhóm carbonate của NPC tại δH = 4,43 ppm (-CH2-O-NPC) cũng đã biến mất,

chỉ còn tín hiệu tại δH = 4,22 ppm (f) đây là tín hiệu proton methylene tại vị trí liên

hợp với Ami (-CH2-O-Ami). Kết quả này chứng tỏ rằng 100% NPC đã bị loại bỏ

trong quá trình hình thành Hep-P123 bằng phản ứng nối giữa Hep-DAB và NPC-

P123-Ami. Từ kết quả phổ FT-IR và phổ 1H-NMR cho thấy đã tổng hợp thành công

copolymer ghép Hep-P123.

Dữ liệu phổ 1H-NMR theo hình 3.7 được thống kê qua bảng 3.4.

65

Bảng 3.4. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-P123-Ami, Hep-DAB và Hep-P123

Vị trí

H H của nhóm

Độ dịch chuyển hóa học (δ, ppm)

NPC-P123-Ami Hep-DAB Hep-P123

a -CH3 (PPO) 1,12-1,14 1,09

b -OCH2-CH2O- (PEO) 3,61-3,63 3,67

c, d -CH=CH- (vòng thơm) 7,38-7,40 và

8,27-8,28

e -CH2-O-NPC 4,43

f -CH2-O-Ami 4,22 4,22

g -CH3CO (Hep) 1,99 1,99

i -CH2-CH2- (DAB) 1,70-1,74 1,74

j -CH2-NH- 3,11-3,22 3,22

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của sản phẩm Hep-P123 được tổng hợp từ NPC-

P123-Ami và Hep-DAB ở bảng 3.4, cho thấy có sự lặp lại các tín hiệu proton đặc

trưng trên phân tử P123 ở vị trí a, b và trên phân tử heparin ở vị trí g, i, j. Phản ứng

nối thành công giữa Hep-DAB và NPC-P123-Ami dẫn đến sự mất hoàn toàn tín hiệu

proton ở vị trí c, d, e, chỉ còn lại tín hiệu tại vị trí f.

3.1.1.4. Kết quả phân tích TGA của Hep-P123

Sự ổn định nhiệt của các copolymer ghép Hep-P123 cùng với heparin và

pluronic P123 được phân tích bằng phép đo TGA để nghiên cứu đặc tính nhiệt của

các sản phẩm. Mẫu được sử dụng trong 10 mg, ở nhiệt độ 25oC - 700oC với tốc độ

10oC/phút, dưới điều kiện khí nitrogen.

Hình 3.8. Kết quả TGA của P123, heparin và các copolymer ghép Hep-P123

66

Hình 3.8 cho thấy giản đồ TGA của heparin ổn định ở nhiệt độ trên 200oC và

có sự phân hủy nhẹ với khối lượng mất khoảng 5%. Heparin bắt đầu bị phân hủy

nhanh ở nhiệt độ 250oC đến 350oC. Ở nhiệt độ trên 400oC quá trình phân hủy diễn ra

chậm dần, và khối lượng dư còn lại là 57,18% tại nhiệt độ 420oC, sự giảm khối lượng

trên được cho là do sự mất nước và sự đốt cháy của heparin [118]. Trong khi đó,

pluronic P123 ổn định ở nhiệt độ lên đến 320oC, và bắt đầu bị phân hủy ở nhiệt độ

350oC, tổng khối lượng sẽ bị mất hoàn toàn ở nhiệt độ 420oC.

Giản đồ TGA của cả 4 copolymer ghép Hep-P123 ở 4 tỉ lệ ghép khác nhau đặc

trưng chứa cả sự phân hủy của pluronic P123 và heparin. Một lượng nhỏ khối lượng

các copolymer ghép Hep-P123 bị phân hủy ở nhiệt độ 200oC, kết quả của quá trình

khử nước của heparin. Hep-P123 bắt đầu bị phân hủy nhanh trong khoảng từ 250oC

đến 350oC và mất phần lớn khối lượng ở nhiệt độ từ 350oC đến 420oC. Tuy nhiên, từ

giản đồ cho thấy vẫn còn một lượng nhỏ còn lại chưa bị phân hủy ở nhiệt độ từ 420oC,

tại nhiệt độ mà pluronic P123 đã bị phân hủy hoàn toàn. Kết quả được cho là do có

sự hiện diện của heparin trong các copolymer ghép [118-119].

Từ kết quả giản đồ TGA cho thấy khối lượng dư còn lại của các copolymer

Hep-P123 với 4 tỉ lệ ghép 1:3; 1:7; 1:10 và 1:14 ở nhiệt độ 420oC tương ứng lần lượt

là 19,60%; 10,58%; 6,54% và 3,39%, trong đó copolymer Hep-P123 (1:3) thể hiện

sự suy giảm khối lượng nhanh chống và giữ lại khối lượng dư còn lại cao nhất. Sự

gia tăng phần trăm khối lượng dư còn lại này phù hợp với sự hiện diện tương ứng của

heparin và pluronic P123 có trong các copolymer Hep-P123 theo các tỉ lệ ghép [120].

Dựa trên tỉ lệ phần trăm khối lượng mất của heparin tinh khiết và phần trăm

khối lượng còn lại của nó trong Hep-P123 ở 420oC, ta có thể tính được phần trăm

khối lượng pluronic P123 được ghép vào heparin theo báo cáo của Hongliang Kang

[121] lần lượt là: 56,53% (Hep-P123 (1:3)); 68,84% (Hep-P123 (1:7)); 71,27% (Hep-

P123 (1:10)) và 74,10% (Hep-P123 (1:14)). Kết quả cho thấy phần trăm khối lượng

P123 tính toán được phù hợp với các tỉ lệ ghép tương ứng.

3.1.1.5. Kết quả phân tích giá trị CMC của Hep-P123

Các copolymer lưỡng tính có thể tự lắp ráp để hình thành micelle [122-124],

trong đó copolymer pluronic P123 được biết với cấu trúc khối PPO kỵ nước và khối

PEO ưa nước có thể dễ dàng hình thành micelle trong dung dịch nước [125-126].

67

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng iodine và phương pháp quang phổ

UV-Vis để xác định sự hình thành nanogel của các copolymer ghép trên cơ sở heparin

liên hợp pluronic P123 (Hep-P123) thông qua giá trị nồng độ tạo micelle tới hạn

(CMC) của các copolymer ghép Hep-P123 trong nước DI. CMC là một tham số đóng

vai trò quan trọng trong việc hình thành micelle của các copolymer lưỡng tính để

phân phối thuốc. Sự hình thành micelle nhờ vào tương tác kỵ nước có giá trị trong

việc cân bằng sự ổn định và giải phóng thuốc [127].

Hình 3.9. Kết quả đo CMC của các copolymer ghép Hep-P123

Trong thực nghiệm này, giá trị CMC được xác định bằng cách sử dụng iodine

đóng vai trò như đầu dò kỵ nước. Iodine được hòa tan trong dung dịch sẽ tham gia

vào môi trường kỵ nước của pluronic P123 gây ra sự dịch chuyển I3- thành I2 từ KI

dư có trong dung dịch. CMC được tính bằng cách vẽ cường độ hấp thụ của I2 so với

log của nồng độ polymer (% wt).

68

Ở hình 3.9 cho kết quả cường độ hấp thụ của iodine bắt đầu tăng đáng kể ở giá

trị nồng độ copolymer ghép Hep-P123 từ 0,028 - 0,041 (%wt), chỉ ra rằng các phân

tử iodine bắt đầu hòa tan trong vùng kỵ nước PPO của pluronic P123. Điều này cho

thấy, ở nồng độ này các copolymer ghép Hep-P123 đã tự lắp ráp để hình thành mạng

lưới polymer liên kết ngang dưới dạng một nanogel có thể hoạt động như chất mang

thuốc kỵ nước. Trên giá trị nồng độ này, cường độ hấp thụ của iodine sẽ tăng dần khi

tăng nồng độ polymer. Đồng thời cấu trúc tự lắp ráp của copolymer ghép Hep-P123

cũng sẽ khác hơn nhiều so với cấu trúc micelle của pluronic P123, sự hình thành

mạng lưới polymer liên kết ngang của nanogel Hep-P123 không chỉ nhờ vào tương

tác kỵ nước giữa các khối PPO, mà còn là sự tập hợp sắp xếp không đồng đều giữa

các khối kỵ nước PPO và khối ưa nước PEO được liên kết với chân heparin ưa nước

bằng liên kết hydro hoặc tương tác tĩnh điện. Cấu trúc độc đáo này có thể giúp cho

nanogel có độ ổn định cao và trở thành hệ mang thuốc lý tưởng [24, 118].

Mặt khác, giá trị CMC của các nanogel Hep-P123 còn liên quan đến tỉ lệ giữa

chiều dài chuỗi ưa nước và kỵ nước trong cấu trúc của copolymer ghép [122]. Giá trị

CMC của dung dịch P123 tinh khiết là 0,0028 (%wt) [125-126]. Trong khi đó giá trị

CMC của các copolymer ghép đo được từ 0,028 - 0,041 (%wt) lớn hơn so với giá trị

CMC của P123 tinh khiết, cho thấy sự có mặt của heparin sẽ làm tăng phần ưa nước

của copolymer ghép dẫn đến làm tăng giá trị CMC của dung dịch mẫu [119, 122,

128]. Sự khác biệt về giá trị CMC của các nanogel Hep-P123 và pluronic P123 cũng

có thể giúp tăng hiệu quả mang thuốc kỵ nước của các nanogel.

3.1.1.6. Kết quả phân tích TEM và DLS của Hep-P123

Hình thái và sự phân bố kích thước của các nanogel Hep-P123 có thể được

quan sát rõ bởi kết quả TEM và DLS. Dữ liệu kết quả TEM và DLS của các các

nanogel Hep-P123 ở hình 3.10 được thống kê qua bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kích thước của nanogel Hep-P123 bởi TEM và DLS

Các copolymer ghép TEM (nm) DLS (nm)

Hep-P123 (1:3) 45-81 nm 94,4

Hep-P123 (1:7) 61-102 nm 107,2

Hep-P123 (1:10) 75-115 nm 113,9

Hep-P123 (1:14) 80-153 nm 182,4

69

Kết quả TEM cho thấy kích thước của micelle pluronic P123 từ 5-10 nm, và

có dạng hình cầu (hình 3.10), trong khi đó kích thước trung bình của các nanogel

Hep-P123 từ 45-153 nm theo TEM (bảng 3.5 và hình 3.11) lớn hơn so với kích thước

của micelle pluronic P123. Kết quả này chỉ ra rằng khi các chân P123 được ghép vào

heparin, ở nồng độ CMC các copolymer tự lắp ráp để hình thành nanogel với cấu trúc

mạng lưới bên trong có sự tập hợp sắp xếp không đồng đều của nhiều chuỗi polymer,

dẫn đến vùng cấu trúc không gian bên trong lớn hơn và có kích thước lớn hơn.

Hình 3.11 và bảng 3.5 còn cho thấy các hạt nanogel Hep-P123 có dạng hình

cầu (TEM), với sự phân bố kích thước hạt trung bình trong khoảng từ 94,4 nm đến

182,4 nm bằng DLS, ở 25oC và phụ thuộc vào lượng pluronic P123 được liên hợp.

Khi lượng pluronic P123 ghép vào heparin tăng làm kích thước hạt của nanogel Hep-

P123 cũng tăng theo, một phần là do pluronic P123 có sự tích điện âm nhẹ, trong cấu

trúc của nanogel Hep-P123 chứa heparin âm điện cao (-75 mV) do chứa số lượng các

nhóm sulfate và carboxylate [48], vì vậy có thể tạo ra lực tương tác đẩy giữa các

nhóm tích điện âm có trên sườn heparin và P123, dẫn đến vùng cấu trúc không gian

bên trong mạng lưới nanogel lớn, đồng thời các chân PEO (P123) và sườn heparin ưa

nước trong cấu trúc của nanogel thì dài, cồng kềnh, đều này cũng góp phần làm tăng

kích thước nanogel Hep-P123 khi tăng tỉ lệ ghép [129].

Hình 3.10. Kết quả TEM của pluronic P123

(a)

70

Hình 3.11. Kết quả TEM và DLS của (b): Hep-P123 (1:3); (c): Hep-P123 (1:7); (d):

Hep-P123 (1:10); (e): Hep-P123 (1:14)

3.1.2. Kết quả tổng hợp nanogel Hep-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin

hydrate

3.1.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH

Các copolymer Hep-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate thông qua

tương tác kỵ nước và sự hình thành phức giữa cisplatin hydrate và các nhóm

carboxylate/sulfate có trên sườn heparin. Trong dung dịch nước, hệ nano mang thuốc

71

tự lắp ráp nhờ vào tương tác kỵ nước để hình thành hệ nanogel mang thuốc (hình

3.12).

Hình 3.12. Sự hình thành phức Hep-P123-CisOH và nanogel của nó

Trên phổ FT-IR của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH ở hình 3.13 ta thấy

xuất hiện đồng thời các dao động đặc trưng của cả heparin và P123 như: tín hiệu peak

2972-2887 cm-1 là dao động hóa trị -C-H của nhóm -CH2 và -CH3 trên pluronic P123;

peak 1108 cm-1 là dao động hóa trị đối xứng C-O-C trên pluronic P123; peak 3453

cm-1 là dao động hóa trị -OH trên phân tử heparin [31, 50, 84-85].

Tín hiệu peak 3296 cm-1 ở vị trí A là dao động hóa trị liên kết N-H của nhóm

amine -NH2 trên phân tử cisplatin. Trong phổ đồ của Hep-P123-CisOH ta thấy xuất

hiện dao động hấp thụ mới ở 1712 cm-1 (B) chứng tỏ có sự tạo phức của CisOH và

nhóm carboxylate của heparin dẫn đến sự dịch chuyển dao động của nối -C=O trong

nhóm carboxylate lên vùng cao hơn từ 1632 cm-1 lên 1712 cm-1. Hơn nữa, 2 dãy hấp

thụ hồng ngoại mới trong phổ đồ của Hep-P123-CisOH ở 1298 cm-1 (C) và 846 cm-1

(D) là dao động của liên kết -S=O và -C-O-S- do sự hình thành phức của nhóm sulfate

và một phần nhóm sulfonate trên heparin với CisOH dẫn đến sự thay đổi tần số hập

thụ của các nhóm.

Hep-P123-CisOH

72

Hình 3.13. Phổ FT-IR của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH

Dữ liệu phổ FT-IR của heparin, Hep-P123, Hep-P123-Cis và Hep-P123-

CisOH ở hình 3.13 được thống kê qua bảng 3.6.

Bảng 3.6. Kết quả FT-IR của heparin, Hep-P123, Hep-P123-Cis, Hep-P123-CisOH

Vị

trí Nhóm chức

Số sóng (cm-1)

Heparin Hep-P123 Hep-P123-Cis Hep-P123-

CisOH

a -OH 3453 3453 3453 3453

b O=S=O (Hep) 1238 1238 1238 1238

c -C-H (–CH2 và

-CH3) (P123) 2972-2887 2972-2887 2972-2887

d C-O-C (P123) 1108 1108 1108

A -NH2 (Cis) 3296 3296

B -C=O (phức) 1712

C -S=O (phức) 1298

D -C-O-S- (phức) 846

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của các chất ở bảng 3.6, một lần nữa cho thấy

sự lặp lại các tín hiệu dao động đặc trưng trên phân tử heparin ở vị trí a, b và trên

phân tử P123 ở vị trí c, d luôn xuất hiện trong phân tử Hep-P123-Cis và Hep-P123-

73

CisOH sau khi tổng hợp. Trong phổ đồ của Hep-P123-CisOH ta thấy xuất hiện các

dao động hấp thụ mới ở vị trí B, C, D chứng tỏ có sự tạo phức của CisOH và nhóm

carboxylate, sunfate trên heparin. Trong khi phổ đồ của Hep-P123-Cis chỉ xuất hiện

tín hiệu dao động tại vị trí A. Kết quả phổ đồ giúp ta xác định được sự hình thành

phức của các nhóm anion trên heparin với các mẫu CisOH. Qua phổ FT-IR ở hình

3.13 chứng minh hợp chất Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH có sự xuất hiện đồng

thời của Hep-P123, cisplatin và cisplatin hydrate, chứng tỏ đã tổng hợp thành công

sản phẩm Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH.

3.1.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH

Trong khảo sát thực nghiệm này, các copolymer ghép Hep-P123 được sử dụng

để mang thuốc chống ung thư cisplatin và cisplatin hydrate. Cisplatin là một trong

những thuốc chống ung thư hóa trị mạnh nhất được sử dụng rộng rãi trong suốt 4 thập

kỷ qua.

Phần trăm hàm lượng cisplatin được mang vào trong hệ chất mang Hep-P123

được tính toán gián tiếp thông qua phần trăm hàm lượng platinum (Pt) từ kết quả

phân tích ICP-OES, theo công thức:

%cisplatin = %Pt x 300,05

195,084 (% wt wt⁄ )

Cấu trúc của heparin và lượng P123 được liên hợp ảnh hưởng đến hiệu quả

mang thuốc Cis và CisOH của Hep-P123. Hiệu quả mang thuốc của 4 loại chất mang

nano Hep-P123 được thể hiện trên hình 3.14.

Hình 3.14. Hiệu quả mang thuốc của hệ chất mang Hep-P123

74

Kết quả cho thấy khi lượng pluronic P123 được ghép vào heparin càng nhiều

sẽ tạo ra tương tác kỵ nước trên phân tử Hep-P123 càng lớn làm cho kết quả mang

Cis cao hơn và sự hình thành phức CisOH thấp hơn, cụ thể: Hep-P123-Cis (1:14)

(13,29%) > Hep-P123-Cis (1:10) (11,75%) > Hep-P123-Cis (1:3) (8,92%) > Hep-

P123-Cis (1:7) (6,14%). Nhìn chung, phần trăm Cis được mang vào trong nanogel

Hep-P123 thông qua tương tác kỵ nước tăng tương ứng với sự tăng tương tác kỵ nước

trên phân tử Hep-P123. Kết quả này khớp với các nghiên cứu trước đây, trong đó

dendrimer liên hợp nhiều pluronic ưa dầu sẽ mang được nhiều thuốc chống ung thư

kỵ nước [130]. Tuy nhiên ở đây có một chút khác biệt trong kết quả mang Cis của

nanogel Hep-P123 (1:3) và Hep-P123 (1:7), điều này được giải thích có thể là do

trong tiến trình mang Cis đã có một phần nhỏ Cis bị thủy phân thành CisOH [131].

Các mẫu CisOH này sẽ kết hợp với các nhóm anion trên Hep-P123, với tỉ lệ ghép 1:3

do có số lượng các nhóm anion trên sườn heparin còn lại nhiều nhất nên sự tạo phức

với các mẫu CisOH sẽ cao hơn một chút, kết quả dẫn đến hiệu suất mang Cis của

nanogel Hep-P123 (1:3) cao hơn so với nanogel Hep-P123 (1:7).

Ngược lại, trên mạch cấu trúc của heparin có chứa các nhóm anion

(carboxylate/sulfate), các nhóm này sẽ tạo liên kết hóa học với phần platinum

hydroxide của CisOH, khi lượng P123 được liên hợp vào heparin càng nhiều, tương

ứng với số lượng các nhóm anion càng giảm, kết quả làm cho sự hình thành phức

thấp hơn, cụ thể: Hep-P123-CisOH (1:14) (8,44%) < Hep-P123-CisOH (1:10)

(15,69%) < Hep-P123-CisOH (1:7) (20,76%) < Hep-P123-CisOH (1:3) (30,3%). Kết

quả này phù hợp với các nghiên cứu trước, số lượng các nhóm anion càng lớn sẽ làm

gia tăng hiệu suất mang platinum của hệ chất mang nano [50, 83, 116]. Kết quả này

cũng chỉ ra rằng trong cấu trúc của Hep-P123 có chứa lượng lớn các nhóm anion.

3.1.3. Kết quả đánh giá khả năng nhả thuốc của Hep-P123

Từ kết quả khảo sát thực nghiệm khả năng mang thuốc của các nanogel Hep-

P123, chúng tôi tiến hành chọn hệ nano Hep-P123-CisOH (1:3) có hiệu quả mang

cisplatin hydrate cao nhất 30,3% để tiếp tục đánh giá khả năng nhả thuốc của nanogel.

Kết quả nhả thuốc cisplatin hydrate của Hep-P123 được xác định bằng phương pháp

đo ICP-OES.

75

Dược tính và cơ chế của cisplatin đã được công bố trong nhiều báo cáo trước

đây. Trong điều kiện sinh lý, cisplatin sẽ bị thủy phân thành monoaqua-

diaquacisplatin, sau đó tạo liên kết với guanine và adenine trong ADN, kết quả can

thiệp vào sự sao chép của ADN. Sự thủy phân của cisplatin hoặc phức platinum và

dược tính của nó cũng đã được công bố [83, 116, 131-132]. Trong nghiên cứu này,

sự giải phóng platinum và độc tính tế bào của cisplatin được đánh giá để làm rõ tiềm

năng mang thuốc của nanogel Hep-P123.

Hình 3.15. Sự giải phóng CisOH từ nanogel platinum ở pH 5,5 và 7,4

Kết quả ở hình 3.15 cho thấy hơn 60% (v/v) CisOH được giải phóng sau 24

giờ trong cả 2 điều kiện pH. Kết quả này là do tốc độ thủy phân nhanh của các nhóm

anion và phức CisOH cũng như mạng lưới nanogel lỏng lẻo do lượng pluronic P123

được liên hợp ít. Trong đó, thuốc giải phóng nhanh trong khoảng 0 giờ đến 3 giờ đầu,

điều này có thể là do phần thuốc tự do còn giữ lại trên mạng lưới nanogel, kết quả

một số công bố cũng cho thấy thuốc giải phóng nhanh trong khoảng 4 giờ đầu tiên

[133-134]. Ngoài ra, khi giá trị pH của dung dịch đệm tăng lên, tốc độ giải phóng

thuốc giảm. Sau 24 giờ, có 65,87 ± 4,03% CisOH được giải phóng ở pH 7,4 và 74,93

± 4,10% ở pH 5,5. Điều này chỉ ra rằng sự giải phóng CisOH thì phụ thuộc pH, thuốc

được giải phóng nhanh trong môi trường acid, kết quả này có ích cho hệ thống mang

thuốc bởi vì pH ở một số vị trí khối u thấp hơn tại vị trí mô bình thường. Kết quả này

cũng phù hợp với một số công bố trước một vài phức platinum ổn định kém trong

điều kiện acid [135-138].

