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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP
AVALIAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS BIOATIVOS DE
PLANTAS AMAZÔNICAS SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE
TESTOSTERONA SÉRICA EM CAMUNDONGOS PÓS
PÚBERES
PAULA ANDREOTTI RODRIGUES
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-graduação em Patologia
Ambiental e Experimental da Universidade
Paulista – UNIP para a obtenção do título de
mestre em Patologia Ambiental e Experimental.
São Paulo
2013
UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP
AVALIAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS BIOATIVOS DE
PLANTAS AMAZÔNICAS SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE
TESTOSTERONA SÉRICA EM CAMUNDONGOS PÓS
PÚBERES
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-graduação em Patologia
Ambiental e Experimental da Universidade
Paulista – UNIP para a obtenção do título de
mestre em Patologia Ambiental e Experimental.
Orientador: Profª Dra. Ivana Barbosa Suffredini
PAULA ANDREOTTI RODRIGUES
São Paulo
2013
PAULA ANDREOTTI RODRIGUES
AVALIAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS BIOATIVOS DE
PLANTAS AMAZÔNICAS SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE
TESTOSTERONA SÉRICA EM CAMUNDONGOS PÓS
PÚBERES
Dissertação de Mestrado apresentado ao
Programa de Pós-graduação em Patologia
Ambiental e Experimental da Universidade
Paulista – UNIP para a obtenção do título de
mestre em Patologia Ambiental e Experimental.
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA
______________________________
Profª Dra. Ivana Barbosa Suffredini
Universidade Paulista- UNIP
______________________________
Profª Dra. Maria Martha Bernardi.
Universidade Paulista- UNIP
______________________________
Profª Dra. Dominique Corinne Hermine.
Faculdade de Ciências Farmacêuticas- USP
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho ao meu filho, e a minha família que sempre estiveram ao
meu lado.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por estar sempre abençoando e dando
força para continuar e nunca desistir dos meus sonhos. Ao meu filho pela
compreensão de algumas ausências.
Agradeço a minha família pela ajuda com meu filho e sempre apoiando e
dando muita força.
Agradeço a Wilton e a Marilda, técnicos do laboratório pela ajuda
durante todo o experimento.
Agradeço principalmente a minha orientadora Profª Dra. Ivana Barbosa
Suffredini pela ajuda compreensão e principalmente pela paciência.
LISTA DE ABREVIATURAS
LH - Hormônio Luteinizante
GnRH - Hormônio liberador de Gonadotropina
FSH - Hormônio folículo estimulante
HDL - High Density Lipoprotein
ECA - Enzima conversora de angiotensina
DHT - Dehidrotestosterona
V.O - Via oral
I.P - Intraperitoneal
SPF - Specific Pathogen Free Organism
EAA Esteróides Anabólicos Androgênicos
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 8
2. REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................... 13
2.1. Testosterona ....................................................................................... 13
2.2. Produtos naturais que influenciam a produção de testosterona .......... 16
3. OBJETIVO GERAL ................................................................................... 19
3.1. Objetivos específicos .......................................................................... 19
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 20
5. CONSIDERAÇÕES GERAIS .................................................................... 25
6. ARTIGO CIENTÍFICO ................................................................................ 26
ANEXO I – APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA .................................... 54
ANEXO II – CURRICULUM LATTES .............................................................. 56
ANEXO III – NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA MEMÓRIAS DO
INSTITUTO OSWALDO CRUZ ........................................................................ 62
8
1. INTRODUÇÃO
A utilização de plantas com fins terapêuticos é das mais antigas formas
de prática medicinal da humanidade. Entre 250-500 mil espécies de plantas,
somente cerca de 5% foram estudadas quimicamente, e pequena porcentagem
foi avaliada sob os aspectos biológicos, levando ao desconhecimento quase
absoluto dos riscos toxicológicos que conteriam (Kuntze et al, 2012).
Em trabalhos anteriores, dez extratos vegetais, obtidos de diferentes
espécies (tabela 1), foram testados em modelos biológicos de citotoxicidade e
antibacterianos, e apresentaram atividade significante, cujos resultados são
vistos em outras publicações (Suffredini et al., 2006a; Suffredini et al., 2006b;
Suffredini et al., 2006c; Suffredini et al., 2007a; Suffredini et al., 2007b). Por
esse motivo, foram testados quanto à toxicidade aguda e influência sobre
ansiedade e locomoção (Estork, 2011; Gusmão, 2011), além de serem
determinadas as doses letais 50% e as doses não letais, observadas na tabela
1.
9
Tabela 1. Relação das espécies de plantas usadas para obtenção dos dez extratos usados, administrados a camundongos
Balb-c, para verificação de sua influência sobre a concentração sérica de testosterona, após administração de doses repetidas. As
doses administradas por via oral aos camundongos representam 10% da dose não letal determinada em estudos prévios (Estork,
2011; Gusmão, 2011).
Espécie Família Número de
coleta Órgão usado N do extrato
Dose letal 50% [g/kg]*
Dose não letal [g/kg]
Xylopia aromatica Annonaceae IBS08 Caule EB149 1,25 0,6259
Amphirrhox longifolia Violaceae PSC80 Órgãos aéreos EB284 0,6259 0,3125
Abarema auriculata Fabaceae Mimosoidae AAO3353 Caule EB689 0,0098 0,0049
Laetia suaveolens Salicaceae AAO3383 Folhas e caule EB719 0,3125 0,1563
Pentaclethra macroloba Fabaceae Mimosoidae AAO3481 Caule EB827 0,1563 0,0789
Swatzia sericea var. sericea Fabaceae Caesalpiniodeae AAO3501 Frutos EB1097 0,1563 0,0789
Symphonya globulifera Clusiaceae AAO3717 Órgãos aéreos EB1257 0,6256 0,3125
Picrolemma sprucei Simaroubaceae AAO3582 Órgãos aéreos EB1151 0,0625 0,0391
Ipomoea alba Convolvulaceae AAO4031 Órgãos aéreos EB1493 2,500 1,25
Moronobea coccinea Clusiaceae IBS142 Flores EB1765 2,500 1,25
*Fonte: (Estork, 2011; Gusmão, 2011).
10
Amphirrhox longifolia, Violaceae não apresenta qualquer informação
farmacológica ou fitoquímica. Porém, pesquisa com a família revela que
espécies relacionadas apresentariam ciclopeptídeos, proteínas cíclicas que
ocorrem em espécies de Violaceae e Rubiaceae. Nos anos 2000, um novo
grupo de substâncias, as proteínas cíclicas ou cliclopeptídeos, passou a
despertar grande interesse na comunidade científica em decorrência das
atividades farmacológicas relacionadas ao grupo e apor sua estrutura proteica
isolada de modo não usual, por resistir a condições sob as quais proteínas
geralmente desnaturam (Lindholm et al., 2002, Felizmenio-Quimio et al., 2001,
Hallock et al., 2000). Estudos que relacionam atividade biológica com proteínas
cíclicas, como o feito por Hermann et al., em 2008, verificaram o potencial
citotóxico desse grupo de substâncias, isoladas de Viola biflora. Outra espécie,
Viola tricolor, igualmente apresentou atividade citotóxica decorrente dos
ciclopeptídeos presentes. Wang et al. (2008) verificaram que ciclopeptídeos
isolados de Viola yedoensis apresentaram atividade contra HIV. Viola genus,
outra espécie de Violaceae, apresentou atividade antimalárica (Moon et al.,
2007). Além desses compostos, há ocorrência de flavonoides (Vukics et al.,
2008a, Vukics et al., 2008b, 2008c, Flamini, 2007), saponinas triterpênicas
(Moon et al., 2004) e óleos essenciais (Flamini et al., 2003).
Informações obtidas de Abarema auriculata (Fabaceae Mimosoidae)
refletem número de estudos inexistentes sobre farmacologia e fitoquímica para
a espécie e para o gênero. Para a subfamília, relata-se a presença de lectinas,
em Parkia platycephala (Gallego Del Sol et al., 2002) e a presença de
saponinas triterpenoides (Haridas et al., 2001).
