B ColorPAC Toxin A Za brzo otkrivanje toksina A vrste Clostridium difficile

Američki patenti 4 743 560, 4 703 017, 4 855 240, 4 695 554, 4 529 561, 5 617 023, 5 369 036 i 5 567 591

Pogledajte objašnjenja simbola na kraju uputstva.

nAmenAColorPAC Toxin A Test (ColorPAC test toksina A) je brzo hromatografsko ispitivanje za kvalitativno otkrivanje toksina A (enterotoksina) vrste Clostridium difficile u uzorcima stolice dobijenim od pacijenata za koje se sumnja da imaju neku bolest izazvanu vrstom C. difficile. Ovaj test se takođe može koristiti za potvrdu očekivanih kolonija toksične C. difficile sa agarnih pločica ili iz rastvora moždano-srčane infuzije (brain-heart infusion, BHI). Ovo ispitivanje je namenjeno za pomoć pri dijagnozi bolesti koje su izazvane vrstom C. difficile.

ReZIme I OBJAŠnJenJeVrsta C. difficile je važan uzrok antibiotske dijareje, koja u svom najozbiljnijem obliku može da dovede do kliničkog sindroma pseudomembranoznog kolitisa sa značajnom smrtnošću. Iako vrsta C. difficile može da spada u normalnu bakterijsku crevnu floru, ona može da postane oportunistički patogen posle terapije antibioticima i naknadne promene normalne crevne flore. Pod pravim uslovima, grupe bakterija C. difficile koje proizvode toksine stvaraju dva toksina: toksin A, enterotoksin koji oštećuje tkivo, i toksin B, in vitro citotoksin.1 Stručna literatura kaže da se toksin A i toksin B proizvode istovremeno.2 Klinički simptomi koji se dovode u vezu sa bolešću se uglavnom pripisuju toksinu A, pa za sada nema uverljivih dokaza da toksin B ima značajnu biološku aktivnost kod bolesti koje nastaju prirodnim putem.3

Najčešća klinička dijagnostička pomagala za kolitis vrste C. difficile koji je izazvan antibioticima su ispitivanja citotoksičnosti (cytotoxicity assays, CTA) pomoću ćelijske kulture, lateksna aglutinacija (LA) i enzimska imunoispitivanja (enzyme immunoassays, EIA).4 CTA otkriva toksin B zahvaljujući citopatskom uticaju na ćelijsku kulturu i potreban je jedan do dva dana da bi se završilo. Lateksna aglutinacija više otkriva antigene za vrstu C. difficile nego određene toksine, ali se smatra vrednim brzim ispitivanjem kada se utvrđuje da li C. difficile ima etiološku ulogu kod pacijenata koji boluju od dijareje.5 Enzimska imunoispitivanja u mikroreaktoru mogu da otkriju toksin A ili, u nekim slučajevima, toksin A i toksin B istovremeno.6

PRInCIPI PROCeDUReColorPAC Toxin A Test se sastoji od uzorka antitela za toksin A vrste C. difficile imobilizovanog na parčetu hromatografskog testa koje se nalazi u test uređaju. Uzorak (tj. stolica, kolonije ili BHI rastvor) se razblažuje puferom i dodaje u reaktor za uzorke u test uređaju. Razblaženi uzorak pali parče testa kapilarnom reakcijom. Ako je prisutan, toksin A se vezuje za uzorak antitela na liniji oko testa dok uzorak prelazi preko parčeta testa. Bris i preostali reagensi se dodaju reaktoru za reagense u test uređaju.Nakon dodavanja otkrivača A, lipozomi toksina A uvaljani u antitelo koji sadrže ružičastu boju prelaze preko parčeta testa i prikačuju se za antigen toksina A vrste C. difficile koji je vezan za parče testa u prethodnom koraku. Nastajanje boje je pojačano posle dodavanja drugog reagensa lipozoma, otkrivača B koji se vezuje za kompleks nastao između otkrivača A i uzorka antitela na liniji oko testa. Nakon poslednjeg brisa, reakcije se očitavaju vizuelno. Ako se antigen za toksin A otkrije u uzorku, pojaviće se ružičasta linija oko testa i kontrole, što ukazuje na pozitivan rezultat. U odsustvu toksina A, pojaviće se ružičasta linija samo oko kontrole, što ukazuje na negativan rezultat.

ReAGenSIColorPAC pribor za test toksina A:Reagens 1 (30,0 mL) Pufer za uzorak: puferovani fiziološki rastvor sa mukolitičkim agensom, deterdžent od 1%.Reagens 2 (1,5 mL) Otkrivač A: zečiji lipozomi uvaljani u antitela toksina A vrste C. difficile.

Reagens 3 (1,5 mL) Otkrivač B: zečiji lipozomi uvaljani u antitela koji su specifični za otkrivač A.Reagens W (2,3 mL) Reagens brisa: puferovani fiziološki rastvor sa stabilizatorom od goveđeg proteina, deterdžent

od 0,1%.Kontrola + (1,0 mL) Pozitivna kontrola: puferovani fiziološki rastvor sa stabilizatorom od goveđeg proteina,

inaktivirani toksin A vrste C. difficile.

Kontrola – (1,0 mL) Negativna kontrola: puferovani fiziološki rastvor sa stabilizatorom od goveđeg proteina. Svi reagensi i kontrole sadrže natrijum-azid od 0,2% (konzervans).30 test uređaja Svaki sadrži parče testa uvaljano u monoklonsko antitelo toksina A vrste C. difficile i toksin A

vrste C. difficile.