Thời gian (giờ)

Ph

ần

tră

m C

isO

H g

iải

ph

ón

g (

%)

76

Ngoài ra, theo báo cáo của Jinrong Peng cho thấy rằng các liên kết liên hợp

được hình thành giữa cisplatin và các nhóm -COOH có thể bị phá vỡ bởi sự tấn công

của ion H+ và nồng độ ion Cl-. Trong cơ thể, nồng độ ion Cl- thì rất cao (95-100 mM)

và tương đối ổn định trong hệ tuần hoàn, ở môi trường acid, nồng độ ion H+ nhiều

hơn có thể đẩy nhanh tiến trình giải phóng cisplatin từ nanogel. Mặt khác, các liên

kết liên hợp tiếp xúc trực tiếp với ion Cl- làm cho cisplatin giải phóng nhanh từ các

nanogel, ngay cả trong môi trường pH 7,4, bằng cách trao đổi chậm các ligand trong

phức hệ Pt (II) với các ion chlorua, cuối cùng là khuếch tán thuốc ra khỏi phức hợp

của nó [139]. Homa Gheybi và cộng sự cũng chỉ ra rằng gần như không có cisplatin

được giải phóng trong nước cất, cho thấy sự hiện diện của ion clorua trong môi trường

sinh lý là rất cần thiết cho quá trình phóng thích thuốc [140]. Mặt khác, sự giải phóng

cisplatin còn có thể là do sự suy thoái của copolymer ghép, heparin và P123 là

polymer phân hủy sinh học có thể bị thủy phân thành các phân đoạn nhỏ hoặc đơn

phân tử ở cả 2 môi trường pH trung tính và acid [141].

Kết quả ở hình 3.15 còn cho thấy phần trăm thuốc cao nhất được giải phóng

từ các vật liệu nano Hep-P123 chỉ gần 75%, cho thấy sự giải phóng thuốc diễn ra

không hoàn toàn, chỉ ra rằng các nhóm carboxylate/sunfate trên heparin sẽ tạo thành

các phức liên kết mạnh với cisplatin, đồng thời có thể có sự liên hợp giữa CisOH với

các nhóm amine/amide trên sườn heparin ngăn cản sự giải phóng hoàn toàn thuốc ra

khỏi hệ chất mang, kết quả này cũng phù hợp với một số báo cáo trước [79, 139].

Đồng thời, ở điều kiện pH 7,4 cho thấy chỉ khoảng 65% trên tổng lượng CisOH được

mang vào Hep-P123 giải phóng ra trong 24 giờ, môi trường PBS. Kết quả này cho

thấy rằng hệ nano phức Hep-P123-CisOH có thể hữu ích như hệ chất mang giải phóng

thuốc chậm. Sự giải phóng thuốc có kiểm soát trong điều kiện trung tính là rất quan

trọng trong việc duy trì sự ổn định các liên kết trong hệ nano phức cho đến khi hệ

chất mang thuốc đến vị trí đích (khối u) và do đó giúp ngăn ngừa độc tính không

mong muốn và không đặc hiệu do sự giải phóng thuốc trong quá trình lưu thông máu.

Khi phức hợp đến mô khối u, thuốc sẽ được giải phóng nhanh chóng trong mô đáp

ứng với môi trường acid của khối u.

77

3.1.4. Kết quả độc tính tế bào (trên dòng tế bào MCF-7 và nguyên bào sợi)

Từ kết quả khảo sát thực nghiệm hiệu quả mang thuốc của các nanogel Hep-

P123, chúng tôi tiến hành chọn hệ nano Hep-P123 (1:3) để đánh giá tính tương hợp

sinh học trên nguyên bào sợi và độc tính tế bào trên dòng tế bào MCF-7 của chất

mang Hep-P123 (1:3) mang cisplatin và cisplatin hydrate.

Kết quả khảo sát tính tương hợp sinh học trên cơ sở độc tính tế bào của chất

mang Hep-P123 (1:3) bằng phương pháp nhuộm SRB trên nguyên bào sợi ở bảng 3.7

cho thấy ở nồng độ 100 µg/mL, sau 48 giờ có tỉ lệ sống của tế bào là 90%. Dựa trên

tiêu chuẩn ISO 10993-5, 1999 (vật liệu không độc đối với tế bào khi tại các nồng độ

pha loãng dung dịch chiết mẫu tỉ lệ tế bào sống đều cao hơn 70%), cho thấy chất

mang Hep-P123 (1:3) có tính tương hợp sinh học và không độc đối với tế bào.

Bảng 3.7. Phần Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%)

Mẫu Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Hep-P123 (1:3) 8,02 12,20 9,92 10,04 ± 2,09

Kết quả độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chất mang thuốc

Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH được thực hiện bằng phương pháp nhuộm SRB

ở hình 3.16.

Hình 3.16. Độc tính tế bào MCF-7 của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH

78

Kết quả sau 48 giờ cho thấy nanogel Hep-P123 mang thuốc thể hiện khả năng

cao ức chế dòng tế bào ung thư vú người MCF-7, tại nồng độ 25 μg/ml hệ chất mang

Hep-P123 mang cisplatin hydrate (Hep-P123-CisOH) có phần trăm gây độc tế bào là

75,07 ± 4,25% cao hơn so với Hep-P123 mang cisplatin (Hep-P123-Cis) là 61,18 ±

2,18%. Kết quả trên chỉ ra rằng khi sử dụng cisplatin dưới dạng hydrate có thể giúp

tăng hiệu quả mang thuốc của hệ nano Hep-P123, từ đó làm tăng đáng kể khả năng

gây độc tế bào MCF-7 của hệ nanogel mang thuốc. Kết quả này phù hợp với giá trị

IC50 đo được của Hep-P123-CisOH là 8,48 ± 0,69 µg/mL thì nhỏ hơn so với Hep-

P123-Cis là 11,77 ± 0,80 µg/mL.

3.2. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

Từ kết quả mang thuốc của các hệ chất mang Hep-P123 với 4 tỉ lệ ghép khác

nhau (1:3; 1:7: 1:10; 1:14 mmol/mmol), chúng tôi tiếp tục tiến hành tổng hợp các

nanogel trên cơ sở heparin liên hợp với các pluronic khác nhau gồm F127, F87 và

F68 với 2 tỉ lệ ghép 1:3 và 1:14 (mmol/mmol) để so sánh.

Cấu trúc của các copolymer ghép Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 được xác

định bằng quang phổ hồng ngoại FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, TGA,

TEM và giá trị CMC.

3.2.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc các copolymer Hep-F127, Hep-

F87 và Hep-F68

Để tổng hợp Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 cần phải hoạt hóa hai nhóm -

OH cuối của pluronic F127, F87, F68 bởi pnitrophenyl chloroformate tạo sản phẩm

trung gian NPC-F127-NPC, NPC-F87-NPC, NPC-F68-NPC.

Phản ứng tạo liên kết urethane từ nhóm –NH2 trên phân tử 3-aminopropanol

với nhóm C=O của sản phẩm trung gian NPC-F127-NPC, NPC-F87-NPC, NPC-F68-

NPC tạo sản phẩm NPC-F127-Ami, NPC-F87-Ami, NPC-F68-Ami.

Sau cùng nhóm -NH2 trên phân tử Hep-DAB sẽ tấn công vào liên kết -C=O

của hợp chất NPC-F127-Ami, NPC-F87-Ami, NPC-F68-Ami bằng phản ứng

urethane tạo sản phẩm Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68.

3.2.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian NPC-

F127-NPC, NPC-F127-Ami, NPC-F87-NPC, NPC-F87-Ami, NPC-F68-NPC, NPC-

F68-Ami

79

Thành phần, cấu trúc các sản phẩm trung gian NPC-F127-NPC, NPC-F127-

Ami, NPC-F87-NPC, NPC-F87-Ami, NPC-F68-NPC, NPC-F68-Ami được xác định

bằng quang phổ hồng ngoại FT-IR và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR.

Kết quả phân tích phổ FT-IR của các sản phẩm NPC-F127-NPC, NPC-F127-

Ami, NPC-F87-NPC, NPC-F87-Ami, NPC-F68-NPC, NPC-F68-Ami cho kết quả

tương tự phổ FT-IR của NPC-P123-NPC và NPC-P123-Ami được thể hiện ở phụ lục

2, 3, 4.

Thành phần, cấu trúc của các sản phẩm NPC-F127-NPC, NPC-F87-NPC,

NPC-F68-NPC được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân cũng cho kết quả

tương tự với kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân của NPC-P123-NPC được thể hiện

ở phụ lục 5, 6, 7. Trên phổ đồ có các tín hiệu của các proton có trong pluronic F127,

F87, F68 như: dao động đặc trưng proton của nhóm methyl -CH3 trên PPO của

pluronic; dao động proton methylene –OCH2-CH2O- của PEO, hai tín hiệu đặc trưng

của proton vòng thơm nhóm (-CH=CH-) của NPC [50]. Đặc biệt, sự xuất hiện của tín

hiệu ở δH = 4,43 ppm được coi là tín hiệu pronton methylene -CH2-O-NPC liên kết

trực tiếp với nhóm carbonate trên NPC. Độ hoạt hóa của các pluronic đạt trên 90%

được tính từ tỷ lệ tích phân của proton thơm (NPC) và proton methyl (Pluronic F127)

theo công thức của Thi Bich Tram Nguyen và Ngoc Quyen Tran [117]. Kết quả này

phù hợp với nghiên cứu trước [84].

Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các sản phẩm NPC-F127-

Ami, NPC-F87-Ami, NPC-F68-Ami cũng cho kết quả tương tự với phổ đồ của NPC-

P123-Ami được thể hiện ở phụ lục 8, 9, 10. Trên phổ đồ ngoài các tín hiệu proton đặc

trưng có trong pluronic F127, F87 và F68, có sự xuất hiện của tín hiệu proton

methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của NPC tại δH = 4,43 ppm (-CH2-

O-NPC) dịch chuyển một phần đáng kể về vùng δH = 4,22 ppm, đây là tín hiệu proton

methylene liên kết trực tiếp với nhóm carbonate của Ami (-CH2-O-Ami), do phản

ứng thay thế một gốc NPC bằng Ami. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước

[84]. Khoảng 50% gốc NPC đã được thay thế bởi Ami, được tính từ phép tính tỷ lệ

tích phân của proton trên NPC và proton của Ami, theo báo cáo của Thi Bich Tram

Nguyen và Ngoc Quyen Tran [117].

80

3.2.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-

F68

Kết quả phổ FT-IR của các sản phẩm Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 cho kết

quả tương tự với phổ FT-IR của Hep-P123 được thể hiện ở phụ lục 11, 12, 13.

Thành phần, cấu trúc của sản phẩm Hep-F127 được xác định bằng phổ cộng

hưởng từ hạt nhân 1H-NMR cũng cho kết quả tương tự với phổ đồ của Hep-P123

được thể hiện ở phụ lục 14. Phổ 1H-NMR của Hep-F127 (500 MHz, D2O, ppm) có

các tín hiệu proton đặc trưng trên phân tử pluronic F127 và heparin. Đặc biệt, ở vùng

δH = 1,66 ppm là dao động của proton methylene ở vị trí -CH2-CH2- trên DAB và ở

δH = 3,03 ppm là dao động của proton methylene ở vị trí -CH2-NH-, cho thấy có sự

liên hợp giữa Hep-DAB và NPC-F127-Ami. Ngoài ra, trên phổ không còn xuất hiện

2 tín hiệu của proton thơm của NPC (-CH=CH-) và tín hiệu proton methylene liên

kết trực tiếp với nhóm carbonate của NPC cũng đã biến mất, chỉ còn tín hiệu proton

methylene tại vị trí liên hợp với Ami (-CH2-O-Ami) ở vùng δH = 4,22 ppm, chứng tỏ

rằng 100% NPC đã bị loại bỏ trong quá trình hình thành Hep-F127 bằng phản ứng

nối giữa Hep-DAB và NPC-F127-Ami.

Dữ liệu phổ 1H-NMR theo phụ lục 14 được thống kê qua bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-Ami, Hep-DAB và Hep-F127

Vị trí

H H của nhóm

Độ dịch chuyển hóa học (δ, ppm)

NPC-F127-Ami Hep-DAB Hep-F127

a -CH3 (PPO) 1,12-1,13 1,08

b -OCH2-CH2O- (PEO) 3,60-3,64 3,67

c, d -CH=CH- (vòng thơm) 7,38-7,40 và

8,25-8,28

e -CH2-O-NPC 4,43

f -CH2-O-Ami 4,22 4,22

i -CH2-CH2- (DAB) 1,70-1,74 1,66

j -CH2-NH- 3,11-3,22 3,03

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của sản phẩm Hep-F127 được tổng hợp từ NPC-

F127-Ami và Hep-DAB ở bảng 3.8, cho thấy có sự lặp lại các tín hiệu proton đặc

trưng trên phân tử F127 ở vị trí a, b và trên phân tử heparin ở vị trí i, j. Phản ứng nối

81

thành công giữa Hep-DAB và NPC-F127-Ami dẫn đến sự mất hoàn toàn tín hiệu

proton ở vị trí c, d, e, chỉ còn lại tín hiệu tại vị trí f.

Phổ 1H-NMR của Hep-F87 và Hep-F68 được thể hiện ở phụ lục 15, 16 cũng

cho kết quả tương tự như ở phổ 1H-NMR của Hep-F127.

3.2.1.3. Kết quả phân tích TGA của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

Sự ổn định nhiệt của các copolymer ghép Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68 cùng

với heparin và các pluronic F127, F87, F68 được phân tích bằng phép đo TGA để

nghiên cứu đặc tính nhiệt của các thành phần có trong copolymer ghép. Mẫu được sử

dụng trong 10 mg mẫu, ở nhiệt độ 25oC - 700oC với tốc độ 10oC/phút, dưới điều kiện

khí nitrogen.

Hình 3.17. Kết quả TGA của F127, F87, F68, heparin và copolymer ghép

Hình 3.17 cho thấy giản đồ TGA của cả 3 pluronic F127, F87 và F68 đều ổn

định ở nhiệt độ lên đến 320oC và bắt đầu bị phân hủy ở nhiệt độ 350oC, và tổng khối

lượng sẽ bị mất hoàn toàn ở nhiệt độ trên 420oC. Heparin ổn định ở nhiệt độ trên

200oC và bị phân hủy nhanh ở nhiệt độ 250oC. Ở nhiệt độ trên 400oC quá trình phân

hủy diễn ra chậm dần [118].

82

Giản đồ TGA của của các copolymer ghép Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

đặc trưng chứa cả sự phân hủy của pluronic F127, F87, F68 và heparin. Các

copolymer ghép Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 bị phân hủy phần lớn khối lượng

từ 250oC đến 420oC. Tuy nhiên, từ giản đồ cho thấy vẫn còn một lượng nhỏ chưa bị

phân hủy ở nhiệt độ từ 420oC, tại nhiệt độ mà pluronic đã bị phân hủy hoàn toàn. Kết

quả được cho là có sự hiện diện của heparin trong các copolymer ghép.

Từ kết quả giản đồ TGA ở hình 3.16 cho thấy khối lượng dư còn lại của các

copolymer ghép ở nhiệt độ trên 420oC lần lượt là: 8,84% (Hep-F127 (1:3)); 4,04%

(Hep-F127 (1:3)); 12,97% (Hep-F87 (1:3)); 1,41% (Hep-F87 (1:14)); 11,00% (Hep-

F68 (1:3)); 3,12% (Hep-F68 (1:14)). Trong đó các copolymer ghép Hep-F127, Hep-

F87 và Hep-F68 ở tỉ lệ ghép 1:3 có phần trăm khối lượng dư còn lại cao hơn so với

tỉ lệ ghép 1:14. Sự gia tăng phần trăm khối lượng dư còn lại này phù hợp với sự hiện

diện tương ứng của heparin và pluronic có trong các copolymer Hep-F127, Hep-F87

và Hep-F68 theo các tỉ lệ ghép.

Dựa trên tỉ lệ phần trăm khối lượng mất của heparin tinh khiết và phần trăm

khối lượng còn lại của nó trong Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 ở 420oC, ta có thể

tính được phần trăm khối lượng pluronic F127, F87 và F68 được ghép vào heparin

theo báo cáo của Hongliang Kang [121]. Kết quả được cho ở bảng 3.9.

Bảng 3.9. Phần trăm khối lượng pluronic được ghép vào heparin

Mẫu Pluronic F127

(%)

Pluronic F87

(%)

Pluronic F68

(%)

Hep-F127 (1:3) 66,12 - -

Hep-F127 (1:14) 81,25 - -

Hep-F87 (1:3) - 48,49 -

Hep-F87 (1:14 - 74,30 -

Hep-F68 (1:3) - - 41,95

Hep-F68 (1:14) - - 75,94

3.2.1.4. Kết quả phân tích giá trị CMC của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

Các copolymer lưỡng tính F127, F87 và F68 với cấu trúc khối PPO kỵ nước

và khối PEO ưa nước nên có thể dễ dàng hình thành micelle trong dung dịch nước.

Sử dụng iodine và phương pháp quang phổ UV-Vis để xác định sự hình thành nanogel

83

của các copolymer ghép Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 thông qua giá trị nồng độ

tạo micelle tới hạn (CMC) trong nước DI. Sự hình thành micelle nhờ vào tương tác

kỵ nước có giá trị trong việc cân bằng sự ổn định và giải phóng thuốc của nanogel.

Mối liên quan giữa giá trị CMC và hiệu quả mang thuốc kỵ nước của micelle hoặc

nanogel đã được công bố trong các báo cáo trước [142-144].

Hình 3.18. Kết quả đo CMC của các pluronic F127, F87 và F68

84

Hình 3.19. Kết quả CMC các copolymer Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68

Ở hình 3.19 cho kết quả cường độ hấp thụ của iodine bắt đầu tăng đáng kể ở

giá trị nồng độ các copolymer ghép Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 từ 0,046 - 0,34

(%wt), chỉ ra rằng các phân tử iodine bắt đầu hòa tan trong vùng kỵ nước PPO của

các pluronic F127, F87 và F68. Điều này cho thấy, ở nồng độ này các copolymer

ghép Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 đã tự lắp ráp để hình thành mạng lưới polymer

liên kết ngang dưới dạng một nanogel có thể hoạt động như chất mang thuốc kỵ nước

tương tự như nanogel Hep-P123.

Giá trị CMC của các nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 đo được cũng

lớn hơn so với giá trị CMC của dung dịch pluronic tinh khiết F127, F87 và F68 tương

ứng (hình 3.18). Đồng thời tỉ lệ chiều dài chuỗi ưa nước và kỵ nước trong cấu trúc

của copolymer ghép cũng liên quan đến giá trị CMC, khi chiều dài chuỗi kỵ nước

càng tăng thì giá trị CMC sẽ càng giảm, trong đó chiều dài khối PPOF127 = 65 (PEO100-

PPO65-PEO100) > PPOF87 = 40 (PEO61-PPO40-PEO61) > PPOF68 = 29 (PEO76-PPO29-

PEO76), cấu trúc của copolymer Hep-F127 có chiều dài chuỗi PPO kỵ nước của

pluronic F127 lớn nhất dẫn đến làm tăng tương tác kỵ nước trong cấu trúc của

copolymer ghép, và kết quả làm cho giá trị CMC càng giảm [122, 145-147].

3.2.1.5. Kết quả phân tích TEM của Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68

Hình thái và sự phân bố kích thước của các nanogel Hep-F127, Hep-F87 và

Hep-F68 có thể được quan sát bởi kính hiển vi điện tử truyền qua TEM.

85

Hình 3.20. Hình thái và kích thước của các nanogel bởi TEM

(a): F127; (b): Hep-F127 (1:3); (c): Hep-F127 (1:14); (d): Hep-F87 (1:3);

(e): Hep-F87 (1:14); (f): Hep-F68 (1:3); (g): Hep-F68 (1:14)

Kết quả kích thước của các nanogel Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68 ở hình 3.20

được thống kê qua bảng 3.9.

Bảng 3.10. Kích thước của các nanogel Hep-F127, Hep-F87, Hep-F68

Tỉ lệ ghép

(mmol/mmol)

Hep-F127

(nm)

Hep-F87

(nm)

Hep-F68

(nm)

1:3 130-170 110-230 100-150

1:4 110-185 219-367 124-177

Kết quả TEM ở hình 3.20 cho thấy kích thước của pluronic F127 là 15 nm (a),

trong khi đó, kích thước của các nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 từ 100 nm

-367 nm (bảng 3.10 và hình 3.20) lớn hơn so với kích thước của micelle pluronic

F127. Kết quả chỉ ra rằng khi các chân pluronic được ghép vào heparin, ở nồng độ

86

CMC các copolymer tự lắp ráp để hình thành nanogel với cấu trúc mạng lưới bên

trong có sự tập hợp sắp xếp không đồng đều của nhiều chuỗi polymer, dẫn đến vùng

cấu trúc không gian bên trong lớn hơn và có kích thước lớn hơn.

Kết quả hình 3.20 còn cho thấy các hạt nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-

F68 có dạng hình cầu, kích thước hạt của các hệ nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-

F68 cũng phụ thuộc vào lượng pluronic được liên hợp. Khi lượng pluronic ghép vào

heparin càng nhiều làm kích thước hạt của các nanogel cũng tăng theo, kết quả này

tương tự với kết quả TEM của nanogel Hep-P123. Lực đẩy tĩnh điện giữa các phần

tích điện âm trên sườn heparin và pluronic dẫn đến vùng cấu trúc không gian bên

trong mạng lưới nanogel lớn, đồng thời các chân PEO (pluronic) và sườn heparin ưa

nước trong cấu trúc của nanogel thì dài, cồng kềnh, kết quả góp phần làm tăng kích

thước các nanogel khi tăng tỉ lệ ghép [129].