11
Pentaclethra macroloba é espécie pertencente à família das Fabaceae;
em termos do gênero, estudos fitoquímicos com P. macroloba demonstraram
compostos químicos ou a ocorrência de vários metabólitos secundários, como
alcaloides, saponinas, flavonoides e substâncias fenólicas, e uma série de
vitaminas, como riboflavina, niacina, entre outras (Okwu e Aluwuo, 2008).
A espécie Swartzia sericea var. sericea não apresenta estudo referente
às características fitoquímicas e farmacológicas de seus extratos. Entretanto,
estudos foram feitos em outras espécies de Swartzia em termos fitoquímicos e
biológicos. Observou-se a presença de uma isoflavona nos extratos
clorofórmicos e benzênicos da madeira de S. brachyraquis var. brachyraquis,
isolada por métodos cromatográficos, e analisadas por métodos
espectrométricos (Sanchez et al., 1999). Diterpenos foram isolados de S.
arborescens (Orphelin et al. 1996). Pterocarpanos isolados de S. polyphylla
foram patenteados como substâncias antagônicas ao hormônio masculino
(Hirayama et al., 1994).
Xylopia aromatica apresentou atividade contra espécies de Leishmania sp.
e Trypanosoma cruzi (Osorio et al., 2007), contra plasmódio (de Mesquita et al.,
2007), contra Aedes aegypti (Rodrigues et al., 2006) e atividade antibacteriana
(Takahashi et al., 2006). Além disso, estudos indicam a presença de diterpenos
caurenoicos (de Melo et al., 2001), outros compostos voláteis (Jürgens et al.,
2000) e acetogeninas (Colman-Saizarbitoria et al., 1995; Colman-Saizarbitoria
et al., 1994).
Espécies de Symphonia, encontradas em várzeas de florestas tropicais,
já foram amplamente investigadas fitoquimicamente e quanto aos efeitos
biológicos. Marti et al., 2010, detectaram do extrato etil-acetato da casca das
12
raízes de S. globulifera grande atividade antimalárica (97% a 10μg/mL). A
investigação fitoquímica desse extrato levou ao isolamento de nove compostos
do tipo acilfloroglucinóis poliprenilados policíclicos (PPAPs) e dois derivados
oxidados. Todos os compostos apresentaram atividade antimalárica com
concentração inibitória 50%. Ngouela et al (2006) detectaram atividade
antimalárica em xantona denominada gaboxantona, isolada da casca da
semente de S. globulifera, junto com outros conhecidos, como sistosterol, ácido
oleanólico e citrato de metila. A estrutura do composto foi determinada como
5,10-dihidroxi-8,9-dimetoxi-2,2-dimetil-12-(3-metilbut-2-enil) pirano [3,2-
b]xanten-6(2H)-ona, por meio de análises espectroscópicas. Bayma et al.
(1998) isolaram da casca da raiz de S. globulifera, nova xantona prenilada,
ananixantona. Nkengfack et al. (2002), usando fracionamento biodirecionado
do extrato da casca da raiz de S. globulifera, isolaram estigmasterol e duas
novas xantonas com unidades isoprenoides, denominadas globulixantonas A
(1) e B (2).
Com a proposta de complementar os estudos referentes aos sinais iniciais
de toxicidade, ansiedade e locomoção, o presente trabalho propôs a avaliação
da influência da atividade dos dez extratos vegetais sobre a concentração de
testosterona sérica em camundongos machos adultos.
13
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Testosterona
Os testículos secretam hormônios sexuais masculinos, chamados
coletivamente androgênios, entre os quais testosterona, di-hidrotestosterona e
androstenediona estão incluídas. De acordo com de Lima e Cardoso (2011), no
organismo masculino a testosterona é o esteroide mais abundante, a ponto de
ser considerado o hormônio testicular fundamental. Em torno de 95% da
testosterona circulante é secretada pelos testículos e apenas 5% pelas
glândulas suprarrenais.
A testosterona é considerada o principal andrógeno da circulação,
responsável pelo desenvolvimento e manutenção das características sexuais
masculinas (Gebara et al., 2002), como desenvolvimento reprodutivo, aumento
de massa muscular, presença de pelos e desempenho sexual (Biatek et al.,
2004).
A testosterona é sintetizada a partir do colesterol por uma sequência de
cadeias enzimáticas dentro das células de Leydig, localizadas no interstício do
testículo maduro (Bagatell e Bremner, 1998). O colesterol utilizado pode ser
obtido a partir de síntese de novo realizada pelas próprias células, que
capturam ésteres de colesterol armazenados na matriz extracelular, ou obtido
diretamente de lipoproteínas de baixa densidade, conhecida como LDL
(Gebara et al., 2002). Na mitocôndria da célula de Leydig, o colesterol é
transformado em pregnenolona, que por sua vez difunde-se ao citosol indo até
o retículo endoplasmático liso onde, por ação de enzimas, é convertida,
subsequentemente, em delta-5 pregnenolona, 17 α hidroxiprepnenolona,
14
dihidroepiandrosterona (DHEA), androstenediol e pela ação da enzima 17 β
hidroxiesteroide desidrogenase, em testosterona (Boff, 2010).
Sua produção é controlada por um sistema de retroalimentação negativa
do hipotálamo e da adenohipófise. A secreção testicular de testosterona é
regulada, primariamente, pela secreção de hormônio luteinizante (LH), pela
hipófise anterior, a qual estimula a estereoidogênese nas células de Leydig,
aumentando o substrato para sua formação (Gebara et al, 2002). A quantidade
de testosterona secretada aumenta em proporção direta à quantidade de LH
disponível (Lise et al, 1999).
A maior parte da inibição de LH provavelmente resulta de efeito direto da
testosterona sobre o hipotálamo, reduzindo a secreção do hormônio liberador
de gonadotropina (GnRH), que por sua vez produz redução correspondente na
secreção de LH e de FSH (hormônio folículo estimulante) pela hipófise anterior;
essa redução de LH diminui a secreção de testosterona pelos testículos (de
Lima e Cardoso, 2011).
Após a sua secreção pelos testículos, cerca de 97% da testosterona
liga-se de forma fraca à albumina plasmática e mais fortemente a uma beta-
globulina denominada globulina ligadora de hormônios sexuais (SHBG) e
circula na sua forma ligada no sangue (Lima, 2008).
Pequena porcentagem da testosterona é convertida em metabólitos
biologicamente ativos; entretanto, a maioria é convertida em metabólitos
inativos, excretados pelos rins e vias biliares. A testosterona é convertida, pela
5-alfa-redutase, em dihidroepiandrosterona na próstata, e em menor extensão
na pele e no fígado. A dihidroepiandrosterona é o mais ativo agonista receptor
de testosterona, que por aromatização é igualmente convertida em estradiol em
15
menor proporção. No cérebro, a aromatização da testosterona em estradiol tem
importante efeito na regulação da secreção de gonadotrofina e na função
sexual (Gebara et al, 2002).
Em geral, a testosterona é responsável pelas características peculiares
do corpo masculino e é secretada durante três fases da vida. Na vida fetal,
quantidades moderadas de testosterona são produzidas durante todo o
desenvolvimento fetal e durante três ou mais semanas após o nascimento.
Quando os testículos não são funcionais durante a vida fetal, ou quando existe
ausência genética de receptores de androgênios nas células alvo, não há
desenvolvimento de qualquer dos órgãos sexuais masculinos, e
consequentemente, em seu lugar, formam-se os órgãos sexuais femininos.
Em camundongos machos, os picos acentuados de testosterona
acontecem entre o 18º e 19º dias de gestação, e novamente após as primeiras
horas após o parto; essa exposição resulta na masculinização e
desfeminização do cérebro (Bernardi, 2006).
