Augu molekulārā ģenētika

1

Nils Rostoks LU Bioloģijas fakultāte

AUGU MOLEKULĀRĀ ĢENĒTIKA

2013. GADA 22. FEBRUĀRIS

2


2 kredītpunkti 11 lekcijas 2 semināri Patstāvīgais darbs – sagatavot prezentāciju semināram Nobeigumā – eksāmens

Prasības KP ieguvei: Lekciju apmeklējums, uzstāšanās ar referātu seminārā un aktīva dalība referātu apspriešanā (50% atzīmes), sekmīgi nokārtots rakstiskais eksāmens (50%)

KURSA APJOMS

MĀCĪBU PLĀNS UN LEKCIJU SARAKSTS


3

Datums Lekcijas temats08.02.2013 Iepazīšanās, ievadlekcija15.02.2013 Augu ģenētikas vēsture. Augi kā ģenētikas modeļorganismi. 22.02.2013 Augu genomu struktūra un pētīšanas metodes 01.03.2013 Augu genomu struktūra un evolūcija. Genomu polimorfisms, poliploīdija

08.03.2013 Molekulāro marķieri un to genotipēšanas tehnoloģijas un to pielietojums genoma kartēšanā

15.03.2013 Kartēšana augos izmantojot eksperimentālas un dabiskas populācijas 22.03.2013 Lekcija nenotiek 29.03.2013 Lieldienu brīvdienas05.04.2013 Molekulārie marķieri augu selekcijā 12.04.2013 Seminārs. Augu genoma struktūra un molekulārie marķieri 19.04.2013 Augu - augu patogēnu molekulārā ģenētika un bioloģija

26.04.2013 Augu abiotiskā stresa izturības un hormonālās regulācijas molekulārā ģenētika

03.05.2013Transgēno augu iegūšanas vēsture, metodes un pielietojums fundamentālos pētījumos. Latvijas un ES likumdošana ĢMO kultūraugu līdzāspastāvēšanas un ierobežotas izmantošanas jomās Transgēno augu pielietojums biotehnoloģijā. Ģenētiski modificēti kultūraugi.

10.05.2013 Seminārs. Augu abiotiskais un biotiskais stress un ĢMO 17.05.2013 Lekcija nenotiek 24.05.2013 Eksāmens

4MĀCĪBU MATERIĀLI

I


Lekcijas

5MĀCĪBU MATERIĀLI

II


Lekcijas

6 2013. GADA 22. FEBRUĀRIS

Nils Rostoks

AUGU GENOMU STRUKTŪRA

7 AUGU GENOMI


Kodola genoms

Mitohondriju genoms

Hloroplastu genoms

Papildus informācija par augu genomiem (Science, 2008)

http://www.sciencemag.org/plantgenomes/feature.html

http://www.sciencemag.org/plantgenomes/feature.html

8GENOMA STRUKTŪRAS

SALĪDZINĀJUMS

Gēnu skaits

Cilvēks – 20 000 – 25 000

Arabidopsis – 25 498

Rīsi – 32 000 – 55 000

Gēnu blīvums un gēnu struktūra

Vidējais introna garums cilvēkam – 5.5 kbp, Arabidopsis – 152 bp, rīsiem – 387 bp

Vidējais kopējais intronu izmērs cilvēkam – 42 kbp, Arabidopsis – 0.74 kbp, rīsiem – 1.8 kbp

Vidējais kopējais eksonu garums cilvēkam – 1.49 kbp (8.7), Arabidopsis – 1.35 kbp (5.7), rīsiem – 1.34 (5.7)

Ren et al. (2006) In plants, highly expressed genes are the least compact. TIG, 22:5282013. GADA 22. FEBRUĀRIS

9GĒNU SKAITS AUGU

GENOMOS


Arabidopsis – 25,498 gēni

Rīsi - 37,544 gēni (International Rice Genome Sequencing Project) no kuriem tikai 71% ir homologi Arabidopsis

Populus trichocarpa - > 45,000 gēni (~485 mbp genoms)

Bet jāņem vērā Bennetzen et al. (2004) Consistent over-estimation of gene number in complex plant genomes. Curr Opin Plant Biol, 7: 732

10 CILVĒKU GĒNI


Vidējais gēnu blīvums – 1 gēns 40 – 45 kbp

Vidējais gēna izmērs – 10 – 15 kbp, bet ļoti variabls

Vidējais starpgēnu attālums – 25 – 30 kbp

Vidējais kodējošās daļas izmērs – 1.5 – 1.8 kbp (500 – 600 kodoni)

Vidējais eksona izmērs - ~200 bp, skaits variabls (1 – 79)