3.2.2. Kết quả tổng hợp nanogel Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 mang thuốc

cisplatin và cisplatin hydrate

3.2.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH, Hep-

F87-Cis, Hep-F87-CisOH và Hep-F68-Cis, Hep-F68-CisOH

Các copolymer Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 mang thuốc cisplatin và

cisplatin hydrate thông qua tương tác kỵ nước và sự hình thành phức giữa cisplatin

hydrate và các nhóm carboxylate/sulfate có trên sườn heparin. Trong dung dịch nước,

hệ nano mang thuốc tự lắp ráp nhờ vào tương tác kỵ nước để hình thành hệ nanogel

mang thuốc.

87

Hình 3.21. Phổ FT-IR của Hep-F127, Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc của Hep-F127-Cis và Hep-F127-CisOH

bằng phổ FT-IR ở hình 3.21 cho thấy xuất hiện đồng thời các dao động đặc trưng của

cả heparin và F127 như: tín hiệu peak 2952 cm-1 và 2874 cm-1 là dao động hóa trị -

C-H của nhóm -CH2 và -CH3 trên pluronic F127; peak 3435 cm-1 là dao động hóa trị

-OH trên phân tử heparin [31, 50, 84-85].

Tín hiệu peak 3286 cm-1 (A) là dao động hóa trị N-H của nhóm amine –NH2

trên phân tử cisplatin. Trong phổ đồ của Hep-F127-CisOH ta thấy 2 dải hấp thụ tại

nối -COO và SO2-O- có sự dịch chuyển dao động từ vùng 1632 cm-1 về vùng 1592

cm-1 và 1241 cm-1 về vùng 1253 cm-1, do sự hình thành liên kết giữa platinum

hydroxide của CisOH với các nhóm carboxylate/sulfate của Hep-F127.

Qua phổ FT-IR ở hình 3.21 chứng minh hợp chất Hep-F127-Cis và Hep-F127-

CisOH đã tổng hợp thành công.

Phổ đồ FT-IR của Hep-F87 và Hep-F68 mang Cis và CisOH cũng cho kết quả

tương tự phổ FT-IR của Hep-F127-Cis và Hep-F127-CisOH và được được thể hiện

ở phụ lục 17, 18.

3.2.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Hep-F127-Cis, Hep-F127-CisOH, Hep-

F87-Cis, Hep-F87-CisOH và Hep-F68-Cis, Hep-F68-CisOH

88

Trong khảo sát thực nghiệm này, các copolymer ghép Hep-F127, Hep-F87 và

Hep-F68 được sử dụng để mang thuốc chống ung thư cisplatin và cisplatin hydrate.

Phần trăm hàm lượng cisplatin được mang vào trong hệ chất mang Hep-F127,

Hep-F87 và Hep-F68 được tính toán gián tiếp thông qua phần trăm hàm lượng

platinum (Pt) từ kết quả phân tích ICP-OES.

Cấu trúc của heparin và lượng pluronic được liên hợp ảnh hưởng đến hiệu quả

mang thuốc Cis và CisOH của các hệ chất mang. Hiệu quả mang thuốc của 6 loại chất

mang nano Hep-P123, Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 ở 2 tỉ lệ ghép 1:3 và 1:14

được thể hiện ở hình 3.22.

Hình 3.22. Hiệu quả mang Cis và CisOH của các hệ chất mang Hep-Plu

Khi lượng pluronic được ghép vào heparin càng nhiều sẽ tạo ra tương tác kỵ

nước trên phân tử Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 càng lớn làm cho kết quả mang

cisplatin cao hơn. Theo kết quả thống kê hiệu quả mang thuốc của các chất mang

nano Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 trên hình 3.22 cho thấy phần trăm cisplatin

được mang vào trong trong Hep-F127 (1:14) cao nhất chiếm 13,21%, điều này có thể

thấy rõ trong cấu trúc của các nanogel và mức độ liên hợp của heparin với các

pluronic. Mặt khác, hiệu quả mang thuốc cisplatin của các nanogel Hep-F127, Hep-

F87 và Hep-F68 cũng bị ảnh hưởng bởi giá trị HLB khác nhau của các pluronic, HLB

càng lớn thì hiệu quả mang thuốc kỵ nước càng giảm [97], cụ thể: F127 (HLB = 22)

< F87 (HLB = 24) < F68 (HLB = 29), HLB càng nhỏ tương ứng với sự tăng tương

tác kỵ nước trên chất mang Hep-F127 > Hep-F87 > Hep-F68.

89

Ngược lại, hiệu quả mang thuốc CisOH phụ thuộc vào số lượng các nhóm

anion (carboxylate/sulfate) còn lại trên mạch cấu trúc của heparin sau khi liên hợp

với pluronic, các nhóm này sẽ tạo liên kết hóa học với phần platinum hydroxide của

CisOH. Khi lượng pluronic được liên hợp vào heparin càng nhiều, tương ứng với số

lượng các nhóm anion càng giảm, kết quả làm cho sự hình thành phức càng thấp, cụ

thể: Hep-F127-CisOH (1:14) (11,41%) < Hep-F127-CisOH (1:3) (26,92%); Hep-

F87-CisOH (1:14) (10,75%) < Hep-F87-CisOH (1:3) (26,15%) và Hep-F68-CisOH

(1:14) (8,02%) < Hep-F68-CisOH (1:3) (25,07%). Kết quả này phù hợp với các

nghiên cứu trước, số lượng các nhóm anion càng lớn sẽ làm gia tăng hiệu suất mang

platinum của hệ chất mang nano [50, 83, 116].

3.3. So sánh kết quả phân tích các nanogel Hep-P123, Hep-F127, Hep-F87, và

Hep-F68 mang cisplatin và cisplatin hydrate

Các nanogel Hep-P123, Hep-F127, Hep-F87, và Hep-F68 với các tỉ lệ ghép

khác nhau sau khi được tổng hợp và xác định thành phần, cấu trúc sẽ được dùng để

đánh giá hiệu quả mang thuốc cisplatin và cisplatin hydrate.

Kết quả so sánh đặc tính cấu trúc và hiệu quả mang thuốc của các hệ nanogel

được trình bày trong bảng 3.11.

Bảng 3.8. Kết quả phân tích các hệ nanogel mang thuốc trên cơ sở heparin liên hợp

pluronic P123, F127, F87 và F68

STT

Nanogel Kết quả TEM CMC

(%wt)

Hiệu quả mang

thuốc (%)

Tên Tỉ lệ

ghép

Hình

thái

Kích thước

(nm) Cisplatin

Cisplatin

hydrate

1 Hep-

P123

1:3 Hình

cầu 45-81 0,041 8,92 30,30

2 1:14 Hình

cầu 80-153 0,028 13,29 8,44

3 Hep-

F127

1:3 Hình

cầu 130-170 0,053 8,61 26,92

4 1:14 Hình

cầu 110-185 0,046 13,21 11,41

90

5

Hep-F87

1:3 Hình

cầu 110-230 0,12 3,63 26,15

6 1:14 Hình

cầu 219-367 0,1 4,78 10,75

7

Hep-F68

1:3 Hình

cầu 100-150 0,34 2,85 25,07

8 1:14 Hình

cầu 124-177 0,21 3,98 8,52

Kết quả phân tích hình thái, kích thước của các nanogel cho thấy các hạt

nanogel có dạng hình cầu, với kích thước hạt tăng dần khi tăng tỉ lệ ghép pluronic.

Kết quả này cho thấy các nanogel có thể đáp ứng được không gian bên trong cấu trúc

vật liệu đủ lớn để có thể tăng hiệu quả mang các thuốc kỵ nước. Với kích thước trung

bình từ 45 nm đến 367 nm các hệ nano mang thuốc có thể dể dàng thâm nhập vào các

mô tế bào ung thư bằng phương pháp phân phối thuốc thụ động thông qua hiện tượng

tăng tính thấm và tăng hiệu quả lưu giữ đặc trưng ở các mô ung thư. Tại hầu hết các

mô khỏe mạnh, kích thước các khe hở lớp nội mô thành mạch máu thường nhỏ hơn

2 nm, các khe hở này quá nhỏ so với kích thước của chất mang nanogel. Còn tại mô

ung thư, do sự phát triển của các tế bào ung thư đòi hỏi sự tăng sinh mạch máu, các

vi mạch máu mới được hình thành tại các mô ung thư và có kích thước từ 100 nm -

800 nm. Do đó các hạt nanogel mang thuốc có thể vượt qua dễ dàng và đi vào mô

ung thư [38].

Các copolymer Hep-P123, Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 có thể tự lắp ráp

để hình thành nanogel trong dung dịch nước thông qua giá trị CMC đo được. Kết quả

giá trị CMC của các nanogel cho thấy phụ thuộc vào tỉ lệ chiều dài của khối ưa nước

PEO và khối kỵ nước PPO trong cấu trúc của nanogel. Khi tỉ lệ chiều dài khối kỵ

nước tăng giá trị CMC đo được càng giảm, cụ thể: PPOP123 = 70 (PEO20-PPO70-

PEO20) > PPOF127 = 65 (PEO100-PPO65-PEO100) > PPOF87 = 40 (PEO61-PPO40-PEO61)

> PPOF68 = 29 (PEO76-PPO29-PEO76), trong đó nanogel Hep-P123 có giá trị CMC đo

được nhỏ nhất. Giá trị CMC có ý nghĩa trong việc cân bằng sự ổn định và phân phối

thuốc của nanogel. Kết quả này cũng chỉ ra rằng các hệ nanogel được hình thành có

ý nghĩa trong việc sử dụng làm hệ chất mang các thuốc kỵ nước.

91

Kết quả hiệu quả mang thuốc kỵ nước cisplatin của các nanogel Hep-P123,

Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 tăng tương ứng với tăng tỉ lệ ghép pluronic. Phần

trăm cisplatin được mang vào các nanogel bị ảnh hưởng bởi tương tác kỵ nước và chỉ

số HLB của các pluronic được liên hợp. HLB càng nhỏ tương ứng với sự tăng tương

tác kỵ nước trên chất mang Hep-P123 > Hep-F127 > Hep-F87 > Hep-F68, cụ thể:

P123 (HLB = 8) < F127 (HLB = 22) < F87 (HLB = 24) < F68 (HLB = 29), kết quả

nanogel Hep-P123-Cis (1:14) có phần trăm cisplatin được mang cao nhất (13,29%)

[97].

Ngược lại, hiệu quả mang thuốc cisplatin hydrate của các nanogel Hep-P123,

Hep-F127, Hep-F87 và Hep-F68 giảm tương ứng khi tăng tỉ lệ ghép pluronic. Phần

trăm cisplatin hydrate được mang vào các nanogel phụ thuộc vào số lượng các nhóm

anion (carboxylate/sulfate) còn lại trên mạch cấu trúc của heparin sau khi liên hợp

với pluronic, các nhóm này sẽ tạo phức với phần platinum hydroxide của CisOH. Khi

lượng pluronic được liên hợp vào heparin càng nhiều, tương ứng với số lượng các

nhóm anion càng giảm, kết quả làm cho sự hình thành phức càng thấp. Đồng thời,

hiệu quả mang thuốc CisOH của các Hep-Plu còn bị ảnh hưởng bởi chiều dài của

khối PEO trong cấu trúc của pluronic. Trong đó PEOF127 = 200 (PEO100-PPO65-

PEO100) > PEOF68 = 152 (PEO76-PPO29-PEO76) > PEOF87 = 122 (PEO61-PPO40-

PEO61) > PEOP123 = 40 (PEO20-PPO70-PEO20) làm mạch cấu trúc phân tử càng dài,

càng cồng kềnh gây cản trở không gian làm ảnh hưởng khả năng tạo phức giữa CisOH

và Hep-Plu, dẫn đến Hep-P123-CisOH (1:3) có phần trăm CisOH được mang cao

nhất (30,3%).

3.4. Kết quả tổng hợp và khảo sát nanogel Fud-P123

Trên cơ sở kết quả tổng hợp và khảo sát khả năng mang, nhả thuốc của các

copolymer ghép Hep-P123 với 4 tỉ lệ ghép 1:3, 1:7, 1:10 và 1:14 (mmol/mmol), theo

đó tỉ lệ ghép 1:3 cho hiệu quả mang thuốc CisOH cao nhất, chúng tôi tiếp tục tiến

hành tổng hợp hệ nanogel Fud-P123 với tỉ lệ ghép 1:3 (mmol/mmol) và khảo sát khả

năng mang, nhả thuốc để so sánh.

Cấu trúc của copolymer ghép Fud-P123 được xác định bằng quang phổ hồng

ngoại biến đổi FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, TGA, TEM và giá trị

CMC.

92

3.4.1. Kết quả xác định thành phần, cấu trúc copolymer Fud-P123

Trong tổng hợp copolymer Fud-P123 thành phần, cấu trúc của sản phẩm

trung gian Fud-DAB cũng được xác định qua các kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-

NMR.

3.4.1.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của sản phẩm trung gian Fud-

DAB

Sản phẩm Fud-DAB được tổng hợp từ fucoidan và 1,4-diaminbutane (DAB),

sử dụng tác chất ghép cặp EDC/NHS có dạng bột màu nâu.

a. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Fud-DAB

Hình 3.23. Phổ FT-IR của fucoidan và Fud-DAB

Ở hình 3.23 trên phổ đồ của fucoidan có các peak dao động đặc trưng như: tín

hiệu peak ở số sóng 3439 cm-1 là dao động hóa trị -OH trên phân tử fucoidan; dao

động hóa trị -C=O của acid carboxylic xuất hiện ở số sóng 1642 cm- chỉ ra sự có mặt

của acid glucuronic trong phân tử fucoidan; các dao động hấp thụ không đối xứng và

đối xứng ở vùng số sóng 1256 cm-1 (O=S=O) và 838 cm-1 (C-O-S) cho thấy sự hiện

diện của liên kết ester sulfate. Ngoài ra còn có dao động hóa trị của liên kết C-O-C

trên vòng saccharide của fucoidan tại vùng số sóng 1047 cm-1 [104, 107].

93

Khi DAB gắn lên fucoidan trên phổ đồ FT-IR của Fud-DAB ở hình 3.23 ta

thấy xuất hiện 2 tín hiệu mới, peak tại số sóng 3097 cm-1 (A) là dao động hóa trị liên

kết N-H của nhóm amine -NH2 trên phân tử DAB không liên kết với fucoidan. Đồng

thời, có sự xuất hiện dãi hấp thụ ở tần số thấp 1469 cm-1; 1449 cm-1 (B) là dao động

-NH do sự hình thành liên kết amide (-NH-CO) sau khi DAB liên hợp với nhóm -

COO trên fucoidan, điều này chứng tỏ đã tổng hợp thành công sản phẩm Fud-DAB.

b. Kết quả phân tích 1H-NMR của Fud-DAB

Hình 3.24. Phổ 1H-NMR của Fud-DAB

Kết quả phân tích thành phần, cấu trúc Fud-DAB được thể hiện qua phổ 1H-

NMR (500 MHz, D2O, ppm) ở hình 3.24. Phổ đồ xuất hiện các tín hiệu proton trên

phân tử fucoidan như: các tín hiệu trong vùng δH = 3,71-5,44 ppm thuộc về proton

trên phân tử fucoidan, ở δH = 1,04-1,28 ppm đặc trưng cho proton -CH3 của nhóm O-

acetyl (CH3CO), kết quả này cho thấy trong phân tử fucoidan có tồn tại gốc acetyl.

Sự kết hợp giữa fucoidan và DAB cho thấy trên phổ 1H-NMR của sản phẩm

Fud-DAB xuất hiện tín hiệu dao động đặc trưng ở vùng trường cao δH =1,67-1,75

ppm (i) đặc trưng cho proton methylene -CH2-CH2- trên dây DAB và tín hiệu proton

ở vùng từ δH = 3,04 ppm (j) thuộc về proton methylene -CH2-N, đây được xem là tín

hiệu tại vị trí mà nhóm amine trên DAB liên kết với nhóm carboxylate trên fucoidan

94

để hình thành liên kết amide. Từ kết quả phổ FT-IR và 1H-NMR cho thấy đã tổng

hợp thành công Fud-DAB.

3.4.1.2. Kết quả phân tích phổ FT-IR và 1H-NMR của Fud-P123

Copolymer Fud-P123 được tổng hợp bằng phản ứng ghép giữa Fud-DAB và

NPC-P123-Ami. Trong giai đoạn phản ứng này, nhóm -NH2 trên phân tử Fud-DAB

sẽ tấn công vào liên kết -C=O của hợp chất NPC-P123-Ami tạo sản phẩm Fud-P123.

Sản phẩm Fud-P123 có dạng hồ keo màu nâu.

a. Kết quả phân tích FT-IR của Fud-P123

Hình 3.25. Phổ FT-IR của Fud-DAB, NPC-P123-Ami và Fud-P123

Từ kết quả phổ FT-IR của Fud-P123 ở hình 3.25 ta thấy xuất hiện đồng thời

các dao động đặc trưng của cả fucoidan và P123 như: tín hiệu peak 2972 cm-1 đến

2887 cm-1 là dao động hóa trị -CH của nhóm -CH2 và -CH3 trên pluronic P123; peak

1108 cm-1 là dao động hóa trị đối xứng C-O-C trên pluronic P123; peak 3425 cm-1

là dao động hóa trị -OH trên phân tử fucoidan; peak 1255 cm-1 là dao động hóa trị đối

xứng O=S=O của nhóm sulfate trên fucoidan [104, 107].

Đặc biệt, ở đây ta thấy có sự dịch chuyển peak dao động từ vùng số sóng

1769,49 cm-1 vể vùng số sóng 1644 cm-1, đây chính là dao động của nhóm -COO, do

phản ứng hình thành liên kết urethane (-NHCOO-) bởi sự thay thế gốc NPC (p-

95

nitrophenyl chloroformate) trên NPC-P123-Ami bằng liên kết urethane với các nhóm

carboxylate trên phân tử fucoidan. Đồng thời dao động của nối -NO2 trong phân tử

NPC tại số sóng 1593 cm-1 trên phổ đồ NPC-P123-Ami cũng đã không còn xuất hiện

trong phổ đồ Fud-P123.

Dữ liệu phổ FT-IR của sản phẩm NPC-P123-Ami, Fud-DAB và Fud-P123

được thống kê qua bảng 3.12.

Bảng 3.12. Kết quả phổ FT-IR của NPC-P123-Ami, Fud-DAB, Fud-DAB

Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1)

NPC-P123-Ami Fud-DAB Fud-P123

a -OH (Fud) 3425 3425

b O=S=O (Fud) 1255 1255

c -CH (-CH2 và -CH3) 2972-2887 2972-2887

d C-O-C (P123) 1108 1108

e -NO2 (NPC) 1593

f -COO-NPC 1769

g -NHCOO- 1644

Qua bảng 3.12, tổng kết dữ liệu phổ của các chất có sự lặp lại các tín hiệu dao

động đặc trưng trên phân tử fucoidan ở vị trí a, b và trên phân tử P123 ở vị trí c, d

luôn xuất hiện trong phổ đồ của phân tử Fud-P123 sau khi tổng hợp. Sự dịch chuyển

tín hiệu dao động ở vị trí f về vị trí g cho thấy sự hình thành liên kết urethane từ phản

ứng giữa Fud-DAB và NPC-P123-Ami, và đi theo là sự biến mất của tín hiệu e.

b. Kết quả phân tích 1H-NMR của Fud-P123

Kết quả phân tích cấu trúc của Fud-P123 được thể hiện qua phổ 1H-NMR (500

MHz, D2O, ppm) ở hình 3.26.

96

Hình 3.26. Phổ 1H-NMR của Fud-P123

Phổ đồ xuất hiện các tín hiệu proton đặc trưng trên phân tử P123 như: δH =

1,10 ppm là dao động đặc trưng proton của nhóm methyl -CH3 (a) trên PPO của P123;

δH = 3,63-3,67 ppm là dao động proton methylene -OCH2-CH2O- (b) của PEO. Các

tín hiệu proton tại δH = 3,71-5,44 ppm thuộc về proton trên phân tử fucoidan, tuy

nhiên vẫn chưa quan sát rõ.

Đặc biệt, ở δH = 1,74 ppm (i) là dao động của proton methylene ở vị trí -CH2-

CH2- trên DAB và ở δH = 3,04 ppm là dao động của proton methylene ở vị trí -CH2-

NH- (j), cho thấy có sự liên hợp giữa Hep-DAB và NPC-P123-Ami. Ngoài ra, trên

phổ không còn xuất hiện các tín hiệu của proton thơm của NPC (-CH=CH-) ở δH =

7,38-7,40 ppm và δH = 8,27-8,28 ppm và tín hiệu proton methylene liên kết trực tiếp

với nhóm carbonate của NPC tại δH = 4,43 ppm (-CH2-O-NPC) đã biến mất, chỉ còn

tín hiệu tại δH = 4,22 ppm (f) đây là tín hiệu proton methylene tại vị trí liên hợp với

Ami (-CH2-O-Ami), chứng tỏ rằng 100% NPC đã bị loại bỏ trong quá trình hình thành

Fud-P123 bằng phản ứng nối giữa Fud-DAB và NPC-P123-Ami.

Dữ liệu phổ 1H-NMR của NPC-P123-Ami, Fud-DAB và Fud-P123 được

thống kê qua bảng 3.13.

97

Bảng 3.13. Kết quả phân tích 1H-NMR của NPC-P123-Ami, Fud-DAB, Fud-P123

Vị trí

H

H của nhóm Độ dịch chuyển hóa học (δ, ppm)

NPC-P123-Ami Fud-DAB Fud-P123

a -CH3 (PPO) 1,12-1,14 1,10

b -OCH2-CH2O- (PEO) 3,61-3,63 3,63-3,67

c, d -CH=CH- (vòng thơm) 7,38-7,40

và 8,27-8,28

e -CH2-O-NPC 4,43

f -CH2-O-Ami 4,22 4,22

i –CH2-CH2- (DAB) 1,67-1,75 1,74

j -CH2-NH- 3,04 3,04

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của sản phẩm Fud-P123 được tổng hợp từ NPC-

P123-Ami và Fud-DAB ở bảng 3.13, cho thấy có sự lặp lại các tín hiệu proton đặc

trưng trên phân tử P123 ở vị trí a, b. Phản ứng nối thành công giữa Fud-DAB và NPC-

P123-Ami dẫn đến sự mất hoàn toàn tín hiệu proton ở vị trí c, d, e, chỉ còn lại tín hiệu

tại vị trí f. Từ kết quả phổ FT-IR và phổ 1H-NMR cho thấy đã tổng hợp thành công

Fud-P123.