Grandes mudanças nos níveis de hormônios reprodutivos ocorrem
durante a puberdade, como GnRH aumenta gradualmente, o LH estimula a
maturação das células de Leydig, resultando na esteroidogênese ativa e
aumento da concentração de andrógeno intratesticular. Com o passar dos
anos, a partir da terceira década de vida, os níveis de testosterona em homens
saudáveis diminui de 1% a 2% por ano (Andersen et al, 2011).
Os esteroides anabólico-androgênicos (EAA) são um grupo de
compostos sintéticos formados pela testosterona e seus derivados, utilizados
primariamente em indivíduos do sexo masculino com deficiência androgênica e
manutenção das características secundárias masculinas, em crianças com
16
retardo da puberdade e adultos com insuficiência testicular (Lize et al, 1999).
Os EAA são geralmente usados por via oral ou parenteral, porém exercem
efeitos tóxicos no fígado. Para minimizar a toxicidade hepática, a estrutura
molecular dos compostos é alterada por alquilação ou esterificação. A
alquilação na posição 17-α diminui a metabolização hepática, aumentando a
efetividade oral. A esterificação do grupo 17-β-hidroxil com ácidos carboxílicos
resulta em compostos que podem ser utilizados como injetáveis de liberação
lenta, o que diminui a toxicidade hepática em relação aos orais, e apresentam
menor potência, como, por exemplo, o proprionato de testosterona. Quanto
maior a cadeia carbônica do éster, mais lipossolúvel se torna o esteroide e
mais prolongada sua ação (de Lima e Cardoso, 2011).
A utilização de EAA é contraindicada em homens portadores de câncer
de próstata, em mulheres com câncer de mama e gestantes, pois esses
fármacos atravessam a barreira placentária e podem causar masculinização
em fetos femininos (Lize et al, 1999).
2.2. Produtos naturais que influenciam a produção de testosterona
Uma variedade de plantas é utilizada com o objetivo de estimular a
produção de testosterona. Estudos com extrato de Tribulus alatus
demonstraram aumento significativo dos níveis de testosterona endógena de
ratos machos após administração oral do extrato alcoólico de Tribulus alatus,
uma vez ao dia, durante 40 dias (El-Tantawny et al., 2007). Segundo
Gauthaman et al (2002), a protodiocina, um tipo de saponina esteroidal
encontrada em extratos vegetais de T. terrestris, aumenta os níveis de
testosterona, hormônio luteinizante, dehidroepiandrosterona, conforme estudos
17
com ratos castrados, que demonstraram melhora do comportamento sexual.
Além disso, estudos comprovaram o efeito anti-hipertensivo do extrato aquoso
da fruta do T. terrestis em ratos; constatou-se atividade maior da enzima
conversora de angiotensina (ECA) nos tecidos e soro dos ratos alimentados
com T. terrestis (Lemos et al, 2011).
Panax ginseng C.A Meyer (Araliaceae) possui como principais
componentes ativos ao menos 18 ginsenosídeos, um grupo diverso de
saponinas esteroidais que podem atuar em diversos tecidos e produzir uma
variedade de respostas farmacológicas complexas. Outros componentes
incluem polissacarídeos, flavonoides, aminoácidos e vitaminas (Nocerino et al.,
2000; Schenkel, 2007). Frequentemente, P.ginseng é utilizado para aumentar o
desempenho físico e melhorar a vitalidade, a função imunológica, a função
sexual e a fertilidade. Contudo, não há estudos conclusivos sobre a ação
benéfica de P.ginseng, porém, no aspecto reprodutivo, proporcionou a
produção de gametas. Os ginsenosídeos Rb2, RC e Re demonstraram ação
estimulatória sobre a motilidade e capacitação dos espermatozoides in vitro
(Kuntze et al, 2012).
Segundo Kuntze et al, 2012, Ginko biloba L. (Ginkoaceae) contém
alguns traços de constituintes potencialmente perigosos, os ácidos ginkgólicos,
mas garante certa quantidade de outros componentes ativos, como glicosídeos
flavonoides e terpenos. Os componentes flavonoídicos atuam como
antioxidantes e reduzem a fragilidade capilar (Tesch, 2002). Em ratos machos,
a administração oral de G. biloba L. intensificou o comportamento copulatório,
indicando efeito afrodisíaco. Em células de Leydig cultivadas in vitro, os autores
18
verificaram que o extrato padrão induziu a produção de testosterona (Kuntze et
al, 2012).
O extrato lipoesterólico de Serenoa repens, além de ser um potente anti-
inflamatório, demonstrou resultados promissores no tratamento da hiperplasia
benigna de próstata, por meio da inibição da atividade da enzima 5α-redutase.
Os compostos responsáveis pelo efeito seriam os fitoesteróis, que igualmente
apresentaram afinidade pelos receptores androgênicos citossólicos da
dehidrotestosterona (DHT), assim competindo com esse hormônio, resultando
na diminuição da exposição das células prostáticas à estimulação hormonal
(Yunes et al, 2001).
O extrato aquoso de Lepidium meyenni Walp, Brassicacea, quando
administrado na dose de 2g/kg, por 14 dias, produziu aumento significativo dos
níveis séricos de testosterona em camundongos machos (Ramírez e Acevedo,
2012).
No norte da Tailândia, extratos vegetais preservados em álcool são
usados para fazer crescer a libido de homens com idade avançada, o que se
dá pelo aumento da produção de testosterona sérica no sangue. Porém,
estudos com sete desses extratos vegetais obtidos de espécies de Betula
alnoides, Begonia strigosa, Polygala chinensi, Desmodium renifolium,
Shenodesme pentandra, Myrica esculenta e Pothos catchcarti indicaram
redução dos níveis séricos de testosterona, com aumento dos níveis de
prolactina, possivelmente porque esses extratos possuem substâncias
biologicamente ativas que induziriam distúrbios hormonais (Wanichacheewa et
al, 2000).
19
3. OBJETIVO GERAL
O objetivo geral do trabalho foi avaliar a influência de extratos vegetais
obtidos de plantas amazônicas e da Mata Atlântica sobre a concentração sérica
de testosterona.
3.1. Objetivos específicos
Avaliar a concentração sérica de testosterona em camundongos
Balc-c machos;
Avaliar o peso corpóreo de camundongos Balc-c machos;
Avaliar o peso dos testículos + epidídimo de camundongos Balc-c
machos.
20
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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25
5. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Os extratos interferiram na concentração sérica de testosterona em
camundongos pós-púberes. As moléculas presentes nesses extratos, que
seriam consideradas responsáveis pela influência sobre a produção de
testosterona, ainda não foram isoladas, porém, com base nos dados da
literatura, provavelmente moléculas de saponinas terpênicas e xantinas seriam
apontados como prováveis grupos a serem investigados.
26
6. ARTIGO CIENTÍFICO
27
AVALIAÇÃO DE EXTRATOS VEGETAIS BIOATIVOS DE PLANTAS
AMAZÔNICAS SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE TESTOSTERONA SÉRICA
EM CAMUNDONGOS PÓS-PÚBERES
Paula Andreotti Rodriguesa, Maria Martha Bernardia, Ivana Barbosa Suffredinia,b
aPrograma de Pós-Graduação em Patologia Ambiental e Experimental,
Universidade Paulista – UNIP, São Paulo, Brasil; bLaboratório de Extração do
Núcleo de Pesquisas em Biodiversidade, Universidade Paulista - UNIP - São
Paulo, Brasil.
RESUMO
Extratos vegetais antitumorais e antibacterianos obtidos das espécies
Amphirrhox longifolia (Violaceae), Abarema auriculata, Pentaclethra macroloba
e Swartzia sericea var. sericea (Fabaceae), Xylopia aromatica (Annonaceae),
Symphonia globulifera e Moronobea coccinea (Clusiaceae), Picrolemma
sprucei (Simaroubaceae), Laetia suaveolens (Salicaceae) e Ipomoea alba
foram previamente avaliados quanto à toxicidade, e quanto à influência sobre
ansiedade e locomoção. No presente estudo, os mesmos extratos foram
avaliados quanto à influência sobre a concentração de testosterona sérica em
camundongos machos adultos. Grupos de 12 animais foram usados para testar
cada um dos extratos, o veículo usado para suspender os extratos e
testosterona, que foi administrada por via oral e intraperitoneal (V.O. e I.P).