Vidējais introna izmērs – ļoti variabls (simti līdz desmiti tūkstoši bp)

Human molecular genetics 2 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.table.686)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.table.686

11 CILVĒKA GĒNI


13 RĪSU GĒNI


Vidējais gēnu blīvums – 1 gēns ~10 kbp

Vidējais gēna izmērs – 2.8 kbp

Vidējais starpgēnu attālums – 7.2 kbp

Vidējais eksona izmērs - ~310 bp, skaits 4.9

Vidējais introna izmērs – ~410 bp

Mew TW (2003) Rice Science: Innovations and Impact for Livelihood (http://books.irri.org/getpdf.htm?book=9712201848)

http://rice.plantbiology.msu.edu/

http://books.irri.org/getpdf.htm?book=9712201848

http://rice.plantbiology.msu.edu/

14 KUKURŪZAS GĒNI


Vidējais gēnu blīvums – 1 gēns ~44 kbp

Vidējais gēna izmērs – 4 kbp

Vidējais starpgēnu attālums – 20 kbp



Haberer et al. (2005) Structure and Architecture of the Maize Genome. Plant Physiol, 139: 1612 http://www.plantphysiol.org/cgi/content/full/139/4/1612/TBL160

http://www.plantphysiol.org/cgi/content/full/139/4/1612/TBL160

http://www.plantphysiol.org/cgi/content/full/139/4/1612/TBL160

15HEKSAPLOĪDO

KVIEŠU GĒNI


Vidējais gēnu blīvums – > 100 kb (bet atkarīgs no genoma rajona)

Vidējais gēna izmērs – 2.2 kbp

Vidējais starpgēnu attālums – ?



http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/

16 MIEŽU GĒNI


4 BAC kloni (kopējais garums bp)

417,5 kbp

Kopējais gēnu skaits 20 Vidējais gēna garums (bp)

2,315

Vidējais proteīna garums (as)

336

Vidējais eksonu skaits 4.2 Vidējais eksona izmērs (bp)

244

Vidējais introna izmērs (bp)

398

Rostoks et al. (2002) FIG, 2:51

17AUGU GENOMA STRUKTŪRA –

MOBILIE ĢENĒTISKIE ELEMENTI


Transponējamo (mobilo) ģenētisko elementu klasifikācijas sistēma eikariotos

Wicker et al. (2007) A unified classification system for eukaryotic transposable elements. Nat Rev Genet, 8: 973

18


1. KLASE – RETROTRANSPOZONI

19TY1-COPIA UN TY3-

GYPSY


20RETROTRANSPOZĪCIJAS

MEHĀNISMS


Retrotranspozīcija notiek ar copy – paste mehānismu, t.i., notiek esošā retrotranspozona kopēšana un insercija jaunā vietā genomā

Retrotranspozīcija notiek ar DNS transkripcijas un transpozīcijas mehānismu palīdzību

21LTR RETROTRANSPOZONI

AUGU GENOMĀ

http://genomebiology.com/2004/5/6/2252013. GADA 22. FEBRUĀRIS

22


23


24


25RETROTRANSPOZONI AUGU

GENOMĀ


SanMiguel et al. (1996) Nested retrotransposons in the intergenic regions of the maize genome. Science, 274: 765

Sekvenē 280 kbp rajonu ap kukurūzas Adh1-F gēnu, identificē 10 jaunas retrotranspozonu grupas

Retrotranspozoni bieži insertējas viens otrā

Retrotranspozonu kopiju skaits 10 000 – 30 000 kopijas uz haploīdu genomu

26MIEŽU

RETROTRANSPOZONI


Pirmais miežu retrotranspozons atklāts 1996. gadā (Suoniemi et al. (1996) Retrotransposon BARE-1 is a major, dispersed component of the barley (Hordeum vulgare L.) genome. Plant Mol Biol, 30: 1321

1.4 x 104 kopijas uz haploīdu genomu. Kopā aizņem apmēram 3% no genoma

Pirmās miežu genoma sekvences parāda to pašu ainu kā kukurūzā (Dubcovsky et al. (2001); Rostoks et al. (2002)) - gēni ir kā salas retrotranspozonu jūrā

27RETROTRANSPOZONU

JŪRAS MIEŽU GENOMĀ


28RĪSU UN MIEŽU GENOMU

KOLINEARITĀTE


29RETROTRANSPOZONI UN

RETROVĪRUSI


Retrotranspozoni ir plaši izplatīti augu valstī, tie tiek transkribēti un to insercijas vietu polimorfisms vienas sugas ietvaros apliecina, ka tie ir aktīvi (Vicient et al. (2001) Envelope-class retrovirus-like elements are widespread, transcribed and spliced, and insertionally polymorphic in plants. Genome Res, 11: 2041)