30 SQ EASY epruveta i vrhova sa filterima.30 štapića za nanošenje leka i 30 pipeta za prenos.Jedna cev kapalice

Upozorenja i mere opreza:Za in vitro dijagnostičku upotrebu.Reagensi: Po prijemu, stavite pribor u frižider ili izvadite kutiju sa reagensima kojima je potrebno čuvanje u frižideru i čuvajte ga na temperaturi od 2 do 8°C. NE ZAMRZAVAJTE. Reagense treba odmah ponovo zatvoriti i vratiti u frižider kada ih ne upotrebljavate, vodeći pri tom računa da se poklopci obeleženi različitim bojama ne izmešaju. Ne koristiti po isteku roka trajanja. Nakon vađenja iz frižidera, zagrejte reagense do sobne temperature pre upotrebe. Izbegavajte predugu izloženost reagenasa jakom svetlu.Nemojte da zamenjujete, mešate ili kombinujete reagense i uređaje iz različitih serija pribora.Ako želite pravilno doziranje kapi, treba da držite bocu za doziranje reagensa vertikalno i da pri tom dozirate kap po kap.

8809761JAA 2006/08

SrpskiU

2

Upozorenje: Reagensi sadrže natrijum-azid. Veoma je toksičan ako se udahne, dođe u kontakt sa kožom ili se proguta. Kontakt sa kiselinama oslobađa vrlo otrovan gas. Nakon kontakta sa kožom, odmah isperite sa puno vode. Natrijum-azid može da reaguje sa olovnim i bakarnim vodoinstalacijama i tako stvori vrlo eksplozivne azide metala. Po bacanju, isperite jakim vodenim mlazom da se azid ne bi nagomilao.Test uređaji: Izvadite test uređaj iz kesice tek neposredno pred upotrebu. Čuvajte neotvarane uređaje na sobnoj temperaturi (od 15 do 30°C) ili u frižideru (od 2 do 8°C) ako tako želite. Nemojte stalno da menjate temperaturu nekorišćenih uređaja tako što ćete ih stavljati u frižider i vaditi iz njega. Jednokratna upotreba; ne upotrebljavajte ih ponovo.Kontrole: Ne koristite pribor ako pozitivne i negativne kontrole ne daju odgovarajuće rezultate. Pozitivna kontrola se pravi sa inaktiviranim toksinom A vrste C. difficile pa njome treba rukovati kao potencijalno opasnim materijalom.Pipete za prenos: Jednokratna upotreba; ne upotrebljavajte ih ponovo.Vrhovi sa filterima: Vrh mora da sadrži beli filter kako bi se obezbedilo ispravno funkcionisanje testa. Jednokratna upotreba; ne upotrebljavajte ih ponovo. Pobrinite se da vrh sa filterom bude ispravno namešten, tako da njegova gornja ivica i vrh SQ-EASY epruvete budu u ravni.Upozorenje: Patogeni mikroorganizmi, uključujući i virus hepatitisa i HIV, mogu se naći u kliničkim uzorcima. Pri rukovanju svim predmetima koji su kontaminirani krvlju i drugim telesnim tečnostima, neophodno je pridržavati se „Standardnih mera predostrožnosti“7-10 i institucionalnih uputstava.Bacite sav materijal koji se koristio prilikom izvođenja testa u kontejner odobren za biološki otpad. Uzorci se mogu obrađivati u autoklavu 60 minuta na temperaturi od 121°C ili tretirati rastvorom natrijum hipohlorita od 0,05% (razblaživanje domaćeg izbeljivača u odnosu 1:100) 30 minuta. Ne obrađujte materijal koji sadrži natrijum hipohlorit u autoklavu.

PRIKUPLJAnJe UZORAKA I RUKOVAnJe UZORCImAPrikupite uzorke stolice u čist, hermetički zatvoren kontejner bez konzervansa. Testiranje uzoraka treba obaviti što ranije nakon prijema u laboratoriju; međutim, možete ih čuvati do 72 sata na temperaturi od 2 do 8°C. Ako planirate da testirate uzorke nakon 72 sata, treba ih zamrznuti na -70°C odmah po prijemu u laboratoriju. Uzorci mogu da budu zamrznuti do 2 meseca. Kod pozitivnih uzoraka će posle tri zamrzavanja i odmrzavanja ili biti primetno blago smanjenje toksina A otkrivenog ColorPAC Toxin A testom ili neće biti smanjenja.Sačekajte da se uzorci stolice zagreju do sobne temperature i promešajte ih što detaljnije pre upotrebe.Na rezultate ColorPAC Toxin A testa ne utiču ampicilin, cefaleksin, metronidazol, vankomicin, barijum sulfat, laksativi, krv i lekovi protiv dijareje koji se mogu naći u stolici.Preporučuje se da se testiranja vrste C. difficile ili njenih toksina izvode na prolivnim (neoformljenim) uzorcima stolice.

PROCeDURAObezbeđeni materijal: Sav materijal koji je naveden u odeljku „Reagensi“.materijal koji je potreban, ali nije obezbeđen: vorteks mikser i merač vremena, mikropipetor; (opcionalno: rastvor moždano-srčane infuzije ili selektivni agar za vrstu C. difficile koji je potreban samo za otkrivanje toksina A u izolatima kulture C. difficile, centrifuga koja postiže 1.500 x g – ref. Procedura ispitivanja-1).Izvođenje testa: Pre nego što započnete proceduru, pogledajte „Mere predostrožnosti“ i „Uzimanje uzoraka i rukovanje“. Potrebno je da mesto na kome se vrši ispitivanje, reagensi, uzorci koji se ispituju i komponente testa pre upotrebe budu na sobnoj temperaturi.Pre upotrebe, lagano promešajte sve reagense nekoliko puta tako što ćete ih okrenuti naopačke. Ne dozvolite da se stvori pena.