3.4.1.3. Kết quả phân tích TGA của Fud-P123

Sự ổn định nhiệt của copolymer ghép Fud-P123 cùng với fucoidan và pluronic

P123 được phân tích bằng phép đo TGA để phân tích đặc tính nhiệt của các sản phẩm.

Mẫu được sử dụng trong 10 mg mẫu, ở nhiệt độ 25oC - 700oC với tốc độ 10oC/phút,

dưới điều kiện khí nitrogen.

Hình 3.27. Kết quả TGA của P123, fucoidan và Fud-P123

98

Hình 3.27 cho thấy giản đồ TGA của fucoidan có sự phân hủy nhẹ với khối

lượng mất khoảng 5% ở 200oC. Fucoidan bắt đầu bị phân hủy nhanh ở nhiệt độ từ

200oC, do sự phá vỡ các liên kết glycosid. Ở nhiệt độ trên 400oC quá trình phân hủy

diễn ra chậm dần [148-149] và khối lượng dư còn lại là 38,23% tại nhiệt độ 420oC.

Trong khi đó, pluronic P123 ổn định ở nhiệt độ lên đến 320oC và bắt đầu bị phân hủy

ở nhiệt độ 350oC, tổng khối lượng sẽ bị mất hoàn toàn ở nhiệt độ trên 420oC [150-

152].

Giản đồ TGA của copolymer ghép Fud-P123 đặc trưng chứa cả sự phân hủy

của pluronic P123 và fucoidan. Một lượng khoảng 7% khối lượng copolymer ghép

Fud-P123 mất ở nhiệt độ 170oC và bị phân hủy nhanh và mất phần lớn khối lượng

trong khoảng từ 200oC đến 420oC . Tuy nhiên, từ giản đồ cho thấy vẫn còn một lượng

Fud-P123 chưa bị phân hủy ở nhiệt độ trên 420oC, tại nhiệt độ mà pluronic P123 đã

bị phân hủy hoàn toàn. Kết quả được cho là do có sự hiện diện của fucoidan trong

copolymer ghép. Từ kết quả giản đồ TGA cho thấy khối lượng dư còn lại của

copolymer Fud-P123 ở nhiệt độ 420oC là 12,96%.

Dựa trên tỉ lệ phần trăm khối lượng mất của fucoidan tinh khiết và phần trăm

khối lượng còn lại của nó trong Fud-P123 ở 420oC, ta có thể tính được phần trăm

khối lượng pluronic P123 được ghép vào fucoidan là 68,36%, theo báo cáo của

Hongliang Kang [121].

3.4.1.4. Kết quả phân tích giá trị CMC của Fud-P123

Sử dụng iodine và phương pháp quang phổ UV-Vis để xác định sự hình thành

nanogel của copolymer ghép Fud-P123 thông qua giá trị nồng độ tạo micelle tới hạn

(CMC) trong nước DI.

Hình 3.28. Kết quả CMC của Fud-P123

99

Ở hình 3.28 cho kết quả giá trị CMC của Fud-P123 là 0,025 (%wt), chỉ ra rằng

các phân tử iodine bắt đầu hòa tan trong vùng kỵ nước PPO của các pluronic P123

trong copolymer Fud-P123. Điều này cho thấy, ở nồng độ này copolymer ghép Fud-

P123 đã tự lắp ráp để hình thành mạng lưới polymer liên kết ngang dưới dạng một

nanogel có thể hoạt động như chất mang thuốc kỵ nước tương tự như nanogel Hep-

P123.

Giá trị CMC của copolymer ghép Fud-P123 đo được ở hình 3.28 cũng lớn

hơn so với giá trị CMC của P123 tinh khiết là 0,0028 %wt. Kết quả này chỉ ra rằng

fucoidan khi được ghép vào P123 sẽ làm tăng phần ưa nước của polymer dẫn đến làm

tăng giá trị CMC của dung dịch mẫu.

3.4.1.5. Kết quả phân tích TEM và DLS của Fud-P123

Hình thái và sự phân bố kích thước của nanogel Fud-P123 có thể được quan

sát thấy rõ bởi kính hiển vi điện tử truyền qua TEM và phương pháp đo phân tán động

học bằng laser DLS.

Hình 3.29. Kết quả TEM và DLS của Fud-P123

Hình thái và kích thước của mẫu nanogel được quan sát bởi TEM và DLS ở

hình 3.29 cho thấy các hạt có dạng hình cầu với đường kính sắp xếp trong khoảng

40-61 nm theo TEM và sự phân bố kích thước hạt trung bình 62,96 nm đo bằng DLS

ở 25oC. Kết quả này cho thấy kích thước hạt nanogel Fud-P123 lớn hơn so với kích

thước của micelle pluronic P123 tinh khiết (5-10 nm), chỉ ra rằng khi các chân P123

được ghép vào fucoidan, ở nồng độ CMC các copolymer tự lắp ráp để hình thành

nanogel. Ngoài ra, một phần là do pluronic P123 có sự tích điện âm nhẹ, trong cấu

100

trúc của nanogel Fud-P123 với sườn fucoidan có chứa số lượng các nhóm anion

sulfate âm điện cao (-77 mV) [55], vì vậy có thể tạo ra lực tương tác đẩy giữa các

nhóm tích điện âm, dẫn đến vùng cấu trúc không gian bên trong mạng lưới nanogel

lớn hơn, dẫn đến kích thước hạt lớn hơn so với micelle P123.

3.4.2. Kết quả tổng hợp nanogel Fud-P123 mang thuốc cisplatin và cisplatin

hydrate

3.4.2.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH

Copolymer Fud-P123 mang cisplatin và cisplatin hydrate thông qua tương tác

kỵ nước và sự hình thành phức giữa cisplatin hydrate và các nhóm carboxylate/sulfate

có trên sườn fucoidan. Trong dung dịch nước, hệ nano mang thuốc tự lắp ráp nhờ vào

tương tác kỵ nước để hình thành hệ nanogel mang thuốc.

Hình 3.30. Phổ FT-IR của Fud-P123, Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH

Trên phổ FT-IR của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH ở hình 3.30 ta thấy

xuất hiện đồng thời các dao động đặc trưng của cả fucoidan và P123 như: tín hiệu

peak 2972 cm-1-2887 cm-1 là dao động hóa trị -CH của nhóm -CH2 và -CH3 trên

pluronic P123; peak 1108 cm-1 là dao động hóa trị đối xứng C-O-C trên pluronic

101

P123; peak 3425 cm-1 là dao động hóa trị -OH trên phân tử fucoidan; peak 1253 cm-

1 là dao động hóa trị đối xứng O=S=O của nhóm sulfate trên fucoidan [104, 107].

Tín hiệu peak 3288 cm-1 và 3281 cm-1 ở vị trí A là dao động hóa trị liên kết N-

H của nhóm amine –NH2 trên phân tử cisplatin. Trong phổ đồ của Fud-P123-CisOH

ở hình 3.30 ta thấy 2 dải hấp thụ tại nối –COO (B) và –SO2-O (C) có sự dịch chuyển

dao động về vùng 1637 cm-1 và 1295 cm-1, kết quả này là do có sự hình thành phức

giữa phần platinum hydroxide của CisOH với các nhóm carboxylate và sulfate của

Fud-P123. Qua phổ FT-IR ở hình 3.30 chứng minh hợp chất Fud-P123-Cis và Fud-

P123-CisOH đã tổng hợp thành công.

Dữ liệu phổ FT-IR của Fud-P123; Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH được

thống kê qua bảng 3.1.4

Bảng 3.14. Kết quả phổ FT-IR của Fud-P123; Fud-P123-Cis; Fud-P123-CisOH

Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1)

Fud-P123 Fud-P123-Cis Fud-P123-CisOH

a -OH 3425 3425 3425

b O=S=O (Fud) 1255 1253 1253

c -CH (-CH2 và -CH3) 2972-2887 2972-2887

d C-O-C (P123) 1108 1108

A -NH2 (Cis) 3288 3281

B -C=O (phức) 1637

C -SO2-O (phức) 1295

Qua bảng tổng kết dữ liệu phổ của các chất ở bảng 3.14, có sự lặp lại các tín

hiệu dao động đặc trưng trên phân tử fucoidan ở vị trí a, b và trên phân tử P123 ở vị

trí c, d luôn xuất hiện trong phân tử Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH sau khi tổng

hợp. Trong phổ đồ của Fud-P123-CisOH xuất hiện các dao động hấp thụ mới ở vị trí

A, B, C chứng tỏ có sự tạo phức của CisOH và nhóm carboxylate, sunfate trên

fucoidan. Trong khi phổ đồ của Fud-P123-Cis chỉ xuất hiện tín hiệu dao động tại vị

trí A. Qua phổ FT-IR chứng minh hợp chất Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH đã

tổng hợp thành công.

102

3.4.2.2. Kết quả phân tích ICP-OES của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH

Trong khảo sát thực nghiệm này, copolymer ghép Fud-P123 được sử dụng để

mang thuốc chống ung thư cisplatin và cisplatin hydrate. Phần trăm hàm lượng

cisplatin được mang vào trong hệ chất mang Fud-P123 được tính toán gián tiếp thông

qua phần trăm hàm lượng platinum (Pt) từ kết quả phân tích ICP-OES.

Kết quả phần trăm hàm lượng thuốc được mang vào trong các hệ chất mang

Fud-P123 được tính theo %Pt chỉ ra ở bảng 3.15.

Bảng 3.15. Hiệu quả mang thuốc Cis và CisOH của hệ nano Fud-P123

Tên Cis CisOH

% Pt (w/w) % Cis (w/w) % Pt (w/w) % Cis (w/w)

Fud-P123 (1:3) 5,63 8,66 14,30 22,00

Kết quả ở bảng 3.15 cho thấy phần trăm CisOH được mang vào nanogel Fud-

P123 cao hơn so với Cis, cụ thể: Fud-P123-Cis (8,66%) < Fud-P123-CisOH (22%).

Kết quả này cũng tương tự với kết quả mang thuốc của hệ chất mang Hep-P123. Hiệu

quả mang thuốc của hệ nanogel Fud-P123 sẽ phụ thuộc vào cấu trúc fucoidan và

lượng P123 được liên hợp.

3.4.3. Kết quả quả đánh giá khả năng nhả thuốc của Fud-P123

Từ kết quả khảo sát thực nghiệm khả năng mang thuốc của nanogel Fud-P123,

chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát khả năng nhả thuốc cisplatin hydrate của Fud-

P123. Kết quả khảo sát khả năng nhả thuốc chống ung thư cisplatin hydrate của Fud-

P123 được xác định bằng phương pháp đo ICP-OES.

Hình 3.31. Sự giải phóng CisOH từ nanogel Fud-P123 ở pH 5,5 và 7,4

103

Kết quả ở hình 3.31 cho thấy dưới 50% (v/v) CisOH được giải phóng sau 24

giờ trong cả 2 điều kiện pH. Trong đó sự giải phóng CisOH ở pH 5,5 (43,27 ± 2,1%)

thì cao hơn ở pH 7,4 (35,35 ± 2,3%) sau 24 giờ. Kết quả này chỉ ra rằng khi giá trị

pH của dung dịch đệm tăng lên, tốc độ giải phóng thuốc giảm, thuốc được giải phóng

nhanh trong môi trường acid.

Kết quả ở hình 3.31 còn cho thấy phần trăm CisOH cao nhất được giải phóng

từ nanogel Fud-P123 chỉ gần 43%, cho thấy sự giải phóng thuốc diễn ra không hoàn

toàn sau 24 giờ. Điều này có thể là do các nhóm anion trên sườn fucoidan sẽ tạo thành

các phức liên kết mạnh với cisplatin, mặt khác trong cấu trúc của fucoidan có chứa

nhiều nhóm -CH3, góp phần làm tăng tương tác kỵ nước giúp cho mạng lưới hệ chất

mang chặt chẽ hơn nên giữ chặt được thuốc hơn và kết quả làm cho tốc độ nhả

platinum chậm hơn.

3.4.4. Kết quả độc tính tế bào (trên dòng tế bào MCF-7 và nguyên bào sợi)

Tính tương hợp sinh học của hệ chất mang nano Fud-P123 được đánh giá trên

cơ sở thử nghiệm hoạt tính gây độc trên nguyên bào sợi và độc tính tế bào trên dòng

tế bào MCF-7 của chất mang Fud-P123 mang cisplatin và cisplatin hydrate.

Kết quả khảo sát tính tương hợp sinh học trên cơ sở độc tính tế bào của chất

mang Fud-P123 bằng phương pháp nhuộm SRB trên nguyên bào sợi ở bảng 3.16 cho

thấy ở nồng độ 100 µg/mL, sau 48 giờ có tỉ lệ sống của tế bào trên 80%. Dựa trên

tiêu chuẩn ISO 10993-5, 1999 (vật liệu không độc đối với tế bào khi tại các nồng độ

pha loãng dung dịch chiết mẫu tỉ lệ tế bào sống đều cao hơn 70%), cho thấy chất

mang Fud-P123 có tính tương hợp sinh học và không độc đối với tế bào.

Bảng 3.16. Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%)

Mẫu Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Fud-P123 17,02 17,48 17,25 17,25 ± 0,02

Kết quả độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 của hệ chất mang thuốc

Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH được thực hiện bằng phương pháp nhuộm SRB ở

hình 3.32. Kết quả sau 48 giờ cho thấy nanogel Fud-P123 mang thuốc thể hiện khả

năng ức chế dòng tế bào ung thư vú người MCF-7, tại nồng độ 50 μg/ml hệ chất mang

Fud-P123 mang cisplatin hydrate (Fud-P123-CisOH) có phần trăm gây độc tế bào là

104

73,28±3,36% cao hơn so với Hep-P123 mang cisplatin (Fud-P123-Cis) là

60,86±3,01%. Kết quả trên chỉ ra rằng khi sử dụng cisplatin dưới dạng hydrate có thể

giúp tăng hiệu quả mang thuốc của hệ nano Fud-P123, từ đó làm tăng đáng kể khả

năng gây độc tế bào MCF-7 của hệ nanogel mang thuốc. Kết quả này phù hợp với giá

trị IC50 đo được của Fud-P123-Cis là 20,51 ± 1,63 µg/mL thì nhỏ hơn so với Fud-

P123-Cis là 30,28 ± 1,03 µg/mL.

Hình 3.32. Độc tính tế bào MCF-7 của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH

3.5. So sánh kết quả phân tích của nanogel Hep-P123 và Fud-P123 mang

cisplatin và cisplatin hydrate

Các nanogel Hep-P123 và Fud-P123 ở tỉ lệ ghép 1:3 sau khi được tổng hợp và

xác định thành phần, cấu trúc sẽ được dùng để đánh giá hiệu quả mang thuốc cisplatin

và cisplatin hydrate.

Kết quả so sánh đặc tính cấu trúc, độc tính tế bào, hiệu quả mang thuốc và

phần trăm thuốc được giải phóng của các hệ nanogel được trình bày trong bảng 3.17.

105

Bảng 3.17. Kết quả phân tích hệ nanogel Hep-P123 và Fud-P123 mang thuốc

Nanogel Kết quả TEM

CMC

(%wt)

Tính

tương

hợp

sinh

học

% thuốc

được mang

% CisOH giải

phóng sau 24

giờ

Tên Hình

thái

Kích

thước

(nm)

Cis CisOH pH 5,5 pH 7,4

Hep-P123

(1:3)

Hình

cầu 45-81 0,041

Tương

hợp

sinh

học

8,92 30,30 74,93 65,87

Fud-P123

(1:3)

Hình

cầu 40-61 0,025

Tương

hợp

sinh

học

8,66 22,00 43,27 35,35

Kết quả phân tích hình thái, kích thước của các nanogel Hep-P123 và Fud-

P123 ở cùng tỉ lệ ghép 1:3 cho thấy các nanogel có dạng hình cầu, với kích thước hạt

trung bình từ 40-81 nm. Điều này chỉ ra rằng các nanogel có thể đáp ứng được không

gian bên trong cấu trúc vật liệu đủ lớn để có thể mang hiệu quả các thuốc kỵ nước.

Với kích thước này các hệ nano mang thuốc có thể dể dàng thâm nhập vào các mô tế

bào ung thư bằng phương pháp phân phối thuốc thụ động thông qua hiện tượng tăng

tính thấm và tăng hiệu quả lưu giữ đặc trưng ở các mô ung thư.

Các copolymer Hep-P123 và Fud-P123 có thể tự lắp ráp để hình thành nanogel

trong dung dịch nước thông qua giá trị CMC đo được. Kết quả CMC của Fud-P123

nhỏ hơn so với Hep-P123 ở cùng tỉ lệ ghép, có thể là do trong cấu trúc của fucoidan

có chứa nhiều nhóm -CH3, góp phần làm tăng tương tác kỵ nước trong mạng lưới cấu

trúc của nanogel, dẫn đến giá trị CMC giảm.

Kết quả khảo sát tính tương hợp sinh học trên cơ sở độc tính tế bào của chất

mang Hep-P123 và Fud-P123 bằng phương pháp nhuộm SRB trên nguyên bào sợi, ở

106

nồng độ 100 µg/mL, sau 48 giờ cho thấy cả 2 hệ nanogel đều có tính tương hợp sinh

học, không gây độc cho tế bào.

Kết quả mang cisplatin của 2 hệ chất mang Hep-P123 và Fud-P123 là gần bằng

nhau, cụ thể: Fud-P123-Cis (8,66%) và Hep-P123-Cis (8,92%). Tuy nhiên, hiệu quả

mang CisOH của hệ chất mang Hep-P123 (30,3%) cao hơn nhiều so với hệ chất mang

Fud-P123 (22%). Kết quả này có thể chỉ ra rằng trong cấu trúc phân tử của fucoidan

chứa ít các nhóm anion hơn heparin, dẫn đến sự hình thành phức thấp hơn. Kết quả

này phù hợp với các nghiên cứu trước, số lượng các nhóm anion càng lớn sẽ làm gia

tăng hiệu suất mang platinum của hệ chất mang nano [50, 83, 116].

Kết quả khả năng nhả thuốc của hệ Hep-P123-CisOH và Fud-P123-CisOH

đều phụ thuộc pH, khi giá trị pH của dung dịch đệm tăng lên, tốc độ giải phóng thuốc

giảm, thuốc được giải phóng nhanh trong môi trường acid. Đồng thời, cả 2 hệ nanogel

mang thuốc còn cho thấy sự giải phóng thuốc diễn ra không hoàn toàn sau 24 giờ.

Phần trăm CisOH được giải phóng ra ở pH 5,5 từ nanogel Hep-P123 là gần 75%,

trong khi đó nanogel Fud-P123 giải phóng thuốc chậm hơn sau 24 giờ chỉ giải phóng

được khoảng 43%.

Độc tính tế bào trên dòng tế bào MCF-7 của Hep-P123-CisOH và Fud-P123-

CisOH cũng được đánh giá thông qua giá trị IC50. Kết quả IC50 của nanogel Hep-

P123-CisOH đo được là 8,48 ± 0,69 µg/mL thấp hơn nhiều so với nanogel Fud-P123-

CisOH là 20,51 ± 1,63 µg/mL. Cho thấy khả năng gây độc tế bào của Hep-P123-

CisOH cao hơn so với Fud-P123-CisOH. Kết quả này phù hợp với hiệu quả mang

thuốc CisOH và khả năng nhả thuốc của hệ Hep-P123 và Fud-P123 tính toán được.

3.6. Kết quả tổng hợp và đánh giá nanogel Hep-F127 mang thuốc cisplatin

hydrate kết hợp nanocurcumin (Hep-F127-CisOH-Cur) lên chuột mang khối u

Từ kết quả mang thuốc của các nanogel Hep-P123, Hep-F127, Hep-F87 và

Hep-F68, Fud-P123 với các tỉ lệ ghép khác nhau, cho thấy tỉ lệ ghép 1:3 mang thuốc

CisOH cao, cụ thể Hep-P123-CisOH (1:3) (30,3%) > Hep-F127-CisOH (1:3)

(26,92%) > Hep-F87-CisOH (1:3) (26,15%) > Hep-F68-CisOH (1:3) (25,07%) >

Fud-P123-CisOH (1:3) (22,00%), trong đó hệ nanogel Hep-P123-CisOH (1:3) mang

thuốc tốt nhất (30,3%). Tuy nhiên theo danh sách các poloxamer được báo báo bởi

FDA thì pluronic P123 chưa được công bố cho phép sử dụng trong lâm sàng, trong

107

khi đó pluronic F127 đã được FDA công bố mức độ an toàn khi sử dụng trong dược

phẩm, y tế và được sử dụng để kết hợp với các polymer ứng dụng làm hệ chất mang

thuốc trong nhiều báo cáo [152-157]. Theo nghiên cứu của Abhishek Sahu và cộng

sự, còn cho thấy pluronic F127 có hiệu quả đóng gói curcumin cao hơn so với pluronic

F68 [158]. Từ các cơ sở trên chúng tôi chọn hệ nanogel Hep-F127 (1:3) để mang

thuốc kết hợp cisplatin hydrate và curcumin ứng dụng điều trị trên mô hình chuột

mang khối u ghép dị loài.

Thành phần, cấu trúc, hình thái của hệ nanogel mang thuốc Hep-F127-CisOH-

Cur được khẳng định nhờ vào quang phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR và TEM.

3.6.1. Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F127-CisOH-Cur

Trong thực nghiệm này nanocurcumin được phân tán trong copolymer Hep-

F127 thông qua các tương tác kỵ nước tại các phân đoạn PPO của F127. Sau đó hệ

nano Hep-F127-Cur sẽ được tiếp tục gắn CisOH thông qua sự tạo phức giữa CisOH

và các nhóm carboxylate/sulfate trên heparin. Kết quả tổng hợp Hep-F127-CisOH-

Cur được xác định thông qua phổ FT-IR.

Hình 3.33. Phổ FT-IR của Hep-F127, Hep-F127-CisOH, Hep-F127-CisOH-Cur

108

Trên phổ FT-IR của Hep-F127-Cis và Hep-F127-CisOH-Cur (hình 3.33) ta

thấy xuất hiện đồng thời các dao động đặc trưng của cả heparin và F127 như: tín hiệu

peak 2972 cm-1 và 2887 cm-1 là dao động hóa trị -CH của nhóm -CH2 và -CH3 trên

pluronic F127; peak 3435 cm-1 là dao động hóa trị -OH trên phân tử heparin [31, 50,

84-85]. Tín hiệu peak 3286 cm-1 là dao động hóa trị N-H của nhóm amine -NH2 trên

phân tử cisplatin.

