Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus
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AUTOINMUNIDAD EN LA
DIABETES MELLITUS
PERSPECTIVA DESDE EL
LABORATORIO
Mª Teresa Herrera del Rey
Unidad de Gestión Clínica de Laboratorios
HH.UU Virgen del Rocío Sevilla
![Page 2: Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022050912/568c53051a28ab4916b90e8e/html5/thumbnails/2.jpg)
I ) Diabetes tipo 1:
A. Inmunomediada
B. Idiopática
II ) Diabetes tipo 2
III) Otros tipos específicos:
1.- Defectos genéticos de la función de la célula β (MODY,
mitocondrial)
2.- Defectos genéticos de la acción de la insulina
3.- Enfermedades del páncreas exocrino
4.- Endocrinopatías
5.- Inducida por fármacos
6.- Infecciones
7.- Formas no comunes de diabetes inmunomediada
8.- Otros síndromes genéticos asociados ocasionalmente con diabetes
IV ) Diabetes gestacional
CLASIFICACIÓN ETIOLÓGICA DE DIABETES MELLITUS
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DIABETES TIPO 1 AUTOINMUNE
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En 1998 se presentan los resultados del estudio UKPDS:
Seguimiento de 5000 pacientes con DM tipo 2 durante 20 años.
Relación entre control intensivo de glucemia y morbi-mortalidad.
HALLAZGO: 7.5-10% de los pacientes diagnosticados de DM tipo 2
presentaron autoanticuerpos positivos ( anti- GAD e IA-2 ), no obesos y
con pocas manifestaciones de síndrome metabólico.
Edad < 50 años
Síntomas agudos
IMC<25
Anti- GAD positivos
Requieren insulina
LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults)
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T1D onset
<10 years
T1D
adult
onset
Autoimmune
phenotypic T2D
Nonimmune
phenotypic T2D
Age-related
deterioration of
glucose
tolerance
Debido a los descubrimientos de los últimos años, se propone un
cambio en el esquema de la clasificación tradicional de la
diabetes.
Tradicionalmente:
Edad de inicio
Síntomas hiperglucemia
Cetosis
Obesidad
Necesidad de tratamiento con
insulina
Actualmente: el sistema
inmune juega un papel
importante en la DM 2, con
similitudes y diferencias
entre DM 1 y DM2.
Is diabetes mellitus a continuous spectrum? Brooks-Worrell B, Palmer JP. Clinical Chemistry February 2011 vol. 57 no. 2 158-161
IS DIABETES MELLITUS A CONTINUOUS SPECTRUM?
![Page 6: Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022050912/568c53051a28ab4916b90e8e/html5/thumbnails/6.jpg)
PREDICCIÓN RIESGO DIABETES
• Marcadores genéticos
Sistema de antígenos humanos HLA: DR3/4 y DQ2/8 (2,4% desarrollan ICAs + antes de los 5 años) (No defecto genético sino variantes de genes)
• Pruebas metabólicas
Test tolerancia glucosa
Hemoglobina glicosilada (>6,5%)
• Medición de autoanticuerpos
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AUTOANTICUERPOS EN LA DIABETES
ANTI ISLOTES PANCREÁTICOS (ICA)
ANTI INSULINA
ANTI GLUTAMATO DESCARBOXILASA (GADA)
ANTI TIROSINA FOSFATASA (IA-2)
TRANSPORTADOR ESPECÍFICO DE Zn T8
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ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS DEL CITOPLASMA DE LAS CÉLULAS DE LOS ISLOTES PANCREÁTICOS (ICA)
• Descubiertos en 1974 (Bottazzo et al. Lancet)
• Positivos en aprox. 80% pacientes con diabetes mellitus
(DM) tipo1 recién diagnosticada
• Disminuyen conforme merma el funcionamiento de los
islotes
• Tipo IgG
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Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Conjugado
anti-hIgG /
fluorocromo
Analito
Ej.: ICA
Luz
UV
Tejido
Ej.: Páncreas Islotes Acinos
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Detección de ICA mediante inmunofluorescencia
indirecta sobre un corte de páncreas.
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ANTI INSULINA IAA
• Anticuerpos frente a la insulina (previo a la
administración de insulina)
Palmer et al (1983) describieron la presencia
de anticuerpos contra la insulina en el 50% de
pacientes de diagnóstico reciente (RIA)
• Su frecuencia estaba asociada a la edad:
niños, sobre todo menores de 10 años (RIA)
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• Informes contradictorios sobre su prevalencia y
valor pronóstico que parecen debidos a la diferente
metodología utilizada para su medición
• Los que se miden por RIA se encuentran más
vinculados a la enfermedad
• Los que se miden por ELISA no sirven para el
diagnóstico de la Diabetes Mellitus, sí para el
diagnóstico de las hipoglucemias autoinmunes.