Doses correspondentes a 10% da dose não letal (dado obtido em trabalhos do
grupo) de cada extrato foram administradas V.O., por seis dias consecutivos,
com descanso no sétimo dia. Seis animais de cada grupo foram eutanasiados
28
no 22º dia de tratamento, e o peso corporal e dos testículos/epidídimo foi
obtido, como o sangue foi retirado para a quantificação hormonal em kits
ELISA. Os seis animais remanescentes permaneceram por mais 23 dias sem
receber os tratamentos e, no 45º dia, foram pesados, eutanasiados, os
testículos+epidídimo foram retirados e pesados e o sangue retirado para se
medir a quantidade de testosterona sérica. Os extratos antitumorais e
antibacterianos testados, identificados como EB149, EB284, EB689, EB719,
EB827, EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 e EB1765, interferiram na
concentração sérica de testosterona em camundongos pós-púberes. O peso
corpóreo dos camundongos tratados com os extratos EB817, Eb1097, EB1257,
EB1493 e EB1765 apresentou-se alterado em relação aos grupos controle; por
esse motivo, ao analisar o ganho de peso no período de tratamento, observou-
se que apenas os camundongos tratados com os extratos EB149 e EB689
apresentaram alterações em relação aos animais dos grupos controle. Por fim,
camundongos tratados com os extratos EB827, EB1257 e EB1765
apresentaram testículos+epidídimo (pesados em conjunto) com peso mais
elevado, em relação aos camundongos dos grupos controle.
Palavras-chave: extratos vegetais, testosterona, toxicidade, hormônios.
29
ABSTRACT
Antitumor and antibacterial plant extracts obtained from Amphirrhox
longifolia (Violaceae), Abarema auriculata, Pentaclethra macroloba e Swartzia
sericea var. sericea (Fabaceae), Xylopia aromatica (Annonaceae), Symphonia
globulifera e Moronobea coccinea (Clusiaceae), Picrolemma sprucei
(Simaroubaceae), Laetia suaveolens (Salicaceae) e Ipomoea alba were
previously evaluated in relation to their toxicity and influence on behavior and
locomotion. In the present work, the influence of these extracts on seric
testosterone of post-pubertal mice. Groups of 12 animals were used for testing
each plant extract, or testosterone or the vehicle used to suspend extracts and
testosterone. All treatments were orally administered, but testosterone, which
were both orally and intraperitoneally administered. Doses corresponding to
10% of the non-lethal dose (data found elsewhere) of each extract were
administered for six consecutive days, suspending treatment administration on
the seventh day. Six animals per group were euthanized on the 22nd Day of
treatment, and body weight, as well as testis+epididimum weight were obtained.
Blood of each animal was collected to the serum quantification of testosterone
using immunoassay. The six animals of each group remained for 23 extra days
without receiving treatments, and in the 45th day they were weighed,
euthanized, testis+epididimum taken and weighed and blood was collected and
tested for seric testosterone concentration. Plant extracts identified as EB149,
EB284, EB689, EB719, EB827, EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 and
EB1765 influenced seric testosterone concentration in male post-pubertal mice.
Mice that received extracts EB817, Eb1097, EB1257, EB1493 and EB1765 as
treatments showed alterations in body weight, in relation to control mice. Weight
30
gain was also analysed and showed that only extracts EB149 and EB689
showed improvement in weight in relation to controls. Finally, elevated weight of
testis+epididimum of mice treated with extracts EB827, EB1257 and EB1765
were shown.
Keywords: plant extracts, testosterone, cytotoxicity, hormones.
31
1. INTRODUÇÃO
A testosterona é o hormônio gonadal testicular mais relevante, responsável
pelo desenvolvimento reprodutivo, pelo aumento de massa muscular, presença
de pelos, desempenho sexual e libido e diminuição do risco de osteoporose, e
exerce influência sobre diversos tecidos, como o cerebral (Biatek et al., 2004),
a musculatura cardíaca (Elamm et al., 2012), sobre tecidos renais e sistemas
endócrinos (Hewitson et al., 2012), entre outros. Variações da concentração
desse hormônio no decorrer da vida levaria ao desenvolvimento de
cardiopatias (Elamm et al., 2012), da Doença de Alzheimer (Rosario et al.,
2010), à queda da massa muscular e à predisposição à arteriosclerose e
alterações enzimáticas relacionadas ao metabolismo de proteínas, carboidratos
e gordura (Kaufman and Vermeulen, 2005), além de afetar fatores relacionados
à memória e comportamento (Gerardin et al., 2005; Ǻgmo, 1997). A produção
de testosterona pelas células de Leydig localizadas nos testículos é feita a
partir do colesterol, e controlada por um sistema de retroalimentação
denominado eixo hipotálamo-hipofisário-gonadal (Kumar e Kaur, 2013), que se
altera com o envelhecimento do macho, alterando suas funções e o deixando
predisponível a doenças. Portanto, estudos relacionados à interferência de
medicamentos sobre a produção hormonal são relevantes, pois a ingestão de
medicamentos tende a aumentar no decorrer da vida. A utilização de
medicamentos naturais, que apresentam compostos de estrutura química
semelhantes aos hormônios, deve ser avaliada com rigor nas diferentes fases
de vida, no que diz respeito às interações com os hormônios sexuais.
A testosterona, em termos químicos, apresenta o núcleo esteroidal comum
a vários hormônios. Essa estrutura está relacionada à sua biossíntese, que se
32
dá a partir do colesterol. De modo geral, a síntese é feita a partir de uma
sequência de cadeias enzimáticas existentes nas células de Leydig, em tecidos
testiculares já maduros. O colesterol utilizado pode ser obtido a partir de
síntese de novo realizada pelas próprias células que captura, ésteres de
colesterol armazenados na matriz extracelular ou ser obtido diretamente de
lipoproteínas de baixa densidade, ou LDL (Gebara et al., 2002).
Cai et al. (2001) isolaram várias saponinas esteroidais de Tribulus
terrestris, planta cujo uso é difundido por melhorar desempenhos relacionados
à testosterona. O extrato aquoso de Lepidium meyenii Walp (Brassicacea)
apresentou aumento significativo dos níveis séricos de testosterona em ratos
machos jovens (Ramírez e Acevedo, 2012), possivelmente por ação indireta de
saponinas. Desse modo, verifica-se que extratos vegetais apresentariam
interferência direta na concentração de testosterona sérica em ratos e
camundongos por conta da similaridade estrutural de moléculas naturais aos
hormônios sexuais (Oshima, 2003).
Em trabalhos anteriores, dez extratos vegetais obtidos de Amphirrhox
longifolia (Violaceae), Abarema auriculata, Pentaclethra macroloba e Swartzia
sericea var. sericea (Fabaceae), Xylopia aromatica (Annonaceae), Symphonia
globulifera e Moronobea coccinea (Clusiaceae), Picrolemma sprucei
(Simaroubaceae), Laetia suaveolens (Salicaceae) e Ipomoea alba
(Convolvulaceae), foram testados em modelos biológicos de citotoxicidade e
antibacterianos, e apresentaram atividade significante, cujos resultados são
vistos em outras publicações (Suffredini et al., 2006a; Suffredini et al., 2006b;
Suffredini et al., 2006c; Suffredini et al., 2007a; Suffredini et al., 2007b). Por
esse motivo, foram testados quanto à toxicidade aguda e influência sobre
33
ansiedade e locomoção (Estork, 2011; Gusmão, 2011), além de serem
determinadas as doses letais 50% e as doses não letais, observadas na tabela
1. Com a proposta de complementar os estudos referentes aos sinais iniciais
de toxicidade, ansiedade e locomoção, o presente trabalho propôs a avaliação
da influência da atividade dos dez extratos vegetais sobre a concentração de
testosterona sérica em camundongos machos adultos.