Trên quang phổ Hep-F127-CisOH ta thấy 2 dải hấp thụ tại nối -COO và SO2-

O- có sự dịch chuyển dao động từ vùng 1632 cm-1 về vùng 1592 cm-1 và 1241 cm-1

về vùng 1253 cm-1, do sự hình thành liên kết giữa platinum hydroxide của CisOH với

các nhóm carboxylate/sulfate của Hep-F127. Mặt khác, trong quang phổ FT-IR của

Hep-F127-CisOH-Cur có thể thấy một số đỉnh hấp thụ của curcumin ban đầu ở

khoảng 1628 cm-1 (C=C vòng thơm) và 1509 cm-1 (C=O và C=C) [139], phổ đồ của

Hep-F127-CisOH-Cur chứa đầy đủ các tín hiệu dao động hấp thụ của cả Hep-F127-

CisOH và curcumin. Điều này chứng tỏ rằng curcumin đã được đóng gói và giữ lại

cấu trúc của nó trong hệ chất mang nano Hep-F127-CisOH.

3.6.2. Kết quả phân tích TEM của Hep-F127-CisOH-Cur

Hình 3.34. Kết quả đo TEM của Hep-F127 (a) và Hep-F127-CisOH-Cur (b)

Hình thái và kích thước của nanogel Hep-F127-CisOH-Cur được đánh giá

thông qua kết quả hình ảnh đo TEM ở hình 3.34, trong đó nanogel Hep-F127 có dạng

hình cầu với kích thước từ 130 - 170 nm (a). Khi curcumin được đóng gói trong phức

hợp nanogel Hep-F127-CisOH sẽ có dạng core-shell với kích thước nano thông qua

tương tác kỵ nước và tương tác tĩnh điện giữa curcumin và hệ chất mang. Một số báo

cáo trước đây cũng cho thấy việc sử dụng hệ dung môi (ethanol và dichloromethane)

109

có thể chế tạo các hạt curcumin phân tán trong dung dịch copolymer chitosan lưỡng

tính được sử dụng cho một số ứng dụng y sinh [159-160].

3.6.3. Kết quả phân tích ICP-OES và UV-Vis của Hep-F127-CisOH-Cur

Kết quả mang thuốc cisplatin hydrate và curcumin được xác định bằng phương

pháp đo ICP-OES và UV-Vis.

Kết quả hàm lượng thuốc CisOH (%wt/wt) được mang vào hệ chất mang Hep-

F127 được tính theo phần trăm khối lượng Platinum (Pt) từ kết quả phân tích ICP-

OES.

Lượng curcumin được mang trong chất mang nano được xác định bằng

phương pháp đo UV-Vis với số sóng hấp thụ lớn nhất ở 420 nm. Đường chuẩn

curcumin được xây dựng từ các dung dịch curcumin trong ethanol : DI có nồng độ

lần lượt là 0; 0,5; 1; 1,5; 3; 5 μg/mL. Đồ thị biểu diễn tỉ lệ giữa nồng độ curcumin và

độ hấp thụ sẽ cho kết quả là một phương trình đường thẳng dạng y = ax + b, trong đó

y là độ hấp thụ còn x là nồng độ.

Từ đường chuẩn xây dựng được, ta có thể tính được lượng curcumin đã được

mang vào bên trong nanogel thông qua cường độ hấp thụ đo được.

Sau đó, hàm lượng CisOH và curcumin được mang trong chất mang nano

Hep-F127 (%EE và %DL) được tính theo công thức [161]:

%EE = Khối lượng thuốc được mang vào hệ nano

Khối lượng thuốc ban đầu ×100%

%DL = Khối lượng thuốc được mang vào hệ nano

Khối lượng thuốc ban đầu + khối lượng copolymer ×100%

Ta thu được kết quả như sau:

Tên mẫu %DL %EE

CisOH Curcumin CisOH Curcumin

Hep-F127-CisOH-Cur 26,7 4,6 42,5 70

3.6.4. Kết quả khảo sát khả năng nhả thuốc của Hep-F127-CisOH-Cur

Hàm lượng thuốc CisOH và curcumin được giải phóng từ phức hợp Hep-F127-

CisOH-Cur được xác định bằng phương pháp ICP-OES và UV-Vis.

110

Hình 3.35. Kết quả nhả thuốc CisOH và Cur của Hep-F127-CisOH-Cur

Kết quả ở hình 3.35 cho thấy CisOH và Cur được giải phóng ở điều kiện pH

5,5 với tốc độ nhanh hơn so với ở điều kiện pH 7,4. Trong đó, hơn 60% CisOH và

curcumin được giải phóng ở pH 7,4 và khoảng 80% ở pH 5,5 sau 96 giờ. Ngoài ra,

sự giải phóng CisOH từ phức hợp nano Hep-F127-CisOH-Cur sau 96 giờ cao hơn 3

lần so với sự giải phóng thuốc trong 1 giờ đầu. Điều này cho thấy phức hợp giữa

CisOH và các nhóm anion trong Hep-F127 thì không bền ở pH 5,5 và sẽ bị thủy phân

nhanh hơn trong môi trường acid. Sự giải phóng platinum diễn ra không hoàn toàn

có thể là do có sự liên hợp giữa CisOH với các nhóm amine/amide trong chuỗi

polysaccharide heparin.

Hơn nữa kết quả khảo sát sự giải phóng CisOH từ mẫu dung dịch CisOH đối

chứng cũng cho thấy khoảng 90% CisOH đã được giải phóng sau 3 giờ, sự khác biệt

này rõ ràng cho thấy tầm quan trọng của CisOH và Cur khi được đóng gói vào trong

phức hợp nanogel Hep-F127 trong việc làm giảm độc tính của thuốc nhờ vào sự nhả

chậm của thuốc từ hệ chất mang nanogel.

3.6.5. Kết quả độc tế bào trên dòng tế bào MCF-7 của Hep-F127 và Hep-F127-

CisOH-Cur bằng phương pháp nhuộm SRB

Kết quả khảo sát độc tính tế bào trên dòng tế bào MCF-7 của nanogel Hep-

F127 bằng phương pháp nhuộm SRB ở bảng 3.18 cho thấy ở nồng độ 100 µg/mL

nanogel Hep-F127 không có khả năng gây độc tế bào MCF-7.

Thời gian (giờ)

Ph

ần

trăm

giả

i p

hó

ng

th

uố

c %

)

111

Bảng 3.18. Phần trăm ức chế MCF-7 của nanogel Hep-F127

Mẫu Nồng độ

(µg/mL)

Phần trăm ức chế

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Hep-F127

200 -2,05 -8,69 -4,43 -5,06 ± 3,37

100 0,29 -3,71 -4,12 -2,51 ± 2,44

50 4,00 0,87 -0,80 1,36 ± 2,43

Hình 3.36 cho kết quả kiểm tra độc tính tế bào trên dòng tế bào MCF-7 của Hep-

F127-Cur, Hep-F127-CisOH và Hep-F127-CisOH-Cur bằng phương pháp nhuộm

SRB.

Hình 3.36. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của Hep-F127-CisOH, Hep-F127-Cur và

Hep-F127-CisOH-Cur

Kết quả ở hình 3.36 cho thấy hệ nanogel Hep-F127-Cur ở nồng độ 100 ppm

ức chế sự phát triển của tế bào ung thư MCF-7 khoảng 63,10 ± 1,91%, trong khi đó

kết quả ức chế sự phát triển tế bào đối với hệ nanogel Hep-F127-CisOH và Hep-

F127-CisOH-Cur là 88,57 ± 1,38% và 95,32 ± 2,57% lớn hơn nhiều so với Hep-F127-

Cur.

Mặt khác, khi có sự kết hợp nanocurcumin trong hệ nanogel Hep-F127-CisOH

giúp làm tăng đáng kể hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú MCF-7 ở

nồng độ trên 20 ppm, cụ thể ở 25 ppm Hep-F127-CisOH-Cur ức chế 69,37 ± 1,55%

sự phát triển của tế bào. Kết quả này chứng minh sự kết hợp thuốc kép có thể tạo ra

hiệu quả cộng hợp chống lại sự phát triển của tế bào ung thư vú MCF-7 trong hệ dẫn

112

truyền thuốc. Cisplatin là một trong những thuốc hóa trị liệu ung thư hiệu quả nhất,

cisplatin tác dụng bằng cách liên kết ngang với ADN và ức chế tổng hợp ADN, tuy

nhiên thời gian điều trị lâu dài gây ra khả năng kháng thuốc. Curcumin là một chất

chống oxy hóa có nhiều hoạt tính sinh học như chống viêm và chống khối u, tăng sức

đề kháng cho cơ thể. Một số nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng sự kết hợp của

curcumin với thuốc chống ung thư có thể tăng cường hiệu quả trị liệu. Hơn nữa, chất

curcumin được chuyển hóa nhanh chóng trong điều kiện sinh lý, do đó, việc đóng gói

curcumin trong các hạt nano có thể góp phần giữ lại hoạt tính sinh học của nó.

Nhiều nghiên cứu lâm sàng đã cho thấy cisplatin có hiệu quả tiêu diệt tế bào

ung thư cao tuy nhiên nó cũng gây độc với cả tế bào lành. Kết quả thử nghiệm cho

thấy độc tính tế bào MCF-7 của cisplatin rất cao với IC50 = 0,54 ± 0,02 µg/mL, đây

là lý do dẫn đến các tác dụng phụ khi dùng thuốc hóa trị. Khi thuốc được mang trong

hệ nanogel dưới dạng tạo phức với cisplatin hydrate, quá trình thủy phân phức trong

nanogel dẫn đến nhả chậm cisplatin hydrate giúp làm giảm độc tính của thuốc và có

thể tạo sinh khả dụng kéo dài. Kết quả nghiên cứu cho thấy cisplatin và hoạt chất

curcumin có thể nhả chậm ra môi trường trong thời gian khảo sát (hình 3.35).

3.6.6. Kết quả thử nghiệm nanogel Hep-F127-CisOH-Cur lên mô hình chuột

mang khối u

3.6.6.1. Kết quả tạo mô hình chuột mang khối u

Sau quy trình gây suy giảm miễn dịch, chuột được tiến hành ghép tế bào MCF-

7 có nguồn gốc từ người bằng cách tiêm 107 tế bào/con vào vị trí dưới da, tại vùng

lưng chuột và tiếp tục theo dõi sự phát triển khối u trong 14 ngày cho đến khi kích

thước khối u đã gia tăng ổn định, kết quả được đánh giá qua hình 3.37.

Hình 3.37. Chuột mang khối u

113

Hình ảnh cho tại vị trí ghép hiện diện khối u rắn, cứng, gồ trên lưng chuột,

hình dạng to, tròn có dạng khối cầu ổn định. Sau quá trình gây tạo khối u, tiến hành

chọn những con chuột có thể tích khối u lớn hơn 50 mm3, khối u rõ, ổn định, dễ đo

kích thước và quan sát bằng mắt. Hiệu quả tạo mô hình chuột mang khối u được đánh

giá dựa trên sự xuất hiện khối u cứng, nhô lên khỏi bề mặt da lưng tại vị trí ghép tế

bào MCF-7. Xét về thể trạng, tất cả chuột có hiện tượng xù lông, sụt cân nhẹ trong 5

ngày đầu nhưng sau đó cân nặng tăng trở lại và ổn định cho đến giai đoạn tiêm thuốc.

Khối u tạo thành được đánh giá mô học để xác định khối u tạo thành từ tế bào ung

thư MCF-7.

Sự tăng sinh tế bào ung thư MCF-7 bên trong chuột được xác nhận bằng

phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch superoxide effutase 2 (SOD2) cho kết quả ở

hình 3.38, trong đó nhân tế bào ung thư được thể hiện bằng màu tím nhạt.

Hình 3.38. Hình thái tế bào trong mô khối u cắt lát được nhuộm hóa mô miễn dịch

bằng kháng thể SOD2

A: hình thái tổng thể khối u; B: ổ tế bào ung thư khối u; C: Ổ tế bào ung thư (từ thư

viện The Human Protein Atlas)

Ở hình 3.38 khi so sánh cấu trúc mô học của khối u thu nhận được từ mô hình

chuột mang khối u (A và B) với mẫu nhuộm của khối u gồm các tế bào ung thư vú từ

người (C) tại thư viện The Human Protein Atlas, cho thấy kết quả tương đương nhau,

trong đó tế bào chất đậm đặc (màu nâu) và các nhân tế bào có màu tím. Qua đó cho

thấy, mô hình khối u gây tạo có thành phần chiếm đa số là các tế bào ung thư có

nguồn gốc từ người.

3.6.6.2. Kết quả đánh giá kích thước khối u chuột trong thời gian điều trị

Sau kết quả tạo mô hình chuột mang khối u thành công, chuột ở 5 nghiệm thức

NaCl (0,9%), Hep-F127, cisplatin đối chứng, Hep-F127-CisOH và Hep-F127-

114

CisOH-Cur sẽ được tiêm thuốc qua đường tĩnh mạch đuôi. Chuột sẽ được theo dõi

cân nặng và sự thay đổi thể tích khối u hàng ngày.

Khối lượng của các đối tượng chuột ban đầu (trước khi có các thử nghiệm về

thuốc điều trị) được chọn lọc cùng nằm trong khoảng 30 g trên mỗi cá thể để đảm

bảo sự tương quan về khối lượng giữa các nghiệm thức thử thuốc và đối chứng. Kết

quả sự thay đổi khối lượng của chuột ở 5 nghiệm thức được thể hiện ở hình 3.39.

Hình 3.39. Khối lượng chuột theo quá trình thử nghiệm

Kết quả ở hình 3.39 cho thấy sau thời gian 14 ngày thử nghiệm, chuột ở hai

nghiệm thức đối chứng NaCl 0,9% và Hep-F127 có sự ổn định về cân nặng và có sự

tăng nhẹ về khối lượng, trong khi ở 3 nghiệm thức có chứa cisplatin còn lại chuột đều

bị giảm cân nặng còn từ 18-22 gtrên một cá thể. Đáng chú ý là ở nhóm điều trị bằng

cisplatin có sự khác biệt đáng kể về việc giảm khối lượng cơ thể chuột vào ngày thứ

10 (m = 21,94 ± 4,08 mg) và chuột ở nghiệm thức này bị chết 3/5 con. Kết quả quan

sát hình thái cho thấy chuột bị sưng viêm nặng và bắt đầu bị hoại tử ở vùng đuôi (khu

vực tiêm thuốc). Điều này có thể do thuốc cisplatin có độc tính cao gây tác động mạnh

lên hệ miễn dịch của chuột làm giảm sức đề kháng dẫn đến chuột chết.

Kết quả đánh giá sự thay đổi thể tích khối u của chuột sau 14 ngày điều trị thể

hiện ở hình 3.40.

115

Hình 3.40. Sự thay đổi thể tích khối u theo thời gian

Trong hình 3.40 có sự ức chế đáng kể sự tăng trưởng thể tích khối u chuột ở

các nghiệm thức cisplatin, Hep-F127-CisOH và Hep-F127-CisOH-Cur. Ngược lại, ở

2 nghiệm thức NaCl 0,9% và Hep-F127 có sự tăng dần thể tích khối u qua các ngày

khoảng 52,12 ± 4,27 % và 65,78 ± 3,91 %, tương ứng ở ngày thứ 14. Điều này cho

thấy chất mang Hep-F127 không có tác dụng trong việc điều trị.

- Đối với nghiệm thức sử dụng cisplatin ta thấy thể tích khối u chuột giảm

đáng kể, tuy nhiên đến ngày thử nghiệm thứ 10 có 3/5 chuột bị chết. Ở thời điểm trên,

thể tích khối u giảm được 67,64 ± 4,74%.

- Đối với nghiệm thức nanogel Hep-F127-CisOH, thể tích khối u giảm 64,09

± 4,5% sau 14 ngày điều trị. Chuột cũng bị viêm sưng đuôi ở vùng tiêm nhưng không

xuất hiện dấu hiệu hoại tử.

- Với nghiệm thức nanogel Hep-F127-CisOH-Cur, thể tích khối u chuột giảm

nhiều hơn so với 2 nhóm nghiệm thức cisplatin và Hep-F127-CisOH, đạt gần 80%

(78,51 ± 13,6%) sau 14 ngày thử nghiệm và các chuột không xuất hiện sưng viêm ở

vùng đuôi tiêm thuốc.

So sánh các kết quả ở 5 nghiệm thức thử nghiệm cho thấy, nghiệm thức Hep-

F127-CisOH-Cur cho hiệu quả giảm thể tích khối u tốt nhất. Khi kết hợp

nanocurcumin trong hệ phức Hep-F127-CisOH cho kết quả giảm thể tích khối u tốt

hơn so với chất mang Hep-F127-CisOH là 14,42%, đồng thời có thể góp phần đáng

kể vào giảm tác dụng phụ của thuốc, chuột không bị viêm tại vùng tiêm và chết sau

10 ngày tiêm so với cisplatin. Kết quả này cũng phù hợp với quá trình thay đổi khối

116

lượng chuột diễn tiến trong thời gian thử nghiệm. Khối lượng chuột suy giảm nhiều

trong mô hình thử thuốc cisplatin và hệ phức nanogel Hep-F127-CisOH so với mô

hình nanogel Hep-F127-CisOH-Cur. Nhìn chung, curcumin góp phần trong việc ức

chế sự phát triển của tế bào ung thư, việc bổ sung thêm nanocurrcumin góp phần lớn

trong nâng cao dược động học của cisplatin, tạo nên hệ mang thuốc có ưu điểm làm

giảm thể tích khối u so với chỉ sử dụng cisplatin đơn thuần hoặc chất mang Hep-F127

mang cisplatin.

So với các nghiên cứu trước đây, năm 2016 Haiyang Yu cùng cộng sự đã báo

cáo hệ mang thuốc poly(L-glutamic acid)-graft-methoxy poly(ethylene glycol) (PLG-

g-mPEG) chứa cisplatin 4mg/kg và thử nghiệm trên chuột bị ức chế miễn dịch mang

tế bào ung thư MCF-7. Kết quả thu nhận được hệ mang thuốc Cisplatin/PLG-g-mPEG

làm giảm thể tích khối u là 46,9% sau 16 ngày điều trị [162]. Năm 2014, Mingqiang

Li cùng cộng sự cũng đã báo cáo hệ mang thuốc gồm hormone LHRH (luteinizing

hormone-releasing hormone) và dextran–succinic acid (Dex–SA) kết hợp với

cisplatin 4 mg/kg. Kết quả cho thấy hệ mang thuốc Dex-SA-LHRH-Cisplatin giúp

giảm thể tích khối u sau 16 ngày điều trị khoảng 50% so với đối chứng [163]. Thông

qua các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy hệ chất mang Hep-F127 kết hợp với

1 thuốc cisplatin và thuốc cisplatin kết hợp nanocurcumin (cisplatin hydrate-

nanocurcumin) đều mang lại hiệu quả cao trong việc làm giảm thể tích khối u, vượt

hơn các nghiên cứu trước khoảng 28,5%.

3.6.6.3. Kết quả nhuộm mô khối u đánh giá hiệu quả điều trị

Các nguyên bào sợi bình thường nằm ở gần lớp tế bào ung thư của nhiều khối

u rắn như ung thư vú, đại tràng và u ác tính được kích thích để trở thành nguyên bào

sợi ung thư. Nguyên bào sợi ung thư là loại tế bào phổ biến nhất trong cấu trúc khối

u của nhiều loại ung thư và có vai trò quan trọng, chúng thúc đẩy sự phát triển khối

u thông qua sự kích thích trực tiếp các yếu tố tăng trưởng tế bào và các cytokine. Bên

cạnh đó, các nguyên bào sợi ung thư cũng góp phần vào sự hình thành mạch, giúp

khối u phát triển và tiếp tục xâm lấn [164]. Theo Ming-Qing Gao cùng cộng sự, vùng

trung gian trong khối u ung thư có tốc độ phát triển nhanh có vai trò quan trọng trong

việc giúp thúc đẩy sự di cư và sự tăng kích thước của của khối u [165]. Vì thế, mục

tiêu đầu tiên của các thuốc hóa trị liệu là dần làm mỏng, phá hủy và dẫn đến loại bỏ

117

hoàn toàn các lớp nguyên bào sợi trưởng thành và chưa trưởng thành, sau đó tiếp tục

nhắm đến việc tiêu diệt các tế bào ung thư. Bằng cách liên kết và làm biến tính ADN,

các phân tử thuốc ngăn chặn khả năng phiên mã, dịch mã và dẫn đến hiện tượng tự

chết (apoptosis) của các tế bào nguyên bào sợi và tế bào ung thư.

Phương pháp nhuộm H&E giúp quan sát cấu trúc các mẫu mô khối u đã thu

nhận để đánh giá hiệu quả điều trị ức chế khối u của các thuốc thử nghiệm. Kết quả

nhuộm H&E của các mẫu mô trong thử nghiệm được thể hiện ở hình 3.41.

Hình 3.41. Kết quả phân tích mô học H&E mô các khối u sau thời gian điều trị:

Hep-F127 (a), NaCl (b), nanogel Hep-F127-CisOH (c) và Hep-F127-CisOH-Cur (d)

Ở hình 3.41 kết quả phân tích mô học trong 2 mô hình đối chứng Hep-F127

(a) và NaCl (b) cho thấy mật độ tế bào ung thư rất cao sau 14 ngày thử nghiệm. Khối

u phát triển bình thường và đã hình thành đầy đủ các lớp tế bào chính như cấu trúc

mô ung thư vú điển hình gồm: vùng bình thường ở ngoài cùng có nhiều tế bào nguyên

bào sợi trưởng thành kéo dài, mật độ tế bào thấp nên có màu hồng nhạt, sáng màu.

Tiếp đến là vùng trung gian cũng gồm nhiều nguyên bào sợi đang phát triển, mật độ

tế bào dày hơn lớp ngoài, màu hồng đậm. Trong cùng là vùng tế bào bắt màu rất đậm,

có màu xanh đen của nhân tế bào đã bắt màu hematoxylin, mật độ tế bào dày đặc tạo

thành khối đậm màu. Như vậy, kết quả từ cả hai nghiệm thức cho thấy khối u tăng

trưởng và phát triển bình thường khi không có thuốc điều trị.