Novērotas vīrusveidīgās daļiņas, kas satur GAG kapsīda proteīnu un integrāzi (Jaaskelainen et al. (1999) Retrotransposon BARE-1: Expression of encoded proteins and formation of virus-like particles in barley cells. Plant J, 20: 413)

Retrotranspozonu aktivitāte atkarīga no apkārtējās vides ietekmes, tos inducē kultivēšana augu audu kultūrās vai abiotiskais stress (Kalendar et al. (2000) Genome evolution of wild barley (Hordeum spontaneum) by BARE-1 retrotransposon dynamics in response to sharp microclimatic divergence. PNAS, 97: 6603

30VLP ŠŪNU

EKSTRAKTOS


A – frakcija, kas satur lielas ~40 nm VLP

B – frakcija, kas satur GAG, IN un RT proteīnus. Redzamas mazās VLP

C – frakcija, kas satur GAG, IN un RT proteīnus. Parādītas gan lielās, gan mazās VLP. Mazās VLP (11 – 16 nm) satur tikai GAG, lielās (~35 nm) satur arī IN un RT

Jaaskelainen et al. (1999) Plant J, 20: 413

31RETROTRANSPOZONU AKTIVITĀTI

IETEKMĒ VIDES FAKTORI


32RETROTRANSPOZONU AKTIVITĀTI

INDUCĒ AUDU KULTŪRAS

2013. GADA 22. FEBRUĀRIS Hirochika et al. 1996

33


2. KLASE – DNS TRANSPOZONI

34TRANSPOZĪCIJAS

MEHĀNISMS


Transpozīcija notiek ar cut – paste mehānismu

Transpozīciju veic enzīms transpozāze, kuru kodē pats transpozons (autonomie elementi), vai arī cits transpozons (neautonomie elementi)

Transpozīcijas rezultātā notiek genomiskās DNS rajona duplikācija

Transpozonam raksturīgi gala invertētie atkārtojumi. To sekvence un garums ir noderīgi transpozonu klasifikācijā

35


36TRANSPOZONI UN GĒNU

VEIDOŠANĀS


Līdz šim uzskatīts, ka transpozoni (retrotranspozoni) un to kodētie proteīni neveic nekādu saimniekorganismam nepieciešamu funkciju

Tomēr nesen atklāts, ka hAT klases transpozons miežos (pie šīs klases pieder arī kukurūzas Ac-Ds) ir specifisks tieši graudaugu grupai un tā kodējošā daļa ir pakļauta pozitīvai selekcijai, t.i., tas veic kādu organismam nepieciešamu funkciju

Muehlbauer et al. (2006) A hAT superfamily transposase recruited by the cereal grass genome. Mol Genet Genomics, 275: 553

37TRANSPOZONI UN GĒNU

VEIDOŠANĀS


hAT klases transpozons Arabidopsis izrādījās nepieciešams normālai augu attīstībai

Elementa kodētais proteīns, ko nosauca par DAYSLEEPER, saistās pie DNS rajona, kas atrodas augšpus no Arabidopsis DNS reparācijas gēna Ku70

Bundock and Hooykaas (2005) An Arabidopsis hAT-like transposase is essential for plant development. Nature, 436: 282

Knip et al. (2012) The SLEEPER genes: a transposase-derived angiosperm-specific gene family. BMC Plant Biology, 12:192

39KO VĒL SATUR AUGU

GENOMI?


Gēni un dažādi transpozoni un retrotranspozoni ir galvenās augu genoma sastāvdaļas. Bet vai tas ir viss?

DNS čipu analīze (whole genome tiling array), lai novērtētu, kuri genoma rajoni tiek transkribēti par RNS

Izrādās, ka papildus zināmiem gēniem, ļoti daudzi genoma rajoni bez zināmas funkcijas tiek transkribēti, piedevām to transkripcija ir atkarīga no diennakts ritma (circadian rhythm)

Hazen et al. (2009) Exploring the transcriptional landscape of plant circadian rhythms using genome tiling arrays. Genome Biol, 10: R17

40


GĒNU EKSPRESIJAS ANALĪZE AR DNS ČIPIEM S

AAAAAA

AAAAAA

Reverse transcription, dsDNA synthesis,

transcription/labelling Fragmentation of the cRNA

in vitro***

******

******

****** ******

*****

**

** **

**

*** ** *

*

*

probeset1

probeset2

***

************

******

*********

*** ***

************

******

*** ******

***

SCRI...

