Autoinmunidad en la Diabetes Mellitus
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AUTOINMUNIDAD EN LA
DIABETES MELLITUS
PERSPECTIVA DESDE EL
LABORATORIO
Mª Teresa Herrera del Rey
Unidad de Gestión Clínica de Laboratorios
HH.UU Virgen del Rocío Sevilla
I ) Diabetes tipo 1:
A. Inmunomediada
B. Idiopática
II ) Diabetes tipo 2
III) Otros tipos específicos:
1.- Defectos genéticos de la función de la célula β (MODY,
mitocondrial)
2.- Defectos genéticos de la acción de la insulina
3.- Enfermedades del páncreas exocrino
4.- Endocrinopatías
5.- Inducida por fármacos
6.- Infecciones
7.- Formas no comunes de diabetes inmunomediada
8.- Otros síndromes genéticos asociados ocasionalmente con diabetes
IV ) Diabetes gestacional
CLASIFICACIÓN ETIOLÓGICA DE DIABETES MELLITUS
DIABETES TIPO 1 AUTOINMUNE
En 1998 se presentan los resultados del estudio UKPDS:
Seguimiento de 5000 pacientes con DM tipo 2 durante 20 años.
Relación entre control intensivo de glucemia y morbi-mortalidad.
HALLAZGO: 7.5-10% de los pacientes diagnosticados de DM tipo 2
presentaron autoanticuerpos positivos ( anti- GAD e IA-2 ), no obesos y
con pocas manifestaciones de síndrome metabólico.
Edad < 50 años
Síntomas agudos
IMC<25
Anti- GAD positivos
Requieren insulina
LADA (Latent Autoimmune Diabetes in Adults)
T1D onset
<10 years
T1D
adult
onset
Autoimmune
phenotypic T2D
Nonimmune
phenotypic T2D
Age-related
deterioration of
glucose
tolerance
Debido a los descubrimientos de los últimos años, se propone un
cambio en el esquema de la clasificación tradicional de la
diabetes.
Tradicionalmente:
Edad de inicio
Síntomas hiperglucemia
Cetosis
Obesidad
Necesidad de tratamiento con
insulina
Actualmente: el sistema
inmune juega un papel
importante en la DM 2, con
similitudes y diferencias
entre DM 1 y DM2.
Is diabetes mellitus a continuous spectrum? Brooks-Worrell B, Palmer JP. Clinical Chemistry February 2011 vol. 57 no. 2 158-161
IS DIABETES MELLITUS A CONTINUOUS SPECTRUM?
PREDICCIÓN RIESGO DIABETES
• Marcadores genéticos
Sistema de antígenos humanos HLA: DR3/4 y DQ2/8 (2,4% desarrollan ICAs + antes de los 5 años) (No defecto genético sino variantes de genes)
• Pruebas metabólicas
Test tolerancia glucosa
Hemoglobina glicosilada (>6,5%)
• Medición de autoanticuerpos
AUTOANTICUERPOS EN LA DIABETES
ANTI ISLOTES PANCREÁTICOS (ICA)
ANTI INSULINA
ANTI GLUTAMATO DESCARBOXILASA (GADA)
ANTI TIROSINA FOSFATASA (IA-2)
TRANSPORTADOR ESPECÍFICO DE Zn T8
ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS DEL CITOPLASMA DE LAS CÉLULAS DE LOS ISLOTES PANCREÁTICOS (ICA)
• Descubiertos en 1974 (Bottazzo et al. Lancet)
• Positivos en aprox. 80% pacientes con diabetes mellitus
(DM) tipo1 recién diagnosticada
• Disminuyen conforme merma el funcionamiento de los
islotes
• Tipo IgG
Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Conjugado
anti-hIgG /
fluorocromo
Analito
Ej.: ICA
Luz
UV
Tejido
Ej.: Páncreas Islotes Acinos
Detección de ICA mediante inmunofluorescencia
indirecta sobre un corte de páncreas.
ANTI INSULINA IAA
• Anticuerpos frente a la insulina (previo a la
administración de insulina)
Palmer et al (1983) describieron la presencia
de anticuerpos contra la insulina en el 50% de
pacientes de diagnóstico reciente (RIA)
• Su frecuencia estaba asociada a la edad:
niños, sobre todo menores de 10 años (RIA)
• Informes contradictorios sobre su prevalencia y
valor pronóstico que parecen debidos a la diferente
metodología utilizada para su medición
• Los que se miden por RIA se encuentran más
vinculados a la enfermedad
• Los que se miden por ELISA no sirven para el
diagnóstico de la Diabetes Mellitus, sí para el
diagnóstico de las hipoglucemias autoinmunes.