PRIPRemA UZORAKA STOLICe – Pogledajte ilustracije, zadnja strana1. Pomoću mikropipetora ili cevi kapalice koja vam je data, dodajte 1 mL reagensa 1 (uzorak pufera) u jednu SQ-EASY

epruvetu za svaki uzorak koji će se testirati.2. Promešajte uzorak stolice što je detaljnije moguće. Kada su u pitanju tečne ili polutvrde stolice, pipetirajte 0,5 mL

uzorka u epruvetu koja sadrži reagens 1 pomoću pipete za prenos koja vam je data. Kada su u pitanju tvrde stolice, uzmite dva uzorka veličine zrna graška (0,5 g) iz različitih oblasti stolice i prenesite ih u epruvetu koja sadrži reagens 1 pomoću štapića za nanošenje leka ili drvenih špatula koje su vam date. Zatvorite epruvetu koristeći vrh sa filterom pre nego što je promućkate.

3. Mućkajte epruvetu 15 sekundi velikom brzinom. Razblaženi uzorak je spreman za upotrebu. Pređite na proceduru ispitivanja.

PRIPRemA UZORAKA KOLOnIJe I BHI RASTVORA – (tj. opcionalno)

Testiranje toksina A u kulturi sa podloga prevučenih metalom:1. Pronađite očekivane kolonije na agarnoj površini među kulturama starim od 42 do 48 sati koje zadovoljavaju

morfološke standarde i standarde za bojenje po Gramu vrste C. difficile.2. Pomoću mikropipetora ili cevi kapalice koja vam je data, dodajte 1 mL reagensa 1 (uzorak pufera) u epruvetu sa

kulturom dimenzija 12 x 75 mm. Aseptično prenesite očekivane izolovane kolonije u dovoljnom broju za postizanje McFarland standarda zamućenosti 2,0.

3. Uporedite odoka bakterijski rastvor i McFarland standard 2,0. Ako je neophodno, upotrebite još reagensa 1 kako biste podesili rastvor na nivo McFarland standarda zamućenosti 2,0.

4. Mućkajte epruvetu 15 sekundi velikom brzinom. Razblaženi uzorak je spreman za upotrebu.5. Pređite na proceduru ispitivanja.

Testiranje toksina A u BHI rastvoru:1. Pomoću mikropipetora ili cevi kapalice koja vam je data, dodajte 1 mL reagensa 1 (uzorak pufera) u SQ-EASY

epruvetu.2. Dodajte 0,5 mL BHI bujona starog 72 sata koji sadrži očekivanu kulturu C. difficile. Zatvorite epruvetu vrhom sa

filterom pre nego što je promućkate.

3

3. Mućkajte epruvetu 15 sekundi velikom brzinom. Razblaženi uzorak je spreman za upotrebu.4. Pređite na proceduru ispitivanja.

Pogledajte ilustracije, zadnja strana

Procedura ispitivanja: Otvorite dovoljno test uređaja za količinu uzoraka i kontrola koji će se testirati.1. Dodajte 3 kapi razblaženog uzorka (125 µL) u reaktor za uzorke test uređaja. Sačekajte 3 minuta da se uzorak upije. NAPOMENA: U retkim prilikama, uzorci koji ne prolaze kroz vrh sa filterom ili uzorci koji prolaze, ali ne teku

zahtevaju centrifugiranje na najmanje 1.500 x g supstance 10 minuta. Pomoću mikropipetora, dodajte 125 µL supernatanta u reaktor za uzorke novog test uređaja.

Umesto razblaženog uzorka, u reaktor za uzorke se u svrhu kontrole kvaliteta mogu dodati 2 kapi kontrole + ili kontrole -.

2. Dodajte jednu kap reagensa W (Wash Reagent, reagens brisa) u reaktor za reagense i sačekajte da se upije.3. Dodajte jednu kap reagensa 2 (otkrivač A) u reaktor za reagense i sačekajte 3 minuta.4. Dodajte jednu kap reagensa W (Wash Reagent, reagens brisa) u reaktor za reagense i sačekajte da se upije. NAPOMENA: Kod jako reaktivnih uzoraka, u prozoru test uređaja može da se pojavi ružičasta linija oko testa

(pozitivan) pre nego što se završe koraci 5 i 6.5. Dodajte jednu kap reagensa 3 (otkrivač B) u reaktor za reagense i sačekajte 3 minuta.6. Dodajte jednu kap reagensa W (Wash Reagent, reagens brisa) u reaktor za reagense i sačekajte da se upije. Očitajte

rezultate posle jednog minuta na dobro osvetljenom mestu. Jačina i pozadina boje mogu da se menjaju vremenom, ali rezultati se mogu tumačiti još 10 minuta.

Kontrola kvaliteta: Tečnu kontrolu + i kontrolu – treba testirati pri otvaranju svakog novog pribora kako bi se potvrdilo funkcionisanje reagenasa i test uređaja. Dodajte 2 kapi kontrole + ili kontrole – reaktoru za uzorke. Sačekajte 3 minuta da se upije. Pređite na drugi korak u odeljku „Procedura ispitivanja“.Opcionalno: Razblaživanje kontrole + pomoću reagensa 1 može se izvesti i testirati kako bi se demonstrirala slabija pozitivna reakcija i to prema sledećim uputstvima: 1. Dodajte 1,5 mL reagensa 1 (uzorak pufera) i jednu kap kontrole + bez stiskanja boce u test epruvetu.