118

Nghiệm thức điều trị tiêm cisplatin đã dừng lại sau 10 ngày do có nhiều chuột

chết, do đó mật độ tế bào ung thư không được đánh giá mô học.

Nghiệm thức điều trị Hep-F127-CisOH (c) cho thấy mật độ tế bào ung thư

MCF-7 giảm sau 14 ngày. Đối với nghiệm thức sử dụng thuốc kết hợp Hep-F127-

CisOH-Cur (d), các đặc điểm chung của cấu trúc mô cho thấy tỷ lệ tế bào ung thư

hiện diện rất nhỏ, không còn tồn tại vùng nguyên bào sợi trưởng thành và vùng

nguyên bào sợi chưa trưởng thành, bên cạnh đó chất nền xung quanh tế bào ung thư

cũng có hiện tượng phân rã. Ngoài ra, tại các vị trí tiêm của chuột được điều trị bằng

nghiệm thức sử dụng thuốc kép đã không thấy hoại tử sau 14 ngày. Kết quả này chỉ

ra rằng sự kết hợp của nanocurcumin trong phức hợp nano Hep-F127-CisOH đã giảm

thiểu độc tính toàn thân so với cisplatin tự do và tăng cường hiệu quả tiêu diệt tế bào

ung thư MCF-7 trong các mô hình chuột mang khối u ghép dị loài từ người.

Từ việc quan sát hình thái tế bào trong các mô khối u cho thấy Hep-F127-

CisOH có hiệu quả trong việc làm giảm thể tích khối u và tiêu diệt một phần các tế

bào ung thư. Nhưng đối với nghiệm thức gồm chất mang Hep-F127 chứa CisOH có

kết hợp thêm nanocurcumin cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc làm giảm thể tích khối

u và tiêu diệt gần như hoàn toàn các tế bào ung thư so với nghiệm thức điều trị 1

thuốc. Điều này cho thấy hiệu quả cộng gộp của hệ chất mang thuốc kết hợp. Chất

mang Hep-F127 giúp thuốc được nhả chậm, góp phần kéo dài thời gian tuần hoàn của

thuốc trong huyết tương và tích tụ nhiều trong các khối u thông qua hiệu ứng EPR.

Curcumin được chứng minh có khả năng chống ung thư, ức chế sự hình thành khối u

và di căn thông qua hiệu ứng của nó trên một loạt các con đường sinh học liên quan

đến đột biến, biểu hiện gene gây ung thư, … góp phần làm giảm độc tính của thuốc

và tăng hiệu quả điều trị [166].

119

KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án, chúng tôi đã đạt được các kết

quả sau:

1. Đã tổng hợp thành công các chất mang nanogel mới trên cơ sở heparin,

fucoidan ghép các polymer tương hợp sinh học pluronic có cấu trúc mạch khác nhau

(P123, F127, F87, F68) với các tỉ lệ liên hợp khác nhau. Trong đó Hep-P123, Hep-

F87, Hep-F68, Fud-P123 là các hệ chất mang mới chưa được nghiên cứu trước đây.

Các sản phẩm nanogel được đánh giá cấu trúc bằng các phương pháp 1H-NMR, FT-

IR, TGA, TEM, CMC.

2. Các nanogel heparin-pluronic mang thuốc cisplatin đạt từ 2,85% đến

13,29% và khi tạo phức với cisplatin dạng hydrate đạt từ 8,44% đến 30,30%, trong

đó phức hợp nanogel Hep-P123 ở tỉ lệ ghép 1:3 với cisplatin hydrate có phần trăm

mang thuốc cao nhất. Ngoài ra, tỉ lệ ghép pluronic càng cao thì phần trăm thuốc

cisplatin hydrate được mang vào nanogel càng giảm. Đây là nét mới của luận án so

với chiều hướng nghiên cứu mới được phát triển gần đây, sử dụng dạng phức hydrate

của cisplatin với chất mang để làm tăng hiệu quả mang thuốc.

Khi so sánh giữa nanogel Hep-P123 và Fud-P123 với tỉ lệ liên hợp 1:3 tương

ứng thì Hep-P123 mang thuốc cisplatin hydrate tốt hơn. Đây là điểm mới của đề tài,

trong đó hệ nanogel Hep-P123 và Fud-P123 chưa từng được nghiên cứu trong và

ngoài nước.

3. Nanogel từ phức giữa cisplatin hydrate và chất mang Hep-P123 và Fud-

P123 (với tỉ lệ liên hợp 1:3) có tốc độ giải phóng thuốc chậm hơn nhiều so với mẫu

cisplatin hydrate đối chứng.

Ngoài ra, so sánh giữa nanogel Hep-P123 và Fud-P123 thì Hep-P123 cho phần

trăm thuốc cisplatin hydrate giải phóng ra sau 24 giờ ở cả 2 điều kiện pH 5,5 và 7,4

nhiều hơn so với Fud-P123.

4. Khi nanogel Hep-P123 và Fud-P123 được tạo phức với cisplatin dạng

hydrate thì có phần trăm ức chế sự phát triển của dòng tế bào MCF-7 cao hơn so với

cisplatin được mang trên nanogel tương ứng.

120

5. Đã tổng hợp thành công chất mang nanogel trên cơ sở heparin liên hợp

pluronic F127 mang thuốc kết hợp cisplatin hydrate và nanocurcumin. Sản phẩm

nanogel được đánh giá cấu trúc bằng các phương pháp FT-IR, TEM.

6. Phức hợp chất mang nanogel Hep-F127 và cisplatin hydrate sau khi kết hợp

với nanocurcumin cho hiệu quả cao khi thử nghiệm trên mô hình chuột nhắt trắng

mang khối u dòng tế bào MCF-7 ghép dị loài từ người, trong đó thể tích khối u giảm

78,51 ± 13,6% sau 14 ngày thử nghiệm. Đây là điểm nổi bật của đề tài, trong đó

nanogel Hep-F127 mang thuốc cisplatin hydrate kết hợp nanocurcumin chưa được

nghiên cứu và thử nghiệm trên động vật trước đây.

Ngoài ra, khi có sự kết hợp của nanocurcumin trên hệ chất mang thuốc Hep-

F127-CisOH, thuốc có độ độc giảm hơn nhiều so với mẫu cisplatin đối chứng, chuột

không xuất hiện triệu chứng sưng viêm và hoại tử ở vùng đuôi tiêm thuốc.

121

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục đề tài trên với các loại pluronic khác. Sau đó tiến hành khảo sát khả

năng mang, nhả thuốc chống ung thư của các hệ nanogel trên với các loại thuốc khác

nhau, nhằm đạt hiệu quả mang thuốc tốt nhất.

Tiếp tục nghiên cứu kết hợp đa thuốc chống ung thư trên các hệ nanogel sau

khi đã tổng hợp, nhằm tăng hiệu quả điều trị cũng như giảm độc tính của thuốc.

Nghiên cứu biến tính các copolymer ghép với các tác nhân hướng đích, nhằm

tăng hiệu quả điều trị khối u của các thuốc chống ung thư kém tan trong nước.

122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Ngoc The Nguyen, Thi Hiep Nguyen, Minh Thanh Vu, Van Thu Le, Xuan

Anh Nguyen, Tram Chau Nguyen, and Thi Bich Tram Nguyen, Novel

amphiphilic heparin-pluronic P123 copolymers exhibiting a great potential

for Cisplatin delivery, Journal of Materials Science, 2018, 53(18), 12692-

12703. IF = 3.394, Q1.

2. Ngoc The Nguyen, Ngoc Nhat Thanh Nguyen, Ngo The Nhan Tran, Phung

Ngan Le, Thi Bich Tram Nguyen, Ngoc Hoa Nguyen, Long Giang Bach, Vu

Nguyen Doan, Ha Le Bao Tran, Van Thu Le, and Ngoc Quyen Tran, Synergic

Activity Against MCF-7 Breast Cancer Cell Growth of Nanocurcumin-

Encapsulated and Cisplatin-Complexed Nanogels, Molecules, 2018, 23(12)

(3347), 1-12. IF = 3.060, Q1.

3. Trung Dinh Nguyen, The Ngoc Nguyen, Trang Thuy Thi Nguyen, Igor A.

Ivanov, Khoa Cuu Nguyen, Quyen Ngoc Tran, Anh Ngoc Hoang and Yuri N.

Utkin, Nanoencapsulation Enhances Anticoagulant Activity of Adenosine and

Dipeptide IleTrp, Nanomaterials, 2019, 9(9), 1191, 1-12. IF = 4.034, Q1.

123

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. L. Kelland, The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy, Nat. Rev.

Cancer, 2007, 7(8), 573-584.

2. S. Dasari, P.B. Tchounwou, Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms

of action, Eur. J. Pharmacol., 2014, 740, 364-378.

3. X. Duan, C. He, S.J. Kron and W. Lin, Nanoparticle formulations of cisplatin

for cancer therapy, Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol., 2016,

8(5), 776-791.

4. J. Sastry and S. J. Kellie, Severe neurotoxicity, ototoxicity and nephrotoxicity

following high-dose cisplatin and amifostine, Pediatr. Hematol. Oncol., 2005,

22(5), 441-445.

5. Y. Yin, B. Hu, X. Yuan, et al., Nanogel: A Versatile Nano-Delivery System for

Biomedical Applications, Pharmaceutics, 2020, 12(3), 290.

6. M. A. Qureshi and F. Khatoon, Different types of smart nanogel for targeted

delivery, Journal of Science: Advanced Materials and Devices, 2019, 4(2), 201-

212.

7. D. Chen, H. Yu, K. Sun, et al., Dual thermoresponsive and pH-responsive self-

assembled micellar nanogel for anticancer drug delivery, Drug Deliv., 2014,

21(4), 258-264.

8. H. Yu, Z. Tang, M. Li, et al., Cisplatin loaded poly (L-glutamic acid)-g-methoxy

poly(ethylene glycol) complex nanoparticles for potential cancer therapy:

preparation, in vitro and in vivo evaluation, J. Biomed. Nanotechnol., 2016,

12(1), 69-78.

9. S.H. Hong, Y. Li, J.B. Eom and Y. Choi, Responsive alginate-cisplatin

nanogels for selective imaging and combined chemo/radio therapy of

proliferating macrophages, Quant. Imaging. Med. Surg., 2018, 8(8), 733-742.

10. L. Liu, M. Gou, T. Yi, et al., Antitumor effects of heparin-polyethyleneimine

nanogels delivering claudin-3-targeted short hairpin RNA combined with

lowdose cisplatin on ovarian cancer, Oncol. Rep., 31(4), 1623-1628.

124

11. J. Alliot, I. Theodorou, D.V. Nguyen, et al., Tumor targeted micellar

nanocarriers assembled from Epipodophyllotoxin-based amphiphiles,

Nanoscale, 2019, 11(19), 9756-9759.

12. A. Nemany, N. Hanafy, M. El-Kemary and S. Leporatti, Micelles Structure

Development as a Strategy to Improve Smart Cancer Therapy, Cancers, 2018,

10(7), 238.

13. S. Kim, Y. Shi, J. Y. Kim, et al., Overcoming the barriers in micellar drug

delivery: loading efficiency, in vivo stability, and micelle–cell interaction,

Expert Opin. Drug Deliv., 2010, 7(1), 49-62.

14. R. Savic, T. Azzam, A. Eisenberg and D. Maysinger, Assessment of the integrity

of poly(caprolactone)-b-poly(ethylene oxide) micelles under biological

conditions: a fluorogenic-based approach, Langmuir, 2006, 22(8), 3570-3578.

15. C. Ragi, M.R. Sedaghat‐Herati, A. Ahmed Ouameur, H.A. Tajmir‐Riahi, The

effects of poly(ethylene glycol) on the solution structure of human serum

albumin, Biopolymers, 2005, 78(5), 231-236.

16. A.S. Michail and C. Allen, Block copolymer micelles for delivery of cancer

therapy: Transport at the whole body, tissue and cellular levels, J. Control.

Release, 2009, 138(2), 214-223.

17. U. Kedar, P. Phutane, S. Shidhaye and V. Kadam, Advances in polymeric

micelles for drug delivery and tumor targeting, Nanomedicine, 2010, 6(6), 714-

729.

18. T.Y. Kim, D.W. Kim, J.Y. Chung, et al., Phase I and pharmacokinetic study of

Genexol-PM, a cremophor-free, polymeric micelle-formulated paclitaxel, in

patients with advanced malignancies, Clin. Cancer Res., 2004, 10(11), 3708-

3716.

19. K.S. Lee, H.C. Chung, S.A. Im, et al., Multicenter phase II trial of Genexol-

PM, a Cremophor-free, polymeric micelle formulation of paclitaxel, in patients

with metastatic breast cancer, Breast Cancer Res. Treat., 2008, 108(2), 241-

250.

20. N. Nishiyama, M. Yokoyama, T. Aoyagi, et al., Preparation and

characterization of self-assembled polymer-metal complex micelle from cis-

125

dichlorodiammineplatinum (II) and poly (ethylene glycol)-poly (α, β-aspartic

acid) block copolymer in an aqueous medium, Langmuir, 1999, 15(2), 377-383.

21. F. Sultana, Manirujjaman, Md. Imran-Ul-Haque, et al., An Overview of Nanogel

Drug Delivery System, J. App. Pharm. Sci., 2013, 3(8), S95-S105.

22. H.KS. Yadav, N.A. Al Halabi, G.A. Alsalloum, Nanogels as Novel Drug

Delivery Systems - A Review, J. Pharmacol. Pharm. Res., 2017, 1(1:5), 1-8.

23. N. Morimoto, Shin-ichiro.M. Nomura, N. Miyazawa and K. Akiyoshi,

Polymeric Drug Delivery II: Nanogel engineered designs for polymeric drug

delivery, ACS Publications, Chapter 6, 2006, 924, 88-101.

24. H. Zhang, Y. Zhai, J. Wang and G. Zhai, New progress and prospects: The

application of nanogel in drug delivery, Mater. Sci. Eng. C Biol. Appl., 2016,

60, 560-568.

25. K. Akiyoshi, S. Deguchi, N. Moriguchi, et al., Self-Aggregates of

Hydrophobized Polysaccharides in Water. Formation and Characteristics of

Nanoparticles, Macromolecules, 1993, 26(12), 3062-3068.

26. X. Wei, T.H. Senanayake, G. Warren and S.V. Vinogradov, Hyaluronic Acid-

Based Nanogel−Drug Conjugates with Enhanced Anticancer Activity Designed

for the Targeting of CD44-Positive and Drug-Resistant Tumors, Bioconjug.

Chem., 2013, 24(4), 658-668.

27. M. Takeo, T. Mori, T. Niidome, et al., A polyion complex nanogel, J. Colloid

Interface Sci., 2013, 390(1), 78-84.

28. S. Zhou, X. Min, H. Dou, et al., Facile fabrication of dextran-based fluorescent

nanogels as potential glucose sensors, Chem. Commun., 2013, 49(82), 9473-

9475.

29. Y.L. Li, L. Zhu, Z. Liu, et al., Reversibly Stabilized Multifunctional Dextran

Nanoparticles Efficiently Deliver Doxorubicin into the Nuclei of Cancer Cells,

Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48(52), 9914-9918.

30. G. Soni and K. S. Yadav, Nanogels as potential nanomedicine carrier for

treatment of cancer: a mini review of the state of the art, Saudi Pharm. J., 2016,

24(2), 133-139.

126

31. D.H. Nguyen, J.H. Choi, Y.K. Joung, and K.D. Park, Disulfide-crosslinked

heparin-pluronic nanogels as a redox-sensitive nanocarrier for intracellular

protein delivery, J. Bioact. Compat. Polym., 2011, 26(3), 287-300.

32. C. Lu, B. Li, N. Liu, et al., A hydrazone crosslinked zwitterionic polypeptide

nanogel as a platform for controlled drug delivery, RSC Adv., 2014, 4(92),

50301-50311.

33. T. Nakai, T. Hirakura, Y. Sakurai, et al., Injectable hydrogel for sustained

protein release by the saltinduced association of hyaluronic acid nanogel,

Macromol. Biosci., 2012, 12(4), 475-483.

34. S. Mangalathillam, N.S. rejinold, A. Nair, et al., Curcumin-loaded chitin

nanogels for skin cancer treatment via the transdermal route, Nanoscale, 2012,

4(1), 239-250.

35. C. Gonçalves, P. Paula and F.M. Gama, Self-assembled hydrogel nanoparticles

for drug delivery applications, Materials, 2010, 3(2), 1420-1460.

36. P.R. Sarika, N.R. James, P.R. Anil Kumar and D.K. Raj, Preparation,

characterization and biological evaluation of curcumin loaded alginate

aldehyde-gelatin nanogels, Mater. Sci. Eng. C., 2016, 68, 251-257.

37. V. Baskar, S. Meeran, A. Subramani, et al., Historic review on modern herbal

nanogel formulation and delivery methods, Int. J. Pharm. Pharm. Sci., 2018,

10(10), 1-10.

38. Nguyễn Cửu Khoa, Vật liệu polyme thông minh và ứng dụng trong y sinh. Nhà

xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 2016, 450-454.

39. M.A. Qureshi and F. Khatoon, Different types of smart nanogel for targeted

delivery, J. Sci. Adv. Mater. Dev., 2019, 4(2), 201-212.

40. R. Cheng, F. Meng, C. Deng, et al., Dual and multi-stimuli responsive polymeric

nanoparticles for programmed site-specific drug delivery, Biomaterials, 2013,

34(14), 3647-3657.

41. N. Morimoto, S. Hirano, H. Takahashi, et al., Self-Assembled pH-Sensitive

Cholesteryl Pullulan Nanogel As a Protein Delivery Vehicle,

Biomacromolecules, 2013, 14(1), 56-63.

127

42. Y. Li, Q.N. Bui, L.T. Minh Duy, et al., One-Step Preparation of pH-Responsive

Polymeric Nanogels as Intelligent Drug Delivery Systems for Tumor Therapy,

Biomacromolecules, 2018, 19(6), 2062-2070.

43. C. Duan, J. Gao, D. Zhang, et al., Galactose-decorated pH-responsive nanogels

for hepatomatargeted delivery of oridonin, Biomacromolecules, 2011, 12(12),

4335-4343.

44. P. Kaner, P. Bengani-Lutz, I. Sadeghi and A. Asatekin, Responsive filtration

membranes by polymer self-assembly, Technology, 2016, 4(4), 217-228.

45. A. Nykänen, M. Nuopponen, A. Laukkanen, et al., Phase behavior and

temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of

polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene,

Macromolecules, 2007, 40(16), 5827-5834.

46. Y. Shin, J.H. Chang, J. Liu J, et al., Hybrid nanogels for sustainable positive

thermosensitive drug release, J. Control. Release, 2001, 73(1), 1-6.

47. C. Wang, J. Mallela, U.S.Garapati, et al., A chitosan-modified graphene nanogel

for noninvasive controlled drug release, Nanomedicine, 2013, 9(7), 903-911.

48. Y. Liang and K.L. Kiick, Heparin-functionalized polymeric biomaterials in

tissue engineering and drug delivery applications, Acta Biomater., 2014, 10(4),

1588-1600.

49. A.F. Martins, D.M. de Oliveira, A.G.B. Pereira, et al., Chitosan/TPP

microparticles obtained by microemulsion method applied in controlled release

of heparin, Int. J. Biol. Macromol., 2012, 51(5), 1127-1133.

50. Nhat-Anh. N. Tong, N.C. Khoa, T.P. Nguyen and N.Q. Tran, Aquated cisplatin

and heparin-pluronic nanocomplexes exhibiting sustainable release of active

platinum compound and NCI-H460 lung cancer cell antiproliferation, J.

Biomater. Sci. Polym. Ed., 2016, 27(8), 709-720.

51. Q. Li, L. Gan, H. Tao, Q. Wang, L. Ye, A. Zhang, Z. Feng, The synthesis and

application of heparin-based smart drug carrier. Carbohydrate Polymers, 2016,

140, 260-268.

128

52. L. Mei, Y. Liu, C. Xia, Y. Zhou, Z. Zhang, Q. He, Polymer-drug nanoparticles

combine doxorubicin carrier and heparin bioactivity functionalities for primary

and metastatic cancer treatment. Mol. Pharmaceutics, 2017, 14(2), 513-522.

53. L. Mei, Y. Liu, H. Zhang, Z. Zhang, H. Gao, Q. He,, Antitumor and

Antimetastasis Activities of Heparin-based Micelle Served As Both Carrier and

Drug. ACS Appl Mater Interfaces, 2016, 8(15), 9577-89.

54. F. Atashrazm, R.M. Lowenthal, G.M. Woods, et al., Dickinson Fucoidan and

Cancer: A Multifunctional Molecule with Anti-Tumor Potential, Mar. Drugs,

2015, 13(4), 2327-2346.

55. L. Wu, J. Sun, X. Su, et al., A review about the development of fucoidan in

antitumor activity: Progress and challenges, Carbohydr. Polym., 2016, 154, 96-

111.

56. Phạm Đức Thịnh, Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của

fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ỏ Vịnh Nha Trang. Luận

án tiến sĩ hóa học, 2015.

57. P.A. Hwang, X.Z. Lin, K.L. Kuo and F.Y. Hsu, Fabrication and Cytotoxicity of

Fucoidan-Cisplatin Nanoparticles for Macrophage and Tumor Cells, Materials

(Basel), 2017, 10(3), 291, 1-10.

58. E.J. Kim, S.Y. Park, J.Y. Lee and J.H. Yoon Park, Fucoidan present in brown

algae induces apoptosis of human colon cancer cells, BMC Gastroenterol.,

2010, 10(1), 96-106.

59. Z. Zhang, K. Teruya, H. Eto and S. Shirahata, Induction of apoptosis by low-

molecular-weight fucoidan through calcium- and caspase-dependent

mitochondrial pathways in MDA-MB-231 breast cancer cells, Biosci.

Biotechnol. Biochem., 2014, 77(2), 235-242.

60. Y. Aisa, Y. Miyakawa, T. Nakazato, et al., Fucoidan induces apoptosis of

human HS-Sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-

regulation of ERK pathways, Am. J. Hematol., 2004, 78(1), 7-14.