ANTI INSULINA IAA
ANTI DESCARBOXILASA DEL ÁCIDO GLUTÁMICO (GAD)
• Específicos contra enzima glutamato
decarboxilasa, síntesis del neurotransmisor
inhibidor ácido gamma-amino-butírico (GABA)
• Dos genes GAD:
GAD1: se traduce en proteína GAD67 (islotes de
ratón)
GAD2 (cromosoma 10): proteína GAD65 (islotes
cél. β humanos)
ANTI DESCARBOXILASA DEL ÁCIDO GLUTÁMICO (GAD)
• Más del 70% de los pacientes de reciente
diagnóstico tienen niveles positivos después 10
años
• El GAD debe ser considerado como la primera
herramienta de screening.
• En DM tipo 2 distinguen a los pacientes que
necesitan insulina (LADA) (Van Deutekom y cols.
Diabet Med.2088;25:117-25)
ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2
ICA-512
Glicoproteína transmembrana perteneciente a la
familia de las proteínas tirosina fosfatasa, localizada
en los gránulos secretores densos de las células
endocrinas secretoras de proteínas y las neuronas
Favorece unión de los gránulos secretores al cito-
esqueleto: activa transporte celular y la exocitosis
ANTI TIROSINA FOSFATASA DE MEMBRANA IA-2
•Son los de mayor valor predictivo positivo (VPP)
•Su presencia en la fase preclínica en niños predice
progresión a diabetes clínica (Grise y cols.
Diabetologia 2010; 53:517-524)
•Método de determinación: RIA y ELISA
Inmunoanálisis con reactivos marcados
- Con compuestos radiactivos:
RIA heterogeneo competitivo
IRMA heterogeneo no competitivo
- Con enzimas: Enzimoinmunoanálisis
Peroxidasa, fosfatasa alcalina, Glucosa 6-fosfato, deshidrogenasa, B- galactosidasa...
Ventajas ELISA
Disponibles comercialmente
Se pueden conjugar por técnicas simples
Tienen varios sustratos
No se utiliza radiactividad (problema de desechos,etc)
En nuestro laboratorio realizamos como apoyo al diagnóstico del
debut diabético:
Ac. Anti GAD
Ac. IA-2
Método de determinación
mediante ELISA en
microplaca.
Analizador Triturus (Grifols)
IA-2
Incubación 16-20 h
IA2 - biotina
Lavado
Streptavidina -
Peroxidasa
TMB
Streptavidina -
Peroxidasa
Streptavidina -
Peroxidasa
Lavado
450 nm
A - [C] ELISA IA-2
MODELOS ELISA
MATRIZ
Pocillo de la
micro placa
INSULINA
Analito: IAA
anti-IgG
humana
conjugado
con
peroxidasa
Mab anti-IgG
humana
Conjugado
anti-rIg /
peroxidasa
ELISA convencional aELISA (amplificado)
Ag
absorbido
a la
superficie
Sustrato tetra metil
bencidina (TMB)
Expresión de Trx-GAD en E. coli
Obtención de la
fracción
intracelular soluble
Trx-GAD-biotina Biotinilación
Determinación de GADA
Marcación de la Trx-GAD recombinante con biotina
ELISA Ag-específico (Ae-ELISA)
Trx-GAD
Trx-GAD-biotina
Avidina-Px
Purificación
Thio-Bond
Resin
*
Trx-GAD *
GADA
Se utiliza como
LIGANDO un
CONJUGADO
GADA65-BIOTINA
(IA-2-BIOTINA)
Función: transportar zinc desde el citoplasma
de las células beta al interior del gránulo de
secreción
Es el principal autoantígeno descubierto en los
últimos 10 años
Transportador de Zn T8
Específico de células beta
Aporta información complementaria al
resto de los autoanticuerpos, aumentando
el porcentaje de detección
Método de determinación: RIA y ELISA
Transportador de Zn T8
IAA: RESULTADOS DISCORDANTES ENTRE RIA
Y ELISA
“ La comparación frecuente de los méritos relativos de los
métodos radiactivos y enzimáticos es básicamente errónea, ya
que los principios que rigen estos ensayos son diferentes”
R. Ekins, 1980
Conocer la prevalencia de auto-anticuerpos anti-GAD, anti-IA-2 y anti-insulina en el debut de la diabetes mellitus en nuestro medio, medidos mediante técnica ELISA.
