Aula - T+®cnicas Moleculares (1)
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Prof. Murilo Malveira Brandão
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Maioria das espécies: pequena parte do
genoma consiste de genes que codificam
proteínas;
O restante do genoma, durante muito tempo,
foi considerado como “DNA lixo”, ou seja,
sem função, e nessa parte incluíam-se os
microssatélites.
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Sequências Simples Repetidas (SSRs)
Consistem de 1 a 6 nucleotídeos repetidos
em tandem,
Classificadas pelo motivo repetido
◦ mono, di, tri, tetra, penta e hexanucleotídeos
Pelo tipo de seqüência repetitiva
◦ microssatélites perfeitos, imperfeitos,
interrompidos ou compostos
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Possuem um alto polimorfismo
Altas taxas de mutação nestes locos
São flanqueados por sequências únicas
Podem ser amplificados através de PCR
Ótimos marcadores moleculares
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Protocolo: Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites Nucleares
ESALQ/USP
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1. Digestão do DNA
Objetivo: digerir o DNA gênomico para gerar
fragmentos de tamanhos adequados (300 – 1200
pb).
◦ Etapa crítica - o DNA deve ter uma boa qualidade e
estar em uma boa concentração (~500 ng/µL).
◦ Se necessário usar Kit de extração de DNA para eliminar
compostos secundários e proteínas.
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Em um eppendorf de 1,5 mL: ◦ Água ultra-pura estéril 74,0 µL ◦ Enzima de restrição RsaI (5’)GT¯AC(3’) (10U/µL – Promega) 5,0 µL ◦ Tampão Restrição (10X) 10,0 µL ◦ BSA Acetilado (10 µg/µL) 1,0 µL ◦ DNA (500 ng/µL) 10,0 µL ◦ Volume da reação 100,0 µL
Procedimento: Misturar, suavemente, por pipetagem. Incubar 4 horas a 37 ºC. Aplicar 10 µL da digestão em gel de agarose 1,5%. Deve-se observar um smear (Figura 1).
* Inativação: Incubar a 65 ºC por 15 minutos
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Figura 1. DNA genômico de Ilex paraguayensis (A) e Dicksonia sellowiana (B) digerido com RsaI. M: 200 bp Ladder Promega
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2. Ligação de Adaptadores
Objetivo: garantir que todos os fragmentos
gerados tenham uma terminação comum e
conhecida.
◦ Adaptadores para RsaI
◦ Rsa21 5’ CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA 3’
◦ Rsa25 5’ TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A 3’
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Em um eppendorf de 1,5 mL: ◦ Água ultra-pura estéril 26,0 µL
◦ T4 DNA Ligase (1U/µL – Promega) 5,0 µL
◦ Tampão Ligação (10 X ) * 5,0 µL
◦ Rsa21 (10 µM) 2,0 µL
◦ Rsa25 (10 µM) 2,0 µL
◦ DNA digerido (~ 500 ng) 10,0 µL
◦ Volume da reação 50,0 µL * tampão deve estar homogêneo. **Add por último a enzima de
restrição e a Ligase
*** Inativação: Incubar a 70 ºC por 10 minutos
Procedimento: Misturar, suavemente, por pipetagem. Incubar 2 horas a 20 ºC (termociclador).
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3. Pré-amplificação
Objetivo: garantir que a ligação dos adaptadores tenha ocorrido.
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Em um eppendorf de 1,5 mL: ◦ Água ultra-pura estéril 30,4 µL
◦ Cloreto de magnésio (25 mM – Fermentas) 3,0 µL
◦ Tampão (10 X – Fermentas) 5,0 µL
◦ Rsa21 (10 µM) 2,0 µL
◦ dNTPs (10 mM) 4,0 µL
◦ Taq polimerase (5U/µL – Fermentas) 0,6 µL
◦ Reação de ligação 5,0 µL
◦ Volume da reação 50,0 µL
Procedimentos: programação do termociclador: 95 ºC 4 minutos, seguido de 20 ciclos (94 ºC 30 segundos, 60 ºC 1 minuto, 72 ºC 1 minuto), extensão final 72 ºC por 8 minutos.
Aplicar 10,0 µL da reação de amplificação em gel de agarose a 1,5%. Deve-se observar um smear de 300 a 1200 pb
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Figura 2. Amplificação pré-seleção dos fragmentos RsaI de DNA genômico de Ilex paraguayensis (A) e Dicksonia sellowiana (B) utilizando o primer Rsa21. M: 200 bp Ladder Promega.