0.01

0.1

1

10

100

0.01

0.1

1

10

100

Norm

alize

d in

tens

ity (l

og sc

ale)

Control Drought Low_nitrate Salt Waterlog

41AFFYMETRIX DNS

ČIPI


Affymetrix GeneChip pārskats http://www.affymetrix.com/support/learning/training_tutorials/expression_data/eda_experimental_design/player.affx

Affymetrix Tiling Arrays pārskats http://www.affymetrix.com/support/learning/training_tutorials/tiling_analysis/tiling_array_analysis_fundamentals/player.html

42ARABIDOPSIS

AFFYMETRIX TILING ČIPS


1 683 620 unikālas 25 n garas oligonukleotīdu zondes

Komplektā ietilpst 2 čipi – katram DNS pavedienam savs

No augu šūnām izdalīja kopējo RNS dažādos diennakts laikos (2 dienas, ik pēc 4 stundām, kopā 12 paraugi) un analizēja ar Arabidopsis Tiling čipu

Gēni, kuru ekspresija mainās diennakts laikā

Atsevišķi eksoni un introni, kuru ekspresija mainās diennakts laikā

Alternatīvais splaisings

Nekodējošās RNS (miRNS), kuru ekspresija mainās diennakts laikā

Dabiskās antisense RNS, kuru ekspresija mainās diennakts laikā

43NEKODĒJOŠĀS RNS GĒNI

AUGU GENOMĀ


Proteīnus nekodējošās RNS – rRNS (23S, 16S, 5S rRNS), tRNS, mazās kodola un citoplazmatiskās RNS (U4, U6 snRNS)

Daudzas citas mazas RNS molekulas, kuras regulē gēnu ekspresiju pēc transkripcijas

Short interfering RNS (siRNS) un mikro RNS (miRNS)

Divpavedienu RNS loma gēnu ekspresijas regulācijā:

siRNS apspiež vīrusu RNS replikāciju

miRNS regulē dažādu gēnu mRNS ekspresiju

44 MIRNS


pri-miRNS kodējošais rajons parasti atrodas starpgēnu rajonos, to transkribē RNS Pol II

Proteīni DDL, CBC, SE un HYL1 izveido un stabilizē pri-miRNS sekundāro struktūru

DCL1 (Dicer-like1) šķeļ pri-miRNS un izveido pre-miRNS

pre-miRNS tiek transportēta no kodola citoplazmā, kur tā veido kompleksu ar Argonaute (Ago) proteīnu, kurš veic regulējamā gēna mRNS šķelšanu

45 EPIGENOMS


Epiģenētika – pētījumi par iedzimstošām izmaiņām gēnu darbībā, kas nav saistītas ar izmaiņām DNS sekvencē, it īpaši saistībā ar organisma attīstību

Epigenoms – katras organisma šūnas epiģenētiskais stāvoklis

Galvenās epiģenētikas pētītās parādības ir DNS metilācija (metilcitozīns) un histonu molekulu acetilācija

http://www.epigenesys.eu/

http://www.epigenesys.eu/

46


47AUGU GENOMI IR

DINAMISKI


Figure 1. Significant hybridization differences are due to structural variation.

Springer NM, Ying K, Fu Y, Ji T, et al. (2009) Maize Inbreds Exhibit High Levels of Copy Number Variation (CNV) and Presence/Absence Variation (PAV) in Genome Content. PLoS Genet 5(11): e1000734. doi:10.1371/journal.pgen.1000734http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1000734

http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1000734

49AUGU MITOHONDRIJU

GENOMS


Arabidopsis mitohondriju genoms 1997. gadā, 366 924 bp

Satur 50 – 60 gēnus (ribosomālo proteīnu un elpošanas kompleksa I – IV gēni, rRNS un tRNS gēni,) daudzi gēni translocēti uz kodolu dažādos augu taksonos

Augu mitohondriju genomiem ir tendence palielināties uz starpgēnu rajonu izmēru rēķina (satur DNS no kodola un hloroplastu genomiem)

Kompleksi genomi, garums no 200 līdz 2400 kbp, var būt gan lineāri, gan cirkulāri genomi un tie var sastāvēt no vairākām daļām

Mitohondriju genomā esošie atkārtojumi veicina iekšmolekulāro rekombināciju

Kubo and Newton (2008) Angiosperm mitochondrial genomes and mutations. Mitochondrion, 8: 5

50KUKURŪZAS MITOHONDRIJU

GENOMI


51DZĪVNIEKU

MITOHONDRIJU GENOMS


Dzīvnieku mitohondriju genoms ir kompakts, apmēram 16 – 17 kbp liels, satur 13 proteīnu gēnus un 4 – 24 RNS gēnus, gēni nesatur intronus, gēni mēdz pārklāties