ANTI INSULINA IAA
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ANTI DESCARBOXILASA DEL ÁCIDO GLUTÁMICO (GAD)
• Específicos contra enzima glutamato
decarboxilasa, síntesis del neurotransmisor
inhibidor ácido gamma-amino-butírico (GABA)
• Dos genes GAD:
GAD1: se traduce en proteína GAD67 (islotes de
ratón)
GAD2 (cromosoma 10): proteína GAD65 (islotes
cél. β humanos)
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ANTI DESCARBOXILASA DEL ÁCIDO GLUTÁMICO (GAD)
• Más del 70% de los pacientes de reciente
diagnóstico tienen niveles positivos después 10
años
• El GAD debe ser considerado como la primera
herramienta de screening.
• En DM tipo 2 distinguen a los pacientes que
necesitan insulina (LADA) (Van Deutekom y cols.
Diabet Med.2088;25:117-25)
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ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2
ICA-512
Glicoproteína transmembrana perteneciente a la
familia de las proteínas tirosina fosfatasa, localizada
en los gránulos secretores densos de las células
endocrinas secretoras de proteínas y las neuronas
Favorece unión de los gránulos secretores al cito-
esqueleto: activa transporte celular y la exocitosis
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ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2
•Son los de mayor valor predictivo positivo (VPP)
•Su presencia en la fase preclínica en niños predice
progresión a diabetes clínica (Grise y cols.
Diabetologia 2010; 53:517-524)
•Método de determinación: RIA y ELISA
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Inmunoanálisis con reactivos marcados
- Con compuestos radiactivos:
RIA heterogeneo competitivo
IRMA heterogeneo no competitivo
- Con enzimas: Enzimoinmunoanálisis
Peroxidasa, fosfatasa alcalina, Glucosa 6-fosfato, deshidrogenasa, B- galactosidasa...
Ventajas ELISA
Disponibles comercialmente
Se pueden conjugar por técnicas simples
Tienen varios sustratos
No se utiliza radiactividad (problema de desechos,etc)
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En nuestro laboratorio realizamos como apoyo al diagnóstico del
debut diabético:
Ac. Anti GAD
Ac. IA-2
Método de determinación
mediante ELISA en
microplaca.
Analizador Triturus (Grifols)
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IA-2
Incubación 16-20 h
IA2 - biotina
Lavado
Streptavidina -
Peroxidasa
TMB
Streptavidina -
Peroxidasa
Streptavidina -
Peroxidasa
Lavado
450 nm
A - [C] ELISA IA-2
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MODELOS ELISA
MATRIZ
Pocillo de la
micro placa
INSULINA
Analito: IAA
anti-IgG
humana
conjugado
con
peroxidasa
Mab anti-IgG
humana
Conjugado
anti-rIg /
peroxidasa
ELISA convencional aELISA (amplificado)
Ag
absorbido
a la
superficie
Sustrato tetra metil
bencidina (TMB)
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Expresión de Trx-GAD en E. coli
Obtención de la
fracción
intracelular soluble
Trx-GAD-biotina Biotinilación
Determinación de GADA
Marcación de la Trx-GAD recombinante con biotina
ELISA Ag-específico (Ae-ELISA)
Trx-GAD
Trx-GAD-biotina
Avidina-Px
Purificación
Thio-Bond
Resin
*
Trx-GAD *
GADA
Se utiliza como
LIGANDO un
CONJUGADO
GADA65-BIOTINA
(IA-2-BIOTINA)
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Función: transportar zinc desde el citoplasma
de las células beta al interior del gránulo de
secreción
Es el principal autoantígeno descubierto en los
últimos 10 años
Transportador de Zn T8
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Específico de células beta
Aporta información complementaria al
resto de los autoanticuerpos, aumentando
el porcentaje de detección
Método de determinación: RIA y ELISA
Transportador de Zn T8
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IAA: RESULTADOS DISCORDANTES ENTRE RIA
Y ELISA
“ La comparación frecuente de los méritos relativos de los
métodos radiactivos y enzimáticos es básicamente errónea, ya
que los principios que rigen estos ensayos son diferentes”
R. Ekins, 1980
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Conocer la prevalencia de auto-anticuerpos anti-GAD, anti-IA-2 y anti-insulina en el debut de la diabetes mellitus en nuestro medio, medidos mediante técnica ELISA.
Valorar su papel como apoyo diagnóstico.