61. K. Haneji, T. Matsuda, M. Tomita, et al., Fucoidan extracted from cladosiphon

okamuranus tokida induces apoptosis of human t-cell leukemia virus type 1-

129

infected t-cell lines and primary adult t-cell leukemia cells, Nutr. Cancer, 2005,

52(2), 189-201.

62. A. Cumashi, N.A. Ushakova, M.E. Preobrazhenskaya, et al., A comparative

study of the antiinflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive

activities of nine different fucoidans from brown seaweeds, Glycobiology, 2007,

17(5), 541-552.

63. H. Maruyamaa, H. Tamauchi, M. Ilizuka and T. Nakano, The role of NK cells

in antitumor activity of dietary fucoidan from Undaria pinnatifida Sporophylls

(Mekabu), Planta Med., 2006, 72(15), 1415-1417.

64. M.T. Ale, H. Maruyama, H. Tamauchi, et al., Fucoidan from sargassum sp. And

fucus vesiculosus reduces cell viability of lung carcinoma and melanoma cells

in vitro and activates natural killer cells in mice in vivo, Int. J. Biol. Macromol.,

2011, 49(3), 331-336.

65. K. Azuma, T. Ishihara, H. Nakamoto, et al., Effects of oral administration of

fucoidan extracted from cladosiphon okamuranus on tumor growth and survival

time in a tumor-bearing mouse model, Mar. Drugs, 2012, 10(10), 2337-2348 .

66. J. Shimizu, U. Wada-Funada, H. Mano, et al., Proportion of murine cytotoxic t

cells is increased by high molecular-weight fucoidan extracted from okinawa

mozuku (cladosiphon okamuranus), J. Health Sci., 2005, 51(3), 394-397.

67. E.V. Batrakova, and A.V. Kabanov, Pluronic block copolymers: evolution of

drug delivery concept from inert nanocarriers to biological response modifiers,

J. Control Release, 2008, 130(2), 98-106.

67. Nguyễn Văn Kình, Nguyễn Tuấn Anh, Sinh học phân tử ung thư. Nhà xuất bản

y học, 2015, Hà Nội.

69. N.J. Wheate, S. Walker, G.E. Craig and R. Oun, The status of platinum

anticancer drugs in the clinic and in clinical trials, Dalton Trans., 2010, 39(35),

8097-8340.

70. Phan Minh Liem, Khả năng kháng ung thư của Curcumin và Graviola, Vietnam

J. Sci., 2015, 2(2), 6-10.

130

71. S. Chen, Q. Liang, S. Xie, et al., Curcumin based combination therapy for anti-

breast cancer: from in vitro drug screening to in vivo efficacy evaluation, Front.

Chem. Sci. Eng., 2016, 10(3), 383-388.

72. H. Su, W. Zhang, Y. Wu, et al., Schiff base-containing dextran nanogel as pH-

sensitive drug delivery system of doxorubicin: Synthesis and characterization,

J. Biomater. Appl., 2018, 33(2), 170-181.

73. J. Yang, M.H. Yao, L. Wen, et al., Multifunctional quantum dot–polypeptide

hybrid nanogel for targeted imaging and drug delivery, Nanoscale, 2014, 6(19),

11282-11292.

74. M. Oishi, H. Hayashi, M. Iijima and Y. Nagasaki. Endosomal release and

intracellular delivery of anticancer drugs using pH-sensitive PEGylated nanogels, J.

Mater. Chem., 2007, 17(35), 3720-3725.

75. Q. Zhang, J. Wu, J. Wang, et al., Neutrophils-Inspired Supramolecular Nanogel

for Magnetocaloric-Enzymatic Tandem Therapy, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,

2020, 59(9), 3732-3738

76. N. Malik, E. G. Evagorou and R. Duncan, Dendrimer-platinate: a novel

approach to cancer chemotherapy, Anticancer Drugs, 1999, 10(8), 767-776.

77. P.J. Pellechia, J. Gao, Y. Gu, et al., Platinum Ion Uptake by Dendrimers, Inorg.

Chem., 2004, 43(4), 1421-1428.

78. E. Wexselblatt, E. Yavin and D. Gibson, Cellular interactions of platinum

drugs, Inorg. Chim. Acta, 2012, 393, 75-83.

79. G.J. Kirkpatrick, J.A. Plumb, O.B. Sutcliffe, et al., Evaluation of anionic half

generation 3.5-6.5 poly(amidoamine) dendrimers as delivery vehicles for the

active component of the anticancer drug cisplatin, J. Inorg. Biochem., 2011,

105(9), 1115-1122.

80. H.P. Thu, P.T.H. Tuyet, M.T.T. Trang, et al., Preparation and Biological

Properties of Platinum(II) Complex-Loaded Copolymer PLA-TPGS, J.

Nanomater., 2013, 2013(5), 1-9.

81. T.U. Ly, N.Q. Tran, C.K. Nguyen, et al., Pegylated dendrimer and its effect in

fluorouracil loading and release for enhancing antitumor activity, J. Biomed.

Nanotechnol., 2013, 9(2), 213-220.

131

82. N.Q. Tran, C.K. Nguyen and T.P. Nguyen, Dendrimer-based nanocarriers

demonstrating a high efficiency for loading and releasing anticancer drugs

against cancer cells in vitro and in vivo, Adv. Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol.,

2013, 4(4), 045013.

83. H. Nguyen, N.H. Nguyen, N.Q. Tran and C.K. Nguyen, Improved Method for

Preparing Cisplatin-Dendrimer Nanocomplex and Its Behavior Against NCI-

H460 Lung Cancer Cell, J. Nanosci. Nanotechnol., 2015, 15(6), 4106-4110.

84. J.H. Choi, Y.K. Joung, N.Q. Tran, et al., Self-Assembled Nanogel of Pluronic-

Conjugated Heparin as a Versatile Drug Nanocarrier, Macromol. Res., 2011,

19(2), 180-188.

85. D.H. Nguyen, Y.K. Joung, J.H. Choi, et al., Targeting ligand-functionalized and

redox-sensitive heparin-Pluronic nanogels for intracellular protein delivery,

Biomed. Mater., 2011, 6(5), 055004.

86. H. Guo, F. Li, H. Qiu, et al., Chitosan-Based Nanogel Enhances

Chemotherapeutic Efficacy of 10-Hydroxycamptothecin against Human Breast

Cancer Cells, Inter. J. Polym. Sci., 2019, 2019(5), 1-6.

87. G.S. El-Feky, S.T. El-Banna, G.S. El-Bahy, et al., Alginate coated chitosan

nanogel for the controlled topical delivery of Silver sulfadiazine, Carbohydr.

Polym., 2017, 177, 194-202.

88. S.H. Hong, Y. Li, J.B. Eom and Y. Choi, Responsive alginate-cisplatin

nanogels for selective imaging and combined chemo/radio therapy of

proliferating macrophages, Quant. Imaging Med. Surg., 2018, 8(8), 733-742.

89. K. Senthilkumar, P. Manivasagan, J. Venkatesan and S.K. Kim, Brown seaweed

fucoidan: biological activity and apoptosis, growth signaling mechanism in

cancer, Int. J. Biol. Macromol., 2013, 60, 366-374.

90. K. Park, K. Kim, I.C. Kwon, et al., Preparation and Characterization of Self-

Assembled Nanoparticles of Heparin-Deoxycholic Acid Conjugates, Langmuir,

2004, 20(26), 11726-11731.

91. X.H. Peng, Y. Wang, D. Huang, et al., Targeted Delivery of Cisplatin to Lung

Cancer Using ScFvEGFR-Heparin-Cisplatin Nanoparticles, ACS Nano, 2011,

5(12), 9480-9493.

132

92. P. Liu, M. Gou, T. Yi, et al., The enhanced antitumor effects of biodegradable

cationic heparin-polyethyleneimine nanogels delivering HSulf-1 gene combined

with cisplatin on ovarian cancer, Int. J. Oncol., 2012, 41(4), 1504-1512.

93. Y.K. Joung, J.Y. Jang, J.H. Choi, et al., Heparin-conjugated pluronic nanogels

as multi-drug nanocarriers for combination chemotherapy, Mol. Pharm., 2013,

10(2), 685-693.

94. L. Liu, M. Gou, T. Yi, et al., Antitumor effects of heparin-polyethyleneimine

nanogels delivering claudin-3-targeted short hairpin RNA combined with low-

dose cisplatin on ovarian cancer, Oncol. Rep., 2014, 31(4), 1623-1628.

95. M.P. Kai, A.W. Keeler, J.L. Perry, et al., Evaluation of drug loading,

pharmacokinetic behavior, and toxicity of a cisplatin-containing hydrogel

nanoparticle, J. Control. Release, 2015, 204, 70-77.

96. M. Li, Z. Tang, Y. Zhang, et al., Targeted delivery of cisplatin by LHRH-peptide

conjugated dextran nanoparticles suppresses breast cancer growth and

metastasis, Acta Biomater., 2015, 18, 132-143.

97. T. Sudha, D.J. Bharali, M. Yalcin, et al., Targeted delivery of cisplatin to tumor

xenografts via the nanoparticle component of nano-diamino-tetrac,

Nanomedicine, 2017, 12(3), 195-205.

98. H.M. Kieler-Ferguson, D. Chan, J. Sockolosky, et al., Encapsulation,

controlled release, and antitumor efficacy of cisplatin delivered in liposomes

composed of sterol-modified phospholipid, Eur. J. Pharm. Sci., 2017, 103, 85-

93.

99. Y. Zhang, F. Wang, M. Li, et al., Self-Stabilized Hyaluronate Nanogel for

Intracellular Codelivery of Doxorubicin and Cisplatin to Osteosarcoma, Adv.

Sci., 2018, 5(6), 1800811.

100. S.E. Alavi, S.M Al Harthi, H.E. Shahmabadi and A. Akbarzadeh, Cisplatin-

Loaded Polybutylcyanoacrylate Nanoparticles with Improved Properties as an

Anticancer Agent, Int. J. Mol. Sci., 2019, 20(7), 1531.

101. Z. Zhang, K. Teruya, T. Yoshida, et al., Fucoidan extract enhances the anti-

cancer activity of chemotherapeutic agents in MDA-MB-231 and MCF-7 Breast

cancer cells, Mar. Drugs, 2013, 11(1), 81-98.

133

102. P.A. Hwang, X.Z. Lin, K.L. Kuo and F.Y. Hsu, Fabrication and Cytotoxicity of

Fucoidan-Cisplatin Nanoparticles for Macrophage and Tumor Cells, Materials

(Basel), 2017, 10(3), 291.

103. M. Tutuncu, M. Kiray, N. Yonguc and H.A. Bagriyanik, The Protective Effects

of Fucoidan on Cisplatin Induced Testicular Cytotoxicity in Rats, Proceedings,

2018, 2(25), 1554.

104. S.J. Wu, T.M. Don, C.W. Lin and F.L. Mi, Delivery of Berberine Using

Chitosan/Fucoidan-Taurine Conjugate Nanoparticles for Treatment of

Defective Intestinal Epithelial Tight Junction Barrier, Mar. Drugs, 2014,

12(11), 5677-5697.

105. Y.C. Huang and T.H. Kuo, O-Carboxymethyl Chitosan/Fucoidan

Nanoparticles Increase Cellular Curcumin Uptake, Food Hydrocolloids, 2016,

53, 261-269.

106. K.Y. Lu, R. Li, C.H. Hsu, et al., Development of a new type of multifunctional

fucoidan-based nanoparticles for anticancer drug delivery, Carbohydr. Polym.,

2017, 165, 410-420.

107. M.S. Deepika, R. Thangam, T.S. Sheena, et al., A novel rutin-fucoidan complex

based phytotherapy for cervical cancer through achieving enhanced

bioavailability and cancer cell apoptosis, Biomed. Pharmacother., 2019,

109(1), 1181-1195.

108. L. M. Mendonça, C. da S. Machado, C.C.C. Teixeira, et al., Curcumin reduces

cisplatin-induced neurotoxicity in NGF-differentiated PC12 cells,

Neurotoxicology, 2013, 34(1), 205-211.

109. P. Baharuddin, N. Satar, K.S. Fakiruddin, et al., Curcumin improves the efficacy

of cisplatin by targeting cancer stem-like cells through p21 and cyclin D1-

mediated tumour cell inhibition in non-small cell lung cancer cell lines, Oncol.

Rep., 2016, 35(1), 13-25.

110. P. Kumar, C.C. Barua, K. Sulakhiya, and R.K. Sharma, Curcumin ameliorates

cisplatin-induced nephrotoxicity and potentiates its anticancer activity in SD

rats: Potential role of curcumin in breast cancer chemotherapy, Front.

Pharmacol., 2017, 8(132), 1-12.

134

111. Z. Wei, J. Hao, S. Yuan, et al., Paclitaxel-loaded Pluronic P123/F127 mixed

polymeric micelles: formulation, optimization and in vitro characterization, Int.

J. Pharm., 2009, 376(1-2), 176-185.

112. K.D. Thakker, and W.H. Chern, Development and Validation of In Vitro

Release Tests for Semisolid Dosage Forms-Case Study, Dissolut. Technol.,

2003, 10(2), 10-15.

113. W. Voigt, Sulforhodamine B Assay and Chemosensitivity, Methods Mol. Med.,

2005, 110, 39-48.

114. J. Jung, Human tumor xenograft models for preclinical assessment of

anticancer drug development, Toxicol. Res., 2014, 30(1), 1-5.

115. M.M. Tomayko, and C.P. Reynolds, Determination of subcutaneous tumor size

in athymic ( nude ) mice, Cancer Chemother. Pharmacol., 1989, 24(3), 148-154.

116. G.J. Kirkpatrick, J.A. Plumb, O.B. Sutcliffe, et al., Evaluation of anionic half

generation 3.5-6.5 poly(amidoamine) dendrimers as delivery vehicles for the

active component of the anticancer drug cisplatin, J. Inorg. Biochem., 2011,

105(9), 1115-1122.

117. T.B.T. Nguyen, T.T.C. Nguyen, N.Q. Tran, et al., 1H-NMR Spectroscopy as an

Effective Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine

Dendrimers and Their Derivatives, International Journal of Polymer Anal.

Charact., 2015, 20(1), 57-68.

118. J.H. Choi, Y.K. Joung, J.W. Bae, et al., Self-Assembled Nanogel of Pluronic-

Conjugated Heparin as a Versatile Drug Nanocarrier, Macromol. Res., 2011,

19(2), 180-188.

119. D.T. Nguyen, V.T. Dinh, N.Q. Tran, et al., Dual Interactions of Amphiphilic

Gelatin Copolymer and Nanocurcumin Improving the Delivery Efficiency of the

Nanogels, Polymers (Basel), 2019, 11(5), 814.

120. L. Hou, W.M.R.N. Udangawa, A. Pochiraju, et al., Synthesis of Heparin-

Immobilized, Magnetically Addressable Cellulose Nanofibers for Biomedical

Applications, ACS Biomater. Sci. Eng., 2016, 2(11), 1905-1913.

135

121. J. Liu, N. Feng, S. Chang, H. Kang, Preparation and characterization of

poly(glycidyl methacrylate) grafted from magnesium hydroxide particles via SI-

ATRP, Appl. Surf. Sci., 2012, 258(16), 6127-6135.

122. N. Rapoport, Physical stimuli-responsive polymeric micelles for anti-cancer

drug delivery, Prog. Polym. Sci., 2007, 32(8-9), 962-990.

123. S. Tu, Y.W. Chen, Y.B. Qiu, et al., Enhancement of Cellular Uptake and

Antitumor Efficiencies of Micelles with Phosphorylcholine, Macromol. Biosci.,

2011, 11(10), 1416-1425.

124. L. Huang, M. Cai, X. Xie, et al., Uptake enhancement of curcumin encapsulated

into phosphatidylcholine-shielding micelles by cancer cells, J. Biomater. Sci.

Polym. Ed., 2014, 25(13), 1407-1424.

125. T.M. Krupka and A.A. Exner, Structural parameters governing activity of

Pluronic triblock copolymers in hyperthermia cancer therapy, Int. J.

Hyperthermia, 2011, 27(7), 663-671.

126. M.Y. Kozlov, N.S. Melik-Nubarov, E.V. Batrakova and A.V. Kabanov,

Relationship between Pluronic Block Copolymer Structure, Critical

Micellization Concentration and Partitioning Coefficients of Low Molecular

Mass Solutes, Macromolecules, 2000, 33(9), 3305-3313.

127. S.R. Croy and G.S. Kwon, Polymeric Micelles for Drug Delivery, Curr. Pharm.

Des., 2006, 12(36), 4669-4684.

128. Zhengzhong Wu, Mengtan cai, Jun cao, Jiaxing Zhang, Xianglin luo. effects of

copolymer component on the properties of phosphorylcholine micelles.

International Journal of Nanomedicine 2017:12 487–500

129. L.M.U. Dutra, M.E.N.P. Ribeiro, I.M. Cavalcante, et al., Binary mixture

micellar systems of F127 and P123 for griseofulvin solubilisation, Polímeros,

2015, 25(5), 433-439.

130. T.T.C. Nguyen, C.K. Nguyen, T.H. Nguyen and N.Q. Tran, Highly lipophilic

pluronics-conjugated polyamidoamine dendrimer nanocarriers as potential

delivery system for hydrophobic drugs, Mater. Sci. Eng. C, 2017, 70(2), 992-

999.

136

131. S. Hann, G. Koellensperger, Z. Stefánka, et al., Application of HPLC-ICP-MS

to speciation of cisplatin and degradation products in water containing different

chloride concentrations and in human urine, J. Anal. At. Spectrom., 2003,

18(11), 1391-1395.

132. A. Sarmah, R.K. Roy, Understanding the preferential binding interaction of

aqua-cisplatins with nucleobase guanine over adenine: a density functional

reactivity theory based approach, RSC Adv., 2013, 3(8), 2822-2830.

133. C. Duan, D. Zhang, F. Wang, et al., Chitosan-g-poly(N-isopropylacrylamide)

based nanogels for tumor extracellular targeting, Int. J. Pharm., 2011, 409(1-

2), 252-259.

134. X. Hou, Y. Pan, H. Xiao,and Jie Liu, Controlled Release of Agrochemicals

Using pH and Redox DualResponsive Cellulose Nanogels, J. Agric. Food

Chem., 2019, 67(24), 6700-6707.

135. W. Zhuang, B. Ma, G. liu, et al., A fully absorbable biomimetic polymeric

micelle loaded with cisplatin as drug carrier for cancer therapy, Regen.

Biomater., 2018, 5(1), 1-8.

136. R. Trummer, W. Rangsimawong, W. Sajomsang, et al., Chitosan-based self-

assembled nanocarriers coordinated to cisplatin for cancer treatment, RSC

Adv., 2018, 8(41), 22967-22973.

137. A. Saisyo, H. Nakamura, J. Fang, et al., pH-sensitive polymeric cisplatin-ion

complex with styrene-maleicacid copolymer exhibits tumor-selective drug

delivery and antitumoractivity as a result of the enhanced permeability and

retention effect, Colloids Surf. B: Biointerfaces, 2016, 138, 128-137.

138. X. Wang, Z. Guo, Targeting and delivery of platinumbased anticancer drugs,

Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 202-224.

139. J. Peng, T. Qi , J. Liao, et al., Controlled release of cisplatin from pH-thermal

dual responsive Nanogels, Biomaterials, 2013, 34(34), 8726-8740.

140. H. Gheybi, H. Niknejad and A.A. Entezami, Polymer-metal complex

nanoparticles-containing cisplatin and amphiphilic block copolymer for

anticancer drug delivery, Des. Monomers Polym., 2014, 17( 4), 334-344.

137

141. S. Aryal, C.M.J. Hu, and L. Zhang, Polymer Cisplatin Conjugate Nanoparticles

for Acid-Responsive Drug Delivery, ACS Nano, 2010, 4(1), 251-258.

142. L.H. Dang, M.T. Vu, N.Q. Tran, et al., Effect of ultrasonication on self-

assembled nanostructures formed by amphiphilic positive-charged copolymers

and negative-charged drug, ACS Omega, 2019, 4(3),4540-4552.

143. S.K. Hait and S.P. Moulik, Determination of critical micelle concentration

(CMC) of nonionic surfactants by donor‐acceptor interaction with lodine and

correlation of CMC with hydrophile-lipophile balance and other parameters of

the surfactants, J. Surf. Deterg., 2001, 4(3), 303-309.

144. B.S.M. Zadeh, G. Esfahani, and A. Salimi, Permeability of ciprofloxacin-

loaded polymeric micelles including ginsenoside as P-glycoprotein inhibitor

through a Caco-2 Cells monolayer as an intestinal absorption

model, Molecules, 2018, 23(8), 1904.

145. S.C. Owen, D.P.Y. Chan, and M.S. Shoichet, Polymeric micelle stability, Nano

Today, 2012, 7(1), 53-65.

146. B. Peterson and C. Marzzacco, The Effect of Hydrocarbon Chain Length on the

Critical Micelle Concentration of Cationic Surfactants: An Undergraduate

Physical Chemistry Experiment, Chem. Educator, 2007, 12(2), 80-84.

147. M.Y. Kozlov, N.S. Melik-Nubarov, E.V. Batrakova, and A.V. Kabanov,

Relationship between Pluronic Block Copolymer Structure, Critical

Micellization Concentration and Partitioning Coefficients of Low Molecular

Mass Solutes, Macromolecules, 2000, 33(9), 3305-3313.

148. P.S. Saravana, Y.N. Cho, H.C. Woo and B.S. Chun, Green and efficient

extraction of polysaccharides from brown seaweed by adding deep eutectic

solvent in subcritical water hydrolysis, J. Clean. Prod., 2018, 198(5), 1474-

1484.

149. R.M. Rodriguez-Jasso, S.I. Mussatto, L. Pastrana, et al., Microwave-assisted

extraction of sulfated polysaccharides (fucoidan) from brown seaweed,

Carbohydr. Polym., 2011, 86(3), 1137-1144.

138

150. W. Cho and K. Char, Thermally Induced Mesophase Development in

Ethanesilica Films via Macromolecular Templating Approach, Macromol.

Res., 2009, 17(9), 697-702.