.
34
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Coleta de plantas
Diferentes órgãos das espécies vegetais A. longifolia, A. auriculata, P.
macroloba, S. sericea var. sericea, X. aromatica, S. globulifera, M. coccinea, P.
sprucei, L. suaveolens e I. alba foram coletados na Floresta Amazônica e na
Mata Atlântica, em áreas sob jurisdição do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
e dos Recursos Renováveis (Ibama), com licença obtida nesse órgão, número
12A/2008. Uma exsicata de cada material foi depositada no Herbário UNIP; os
números de registro, a identificação taxonômica das espécies e as partes
coletadas encontram-se descritos na tabela 1. O material vegetal, após ser
limpo, foi seco em estufa de circulação de ar (Fanem) a 40 ºC e depois moído
em moinho de martelo (Holmes). O material moído foi acondicionado em sacos
plásticos, selado, identificado e mantido em câmara fria até ser usado para
fazer os extratos (Younes et al., 2000).
2.2. Obtenção dos extratos
O material moído foi colocado em percoladores de vidro (Kontes) e a
mistura de solventes, composta por diclorometano e metanol (Synth ou Merck)
na proporção de 1:1, foi adicionada aos percoladores. O conjunto pó-mistura de
solventes foi mantido em contato por 24h, em maceração. O solvente foi
removido por evaporação rotativa (Buchii) e o extrato seco armazenado em
câmara fria a –20 ºC. Em seguida, água Milli-Q foi acrescentada ao pó da
planta e nova maceração foi feita por mais 24h. O extrato aquoso foi congelado
(Revco) e liofilizado (Virtis). O armazenamento dos extratos secos foi feito em
câmara fria, a –20 ºC. Dois extratos foram obtidos, portanto, com o mesmo
35
material vegetal: um extrato orgânico e um extrato aquoso (Younes et al.,
2000). No presente trabalho, apenas o extrato ativo de cada parte de planta foi
avaliado. Os extratos receberam identificação, relacionada na tabela 1.
2.3. Preparo dos extratos e substâncias de referência
Os extratos vegetais foram preparados na forma de suspensão em óleo de
amêndoas doces, tendo 5% de polissorbato 80 diluído em água como agente
suspensor dos extratos e como veículo a ser administrado no grupo controle
negativo. A dose a ser administrada variou conforme o extrato, e foi
determinada em 10% da dose não letal obtida em ensaios anteriores (Estork,
2011; Gusmão, 2011), como observado na tabela 1.
Dois grupos controles positivos foram estipulados. Para ambos, utilizou-se
propionato de testosterona 1g/kg (4-androsteno-3-ona, 17beta-ol), diluído em
óleo de amêndoas doces, porém, um grupo recebeu administração por via oral
e outro grupo por via intraperitoneal.
2.4. Animais
Foram utilizados camundongos Balb/C machos (Mus musculus), com
idade de 6 a 9 semanas, e peso com variação de 20g a 35g, provenientes do
biotério da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Os
camundongos foram trazidos ao Biotério UNIP e mantidos em microisoladores
para animais SPF (Specific Pathogen Free Organism), cinco animais por
gaiola. Os microisoladores foram colocados em sala com ciclo de luz
36
controlado de 12 horas claro por 12 horas escuro. Água e comida foram
fornecidas aos animais à vontade.
2.5. Ensaio hormonal
Animais dos grupos controle e experimentais foram divididos em grupos
de 12, cada (n=12, ntotal=156). Os tratamentos foram administrados por via oral
(V.O.) ou via intraperitoneal (I.P.), em um volume total que não excedesse 0,1
mg/kg. O experimento foi programado para ser realizado em 45 dias, sendo
que os animais receberam os tratamentos nos primeiros 22 dias e depois
ficaram sem recebê-los durante os outros 23 dias. Os tratamentos foram
administrados durante 6 dias por semana, intercalados com um dia sem o
recebimento do tratamento. Após os 22 dias iniciais, metade do grupo (n=6) foi
anestesiada e eutanasiada, e o sangue dos animais retirado por punção
hepática. O mesmo tratamento foi feito com a outra metade do grupo (n=6), no
45º dia.
O peso corpóreo dos animais foi obtido no 1º, 22º e 45º dias de
experimento. O peso dos testículos + epidídimo foi obtido no 22º e 45º dias de
experimento.
2.5.1. Avaliação da dosagem da testosterona sérica
A dosagem da testosterona sérica foi avaliada pelo Kit de ELISA USCN-
E90458Mu Enzyme-linked Ammunosorbent Assay Kit for Testosterone for
37
mouse. Os experimentos foram feitos de acordo com as instruções do
fabricante, pela empresa Genese Produtos Diagnósticos Ltda.
2.6. Forma de análise dos resultados
Os resultados dos níveis séricos de testosterona e do peso corporal e
dos testículos+epidídimo foram analisados por análise de variância ANOVA de
duas entradas e teste posterior de comparação das diferenças entre as médias
obtidas de Bonferroni (GraphPad® Prism 5.0).
3. Resultados e discussão
Dez extratos vegetais obtidos de espécies de A. longifolia (EB284), A.
auriculata (EB689), P. macroloba (EB827), S. sericea var. sericea (EB1097), X.
aromatica (EB149), S. globulifera (EB1257), M. coccinea (EB1765), P. sprucei
(EB1151), L. suaveolens (EB719) e I. alba (EB1493) foram previamente
submetidos a ensaios de toxicidade aguda, ansiedade e locomoção, em
camundongos (Estork, 2011; Gusmão, 2011). A atividade dos extratos vegetais
sobre a concentração de testosterona sérica em camundongos foi avaliada
como dado toxicológico complementar, pois a principal atividade farmacológica
atribuída aos extratos relaciona-se à atividade antitumoral e antimicrobiana.
Em relação à concentração sérica de testosterona (figura 2), o
tratamento com diferentes extratos afetou os resultados experimentais de modo
muito significante (F(12;130)=2,87; p<0.01) e representa 16,45% da variância
total. Já a medida nos diferentes tempos teve influência significante
(F(1;130)=5.82; p<0.05), e representa apenas 2,78% do total da variância. Já a
38
interação entre as duas variáveis é muito significante (F(12;129)=3,25; p<0.001), e
representa 18,62% do total da variância.
Em relação aos grupos controles, não foram observadas diferenças
entre as concentrações séricas de testosterona nos animais do grupo controle
veículo e do grupo Testo V.O. Por outro lado, diferenças significantes foram
observadas na concentração sérica de testosterona dos animais do grupo
controle Testo I.P. (p<0,001), no 45º dia de experimento, que foram menores
do que as observadas para o grupo controle veículo. Portanto, o que se pode
concluir é o fato de a molécula de propionato de testosterona administrada por
via oral pode ter sofrido o efeito de primeira passagem, resultando em um
metabólito menos ativo do que a molécula original, que demonstrou ser mais
ativa quando administrada por via intraperitoneal.