OBJETIVOS
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MATERIAL Y METODOS
• Estudio observacional descriptivo para determinación de prevalencia y valoración de pruebas diagnósticas
• Muestra 111 pacientes debut diabético: 61 DM tipo 1 (incluye 12 casos DM tipo LADA (Latente Autoinmune del Adulto), 50 DM tipo 2. Grupo control de 64 personas no diabéticas.
• Enzimoinmunoanálisis en micro placa: Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) Autoantibody ELISA kit from RSR (RSR Limited), IA-2 Autoantibody ELISA versión 2 kit from RPR y AESKULISA Insulin-G (AESKU DIAGNOSTICS) para IAA.
• Criterio (+): GADA >5 U/ml, IA-2 >7,5 U/ml e IAA >15 U/ml.
• Análisis estadísticos mediante paquete PASW Statistics versión 18.
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RESULTADOS
![Page 28: Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022050912/568c53051a28ab4916b90e8e/html5/thumbnails/28.jpg)
PREVALENCIA AUTOANTICUERPOS EN DIABETES MELLITUS DE INICIO
RESULTADOS
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
%
Figura 1. Gráfico de frecuencias
Anti-GAD 78,7 2,0 7,8
Anti-IA2 31,7 4,0 3,1
IAA 10,3 6,0 1,7
DM 1 DM 2 Control
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VALORES MEDIANAS AUTOANTICUERPOS
Muestra Medianas (U/ml) Percentil 25-75
Control 2.59 1.88 – 3.54
GAD DM 1 108.00 4.56 – 304.00
DM 2 1.84 1.54 – 2.64
Control 5.16 4.56 – 5.70
IA2 DM 1 6.05 5.28 – 264.50
DM 2 5.21 4.73 – 5.73
Control 2.22 1.39 – 4.05
IAA DM 1 3.17 2.04 – 5.75
DM 2 3.72 1,69 – 5.84
GAD IA2 IAA
Control - DM 1 P< 0.0001 P< 0.0001 P = 0.0309
Control - DM 2 P = 0.0176 P = 0.3269 P = 0.0196
DM 1 - DM 2 P< 0.0001 P = 0.0002 P = 0.5850
0
20
40
60
80
100
120
Gráfico 2. Medianas
CONTROL 2,58 5,16 2,22
DM 1 108 6,05 3,17
DM 2 1,83 5,26 3,84
GAD IA2 IAA
RESULTADOS
![Page 30: Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022050912/568c53051a28ab4916b90e8e/html5/thumbnails/30.jpg)
CURVAS ROC (RECEIVER
OPERATING
CHARACTERISTICS)
RESULTADOS
![Page 31: Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022050912/568c53051a28ab4916b90e8e/html5/thumbnails/31.jpg)
La diabetes Mellitus tipo I es una enfermedad asociada a fenómenos de auto inmunidad humoral y celular que pueden ser detectados tanto en el momento del diagnóstico clínico como mucho tiempo antes.
La predicción de riesgo de diabetes incluye la combinación de marcadores genéticos, pruebas metabólicas y medición de auto-anticuerpos.
Los auto anticuerpos son de gran utilidad como marcadores precoces de enfermedad y como apoyo diagnóstico.
CONCLUSIONES
![Page 32: Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022050912/568c53051a28ab4916b90e8e/html5/thumbnails/32.jpg)
Los informes contradictorios sobre su prevalencia parecen debidos a los distintos procedimientos utilizados para su análisis.
Las técnicas ELISA, de fácil realización están sustituyendo a los métodos RIA, salvo en el caso de IAA, donde ELISA no alcanza la sensibilidad de RIA.
En nuestro estudio, la prevalencia de GAD (+) en el debut diabético es alta, y su determinación se ha mostrado eficaz para el diagnóstico de MD tipo 1. También lo son, aunque en menor medida IA-2.
La determinación conjunta de GAD e IA-2 incrementa la probabilidad de diagnóstico.
Los anticuerpos IAA no tienen valor como marcador en el diagnóstico y tipificación de diabetes mellitus
CONCLUSIONES
![Page 33: Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022050912/568c53051a28ab4916b90e8e/html5/thumbnails/33.jpg)
Momento actual El GAD es el parámetro más fiable para el apoyo al
diagnóstico de la DM I y LADA. 78% positividades en el debut de la DM I
IA-2: nuestra técnica por ELISA RSR junto con Medipan son las técnicas más utilizadas.
Los laboratorios Royal Devon and Exeter NHS utilizan técnicas ELISA RSR para IA-2 y GAD.
Estamos trabajando en mejorar la especificidad y la sensibilidad de los ensayos IA-2.
Estamos inscritos en un programa internacional de controles, puestos en marcha a partir de Enero 2013 dentro de la estandarización de los anticuerpos.
![Page 34: Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022050912/568c53051a28ab4916b90e8e/html5/thumbnails/34.jpg)
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