BQI 305 Bioqumica Analtica Prtica 6:

Western Blotting.

Amanda Cristina Teixeira da Silva 66631

Introduo: O western blot um mtodo em biologia molecular/bioqumica/inmunogentica para a deteco de protenas em uma amostra. Essa tcnica usa eletroforese em gel para separar as protenas desnaturadas por massa. As protenas so ento transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose), onde foram usados como sonda anticorpos especficos protena. Como resultado, os pesquisadores podem examinar a quantidade de protena em uma dada amostra e comparar os nveis entre diversos grupos. Outras tcnicas, tambm usando anticorpos, permitem a deteco de protenas em tecidos imunohistoqumica) e clulas (imunocitoqumica). uma tcnica empregada em muitos estudos clnicos e de investigao. O mtodo foi originado nos laboratrios de George Stark em Stanford. O nome de "western blot" foi dado tcnica por W. Neal Burnette com base em "Southern blot", tcnica para a deteco de DNA desenvolvida anteriormente por Edwin Southern. A deteco de RNA denominada Northern blotting. Materiais e mtodos: O preparo das amostras foi feito previamente, usamos um marcador molecular, um extrato total de E. coli contendo vetor de expresso GTPase, extrato total de E. coli cepa DH5 alfa e a GTPase purificada. A cada 15 microL de extrato adicionou-se 100 microL de tampo de amostra e posteriormente aplicou-se no gel de SDS-page preparado pelo professor conforme procedimento da ltima aula prtica (SDS Page). Aplicou-se a voltagem do de 80 V e deixouse a corrida por 1 hora de 10 minutos . As amostras foram aplicadas em duplicatas no gel, repetindo a seguinte ordem: Marcador molecular Extrato total E. coli (vetor de expresso GTPase) Extrato total E. coli (DH5 alfa) GTPase purificada

Aps a corrida, retirou-se o gel e dividiu-se ele em 2, uma parte foi utilizada para revelao com Coomassie Blue, na outra parte deu-se continuidade ao imunoblotting. O gel foi embebido no tampo de transferncia ( 200 mL Tris/glicina 10X, 400 mL de metanol e 1400 mL de gua deionizada) por 15 minutos. A membrana de nitrocelulose previamente cortada tambm foi equilibrada no tampo de transferncia por 15 minutos. Papis filtro tambm foram equilibrados com tampo de transferncia. Montou-se o sanduche: 3 folhas de papel filtro Membrana de nitrocelulose Gel 3 folhas de papel filtro

Na montagem o nodo foi colocado no lado do papel filtro que antecedia a membrana de nitrocelulose. A transferncia ocorreu por cerca de 30 minutos 10-15 V. Aps a transferncia a membrana foi transferida para um recipiente, onde foi lavada com gua destilada e

posteriormente adicionou-se a soluo corante de PONCEAU-S para visualizao das bandas e posteriormente lavou-se novamente a membrana. Adicionou-se soluo de bloqueio (5% de leite em p desnatado em TBS-T 1X) por uma semana at a prxima aula. Na outra aula lavouse a membrana sob leve agitao 2 vezes por 10 minutos cada lavagem com TBS-Tween. Colocou-se a membrana no primeiro anticorpo, utilizando 10 microL de IgG de coelho 1:2000 v/v diludo em TBS-Tween e deixou-se 1 hora e 20 minutos. Lavou-se a membrana 3 vezes por 15 minutos cada lavagem. Depois colocou-se a membrana soluo do segundo anticorpo e deixou-se sob agitao por 45 minutos, aps isso lavou-se a membrana 3 vezes por 15 minutos com TBS-Tween. A revelao ocorreu utilizando 20 mL de substrato para revelao (10 mL TrisHCl 50 mM (pH 7,6), 10 mg DAB, 1 mL NiCl2 (0,3%) e 10 microL H2O2 (30%)).

Resultados e discusso: A tcnica foi realizada satisfatoriamente e foi possvel identificar a GTPase. O processo de bloqueio da membrana com protenas do leite foi feito para evitar que o anticorpo primrio se ligasse superfcie da membrana e garantir a perfeita deteco da enzima. A enzima conjugada com o anticorpo secundrio, peroxidase, utiliza o H2O2 para oxidar o substrato DAB e formar um polmero de cor marrom que precipita e revela a banda referente enzima. Na figura as bandas seguem a seguinte ordem: Marcador molecular Extrato total E. coli (vetor de expresso GTPase) Extrato total E. coli (DH5 alfa) GTPase purificada

A comparao da fotografia do Gel em SDS-Page (Fig1) com a revelao de PONCEAU-S (Fig 2) verifica-se que a transferncia do gel para a membrana foi satisfatria. Comparando-se a Fig 2 com a Fig 3 que a membrana revelada, observamos que o extrato total de E. coli DH5alfa no apresentou bandas, como era de se esperar. Pela qualidade dos resultados, verifica-se que uma possvel mudana para uma melhora no experimento seria a diluio do extrato de protenas, pois verifica-se uma grande quantidade destas, ou ento a diluio do anticorpo utilizado.

Referncias: http://pt.encydia.com/es/Western_blot