A administração dos extratos por 22 dias, no regime de 6 dias de
tratamento e 1 dia de descanso, resultou em interferências significantes na
concentração sérica dos animais, nos dados referentes ao 45º dia. De acordo
com a figura 2, observa-se que, de modo significante (p<0,05), todos os grupos
tratados com extratos vegetais (EB149, EB284, EB689, EB719, EB827,
EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 e EB1765) influenciaram a concentração
sérica de testosterona em relação ao controle. Porém, não foram observadas
diferenças entre os grupos no 22º dia de experimento. As diferenças
observadas podem se referir a uma alteração no desenvolvimento das gônadas
dos animais, pois os extratos foram administrados na fase pós-púbere na qual
se encontravam. Considera-se, para se estabelecer os parâmetros de análise
relativos à idade dos animais, o tempo de vida que os animais chegaram ao
laboratório (entre 6 e 9 semanas), acrescido de uma semana de adaptação às
39
condições experimentais, mais três semanas de tratamento, o que leva os
animais a apresentarem idade variando entre 10 e 13 semanas ao final do 22º
dia, e 13 a 16 semanas no 45º dia, considerados recém-saídos da puberdade
durante o período experimental. Observa-se que, de acordo com a figura 3,
todos os animais apresentam baixa concentração de testosterona no 22º dia, o
que caracteriza essa condição, reforçada pela elevada concentração de
hormônios do grupo controle no 45º dia. A maturidade sexual dos
camundongos ocorre entre a 5ª e a 8ª semanas de vida, sendo que os machos
têm a tendência ao amadurecimento em período posterior ao das fêmeas
(www.research.uci.edu/tmf/husbandry.htm). Entre a 8ª e a 12ª semanas de
vida, casais de camundongos podem ser colocados para cruzar.
A interferência na produção de testosterona nos grupos tratados com
extratos vegetais abre a possibilidade de os extratos vegetais apresentarem
algum componente pertencente a grupos específicos de princípios ativos,
particularmente os que apresentam estrutura esteroidal, como alguns tipos de
saponinas, ou glicosídeos cardioativos. De modo geral, espécies como Tribulus
alatus, cujo uso popular está relacionado ao aumento de massa muscular,
apresenta essas propriedades possivelmente relacionadas à presença de
saponinas esteroidais (El-Tantawny et al., 2007).
Dos extratos estudados, poucos apresentam estudos químicos
relatados. Estudos anteriores mostram que X. aromatica apresenta diterpenos
caurenoicos (de Melo et al., 2001), compostos voláteis (Jürgens et al., 2000) e
acetogeninas (Colman-Saizarbitoria et al., 1995; Colman-Saizarbitoria et al.,
1994). A. longifolia não apresenta dados químicos, mas espécies correlatas
apresentam compostos da classe dos ciclopeptídeos/ciclotídeos (Svangard et
40
al., 2004); além desses compostos, há a ocorrência de flavonoides (Vukics et
al., 2008a, Vukics et al., 2008b, Flamini, 2007), saponinas triterpênicas (Moon
et al., 2004) e óleos essenciais (Flamini et al., 2003). Os extratos EB689,
EB827 e EB1097 foram obtidos de espécies de Fabaceae (Leguminosae), e
ainda não foram estudados quimicamente. Porém, espécies correlatas
apresentam saponinas triterpênicas (Haridas et al., 2001). O extrato 719 foi
obtido de L. suaveolens, planta cujos relatos químicos são inexistentes, porém,
espécies pertencentes ao mesmo gênero foram estudadas e apresentaram
diterpênicos clerodânicos, chamados de corymbulosinas A, B e C (Henry et al.,
2006). O extrato 1151, obtido de P. sprucei, também não apresenta relatos de
estudos químicos. Estudos prévios com essa espécie mostraram a presença de
quassinosídeos, denominados isobruceína B e neosergeolídeo (Silva et al.,
2009), além de neosergeolídeo (de Andrade-Neto et al., 2007). S. globulifera foi
a planta usada para se obter o extrato 1257. Estudos prévios mostraram a
presença de acilfloroglucinóis poliprenilados policíclicos, e M. coccinea, planta
da qual o extrato 1765 foi isolado, apresentou benzofenonas polipreniladas
(Marti et al., 2010). Diversos tipos de xantonas foram isoladas de S. globulifera.
Por fim, I. alba é a planta que originou o extrato 1493, e nenhum dado químico
da espécie foi encontrado, o que não acontece para várias espécies do gênero,
algumas muito estudadas, como a batata-doce.
O peso corporal dos animais e o peso dos testículos + epidídimo foram
obtidos. Em relação ao peso corporal (figura 3), observou-se que os
tratamentos representaram 36,41% da variância total (F(12;335)=32,08; p<0,001),
o tempo representou 16,62% da variância total (F(2;335)=87,87; p<0,001) e a
relação entre os dois representou 5.02% do total de variância (F(24;335)=2,21;
41
p<0,01). Para os extratos EB827, EB1097, EB1257, EB1493 e EB1765 houve
diferença muito significativa de peso em relação aos três controles usados
(p<0,001). Como essa diferença já foi observada desde a divisão dos animais
em grupos, no 1º dia de experimentos talvez essa alteração de peso esteja
relacionada não à influência dos hormônios sobre a massa muscular dos
animais, mas simplesmente à variação natural de peso que se manteve
durante o período de experimentos. Para evidenciar quaisquer alterações de
peso envolvidas com a administração dos extratos, foi feita análise do ganho
de peso, nos dias 22 e 45 em relação ao início do tratamento. Nessa análise,
observou-se que os tratamentos representaram um total de 15,42% da
variância (F(12;192)=6,93; p<0.001), e o tempo representou 7,84% do total de
variância (F(1;192)=225,38; p<0.001); a interação entre os dois não se mostrou
significante. Nas duas medidas obtidas, apenas os extratos EB149 (p<0,01) e
EB689 (p<0,05) apresentaram-se diferentes em relação ao controle.
A análise do peso dos testículos=epidídimo (tabela 4) foi feita após
eutanásia dos animais, nos dias 22 e 45 após o início do tratamento, que
mostrou-se significante (F(12;120)=4,60; p<0.01). O tempo não apresentou
significância relevante, porém a interação entre tratamento e tempo mostrou-se
significante (F(12;120)=2.58; p<0.001). Os dados indicam aumento no peso dos
testículos + epidídimo dos animais tratados com os extratos EB827, EB1257 e
EB1765, e a significância varia de p<0,05 a p<0,001.
42
4. Conclusões
Os extratos antitumorais e antibacterianos testados, identificados como
EB149, EB284, EB689, EB719, EB827, EB1097, EB1151, EB1257, EB1493 e
EB1765, interferiram na concentração sérica de testosterona em camundongos
pós-púberes. O peso corpóreo dos camundongos tratados com os extratos
EB817, Eb1097, EB1257, EB1493 e EB1765 apresentou-se alterado em
relação aos grupos controle, e por esse motivo, ao analisar o ganho de peso no
período de tratamento, observou-se que apenas os camundongos tratados com
os extratos EB149 e EB689 apresentaram alterações em relação aos animais
dos grupos controle. Por fim, camundongos tratados com os extratos EB827,
EB1257 e EB1765 apresentaram testículos+epidídimo (pesados em conjunto)
com peso mais elevado, em relação aos camundongos dos grupos controle.
43
Agradecimentos
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP
(2008/58706-8).
Revista para a qual pretende-se enviar o artigo: Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz.
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49
Tabela 1. Relação das espécies de plantas usadas para obtenção dos dez extratos usados administrados a camundongos Balb-c, para
verificação de sua influência sobre a concentração sérica de testosterona, após administração de doses repetidas. As doses administradas por
via oral aos camundongos representam 10% da dose não letal determinada em estudos prévios (Estork, 2011; Gusmão, 2011).
Espécie Família Número de
coleta Órgão usado N do extrato
Dose letal
50% [g/kg]*
Dose não
letal [g/kg]
Dose
experimental
[g/kg]
Xylopia aromatica Annonaceae IBS08 Caule EB149 1,25 0,6259 0,063
Amphirrhox longifolia Violaceae PSC80 Órgãos aéreos EB284 0,6259 0,3125 0,03125
Abarema auriculata Fabaceae Mimosoidae AAO3353 Caule EB689 0,0098 0,0049 0,0005
Laetia suaveolens Salicaceae AAO3383 Folhas e caule EB719 0,3125 0,1563 0,0156
Pentaclethra macroloba Fabaceae Mimosoidae AAO3481 Caule EB827 0,1563 0,0789 0,0079
Swatzia sericea var.
sericea
Fabaceae
Caesalpiniodeae AAO3501 Frutos EB1097 0,1563 0,0789 0,0079
Symphonya globulifera Clusiaceae AAO3717 Órgãos aéreos EB1257 0,6256 0,3125 0,0312
Picrolemma sprucei Simaroubaceae AAO3582 Órgãos aéreos EB1151 0,0625 0,0391 0,0039
Ipomoea alba Convolvulaceae AAO4031 Órgãos aéreos EB1493 2,500 1,25 0,1250
Moronobea coccinea Clusiaceae IBS142 Flores EB1765 2,500 1,25 0,1250
*Fonte: (Estork, 2011; Gusmão, 2011).