Lagano promešajte. 2. Dodajte 1,0 mL reagensa 1 (uzorak pufera) u SQ-EASY epruvetu. 3. Pomoću pipete za prenos, prenesite 0,5 mL razblažene kontrole + iz prve epruvete u SQ-EASY

epruvetu. 4. Zatvorite SQ-EASY epruvetu vrhom sa filterom. Postarajte se da filter bude pravilno namešten. 5. Mućkajte epruvetu 15 sekundi velikom brzinom. Razblaženi uzorak je spreman za upotrebu. Pređite

na “Proceduru ispitivanja”.ColorPAC uređaj za toksin A sadrži dve ugrađene kontrole. Pojavljivanje ružičaste linije za kontrolu u prozoru ispitivanja (oblast „C“) pruža unutrašnju pozitivnu kontrolu koja ocenjuje imunološku reaktivnost uređaja, ispravnost funkcionisanja reagensa za otkrivanje i ispravnost karakteristika toka. Funkcije oblasti membrane (pozadine) služe kao negativna kontrola koja osigurava da neodređena širenja boje ne utiču na rezultate testa.Ono što je potrebno za kontrolu kvaliteta mora se obavljati u skladu sa važećim lokalnim, državnim i/ili saveznim propisima ili potrebama akreditacije i standardnim procedurama za kontrolu kvaliteta vaše laboratorije. Preporučuje se da korisnik pogleda relevantna CLSI uputstva i CLIA propise ako želi da vidi odgovarajuće procedure za kontrolu kvaliteta.Rezultate pacijenta ne treba prijavljivati ako pozitivne i negativne kontrole ne daju odgovarajuće rezultate.

TUmAČenJe ReZULTATA

Pogledajte ilustracije, zadnja stranaPozitivan test: Rezultat je pozitivan ako se u prozoru ispitivanja (oblast „T“) oko testa pojavljuje ružičasta linija bilo kog intenziteta. Pozitivan rezultat testa znači da je toksin A vrste C. difficile otkriven u uzorku pacijenta. Ružičasta linija oko kontrole bilo kog intenziteta treba da se pojavi u prozoru ispitivanja (oblast „C“). Neke jako pozitivne reakcije mogu da dovedu do smanjenja intenziteta linije oko kontrole. Intenzitet pozadine ne treba da smanji vidljivost linije oko kontrole.negativan test: Rezultat je negativan ako se linija oko testa u prozoru ispitivanja (oblast „T“) ne vidi. Negativan rezultat testa znači da toksin A vrste C. difficile nije otkriven u uzorku pacijenta. Ružičasta linija oko kontrole bilo kog intenziteta treba da se pojavi u prozoru ispitivanja (oblast „C“). Neki uzorci pacijenata mogu za posledicu da imaju tamnu zamrljanu pozadinu, što dovodi do smanjenja intenziteta linije oko kontrole. Kao i kod mnogih dijagnostičkih ispitivanja na toksin A vrste C. difficile koja se izvode na uzorku stolice, u slučaju da je rezultat negativan, a simptomi su i dalje prisutni i sumnja se na dijareju izazvanu vrstom C. difficile, preporučuje se testiranje istog ili naknadnih uzoraka stolice drugačijom metodologijom.nerazumljiv test:Rezultat je nerazumljiv ako nema ružičaste linije oko kontrole u prozoru ispitivanja (oblast „C“) ili ako pozadina otežava očitavanje linije oko kontrole.Ako je rezultat nerazumljiv, treba pripremiti novi uzorak, centrifugirati ga na najmanje 1.500 x g supstance 10 minuta i testirati onako kako stoji u koracima od 1 do 6 u odeljku „Procedura ispitivanja“. Ako uzorak ostane nerazumljiv, treba zatražiti novi uzorak.

OGRAnIČenJA PROCeDUReColorPAC Toxin A Test ne ustanovljuje prisustvo bolesti izazvane vrstom C. difficile, već samo demonstrira prisustvo toksina A u stolici. Za nivo toksina nije dokazano da ima veze sa prisustvom ili odsustvom bolesti kod pacijenta. Ove rezultate testa zajedno sa drugim rezultatima laboratorijskih testova i kliničkim nalazima pacijenta treba da tumači lekar.Na dijareju izazvanu vrstom C. difficile (C. difficile-associated diarrhea, CDAD) treba sumnjati kod svakog pacijenta sa dijarejom koji je primao antibiotike u prethodna dva meseca i/ili čija dijareja je počela 72 ili više sati nakon hospitalizacije.11

4

Faktori kao što su tehničke ili proceduralne greške, kao i dodatne supstance prisutne u uzorku stolice koje nisu navedene u odeljku „Skupljanje uzoraka i rukovanje uzorcima“ mogu da utiču na test i dovedu do pogrešnih rezultata.Za neke izolate vrste Clostridium sordellii dokazano je da stvaraju hemoragični toksin (hemorrhagic toxin, HT) koji ima slična biološka, fiziološko-hemijska i imunohemijska svojstva kao toksin A. HT može unakrsno da reaguje pri testiranju na toksin A.4 HT grupe bakterija vrste C. sordellii nisu otkrivene kod pacijenata sa dijarejom i kolitisom izazvanim antibioticima.Deca i pacijenti koji boluju od cistične fibroze mogu da imaju toksin vrste C. difficile u stolici, a da to nema kliničkog značaja.12,13

Funkcionalne karakteristike ColorPAC Toxin A testa nisu utvrđene kod pedijatrijskih pacijenata (<12 godina).Studije funkcionalnosti nisu izvođene u laboratoriji pri lekarskoj ordinaciji ili na odeljenju za negu.Kao i sa drugim tipovima testova, rukovanje uzorcima je važno za održavanje titara toksina A. Ako se testiranje odlaže više od 72 sata, preporučuje se zamrzavanje uzoraka na temperaturi od -70°C (pogledajte odeljak „Skupljanje uzoraka i rukovanje uzorcima“).