151. Tr. D. Nguyen, A. N. Hoang, Y. N. Utkin, et al., Nanoencapsulation Enhances

Anticoagulant Activity of Adenosine and Dipeptide IleTrp, Nanomaterials,

2019, 9(9), 1191.

152. D.D. Singh-Joy and V.C. McLain, Safety assessment of poloxamers 101, 105,

108, 122, 123, 124, 181, 182, 183, 184, 185, 188, 212, 215, 217, 231, 234, 235,

237, 238, 282, 284, 288, 331, 333, 334, 335, 338, 401, 402, 403, and 407,

poloxamer 105 benzoate, and poloxamer 182 dibenzoate as used in cosmetics,

Int. J. Toxicol., 2008, 7(2), 93-128.

153. E. Giuliano, D. Paolino, M. Fresta and D. Cosco, Mucosal Applications of

Poloxamer 407-Based Hydrogels: An Overview, Pharmaceutics, 2018, 10(3),

159.

154. G. Dumortier, J.L. Grossiord, F. Agnely and J.C. Chaumeil, A review of

poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics, Pharm.

Re., 2006, 23(12), 2709-2728.

155. W. Zhang, K. Gilstrap, L. Wu, et al., Synthesis and Characterization of

Thermally Responsive Pluronic F127-Chitosan Nanocapsules for Controlled

Release and Intracellular Delivery of Small Molecules, ACS Nano, 2010, 4(11),

6747-6759.

156. N.Tr.T. Huynh, H.L.B. Tran, V.N. Doan, and N.Q. Tran, Thermosensitive

nanocomposite hydrogel based Pluronic-grafted gelatin and nanocurcumin for

enhancing burn healing, Science and Technology Development Journal:

Natural Sciences, 2019, 2(4), 146-154.

157. D.V. Tuan, P.T. Lyna, T.N. Quyen, et al., Nanocurcumin and chitosan-pluronic

F127-based hydrogel for 3rd degree burn treatment, Vietnam J. Sci. Technol.,

2018, 56(5), 594-603.

158. A. Sahu, N. Kasoju, P. Goswami and U. Bora, Encapsulation of Curcumin in

Pluronic Block Copolymer Micelles for Drug Delivery Applications, J.

Biomater. Appl., 2011, 25(6), 619-639.

139

159. X. Chen, L.Q. Zou, J. Niu, et al., The Stability, Sustained Release and Cellular

Antioxidant Activity of Curcumin Nanoliposomes, Molecules, 2015, 20(8),

14293-14311.

160. M.M. Tomayko and C.P. Reynolds, Determination of subcutaneous tumor size

in athymic (nude) mice, Cancer. Chemother. Pharmacol., 1989, 24(3), 148-514.

161. T.U. Ly, N.Q. Tran, T.K.D. Hoang, et al., Pegylated dendrimer and its effect in

fluorouracil loading and release for enhancing antitumor activity, J. Biomed.

Nanotechnol., 2013, 9(2), 213-220.

162. H. Yu, Z. Tang, M. Li, et al., Cisplatin loaded poly (L-glutamic acid)-g-

methoxy poly (ethylene glycol) complex nanoparticles for potential cancer

therapy: preparation, in vitro and in vivo evaluation, J. Biomed. Nanotechnol.,

2016, 12(1), 69-78.

163. M. Li, Z. Tang, Y. Zhang, et al., LHRH-peptide conjugated dextran

nanoparticles for targeted delivery of cisplatin to breast cancer, J. Mater.

Chem. B, 2014, 2(22), 3490-3499.

164. S.Y. Ha, S.Y. Yeo, Y.H. Xuan, and S.H. Kim, The prognostic significance of

cancer-associated fibroblasts in esophageal squamous cell carcinoma, PloS

One, 2014, 9(6), e99955.

165. M.Q. Gao, B.G. Kim, S. Kang, et al., Stromal fibroblasts from the interface

zone of human breast carcinomas induce an epithelial–mesenchymal transition-

like state in breast cancer cells in vitro, J. Cell. Sci., 2010, 123(20), 3507-3514.

166. R. Wilken, M.S. Veena, M.B. Wang, and E.S. Srivatsan, Curcumin: A review

of anti-cancer properties and therapeutic activity in head and neck squamous

cell carcinoma, Mol. Cancer, 2011, 10(1), 12.

140

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Sơ đồ tổng hợp Hep-DAB sử dụng tác chất ghép cặp EDC/NHS

Phụ lục 2: Kết quả phổ FT-IR của F127, NPC-F127-NPC và NPC-F127-Ami

141

Phụ lục 3: Kết quả phổ FT-IR của F87, NPC-F87-NPC và NPC-F87-Ami

Phụ lục 4: Kết quả phổ FT-IR của F68, NPC-F68-NPC và NPC-F68-Ami

142

Phụ lục 5: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của NPC-F127-NPC

Phụ lục 6: Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F87-NPC

143

Phụ lục 7: Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F68-NPC

Phụ lục 8: Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F127-Ami

144

Phụ lục 9: Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F87-Ami

Phụ lục 10: Kết quả phổ 1H-NMR của NPC-F68-Ami

145

Phụ lục 11: Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F127

Phụ lục 12: Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F87

146

Phụ lục 13: Kết quả phân tích phổ FT-IR của Hep-F68

Phụ lục 14: Kết quả phổ 1H-NMR của Hep-F127

147

Phụ lục 15: Kết quả phổ 1H-NMR của Hep-F87

Phụ lục 16: Kết quả phổ 1H-NMR của Hep-F68

148

Phụ lục 17: Phổ FT-IR của Hep-F127-Cis, Hep-F87-Cis và Hep-F68-Cis

Phụ lục 18: Phổ FT-IR của Hep-F127-CisOH, Hep-F87-CisOH, Hep-F68-CisOH

149

Phụ lục 27Phụ lục 19: Ảnh TEM của (a): pluronic P123, (b): Hep-P123 (1:3),

(c): Hep-P123 (1:7), (d): Hep-P123 (1:10), (e): Hep-P123 (1:14)

150

151

Phụ lục 20: Ảnh TEM của (a): F127; (b): Hep-F127 (1:3); (c): Hep-F127 (1:14);

(d): Hep-F87 (1:3); (e): Hep-F87 (1:14); (f): Hep-F68 (1:3); (g): Hep-F68 (1:14)

152

153

154

155

Phụ lục 21: Ảnh TEM của Fud-P123

Phụ lục 22: Ảnh TEM của Hep-F127-CisOH-Cur

156

Phụ lục 23: Kết quả xác định hoạt tính của Hep-P123-Cis và Hep-P123-CisOH

Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 của các mẫu ở các nồng độ khác nhau (%)

Mẫu Nồng độ

(µg/mL)

Phần trăm gây độc tế bào (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Hep-P123-Cis

100 93,28 94,64 94,56 94,16 ± 0,76

50 79,11 81,07 79,66 79,95 ± 1,01

25 61,36 63,27 58,93 61,18 ± 2,18

10 41,27 49,18 49,24 46,56 ± 4,58

5 35,06 36,21 28,26 33,18 ± 4,30

2.5 20,16 17,11 20,42 19,23 ± 1,84

Hep-P123-CisOH

25 79,97 72,89 72,35 75,07 ± 4,25

10 55,44 50,39 52,76 52,86 ± 2,53

5 38,08 36,69 38,36 37,71 ± 0,89

2,5 26,20 25,23 24,86 25,43 ± 0,70

1,0 1,57 9,80 13,42 8,26 ± 6,07

Giá trị IC50 của mẫu trên MCF-7

Mẫu IC50 (µg/mL) trên MCF-7

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Hep-P123-Cis 12,29 10,85 12,18 11,77 ± 0,80

Hep-P123-CisOH 7,737 9,088 8,619 8,48 ± 0,69

Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%)

Mẫu Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Hep-P123 8,02 12,20 9,92 10,04 ± 2,09

157

Phụ lục 24: Số liệu nhả thuốc của Hep-P123-CisOH

pH = 7,4

Thời gian (giờ) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung bình Độ lệch chuẩn

0,25 32,35 29,09 27,10 29,51 2,65

0,5 41,00 37,80 36,05 38,28 2,51

1 55,80 51,05 50,00 52,28 3,09

3 63,80 55,23 54,00 57,68 5,34

7 66,90 62,61 61,10 63,54 3,01

12 69,01 62,73 61,00 64,25 4,21

24 70,48 64,10 63,03 65,87 4,03

pH = 5,5

Thời gian (giờ) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung bình Độ lệch chuẩn

0,25 37,50 34,01 34,00 35,17 2,02

0,5 46,88 42,58 43,02 44,16 2,37

1 58,93 52,41 54,33 55,22 3,35

3 72,41 63,77 66,12 67,43 4,47

7 75,86 69,74 67,89 71,16 4,17

12 79,85 72,55 71,09 74,50 4,69

24 79,63 73,01 72,14 74,93 4,10

158

Phụ lục 25: Kết quả xác định hoạt tính của Fud-P123-Cis và Fud-P123-CisOH

Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 của các mẫu ở các nồng độ khác nhau (%)

Mẫu Nồng độ

(µg/mL)

Phần trăm gây độc tế bào (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Fud-P123-Cis

100 83,93 85,31 86,92 85,38 ± 1,50

50 63,51 57,59 61,48 60,86 ± 3,01

25 39,40 41,77 36,22 39,13 ± 2,78

10 22,50 20,41 27,72 23,55 ± 3,76

5 22,16 18,70 16,67 19,18 ± 2,78

Fud-P123-CisOH

100 85,71 87,90 87,61 87,08 ± 1,19

50 74,68 75,72 69,44 73,28 ± 3,36

25 52,42 50,79 51,68 51,63 ± 0,82

10 31,56 33,61 27,21 30,79 ± 3,27

5 23,57 21,77 19,93 21,75 ± 1,82

Giá trị IC50 của mẫu trên MCF-7

Mẫu IC50 (µg/mL) trên MCF-7

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Fud-P123-Cis 29,37 31,39 30,07 30,28 ± 1,03

Fud-P123-CisOH 19,66 19,49 22,39 20,51 ± 1,63

Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%)

Mẫu Phần trăm gây độc tế bào trên nguyên bào sợi (%)

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

Fud-P123 17,02 17,48 17,25 17,25 ± 0,02

159

Phụ lục 26: Số liệu nhả thuốc của Fud-P123-CisOH (%Cis)

pH = 7,4

Thời gian (giờ) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung bình Độ lệch chuẩn

0,25 9,53 10,20 8,91 9,55 0,65

0,5 16,03 18,00 14,10 16,04 1,95

1 22,14 24,30 22,70 23,05 1,12

3 30,01 32,66 29,00 30,56 1,89

7 33,72 33,04 31,17 32,64 1,32

12 36,26 35,28 33,07 34,84 1,63

24 36,90 35,80 33,36 35,35 1,81

pH = 5,5

Thời gian (giờ) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Trung bình Độ lệch chuẩn

0,25 17,36 14,01 15,11 15,49 1,71

0,5 23,00 19,03 20,34 20,79 2,02

1 28,08 25,90 25,53 26,50 1,38

3 37,11 33,00 36,08 35,40 2,14

7 41,22 39,05 41,02 40,43 1,20

12 43,80 41,67 41,17 42,21 1,40

24 44,88 42,76 42,18 43,27 1,42

160

Phụ lục 27: Kết quả thử độc tính tế bào MCF-7

Tên mẫu Nồng độ Phần trăm ức chế DLC

Cisplatin

10 93,86 92,86 92,15 92,97 0,85

7,5 91,05 94,77 92,88 92,90 1,86

5 89,78 90,11 90,64 90,17 0,43

2,5 84,67 86,73 84,67 85,36 1,19

0,5 49,93 49,93 49,93 49,93 0

Hep-

F127-

CisOH

%I

C (ppm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB DLC

100 88,13 87,46 90,11 88,57 1,38

50 78,95 77,61 78,99 78,52 0,79

25 67,34 64,46 62,79 64,86 2,30

10 48,58 47,28 48,74 48,20 0,80

5 35,49 31,63 31,93 33,02 2,15

IC50 (mg/mL) 10.40 11.75 11.57 11.24 0.73

Hep-

F127-

CisOH-

Cur

%I

C (ppm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB DLC

100 97,56 92,25 96,16 95,32 2,75

50 91,04 92,71 92,70 92,15 0,96

25 67,72 69,58 70,80 69,37 1,55

10 46,00 40,71 41,45 42,72 2,87

5 32,46 21,97 24,66 26,36 5,45

1 13,45 6,40 7,52 9,12 3,79

IC50 (mg/mL) 10,35 12,67 12,06 11,69 1,20

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB DLC

Hep-

F127

(ppm) %I

200 -2,05 -8,69 -4,43 -5,06 3,37

100 0,29 -3,71 -4,12 -2,51 2,44

50 4,00 0,87 -0,80 1,36 2,43

161

Phụ lục 28: Kết quả khảo sát khối lượng chuột (g)

Nghiệm thức 1: NaCl 0,9%

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5 TB DLC

1 30,00 34,00 31,00 29,58 33,75 31,67 2,08

2 29,30 32,60 31,78 32,98 32,67 31,87 1,50

3 30,55 34,00 29,20 33,30 33,20 32,05 2,07

4 30,10 34,05 31,70 34,00 30,00 31,97 1,99

5 29,25 35,12 33,25 33,67 31,10 32,48 2,31

6 30,30 34,50 32,00 33,85 30,45 32,22 1,92

7 31,60 33,20 32,00 32,00 32,00 32,16 0,61

8 30,14 34,39 30,80 30,34 30,00 31,13 1,85

9 31,00 34,00 30,85 31,00 30,42 31,45 1,44

10 31,00 35,40 29,80 30,00 29,60 31,16 2,43

11 31,20 34,10 30,00 30,50 30,30 31,22 1,67

12 31,00 33,50 31,38 30,00 30,26 31,23 1,39

13 31,20 34,50 33,00 29,00 30,00 31,54 2,23

14 31,38 34,70 32,26 29,30 29,80 31,49 2,15

Nghiệm thức 2: Hep-F127

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5 TB DLC

1 29,00 33,20 29,70 27,00 32,00 30,18 2,46

2 31,30 32,90 31,78 29,80 31,00 31,36 1,13

3 30,83 33,56 31,15 29,12 30,70 31,07 1,60

4 30,67 34,28 31,28 28,63 30,00 30,97 2,10

5 31,90 34,70 30,00 29,37 29,10 31,01 2,33

6 31,16 33,06 28,20 28,1 30,12 30,13 2,09

7 31,78 33,64 28,86 29,13 28,15 30,31 2,31

8 30,95 33,12 27,69 29,73 29,87 30,27 1,98

9 29,24 31,00 28,67 29,70 30,00 29,72 0,87

10 29,00 31,90 28,30 30,38 29,00 29,72 1,44

162

11 28,84 33,00 31,22 29,00 28,00 30,01 2,05

12 30,00 32,67 31,10 28,90 30,00 30,53 1,43

13 31,33 31,73 30,92 29,05 31,74 30,95 1,12

14 33,12 32,75 28,96 28,35 31,65 30,97 2,19

Nghiệm thức 3: Cisplatin

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5 TB DLC

1 28,00 33,92 32,20 27,18 32,10 30,68 2,93

2 26,13 34,42 31,56 26,52 30,00 29,73 3,49

3 27,28 34,00 31,84 27,13 29,49 29,95 2,97

4 25,91 32,50 29,87 26,86 27,17 28,46 2,69

5 25,82 30,80 28,71 25,16 26,23 27,34 2,35

6 25,75 29,46 28,41 23,89 24,67 26,44 2,40

7 25,06 29,00 28,11 21,75 23,00 25,38 3,14

8 24,00 28,06 27,79 21,00 21,66 24,50 3,32

9 23,89 26,56 27,65 20,93 21,58 24,12 2,96

10 19,46 25,70 25,50 19,50 21,31 22,29 3,11

Nghiệm thức 4: Hep-F127-CisOH

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5 TB DLC

1 33,60 30,92 30,00 28,52 28,46 30,30 2,12

2 31,18 28,21 29,48 25,18 26,30 28,07 2,41

3 28,54 26,28 26,86 24,07 24,54 26,06 1,81

4 29,36 28,95 27,47 24,20 25,82 27,16 2,16

5 28,15 28,04 26,36 24,08 23,30 25,99 2,23

6 26,33 25,74 24,81 23,00 23,86 24,75 1,35

7 24,11 23,64 24,35 24,06 24,12 24,06 0,26

8 22,10 22,46 23,30 23,00 23,05 22,78 0,49

9 21,30 19,01 21,00 23,60 22,75 21,53 1,76

10 22,01 20,17 19,85 22,62 22,40 21,41 1,30

11 22,00 18,40 20,11 22,30 21,91 20,94 1,66

12 20,54 16,45 19,76 21,00 21,30 19,81 1,97

163

13 17,71 18,25 18,90 17,78 19,04 19,30 0,62

14 17,50 18,07 18,60 17,12 18,67 18,00 0,68

Nghiệm thức 5: Hep-F127-CisOH-Cur

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5 TB DLC

1 28,98 34,10 31,79 33,02 28,65 31,31 2,42

2 28,84 34,21 31,54 33,66 28,74 31,40 2,58

3 30,48 34,90 32,93 33,26 30,33 32,38 1,95

4 30,49 35,91 32,45 32,47 31,93 32,65 1,99

5 29,08 35,46 32,70 33,93 28,06 31,85 3,17

6 32,86 35,24 29,72 33,40 30,59 32,36 2,22

7 32,60 34,08 29,70 32,95 29,51 31,77 2,05

8 30,35 31,89 30,06 32,40 28,07 30,55 1,71

9 31,85 32,57 28,03 33,22 25,84 30,30 3,21

10 28,92 29,87 28,8 29,23 25,70 28,50 1,62

11 29,97 28,34 26,99 27,46 24,53 27,46 1,99

12 29,38 27,28 25,61 26,64 23,60 26,50 2,13

13 26,16 25,86 25,23 23,73 23,00 24,80 1,37

14 23,50 23,39 22,70 20,29 20,12 22,00 1,67

164

Phụ lục 29: Khảo sát kích thước khối u qua các ngày

Nghiệm thức 1: NaCl 0,9%

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5

TB d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2

1 6,00 6,45 124,81 6,84 6,36 138,34 6,34 6,06 116,41 6,45 6,00 116,10 6,78 6,56 145,88 128,31

4 6,12 6,26 119,91 6,39 6,48 134,16 6,16 6,18 117,63 6,67 6,30 132,37 7,04 6,70 158,01 132,42

7 6,22 6,33 124,61 6,48 6,70 145,44 6,28 6,40 128,61 6,70 6,28 132,12 6,97 6,90 165,92 139,34

10 6,46 6,34 129,83 6,60 6,80 152,59 6,40 6,62 140,24 6,74 6,30 133,76 7,06 7,04 174,95 146,27

14 6,66 6,46 138,97 6,71 6,94 161,59 6,62 6,83 154,41 7,04 6,67 156,60 7,34 7,30 195,57 161,43

Nghiệm thức 2: Hep-F127

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5

TB d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2

1 6,00 7,44 166,06 7,34 6,54 156,97 6,78 6,58 146,77 6,80 6,48 142,77 6,82 6,56 146,74 151,86

4 6,12 7,26 161,29 7,39 6,58 159,98 6,90 6,67 153,49 6,97 6,60 151,81 7,04 6,70 158,01 156,91

7 6,30 7,46 175,30 7,40 6,70 166,09 7,08 6,84 165,62 7,22 6,90 171,87 7,15 6,80 165,31 168,84

10 6,48 7,40 177,42 7,46 6,80 172,48 7,00 6,90 166,64 7,00 7,02 172,48 7,06 6,91 168,55 171,51

14 6,78 7,35 183,14 7,26 6,99 177,36 6,93 7,17 178,13 7,16 7,10 180,47 7,36 6,88 174,19 178,66

165

Nghiệm thức 3: Cisplatin

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5

TB d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2

1 3,72 2,76 14,17 3,76 4,54 38,75 6,88 6,48 144,45 4,72 5,16 62,84 3,72 4,38 35,68 59,18

4 3,36 3,03 15,42 3,74 4,40 36,20 6,90 6,24 134,33 4,40 5,00 55,00 2,96 3,38 16,91 51,57

7 2,94 2,72 10,88 2,76 4,12 23,42 6,18 5,60 96,90 4,72 4,54 48,64 2,36 3,71 16,24 39,22

10 2,72 2,76 10,36 2,80 4,02 22,62 6,16 5,68 99,37 4,54 4,63 48,66 2,38 3,72 16,47 39,50

Nghiệm thức 4: Hep-F127-CisOH

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5 TB

d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2

1 5,86 5,16 78,01 4,04 5,16 53,78 5,00 3,82 36,48 5,90 6,16 111,94 4,52 4,30 41,79 64,40

4 5,70 5,21 77,36 4,10 5,00 51,25 5,06 3,94 39,27 6,00 5,80 100,92 4,44 4,38 42,59 62,28

7 5,72 4,90 68,67 3,74 4,90 44,90 4,77 3,66 31,95 5,90 5,62 93,17 4,74 4,06 39,07 55,55

10 5,50 5,01 69,03 3,66 4,74 41,12 4,94 3,74 34,55 4,54 4,63 48,66 4,12 3,72 28,51 44,37

14 5,47 4,94 66,74 3,74 4,54 38,54 5,01 3,53 31,21 5,14 3,94 39,90 4,06 3,54 25,44 40,37

166

Nghiệm thức 5: Hep-F127-CisOH-Cur

Ngày Con 1 Con 2 Con 3 Con 4 Con 5

TB d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2 d1 d2 axb2/2

1 4,06 4,48 40,74 4,48 5,16 59,64 4,88 4,52 49,85 4,90 3,90 37,26 6,16 5,90 107,21 58,94

4 3,74 4,24 33,62 4,90 5,12 64,23 4,66 4,04 38,03 4,06 3,00 18,27 5,38 4,38 51,61 41,15

7 3,01 3,70 20,60 3,74 4,04 30,52 4,27 3,58 27,36 3,92 3,00 17,64 5,48 4,02 44,28 28,08

10 2,53 2,93 10,86 3,30 3,85 24,46 4,12 3,74 28,81 4,04 2,52 12,83 4,02 3,72 27,82 20,95

14 2,76 2,54 8,90 3,08 3,66 20,63 3,99 3,54 25,00 4,02 2,24 10,09 3,50 2,76 13,33 15,59