50
O
OH
Figura1. Representação estrutural da molécula de testosterona
51
Concentração de testosterona em soro de camundongo
Tratamento
[pg
/mL
]
149
284
689
719
827
1097
1151
1257
1493
1765
vehic
le c
ontrol
test
oster
ona V.O
.
test
oster
ona I.P
.0
5000
10000
15000
20000
***
***
***
***
*
*** ***
*
****** ***
Figura 2. Concentração de testosterona sérica obtida de camundongos tratados com
extratos vegetais, a partir de radioimunoensaio em placas de ELISA (USCN Kit
E90458Mu 96 tests enzyme-linked). Análise estatística ANOVA de duas entradas,
com teste posterior de Bonferroni e nível de significância p<0.05.
52
Peso corporal dos camundongos
Tratamento
peso
[g
]
Contr
ole v
eícu
lo
Testo
I.P.
Testo
V.O
.
EB14
9
EB28
4
EB68
9
EB71
9
EB82
7
EB10
97
EB11
51
EB12
57
EB14
93
EB17
65
15
20
25
30
35Controle veículo
Testo I.P.
Testo V.O.
EB149
EB284
EB689
EB719
EB827
EB1097
EB1151
EB1257
EB1493
EB1765
*
******
****** ***
***
****** ***
***
*######
# #
######
###
### #####
#$$$$$$
$
$$$
$
$
$$
Variação de peso corporal
Tratamento
[g]
Contr
ole v
eícu
lo
Testo
I.P.
Testo
V.O
.
EB14
9
EB28
4
EB68
9
EB71
9
EB82
7
EB10
97
EB11
51
EB12
57
EB14
93
EB17
65
-2
0
2
4
6
8
****
A
Figura 3. (A) Peso dos camundongos tratados com extratos vegetais, obtido nos dias
22 e 45 a partir do início do tratamento. (B) Ganho de peso dos camundongos tratados
com extratos vegetais, obtido nos dias 22 e 45 a partir do início do tratamento. Análise
estatística ANOVA de duas entradas, com teste posterior de Bonferroni e nível de
significância de p<0.05.
53
Peso dos testículos de camundongos
Tratamento
peso
[g
]
contr
ole v
eícu
lo
Testo
V.O
.
Testo
I.P.
EB14
9
EB28
4
EB68
9
EB71
9
EB82
7
EB10
97
EB11
51
EB12
57
EB14
93
EB17
65
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
*** ** **
Figura 4. Peso dos testículos de camundongos tratados com extratos vegetais aos 22
e 45 dias do início do tratamento. Análise de variância ANOVA de duas entradas, com
teste posterior de Bonferroni e nível de significância de p<0.05.
54
ANEXO I – Aprovação pelo Comitê de Ética
55
56
ANEXO II – Curriculum Lattes
Paula Andreotti Rodrigues
Curriculum Vitae
Fevereiro/2013
57
Paula Andreotti Rodrigues
Curriculum Vitae ______________________________________________________________________________________
Dados pessoais
Nome Paula Andreotti Rodrigues Nome em citações bibliográficas RODRIGUES, P. A. Sexo Feminino Filiação Wilson Rodrigues e Alice Andreotti Rodrigues Nascimento 08/07/1983 - São Paulo/SP - Brasil Carteira de Identidade 339318867 SSP - SP - 06/08/2007 CPF 322.663.588-39 Endereço residencial Praça Sampaio Vidal , 121, apto 114 Vila Formosa - Sao Paulo 03356-060, SP - Brasil Telefone: 11 27834968 ______________________________________________________________________________________
Formação acadêmica/titulação
2006 - 2007 Especialização em Fisioterapia Dermato-Funcional. Universidade Gama Filho, UGF, Brasil Título: Avaliação da Toxicidade do Nicotinato de Metila utilizado com o
método de fonoforese Orientador: Daclé Juliane Macrini 2000 - 2005 Graduação em Fisioterapia. Centro Universitário São Camilo, SÃO CAMILO, Brasil Título: Teste de caminhada de seis minutos em DPOC Orientador: Renata Trimer ______________________________________________________________________________________
Formação complementar
2008 - 2008 Curso de curta duração em Maquilador. SENAC, SENAC, Brasil 2007 - 2007 Curso de curta duração em Destoxiredução. Campcursos, 111, Brasil 2007 - 2007 Curso de curta duração em Shiatsu Nivel I. SENAC, SENAC, Brasil ______________________________________________________________________________________
Atuação profissional
1. Universidade Paulista - UNIP __________________________________________________________________
58
__________ Vínculo institucional 2007 - Atual Vínculo: Docente , Enquadramento funcional: Docente , Carga
horária: 25, Regime: Dedicação exclusiva
2. Vitaderm Hipoalergênica - VITADERM __________________________________________________________________
__________ Vínculo institucional 2007 - Atual Vínculo: Autônomo , Enquadramento funcional: Técnica , Carga
horária: 6, Regime: Parcial
3. Cruz Vermelha Brasileira - São Paulo - CVB/SP __________________________________________________________________
__________ Vínculo institucional 2007 - 2009 Vínculo: autônomo , Enquadramento funcional: Docente ,
Carga horária: 6, Regime: Parcial
4. Estética Onodera - ONODERA __________________________________________________________________
__________ Vínculo institucional 2006 - 2007 Vínculo: Avaliadora , Enquadramento funcional: Avaliadora e
atendimento em Dermato funcional , Carga horária: 30, Regime: Dedicação exclusiva
5. Centro Estético Roma - ROMA __________________________________________________________________
__________ Vínculo institucional 2005 - 2006 Vínculo: contratada , Enquadramento funcional: Avaliadora,
atendimento em Dermato Funcional , Carga horária: 35, Regime: Dedicação exclusiva
6. Le Ru - Estética especializada - LE RU __________________________________________________________________
__________ Vínculo institucional 2002 - 2005 Vínculo: contratada , Enquadramento funcional: Avaliadora ,
Carga horária: 30, Regime: Dedicação exclusiva Outras informações: Atendente, avaliadora, cooredenadora de procedimentos e gerente
______________________________________________________________________________________
59
Idiomas
Inglês Compreende Razoavelmente , Fala Razoavelmente , Escreve Pouco , Lê
Razoavelmente
Producão
______________________________________________________________________________________
Produção bibliográfica Livros publicados 1. Calvi, Eliziane Nitz de Carvalho, RODRIGUES, P. A., Thais Andreotti Gelsi Bambuterapia. São Paulo : Yendis, 2009, v.01. p.156. Palavras-chave: bambu, estética Áreas do conhecimento : Estética Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Impresso, ISBN: 9788577281091
Apresentação de trabalho e palestra 1. RODRIGUES, P. A. Influência da administração do extrato orgânico obtido de Abarema Auriculata sobre a concentração de testosterona sérica em camundongos, 2012. (Congresso,Apresentação de Trabalho)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Outro; Cidade: Bento Gonçalves; Evento: XXII Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil
Orientações e Supervisões
Orientações e supervisões Orientações e supervisões concluídas Trabalhos de conclusão de curso de graduação 1. Andressa Karoline Bicudo dos Santos. Tratamento de Estrias com uso de Eletrolifting. 2011. Curso (Fisioterapia) - Universidade Paulista
Referências adicionais : Brasil/Português.
