Aula 09 - Purificacao de Produtos Biotecnologicos
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13/06/2014
1
PURIFICAO DE PRODUTOS PURIFICAO DE PRODUTOS BIOTECNOLGICOSBIOTECNOLGICOS
Disciplina: Biotecnologia Farmacutica
Profa.Greiciane G. Paneto
Etapas de um Etapas de um Processo Processo
de de PurificaoPurificao
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Etapa do processoEtapa do processo Operaes unitrias Operaes unitrias Princpio Princpio
Clarificao
Filtrao convencional Tamanho de partculas Centrifugao Tamanho e densidade de partculas Filtrao tangencial (membranas) Tamanho de partculas
Floculao Hidrofobicidade de partculas
Rompimento de clulas
Homegeneizao Cisalhamento Ultra-som Cisalhamento Moagem em moinho de bolas Cisalhamento
Rompimento qumico ou enzimtico Hidrlise, solubilizao ou desidratao de molculas que compem a parede ou a membrana celular
Purificao de baixa resoluo
Precipitao Solubilidade
U Itrafiltrao (membranas) Massa molar e raio hidrodinmico de molculas
Extrao em sistemas de duas fases lquidas Solubilidade, massa molar
Purificao de alta resoluo
Cromatografia de troca-inica Tipo e densidade de carga na superfcie da biomolcula
Cromatografia de afinidade (biolgica ou qumica)
Stios especficos da superfcie de uma protena (adsoro)
Cromatografia de imunoafinidadeStios especficos da superfcie de uma protena (adsoro antgeno/anticorpo)
Cromatografia de interao hidrofbica Hidrofobicidade
Cromatografia de excluso molecular Massa molar
Membranas adsortivasMassa molar e caractersticas para adsoro ou stios especficos da superfcie de uma protena
Tratamentos finais
Cristalizao Solubilidade e caractersticas de equilbrio lquido-slido
LiofiIizao Caractersticas de equilbrio lquido-slido
Secagem Caractersticas de equilbrio lquido-slido
CLARIFICAO
Filtrao: usada quando assepsia no necessria;
Cetrifugao: sedimentao pela fora da gravidade.
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Rompimento Celular Microbiano
Produtos intracelulares tornam o processo de purificao de biomolculas mais difcil em comparao com produtos extracelulares devido necessidade do
rompimento
Rompimento Celular
Mtodos para Rompimento: Aplicados aps a separao e lavagem das clulas.
Clulas animais (possuem apenas membrana),fcil rompimento com baixa fora decisalhamento;
Bactrias, leveduras e outros fungos possuemparedes rgidas, exigem grande tenses decisalhamento para rompimento.
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Forma mais adequada de Rompimento?
Tipo de microrganismo;
Tamanho da clula;
Tolerncia a tenses de cisalhamento;
Necessidade de controle de temperatura;
Gasto de energia.
Parede Celular
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Mtodos de Rompimento Celular
Homogeneizador de alta presso
Moinho de bolas
Ultrassom
Homogeneizador de alta presso
Moinho de bolas
Ultrassom Mecnicos
Choque osmtico
Congelamento-descongelamento
Aquecimento
Secagem
Choque osmtico
Congelamento-descongelamento
Aquecimento
Secagem
No-mecnicos
lcalis
Solventes
Detergentes
cidos
lcalis
Solventes
Detergentes
cidos
Qumicos
Lize enzimticaEnzimticos
Mecnico Mecnico -- Homogeneizador a alta presso
CavitaoTurbulnciaCisalhamento
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Mecnico Mecnico -- Homogeneizador a alta presso
Este tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigerao.
Presses utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentao da ordem de 180 a 280 m/s e concentraes celulares de 450 a 750 g/L (massa mida).
Mecnico Mecnico -- Homogeneizador a alta presso
O desempenho pode ser afetado por:
Presso de operao; Velocidade de alimentao; Temperatura; Estado fisiolgico do microrganismo; Condies de cultivo; Tipo de clula e sua concentrao.
tamanho das clulas (maior => rompimento mais fcil)
presso (maior => maior eficincia)
nmero de passagens (mltiplas etapas aumenta o ren-dimento)
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Mecnico Mecnico Moinho de Bolas
Consiste na passagem da suspenso celular por uma cmara de triturao (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitao e preenchida com esferas de vidro.
O rompimento ocorre devido fora de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das clulas.
Mecnico Mecnico Moinho de Bolas
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MecnicoMecnico Ultra-som
O rompimento ocorre quando ondas sonoras(~20kHz), so convertidas em vibraes em ummeio lquido e causam o fenmeno decavitao.
Escala de laboratrio.
Mecnico Mecnico -- Ultrassom
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Rompimentos Mecnicos
Desvantagens:
As elevadas foras de cisalhamento provocadas pelosrompimentos mecnicos podem destruir organelascelulares e desnaturar enzimas;
Com o rompimento integral das clulas todo ocontedo intracelular, incluindo cidos nuclicos,organelas e fragmentos celulares liberado junto coma molcula-alvo, sendo que o homogeneizado celularpode conter grande quantidade de contaminantes eelevada viscosidade.
Produto intracelular mtodos mtodos qumicosqumicos de rompimento
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Produto extracelular
Processos cromatogrficos
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(Cromatografia) Filtrao em gel
Cromatografia de afinidade
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Cromatografia de Troca Inica
Eletroforese
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Tratamentos Finais