OČeKIVAne VReDnOSTIClostridium difficile je oportunistički patogen koji ostvaruje toksične uticaje kada je crevni trakt na neki način oštećen, na primer antibiotskom terapijom. Iz tog razloga su najčešće zaraženi pacijenti koji su nedavno primali antibiotsku terapiju ili se stalno nalaze u situacijama gde im se ukazuje nega. Procene ukazuju na to da je do 15% zdravih odraslih osoba možda pozitivno na citotoksin u stolici. 14,15 Prevalencija infekcije vrstom C. difficile među pacijentima sa dijarejom varira u zavisnosti od tipa ustanove, kućnog reda i populacije pacijenata. Kada je ColorPAC Toxin A test evaluiran sa prospektivnim uzorcima u kliničkim proverama koje su vršene u četiri velika nezavisna zdravstvena centra, među pacijentima za koje se sumnjalo da imaju neku bolest izazvanu vrstom C. difficile zapažene su stope prevalencije od 8,5 do 13,5%.16

FUnKCIOnALne KARAKTeRISTIKeFunkcionisanje ColorPAC Toxin A testa je određeno u evaluacijama izvedenim u četiri velika nezavisna zdravstvena centra. Studijske lokacije su se nalazile u geografski različitim oblastima Sjedinjenih Američkih Država. Testirano je ukupno 598 svežih i 162 zamrznutih uzoraka stolice koji su dobijeni od pacijenata za koje se sumnjalo da imaju neku bolest izazvanu vrstom C. difficile. Svaka studijska lokacija upoređivala je svoje rutinsko ispitivanje citotoksina B i ColorPAC Toxin A test. Za svega 0,1% stolica je bilo potrebno centrifugiranje i ponovno testiranje pre nego što je dobijen rezultat koji se može prijaviti. Rezultati ovog početnog poređenja su sumirani u tabeli 1.

Tabela 1

Poređenje rezultata ColorPAC Toxin A testa i ispitivanja citotoksina B

Rezultati ispitivanja citotoksina B

Studijska lokacija

Broj ColorPAC Toxin A Test

Pozitivni negativni Intervali pouzdanosti od 95%

1 240 PozitivniNegativni

028006

006200

Osetljivost 82%Specifičnost 97%

(65,5%, 93,2%)(93,8%, 98,9%)

2 135 PozitivniNegativni

018022

001114

Osetljivost 90%Specifičnost 99%

(68,3%, 98,8%)(95,3%, 99,9%)

3 207 PozitivniNegativni

021005

011170

Osetljivost 81%Specifičnost 94%

(60,7%, 93,5%)(89,4%, 96,9%)

4 178 PozitivniNegativni

029010

001138

Osetljivost 74%Specifičnost 99%

(57,9%, 87,0%)(96,1%, 100%)

Kombinovano 760 PozitivniNegativni

096023

019622

Osetljivost 81%Specifičnost 97%

(72,4%, 87,3%)(95,4%, 98,2%)

Zbog nedostatka standardizacije ispitivanja citotoksina, uzorci kod kojih se rezultati nisu slagali dodatno su ispitivani pomoću toksične kulture. Poređenje rezultata ColorPAC Toxin A testa koji se ne slažu i testa sa toksičnom kulturom sumirano je u tabeli 2.

Tabela 2

Poređenje rezultata ColorPAC Toxin A testa i rezultata citotoksina B sa rezolucijom uzoraka koji se ne slažu

Rezultati ispitivanja citotoksina BStudijska lokacija

Broj ColorPAC Toxin A Test

Pozitivni negativni

1 240 PozitivniNegativni

030005

004201

2 135 PozitivniNegativni

018000

001116

3 207 PozitivniNegativni

022000

010175

4 178 PozitivniNegativni

029007

001141

Kombinovano 760 PozitivniNegativni

099012

016633

Kada je ColorPAC Toxin A test evaluiran sa prospektivnim uzorcima u kliničkim proverama koje su vršene u četiri velika nezavisna zdravstvena centra, među pacijentima za koje se sumnjalo da imaju neku bolest izazvanu vrstom C. difficile stope prevalencije su se kretale od 8,5 do 13,5%, kako je naznačeno u odeljku „Očekivane vrednosti“. Predviđene

5

pozitivne i negativne vrednosti (positive predictive values, PPV; negative predictive values, NPV) za svaku studijsku lokaciju prikazane su u tabeli 3 na osnovu stvarne prevalencije i funkcionalnih karakteristika na svakoj kliničkoj lokaciji.

Tabela 3

ColorPAC Toxin A Test – Predviđene pozitivne i negativne vrednosti na osnovu stvarne prevalencije i funkcionalnih karakteristika

Studijska lokacija

Osetljivost Specifičnost Prevalencija PPV nPV

1 82% 97% 8,5% 72% 98%2 90% 99% 13,5% 93% 98%3 81% 94% 10,2% 61% 98%

4 74% 99% 11,1% 90% 97%

ColorPAC Toxin A test je takođe upoređen sa tri enzimska imunoispitivanja (enzyme immunoassays, EIA). Svaka od četiri kliničke studijske lokacije je barem jednom koristila EIA, ColorPAC Toxin A test i ispitivanje citotoksina B za svaki uzorak. Rezultati svakog ispitivanja toksina A upoređeni su sa ispitivanjem citotoksina B i sumirani u tabeli 4.

Tabela 4

Poređenje ispitivanja toksina A i citotoksina B na kombinovanoj studijskoj lokaciji

Funkcionisanje ColorPAC Toxin A Test

eIA metoda 1 eIA metoda 2 eIA metoda 3

Osetljivost 81% 80% 74% 86%Specifičnost 97% 97% 98% 98%

Podudarnost 95% 94% 94% 96%Procenat rezultata koji su u početku

bili nerazumljivi ili neodređeni

0,1% 0,9% 2,4% 0%

Potvrda kolonijeIzvedena je studija sa ciljem evaluacije funkcionisanja ColorPAC Toxin A testa pri proveri kolonije u rastu očekivane kolonije grupa bakterija C. difficile koje proizvode toksin pomoću selektivnog agara, anaerobnog krvnog agara i rastvora moždano-srčane infuzije (Brain Heart Infusion, BHI). Ukupno 111 kliničkih izolata koji su zadovoljavali morfološke standarde vrste C. difficile testirano je na svakoj podlozi pomoću ColorPAC Toxin A testa. Nakon identifikacije kolonija biohemijskim metodama, toksični status je određen ispitivanjem citotoksina B. Rezultati ovog početnog poređenja su sumirani u tabeli 5.