Katrā šūnā ir vairāki simti mitohondriju un katrs mitohondrijs satur vairākas genoma kopijas

52AUGU HLOROPLASTU

GENOMS


Augu hloroplastu genoms ir 120 – 190 kbp garš un kodē > 100 gēnus (tai skaitā visus proteīnu sintēzei nepieciešamos rRNS un tRNS gēnus), gēnos ir sastopami introni

Katrā hloroplastā ir vairākas (20 – 40) genoma kopijas, parasti arī paši hloroplasti šūnā ir vairākās kopijās

Plaši pielietots augu sistemātikā (piemēram, rbcL gēns, kodē ribuloses-1,5-bifosfāta karboksilāzes/oksigenāzes lielo subvienību – rubisko)

53


Saski et al. (2007) TAG, 115: 571

54KODOLA, MITOHONDRIJU UN

HLOROPLASTU MIJIEDARBĪBAS


Anterograde signāli – no kodola uz organellām

Retrograde (atpakaļejošie) signāli – no organellām uz kodolu

CMS – citoplazmatiskā vīrišķā sterilitāte – pa mātes līniju iedzimstoša nespēja veidot putekšņus, kuru nosaka defekti mitohondriju genomā (bieži ATP sintāzes gēnos). Šie defekti noved pie izmaiņām kodola gēnu ekspresijā (bieži MADS-box transkripcijas faktoros

CMS fenotipu var novērst, ja kodola genomā ir Rf (restorer of fertility) lokusi, kuri novērš defektīvo mitohondriju proteīnu uzkrāšanos

Woodson and Chory (2008) Coordination of gene expression between organellar and nuclear genomes. Nat Rev Genet, 9: 383

55


Nils Rostoks

Vajag paskaidrojumu par labo attēlu

56PROTEĪNU TRANSPORTS

UZ ORGANELLĀM


Organellas sintezē tikai daļu no tām nepieciešamajiem proteīniem

Kodolā kodēto proteīnu biosintēze notiek endoplazmatiskajā tīklā, pēc tam proteīni tiek transportēti uz to darbības vietu

Lai proteīni nonāktu organellās, tiem jābūt atbilstošam signālam, kas nosaka to transportu hloroplastos vai mitohondrijos

57ORGANELLU GENOMS

AUGU ĢENĒTIKĀ


Organellu genoms segsēkļos (Angiospermeae) tiek nodots pa mātišķo līniju, bet kailsēkļos (Gymnospermae) pa vīrišķo līniju

Organellu genomus neietekmē dzimumvairošanās un mejotiskā rekombinācija, tādēļ tie piemēroti populāciju ģenētikas pētījumiem

Segsēkļos mitohondriju un hloroplastu genoms izplatās tikai ar apaugļotām sēklām (sporofītu), bet kodola genoms var izplatīties arī ar putekšņiem (vīrišķo gametofītu). Rezultātā mitohondriju un hloroplastu genoms labāk piemērots populāciju diferenciācijas pētījumiem

58SINTĒNIJA UN SALĪDZINOŠĀ

GENOMIKA


Visiem dzīvajiem organismiem uz zemes ir kopīga izcelsme, to var redzēt arī to genomos

Jo evolucionāri tuvāki pētāmie taksoni, jo līdzīgāki to genomi

SINTĒNIJA


59

Sākotnēji šis termins nozīmēja, ka gēni ir uz vienas hromosomas, t.i., sintēniski (no grieķu valodas burtiski “uz viena pavediena”)

Termins tiek plaši lietots, lai uzsvērtu, ka gēnu kārtība hromosomā dažādiem organismiem ir vienāda (sintēniska)

Mikrosintēnija – gēnu kārtības saglabāšanās nelielā genoma rajonā

Kolinearitāte – gēnu (marķieru) kārtības saglabāšanās

GĒNU KĀRTĪBAS SAGLABĀŠANĀS EVOLŪCIJAS GAITĀ (SINTĒNIJA)


60

A B C D E

A X B C E A B CB’ D E

A B C D E A B C D E

Sākotnējā hromosomaJaunu sugu

veidošanās

Suga 1 Suga 2

Neatkarīga evolūcija mutācijas, gēnu duplikācijas, insercijas un delēcijas

61SINTĒNIJAS PIELIETOJUMS

GENOMU KARTĒŠANĀ

Kukurūzas – rīsu gēnu sintēnija

Rīsu hromosoma ir sintēniska kukurūzas 3 un 8 hromosomai.


Augu molekulārā ģenētika

Documents

Transcript of Augu molekulārā ģenētika