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4. Purificação
Objetivo: preparar o DNA para a etapa de seleção de fragmentos (≈ 40 μL da etapa 3) que contenham microssatélites. Usar o kit de purificação de PCR QIAquick da QIAGEN.
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4. Purificação
Procedimento: ver recomendações do fabricante.
Eluir o DNA em 100 µL de água ultra-pura estéril em duas etapas. Adicionar, à coluna, 50 µL de água e centrifugar por 1 minuto; repetir o passo anterior.
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5.1 Preparo das beads magnéticas (Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles - Promega)
Procedimento: 1. ressuspender os 600 µL das beads por
agitação; 2. magnetizar e, com cuidado, aspirar o
sobrenadante; 3. adicionar 300 µL de SSC 0,5 X,
ressuspender, magnetizar, descartar o sobrenadante;
4. repetir três vezes a etapa 3; 5. ressuspender as beads em 100 µL de SSC
0,5 X.
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◦ Preparo do DNA purificado
Procedimento: 1. 405 µL de água MilliQ + 95 µL de DNA purificado (etapa 4); 2. Incubar a 95 ºC por 15 minutos; 3. Adicionar 13 µL de SSC 20 X e, em seguida, acrescentar 3 µL de
cada (sonda) oligo biotinilado [(CT)8, (GT)8 e (TTC)8], em concentração de 50 µM
4. Deixar à temperatura ambiente por 20 minutos agitando lentamente a cada 2 minutos. A agitação é muito importante nesta etapa.
5. Misturar os 100 µL de beads pré-lavadas com os 522 µL da mistura de hibridação;
6. Incubar por 10 minutos `a temperatura ambiente, agitando suavemente o tempo todo (apenas rolar os tubos entre os dedos);
7. Magnetizar e aspirar o sobrenadante; 8. Ressuspender em 300 µL de SSC 0,1 X (cuidado em sempre trocar
a ponteira); 9. Repetir as etapas 7 e 8 por mais 2 vezes; 10. Ressuspender em 100 µL de água, magnetizar, e reservar o
sobrenadante em um eppendorf; 11. Ressuspender por mais 1 vez com 150 µL de agua; 12. Juntar as duas partes (250 µL) e conservar `a - 20 ºC.
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6. Amplificação dos fragmentos selecionados
Objetivo: Aumentar a quantidade de DNA (fragmentos)
Em um eppendorf de 1,5 mL:
Água ultra-pura estéril 51,4 µL
Cloreto de magnésio (25 mM -Fermentas) 6,0 µL
Tampão (10 X - Fermentas) 10,0 µL
Rsa21 (10 µM) 4,0 µL
dNTP (10 mM) 8,0 µL
Taq polimerase (5U/µL - Fermentas) 0,6 µL
Fragmentos selecionados (250 µL) 20,0 µL
Volume da reação 100,0 µL
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Procedimentos: programação do termociclador: 95 ºC 1 minuto, seguido de 25 ciclos (94 ºC 30 segundos, 60 ºC 1 minuto, 72 ºC 2 minuto), extensão final 72 ºC, por 5 minutos. Aplicar 10,0 µL da amplificação em gel de agarose 1,5% (Figura 3). Bandas de baixo peso molecular, entre 300 e 1000 pb, é o que se espera; não deve haver bandas preferenciais.
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Figura 3. M: 200 bp Ladder Promega. A: fragmentos RsaI do DNA de Dicksonia sellowiana selecionados por hibridização com sondas para SSRs e amplificados com o primer Rsa21.
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7. Duplo enriquecimento
Repetir todos os procedimentos a partir da etapa 4, purificando os 100 µL da etapa 6.
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8. Clonagem em um vetor pGEM – T easy (Promega)
Em um eppendorf de 1,5 mL: Água ultra-pura estéril 10,0 µL Tampão da ligase (10 X)** 2,0 µL Plasmídio (50 ng/µL) 1,0 µL Produto de amplificação* 6,0 µL T4 DNA Ligase** 1,0 µL Volume da reação 20,0 µL
Procedimento: incubar `a 4 ºC overnight
(termociclador). Obs.:* adicionar uma maior quantidade (> 6,0
µL) se, no gel (Figura 4), verificar que as bandas ficaram claras. ** o tampão e a ligase foram os mesmos utilizados para ligar os adaptadores.