Tabela 5

Poređenje rezultata ColorPAC Toxin A testa i ispitivanja citotoksina B – Provera kolonije po tipu podloge (početno testiranje)

Tip podloge Broj uzoraka

Osetljivost Intervali pouzdanosti od 95%

Specifičnost Intervali pouzdanosti od 95%

BHI bujon 111 52/55 95%(84,9%, 98,8%)

52/56 93%(82,7%, 98,0%)

Selektivni agar

111 52/55 95%(84,9%, 98,8%)

52/56 93%(82,7%, 98,0%)

Anaerobni krvni agar

111 49/55 89%(77,7%, 95,9%)

53/56 95%(85,1%, 98,9%)

Rezultati koji se ne slažu su dodatno ispitivani tako što je testirano da li u kolonijama ima proizvodnje toksina A pomoću Toxin A EIA metode. Poređenje rezultata ColorPAC Toxin A testa koji se ne slažu, ispitivanja citotoksina B i metode sa toksinom A sumirani su u tabeli 6.

Tabela 6

Poređenje rezultata ColorPAC Toxin A testa i ispitivanja citotoksina B – Provera kolonije po tipu podloge (sa rezolucijom)

Tip podloge Broj uzoraka Osetljivost SpecifičnostBHI bujon 111 55/55 55/56

Selektivni agar 111 55/55 55/56Anaerobni krvni agar 111 52/55 56/56

Unakrsna reaktivnost: Ispitivano je da li ColorPAC Toxin A test unakrsno reaguje tako što su uzorci stolice pozitivni i negativni na toksin A inficirani mikroorganizmima (tj. bakterijama, kvascem, virusima i parazitima) sve dok nije dobijena konačna koncentracija od 107 – 108 CFU/mL za bakterije i kvasac, 103.2 - 106.2 TCID50/mL za viruse i 106/mL za parazite. Prema očekivanju, jedini organizam za koji je u testu dokazano da unakrsno reaguje je vrlo toksični izolat vrste Clostridium sordellii (VPI 9048). Ovaj izolat razvija visoke nivoe hemoragičnih i smrtonosnih toksina za koje je dokazano da su imunološki i biološki slični toksinima A i B vrste C. difficile. Staphylococcus aureus Cowan soj ATCC 12598, koji proizvodi protein A, nije unakrsno reagovao. Isto tako, sojevi Escherichia coli ATCC 43889, 43894 i 43895 koje proizvode toksine nalik šiga toksinima (Shiga-like toxins, SLT) nisu uopšte unakrsno reagovale. Sledeći mikroorganizmi nisu dali netačne pozitivne rezultate u stolicama negativnim na toksin A ili netačne negativne rezultate u stolicama pozitivnim na toksin A.

6

mikroorganizmi (broj sojeva koji je testiran)Adenovirus, tipovi 2, 40 i 41 (3) Clostridium perfringens (1) Giardia intestinalis (1)Aeromonas hydrophilia (1) Clostridium septicum (1) Klebsiella pneumoniae (1)Bacillus cereus (1) Clostridium sordellii, VPI 9048 (1) Peptostreptococcus anaerobius (1)Bacillus subtilis (1) Clostridium sporogenes (1) Proteus mirabilis (1)Bacteroides fragilis (1) Clostridium subterminale (1) Pseudomonas aeruginosa (1)Campylobacter coli (1) Clostridium tetani (1) Rotavirus, ljudski (1)Campylobacter fetus (1) Coxsackie virus, B1 (1) Salmonella choleraesius (1)Campylobacter jejuni (1) Cytomegalovirus (1) Shigella dysenteriae (1)Campylobacter laridis (1) Echovirus, tip 22 (1) Shigella flexneri (1)Candida albicans (1) Entamoeba histolytica (1) Shigella sonnei (1)Clostridium botulinum, tip A (1) Enterococcus faecalis, ATCC 29212 (1) Staphylococcus aureus, ATCC 12598

(Cowan) (1)Clostridium butyricum (1) Enterococcus faecium, ATCC 51559 (Otporan na vankomicin) (1)Clostridium histolyticum (1) Vibrio cholerae (1)

Clostridium innocuum (1) Enterovirus, tip 69 (1) Vibrio parahemolyticus (1)Clostridium novyi (1) Escherichia coli (4) Yersinia enterocolitica (1)

Granica otkrivanjaAnalitička osetljivost ColorPAC Toxin A testa rađena je tako što je pet uzoraka od kojih se svaki sastojao od tečnih, polutvrdih i tvrdih stolica inficirano poznatim koncentracijama toksina A. Inficirani uzorci su testirani u tri primerka. Rezultati su sumirani u tabeli 7.

Tabela 7Granica otkrivanja po tipu stolice

matrica inficirana toksinom A Raspon granice otkrivanja (ng/mL)Tečna stolica 1,38 – 5,21

Polutvrda stolica 1,61 – 18,71Tvrda stolica 3,19 – 22,58

Ponovljivost ispitivanjaPonovljivost ColorPAC Toxin A testa je evaluirana u nekoliko kliničkih laboratorija testiranjem panela stolice koji su se sastojali od tri nivoa toksina A i kontrole antigena negativne na toksin A. Slepi uzorci su testirani u tri primerka, jedanput dnevno tokom tri dana, na svakoj od četiri različite kliničke studijske lokacije. ColorPAC Toxin A test je pokazao ponovljivost od 100% unutar jednog ispitivanja i između različitih ispitivanja.

DOSTUPnOST

Kat. br. Opis274030 ColorPAC Toxin A, C.difficile, pribor za 30 testova.