Valorar su papel como apoyo diagnóstico.
OBJETIVOS
MATERIAL Y METODOS
• Estudio observacional descriptivo para determinación de prevalencia y valoración de pruebas diagnósticas
• Muestra 111 pacientes debut diabético: 61 DM tipo 1 (incluye 12 casos DM tipo LADA (Latente Autoinmune del Adulto), 50 DM tipo 2. Grupo control de 64 personas no diabéticas.
• Enzimoinmunoanálisis en micro placa: Glutamic Acid Decarboxylase (GAD) Autoantibody ELISA kit from RSR (RSR Limited), IA-2 Autoantibody ELISA versión 2 kit from RPR y AESKULISA Insulin-G (AESKU DIAGNOSTICS) para IAA.
• Criterio (+): GADA >5 U/ml, IA-2 >7,5 U/ml e IAA >15 U/ml.
• Análisis estadísticos mediante paquete PASW Statistics versión 18.
RESULTADOS
PREVALENCIA AUTOANTICUERPOS EN DIABETES MELLITUS DE INICIO
RESULTADOS
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
%
Figura 1. Gráfico de frecuencias
Anti-GAD 78,7 2,0 7,8
Anti-IA2 31,7 4,0 3,1
IAA 10,3 6,0 1,7
DM 1 DM 2 Control
VALORES MEDIANAS AUTOANTICUERPOS
Muestra Medianas (U/ml) Percentil 25-75
Control 2.59 1.88 – 3.54
GAD DM 1 108.00 4.56 – 304.00
DM 2 1.84 1.54 – 2.64
Control 5.16 4.56 – 5.70
IA2 DM 1 6.05 5.28 – 264.50
DM 2 5.21 4.73 – 5.73
Control 2.22 1.39 – 4.05
IAA DM 1 3.17 2.04 – 5.75
DM 2 3.72 1,69 – 5.84
GAD IA2 IAA
Control - DM 1 P< 0.0001 P< 0.0001 P = 0.0309
Control - DM 2 P = 0.0176 P = 0.3269 P = 0.0196
DM 1 - DM 2 P< 0.0001 P = 0.0002 P = 0.5850
0
20
40
60
80
100
120
Gráfico 2. Medianas
CONTROL 2,58 5,16 2,22
DM 1 108 6,05 3,17
DM 2 1,83 5,26 3,84
GAD IA2 IAA
RESULTADOS
CURVAS ROC (RECEIVER
OPERATING
CHARACTERISTICS)
RESULTADOS
La diabetes Mellitus tipo I es una enfermedad asociada a fenómenos de auto inmunidad humoral y celular que pueden ser detectados tanto en el momento del diagnóstico clínico como mucho tiempo antes.
La predicción de riesgo de diabetes incluye la combinación de marcadores genéticos, pruebas metabólicas y medición de auto-anticuerpos.
Los auto anticuerpos son de gran utilidad como marcadores precoces de enfermedad y como apoyo diagnóstico.
CONCLUSIONES
Los informes contradictorios sobre su prevalencia parecen debidos a los distintos procedimientos utilizados para su análisis.
Las técnicas ELISA, de fácil realización están sustituyendo a los métodos RIA, salvo en el caso de IAA, donde ELISA no alcanza la sensibilidad de RIA.
En nuestro estudio, la prevalencia de GAD (+) en el debut diabético es alta, y su determinación se ha mostrado eficaz para el diagnóstico de MD tipo 1. También lo son, aunque en menor medida IA-2.
La determinación conjunta de GAD e IA-2 incrementa la probabilidad de diagnóstico.
Los anticuerpos IAA no tienen valor como marcador en el diagnóstico y tipificación de diabetes mellitus
CONCLUSIONES
Momento actual El GAD es el parámetro más fiable para el apoyo al
diagnóstico de la DM I y LADA. 78% positividades en el debut de la DM I
IA-2: nuestra técnica por ELISA RSR junto con Medipan son las técnicas más utilizadas.
Los laboratorios Royal Devon and Exeter NHS utilizan técnicas ELISA RSR para IA-2 y GAD.
Estamos trabajando en mejorar la especificidad y la sensibilidad de los ensayos IA-2.
Estamos inscritos en un programa internacional de controles, puestos en marcha a partir de Enero 2013 dentro de la estandarización de los anticuerpos.
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