2. Bruna Tanzillo Gomes Nogueira. ESTUDO COMPARATIVO DA DRENAGEM LINFÁTICA ASSOCIADA AO PRINCÍPIO ATIVO SILOXANETRIOL ALGINATO DE CAFEÍNA. 2010. Curso (fisioterapia) - Universidade Paulista Palavras-chave: drenagem linfática manual Áreas do conhecimento : Fisioterapia e Terapia Ocupacional Setores de atividade : Atividades profissionais, científicas e técnicas, Saúde humana e serviços sociais Referências adicionais : Brasil/Português.
Iniciação científica 1. Analu Ribeiro da Silva. Tratamentos estéticos em fissuras em região de calcâneo. 2012. Iniciação científica (Estética e Cosmética) - Universidade Paulista
Referências adicionais : Brasil/Português.
60
Eventos
Eventos Participação em eventos 1. Apresentação Oral no(a) I Congresso New Wstic, 2008. (Congresso) Ciclotermia para redução de gordura localizada. Organização de evento 1. RODRIGUES, P. A. Encontro Acadêmico de Estética e Cosmética, 2012. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
2. RODRIGUES, P. A. Encontro Prático de Estética - Dia de Vênus, 2012. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
3. RODRIGUES, P. A. Encontro Acadêmico de Estética e Cosmética, 2011. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
4. RODRIGUES, P. A. Encontro Prático de Estética - Dia de Vênus, 2011. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
5. RODRIGUES, P. A. A Semana da Mulher na UNIP, 2010. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
6. RODRIGUES, P. A. Encontro Acadêmico de Estética e Cosmética, 2010. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
7. RODRIGUES, P. A. Encontro Prático de Estética - Dia de Vênus, 2010. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
8. RODRIGUES, P. A. A Estética na Primavera, 2009. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
9. GUSMAO, D. F., MACRINI, D. J., RODRIGUES, P. A. Encontro De Estética e Cosmética, 2009. (Outro, Organização de evento)
Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Outro
10. RODRIGUES, P. A. Encontro de Estética e Cosmética (Cosmetologia e Estética) - Dia de Vênus, 2009. (Outro, Organização de evento) Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
11. RODRIGUES, P. A. Encontro Acadêmico de Cosmetologia e Estética da UNIP, 2008. (Outro, Organização de evento) Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Vários
12. GUSMAO, D. F., RODRIGUES, P. A., MACRINI, D. J. I Encontro Acadêmico de Prática em Estética da UNIP, 2008. (Outro, Organização de evento) Referências adicionais : Brasil/Português. Meio de divulgação: Outro
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______________________________________________________________________________________
Totais de produção
Produção bibliográfica
Livros
publicados......................................................................... 1
Apresentações de trabalhos
(Congresso).................................................... 1
Orientações
Orientação concluída (trabalho de conclusão de curso de
graduação)........................ 2
Orientação concluída (iniciação
científica)............................................... 1
Eventos
Participações em eventos
(congresso)...................................................... 1
Organização de evento
(outro)............................................................. 12
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Anexo III – Normas para publicação na revista Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
The manuscript should be prepared using standard word processing software and should be printed (font size 12) double-
spaced throughout the text, figure captions, and references, with margins of at least 3 cm. The figures should come in the
extension tiff, with a minimum resolution of 300 dpi. Tables and legends to figures must be submitted all together in a single file.
Figures, must be uploaded separately as supplementary file.
The manuscript should be arranged in the following order:
Running title: with up to 40 characters (letters and spaces)
Title: with up to 250 characters
Author's names: without titles or graduations
Institutional affiliations: full address of the corresponding author only
Summary: up to 200 words (100 words in case of short communications). It should emphasize new and important aspects of
the study or observations.
Key words: 3-6 items must be provided. Terms from the Medical Subject Headings (Mesh) list of Index Medicus should be
used.
Sponsorships: indicating the sources of financial support and change of address.
Introduction: should set the purpose of the study, give a brief summary (not a review) of previous relevant works, and state
what new advance has been made in the investigation. It should not include data or conclusions from the work being reported.
Materials and Methods: should briefly give clear and sufficient information to permit the study to be repeated by others.
Standard techniques need only be referenced.
Ethics: when reporting experiments on human subjects, indicate whether the procedures followed were in accordance with the
ethical standards of the responsible committee on human experimentation (institutional or regional) and with the Helsinki
Declaration of 1975, as revised in 1983. When reporting experiments on animals, indicate whether the institution's or a national
research council's guide for, or any national law on the care and use of laboratory animals was followed.
Results: should be a concise account of the new information discovered, with the least personal judgement. Do not repeat in
text all the data in the tables and illustrations.
Discussion: should be limited to the significance of the new information and relate the new findings to existing knowledge. Only
unavoidable citations should be included.
Acknowledgements: should be short and concise, and restricted to those absolutely necessary.
REFERENCES
must be accurate. Only citations that appear in the text should be referenced. Unpublished papers, unless accepted for publication, should not be cited. Work accepted for publication should be referred to as "in press" and a letter of acceptance of the journal must be provided. Unpublished data should only be cited in the text as "unpublished observations", and a letter of permission from the author must be provided. The references at the end of the paper should be arranged in alphabetic order according to the surname of the first author. CLICK HERE [+]
FIGURES AND TABLES MUST BE UNDERSTANDABLE WITHOUT REFERENCE TO THE TEXT
Figures: presented in tiff format with a minimum of 300 dpi and photographs must be sharply focused, well contrasted, and if
mounted onto a plate, the figures should be numbered consecutively with Arabic numbers. Magnification must be indicated by a
line or bar in the figure, and referenced, if necessary in the caption (e.g., bar = 1 mm). Plates and line figures should either fit
one column (8 cm) or the full width (16.5 cm) of the page and should be shorter than the page length to allow inclusion of the
legend. Letters and numbers on figures should be of a legible size upon reduction or printing. A colour photograph illustrates the
63
cover of each issue of the Journal and authors are invited to submit illustrations with legends from their manuscript for
consideration for the cover.
Tables: should supplement, not duplicate, the text and should be numbered with Roman numerals. A short descriptive title
should appear above each table, with any explanations or footnotes (identified with a, b, c, etc.) below.
Technical Notes: Technical Notes should communicate rapidly single novel techniques or original technical advances. The
entire note should occupy no more than three printed pages including figures and/or tables (it means around 10 double-spaced
typed Word file maximum). The text must not be not divided into sections. Therefore, the state of art must be very briefly
presented; results must be rapidly presented and discussed at a time. Complementary tables and figures may be published as
supplementary data. References must be limited to few essential ones and cited at the end of the note, using the same format
as in full papers. A brief summary and three key words must be provided.
Short communications: should communicate rapidly single results or techniques. They should occupy no more than three
printed pages including figures and/or tables. They should not contain excessive references. References should be cited at the
end of the paper using the same format as in full papers. A brief summary and three key words must be provided.
Alternative format: manuscripts may be submitted following the "Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to
Biomedical Journals" produced by the International Committee of Medical Journal Editors also known as the Vancouver Style. In
this case, authors should follow the guidelines in the fifth edition (Annals of Internal Medicine 1997; 126: 36-47, or at the website
http://www.acponline.org/journals/resource/unifreqr/htm) and will be responsible for modifying the manuscript where it differs
from the instructions given here, if the manuscript is accepted for publication.
Authors should also follow the Uniform Requirements for any guidelines that are omitted in these Instructions.
In case of clinical trials it’s mandatory to inform the registration number of the REBEC platform.
A statement that the data/results of the manuscript are not plagiarism and have not been published elsewhere.
ONCE A PAPER IS ACCEPTED FOR PUBLICATION, THE AUTHORS MUST PROVIDE:
an affidavit, provided by the Editorial Office, signed by all authors. Authors from different countries or institutions may sign in
different sheets containing the same basic statement;
a copyright assignment form, provided by the Editorial Office, signed by the corresponding author.
Page charges: there will be no page charges.
Proofs: one set of page proofs will be supplied for the author to check for typesetting accuracy, to be returned by the stipulated
date. No changes to the original manuscript will be allowed at this stage.