ReFeRenCe1. Sullivan, N.M., S. Pellet, and T.D. Wilkins. 1982. Purification and characterization of toxin A and B of Clostridium

difficile. Infect. Immun. 35:1032-1040.2. Lyerly, D.M., N.M. Sullivan, and T.D. Wilkins. 1983. Enzyme-linked immunosorbent assay for Clostridium difficile toxin

A. J. Clin. Microbiol. 17:72-78.3. Bartlett, J.G. 1994. Clostridium difficile: history of its role as an enteric pathogen and current state of knowledge

about the organism. Clin. Infect. Dis. 18: (Suppl. 4): S265-S272.4. Lyerly, D.M., H.C. Krivan, and T.D. Wilkins. 1988. Clostridium difficile: its disease and toxins. Clin. Microbiol.

Rev. 1: 1-18.5. Baron, E.J. 1989. Assessment of currently-available laboratory tests for Clostridium difficile-associated diarrhea. Clin.

Microbiol. Newsl. 11:118-120.6. Merz, C.S., C. Kramer, M. Forman, L. Gluck, K. Mills, K. Senft, I. Steiman, N. Wallace, and P. Charache. 1994.

Comparison of four commercially available rapid enzyme immunoassays with cytotoxin assay for detection of Clostridium difficile toxin(s) from stool specimens. J. Clin. Microbiol. 32:1142-1147.

7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers From occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.

8. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80.

9. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.

10. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.

11. Gerding, D.N., Johnson, S. 1998. Clostridium difficile - associated diarrhea. Clin. Infect. Dis. 26:1027-1036.12. Cooperstock, M. 1988. Clostridium difficile in infants and children, p. 45-64. In R.O. Rolfe, and S.M. Finegold (ed.),

Clostridium difficile: its role in intestinal disease. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.13. Peach, S.L., S.P. Borriello, H. Gayla, F.E. Barclay, and A.R. Welch. 1986. Asymptomatic carriage of Clostridum difficile in

patients with cystic fibrosis. J. Clin. Pathol. 39:1013-1018.

7

14. Schleupner, M.A., D.C. Garner, K.M. Sosnowski, C.J. Schleupner, L.J. Barrett, E. Silva, D. Hirsch, and R.L. Guerrant. 1995. Concurrence of Clostridium difficile toxin A enzyme-linked immunosorbent assay, fecal lactoferrin assay, and clinical criteria with Clostridium difficile cytotoxin titer in two patient cohorts. J. Clin. Microbiol. 33:1755-1759.

15. Gerding, D. N., S. Johnson, L.R. Peterson, M.E. Mulligan, and J. Silva, Jr. 1995. Clostridium difficile-associated diarrhea and colitis. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 16:459-477.

16. Data on file, BD Diagnostic Systems.

8

Manufacturer / Výrobce / Producent / Fabrikant / Tootja / Valmistaja / Fabricant / Hersteller / ÊáôáóêåõáóôÞò / Gyártó / Ditta produttrice / Gamintojas / Producent / Fabricante / Výrobca / Tillverkare / Производител / Producãtor / Üretici / Proizvođač

Use by / Spotøebujte do / Anvendes før / Houdbaar tot / Kasutada enne / Viimeinkäyttöpäivä / A utiliser avant / Verwendbar bis / Çìåñïìçßá ëÞîçò / Felhasználhatóság dátuma / Usare entro / Naudokite iki / Brukes før / Stosować do / Utilizar em / Použite do / Usar antes de / Använd före / Използвайте до / A se utiliza pânã la / Son kullanma tarihi / Upotrebiti do YYYY-MM-DD / YYYY-MM (MM = end of month) / RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = konec mìsíce)ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutning af måned) / JJJJ-MM-DD / JJJJ-MM (MM = einde maand)AAAA-KK-PP / AAAA-KK (KK = kuu lõpp)VVVV-KK-PP / VVVV-KK (kuukauden loppuun mennessä)AAAA-MM-JJ / AAAA-MM (MM = fin du mois) / JJJJ-MM-TT / JJJJ-MM (MM = Monatsende) / ÅÅÅÅ-ÌÌ-ÇÇ / ÅÅÅÅ-ÌÌ (ÌÌ = ôÝëïò ôïõ ìÞvá) /ÉÉÉÉ-HH-NN / ÉÉÉÉ-HH (HH = hónap utolsó napja)AAAA-MM-GG / AAAA-MM (MM = fine mese) / MMMM-MM-DD / MMMM-MM (MM = mënesio pabaiga)ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutten av måneden)RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec miesi¹ca)AAAA-MM-DD / AAAA-MM (MM = fim do mês) / RRRR-MM-DD / RRRR-MM (MM = koniec mesiaca)aaaa-mm-dd / aaaa-mm (mm = fin del mes) / ÅÅÅÅ-MM-DD / ÅÅÅÅ-MM (MM = slutet på månaden) / ГГГГ-ММ-ДД / ГГГГ-ММ (ММ = края на месеца) / AAAA-LL-ZZ / AAAA-LL (LL = sfârºitul lunii) / YYYY-AA-GG / YYYY-AA (AA = ayın sonu) / GGGG-MM-DD / GGGG-MM (MM = kraj meseca)

Authorized Representative in the European Community / Autorizovaný zástupce pro Evropskou unii / Autoriseret repræsentant i EU / Erkend vertegenwoordiger in de Europese Unie / Volitatud esindaja Euroopa Nõukogus / Valtuutettu edustaja Euroopan yhteisössä / Représentant agréé pour la C.E.E. / Autorisierte EG-Vertretung / ÅîïõóéïäïôçìÝíïò áíôéðñüóùðïò óôçí ÅõñùðáúêÞ Êïéíüôçôá / Hivatalos képviselet az Európai Unióban / Rappresentante autorizzato nella Comunità europea / Ágaliotasis atstovas Europos Bendrijoje / Autorisert representant i EU / Autoryzowane przedstawicielstwo w Unii Europejskiej / Representante autorizado na União Europeia / Autorizovaný zástupca v Európskom spoločenstve / Representante autorizado en la Comunidad Europea / Auktoriserad representant i EU / Оторизиран представител в ЕU / Reprezentant autorizat în Uniunea Europeanã / Avrupa Topluluğu Yetkili Temsilcisi / Ovlašćeni predstavnik u Evropskoj zajednici