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Figura 4. A: fragmentos RsaI de DNA genômico de Dicksonia sellowiana selecionados por complementaridade com as sondas para SSRs, inseridos em vetor pGEM-T Easy e amplificados por PCR utilizando primers M13 forward e reverse. B: controle; pUC19 amplificado com os mesmos primer.
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8. PCR para checar a clonagem Em um eppendorf de 1,5 mL: Água ultra-pura estéril 5,6 µL Cloreto de magnésio (25 mM - Fermentas) 0,6 µL Tampão (10 X - Fermentas) 1,0 µL M13 F (10 µM) 0,3 µL M13 R (10 µM) 0,3 µL dNTP 10 mM 1,0 µL Taq polimerase 5U/µL (Fermentas) 0,2 µL Reação de ligação 1,0 µL Volume da reação 10,0 µL
Procedimentos: Ciclos: 95 ºC 4 minutos, seguido de 20
ciclos (94 ºC 30 segundos, 50 ºC 1 minuto, 72 ºC 1 minuto), extensão final 72 ºC por 8 minutos (Figura 4).
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9. Transformação em XL1-Blue
Objetivo: transformar células de E. coli, quimicamente competentes, com o produto de clonagem para proporcionar a amplificação do inserto.
Produto de ligação 8,0 µL
Transfo-buffer 32,0 µL
Aliquota células competentes OmniMAX 2T-1 (Invitrogen) 50,0 µL
Volume da reação 80,0 µL
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Procedimentos: 1. ressuspender cuidadosamente os 80 µL da reação e
incubar em gelo por 15 a 30 minutos; 2. Retirar do gelo e deixar por 10 minutos `a
temperatura ambiente; 3. Dar um spin, adicionar 440 µL de LB (contendo
ampicilina) a 37 ºC, e incubar `a 37 ºC por 50 minutos;
4. Centrifugar a 3000 rpm por 30 segundos, descartar 440 µL do sobrenadante e, ressuspender o pellet em 160 µL de LB (contendo ampicilina a 100 mg/ml) a 37 ºC.
5. Preparar uma placa com meio LB (Luria-Bertani) sólido (contendo ampicilina), e aplicar 80 µL do volume total por placa.
6. Deixar overnight (18 a 22 horas) a 37 ºC e em seguida colocar em geladeira. Colônias brancas (Figura 5) contém o inserto (fragmentos com SSRs).
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Figura 5. Colônias brancas (transformadas) e azuis produzidas pelo crescimento das células de E. coli transformadas com plasmídio pGEM T-Easy contendo ou não insertos de SSRs de Dicksonia sellowiana. As células foram plaqueadas em LB sólido com X-Gal e IPTG e cultivadas overnight a 37 °C.
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10. Inoculação e mini-prep (extração plasmidial) Objetivo: isolar o DNA plasmidial das colônias recombinantes.
1. Colocar 1 mL (ou 500 uL???) de meio LB contendo 100 µg/mL de
ampicilina em cada pocinho da placa alta; 2. Inocular as colônias brancas, uma em cada pocinho, utilizando palitos
autoclavados, selar a placa com adesivo e furar em cima com uma agulha, para aeração durante o crescimento;
3. Incubar `a 37 ºC, em agitador a 300 rpm, durante 22 h; 4. Trocar o adesivo da placa e centrifugar (23 ºC) por 6 minutos a 3000
rpm 5. Descartar o sobrenadante e manter a placa invertida sobre papel
absorvente por 1 minuto; 6. Adicionar a cada pocinho 240 µL de GTE (Glicose-Tris-Edta), selar a
placa com adesivo e ressuspender as células agitando no vortex por 2 minutos;
7. Centrifugar por 6 minutos a 4000 rpm (enquanto isto, colocar 5 µL de RNAse, 10 mg/mL, em cada placa de fundo em U);
8. Descartar o sobrenadante, adicionar a cada pocinho 80 µL de GTE, e selar a placa com adesivo. Agitar no vortex por 5 minutos;
9. Transferir 60 µL de cada suspensão de células para placa de fundo em U contendo RNAse;
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10. Adicionar a cada pocinho 60 µL de NaOH 0,2M – SDS 1 %, selar a placa com adesivo e misturar 10 vezes por inversão. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente (começar a marcar o tempo quando colocar a solução na primeira fileira);