Catalog number / Katalogové číslo / Katalognummer / Catalogusnummer / Kataloogi number / Tuotenumero / Numéro catalogue / Bestellnummer / Áñéèìüò êáôáëüãïõ / Katalógusszám / Numero di catalogo / Katalogo numeris / Numer katalogowy / Número do catálogo / Katalógové číslo / Número de catálogo / Каталожен номер / Numãr de catalog / Katalog numarası / Kataloški broj

In Vitro Diagnostic Medical Device / Lékaøské zaøízení určené pro diagnostiku in vitro / In vitro diagnostisk medicinsk anordning / Medisch hulpmiddel voor in vitro diagnose / In vitro diagnostika meditsiiniaparatuur / Lääkinnällinen in vitro -diagnostiikkalaite / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Medizinisches In-vitro-Diagnostikum / In vitro äéáãíùóôéêÞ éáôñéêÞ óõóêåõÞ / In vitro diagnosztikai orvosi eszköz / Dispositivo medico diagnostico in vitro. / In vitro diagnostikos prietaisas / In vitro diagnostisk medisinsk utstyr / Urz¹dzenie medyczne do diagnostyki in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / Medicínska pomôcka na diagnostiku in vitro / Dispositivo médico de diagnóstico in vitro / Medicinsk anordning för in vitro-diagnostik / Медицински уред за диагностика ин витро / Aparaturã medicalã de diagnosticare in vitro / In Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz / Medicinski uređaj za in vitro dijagnostiku

Temperature limitation / Teplotní omezení / Temperaturbegrænsning / Temperatuurlimiet / Temperatuuri piirang / Lämpötilarajoitus / Température limite / Zulässiger Temperaturenbereich / ¼ñéï èåñìïêñáóßáò / Hõmérsékleti határ / Temperatura limite / Laikymo temperatûra / Temperaturbegrensning / Ograniczenie temperatury / Limitação da temperatura / Ohraničenie teploty / Limitación de temperatura / Temperaturbegränsning / Температурни ограничения / Limitare de temperaturã / Sıcaklık sınırlaması / Ograničenje temperature

Contains sufficient for <n> tests / Dostatečné množství pro <n> testù / Indeholder tilstrækkeligt til <n> test / Voldoende voor <n> tests / Küllaldane <n> testide jaoks / Sisältöon riittävä <n> testejä varten / Contenu suffisant pour <n> tests / Ausreichend für <n> Tests / ÐåñéÝ÷åé åðáñêÞ ðïóüôçôá <n> åîåôÜóåéò / <n> teszthez elegendõ / Contenuto sufficiente per <n> test / Pakankamas kiekis atlikti <n> testø / Innholder tilstrekkelig for <n> tester / Zawiera iloœć wystarczaj¹c¹ do <n> testów / Contémo suficiente para <n> testes / Obsah vystačí na <n> testov / Contenido suficiente para <n> pruebas / Räckertill <n> antal tester / Съдържанието е достатъчно за <n> теста / Conþine suficient pentru <n> teste / <n> testleri için yeterli miktarda içerir / Sadržaj dovoljan za <n> testova

Batch Code (Lot) / Kód (číslo) šarže / Batch kode (Lot) / Chargenummer (lot) / Partii kood / Eräkoodi (LOT) / Code de lot (Lot) / Chargencode (Chargenbezeichnung) / Êùäéêüò ðáñôßäáò (Ðáñôßäá) / Tétel száma (Lot) / Codice del lotto (partita) / Partijos numeris (Lot) / Batch-kode (Serie) / Kod partii (seria) / Código do lote (Lote) / Kód série (šarža) / Código de lote (Lote) / Satskod (parti) / Код (Партида) / Numãr lot (Lotul) / Parti Kodu (Lot) / Kod serije

9

Positive control / Pozitivní kontrola / Positiv kontrol / Positieve controle / Positiivne kontroll / Positiivinkontrolli / Contrôle positif / Positive Kontrolle / èåôéêüò Ýëåã÷ïò / Pozitív kontroll / Controllo positivo / Teigiama kontrolë / Positiv kontroll / Kontrola dodatnia / Controlo positivo / Pozitívna kontrola / Control positivo / Положителен контрол / Etalon pozitiv / Pozitif kontrol / Pozitivna kontrola

Consult Instructions for Use / Prostudujte pokyny k použití / Læs brugsanvisningen / Raadpleeg gebruiksaanwijzing / Lugeda kasutusjuhendit / Tarkista käyttöohjeista / Consulter la notice d’emploi / Gebrauchsanweisung beachten / Óõìâïõëåõôåßôå ôéò ïäçãßåò ÷ñÞóçò / Olvassa el a használati utasítást / Consultare le istruzioni per l'uso / Skaitykite naudojimo instrukcijas / Se i bruksanvisningen / Zobacz instrukcja u¿ytkowania / Consulte as instruções de utilização / Pozri Pokyny na používanie / Consultar las instrucciones de uso / Se bruksanvisningen / Направете справка в инструкциите за употреба / Consultaþi instrucþiunile de utilizare / Kullanım Talimatları’na başvurun / Pogledajte uputstvo za upotrebu

10

B

Becton, Dickinson and Company BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Sparks, Maryland 21152 USA Shannon, County Clare, Ireland 800-638-8663 Tel: 353-61-47-29-20 Fax: 353-61-47-25-46

SQ-EASY is a trademark of Porex Technologies.ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. BD, BD Logo and ColorPAC are trademarks of Becton, Dickinson and Company. ©2006 BD