11. Colocar na centrífuga e dar um spin (até 1000 rpm);
12. Adicionar a cada pocinho 60 µL de KOAc (acetato de potássio) 3M (estocado a 4 ºC), selar a placa com adesivo e misturar 10 vezes por inversão;
13. Remover o adesivo e incubar em estufa a 90 ºC por exatos 30 minutos;
14. Esfriar a placa em gelo por 10 minutos e centrifugar por 4 minutos a 4000 rpm;
15. Fixar com fita adesiva uma placa filtro no topo de uma placa em U e, transferir todo o volume para a placa filtro e centrifugar por 4 minutos a 4000 rpm;
16. Remover a placa filtro e adicionar ao filtrado 90 µL de isopropanol gelado;
17. Selar a placa com adesivo e misturar 20 vezes por inversão. Trocar o adesivo e centrifugar por 45 minutos a 4000 rpm, 20 ºC;
18. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 180 µL de etanol 70% gelado;
19. Centrifugar por 5 minutos a 4000 rpm, 20 ºC, e descartar o sobrenadante;
20. Inverter a placa sobre papel absorvente e deixar secar por 60 minutos `a temperatura ambiente;
21. Ressuspender em 60 µL de água miliQ. Deixar overnight.
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11. Reação de sequenciamento e purificação 11.1 Reação de sequenciamento Água miliQ 1,4 µL
Primer (5 µM) 0,6 µL
DYEnamic mix 4,0 µL
DNA (50 -200 ng/µL) 4,0 µL
Primer (MER) 5’ CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG 3’
Procedimentos: 27 Ciclos: 95 ºC 25
segundos, 50 ºC 15”, 60 ºC 1 minuto), 4 ºC forever.
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11.2 Purificação 1. adicionar 1 µL de acetato de amônio 7,5M e 28 µL de
etanol 100% a cada reação de sequenciamento (a concentração final de etanol deve ser de 70%);
2. agitar levemente para homogeneizar;
3. manter por 15 minutos (precipitação) em ambiente escuro;
4. centrifugar `a temperatura ambiente por 25 minutos a 4000 rpm;
5. remover o sobrenadante e adicionar 150 µL de etanol 70% (gelado) para lavar o pellet. Centrifugar nas mesmas condições descritas na etapa 4;
6. remover o sobrenadante e deixar o pellet secar ao ar (ambiente escuro);
7. ressuspender o pellet em 10 µL de loading solution e deixar overnight a 4 ºC
8. vortexar, centrifugar (spin) e sequenciar.
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ABI 3500
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Extração do DNA e reação PCR
◦ Pares de primers (forward e reverse) - universais de cpDNA
◦ PCR: 35 ciclos – Temperatura de anelamento: 53°C
◦ visualização em gel de agarose 1%
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Figura : Fragmentos de cpDNA amplificados de quatro indivíduos de Ceiba pubiflora em gel de agarose 1%, para pares de primers cpDNA (P1 a P8). Marcador de peso molecular M1=100pb e M2=1Kb.
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DNA Cloroplastidial (cpDNA)
◦ 1 célula = 10.000 cópias do cpDNA
◦ Região LSC = menos conservada
Estudos taxonômicos
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Purificação da Reação com Enzimas de Restrição
Shimp Alkaline Phosphatase (SAP) a 1U/μL e Exonuclease I (EXO) a 20U/μL (mix de restrição)
Ativadas a 37ºC por 30 min. e, em seguida, desnaturadas a 80ºC por 20 min.
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Reação de preparo para o sequenciamento ◦ PCR com a presença de somente um dos primer
(forward ou reverse)
◦ bases nucleotídicas marcadas com fluorescência
◦ leitura automatizada do sequenciador (ABI 3500).
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Seleção de Primers cpDNA e Número de Haplótipos ◦ padrão de amplificação – observação de única
banda no gel
◦ BioEdit
◦ correção manual das sequências
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Alinhamento das sequências: ◦ Mega v.4.0 – método Clustal-W
◦ DNASP 4.1:
◦ determinar o número de haplótipos
◦ frequência na amostra
◦ diversidade nucleotídica (π)
◦ diversidade haplotípica (HD)