ASPECTOS GENÉTICOS E CLÍNICOS DA SÍNDROME DE...
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BÁRBARA MERFORT FERREIRA
ASPECTOS GENÉTICOS E CLÍNICOS DA SÍNDROME DE
ROBINOW AUTOSSÔMICA DOMINANTE
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA (BRASÍLIA), 2017
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
BÁRBARA MERFORT FERREIRA
ASPECTOS GENÉTICOS E CLÍNICOS DA SÍNDROME DE ROBINOW
AUTOSSÔMICA DOMINANTE
Dissertação apresentada como requisito parcial
para obtenção do Título de Mestre em Ciências da
Saúde do Programa de Pós-graduação em Ciências
da Saúde da Universidade de Brasília
Orientadora: Drª Juliana Forte Mazzeu de Araújo
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA (BRASÍLIA)
2017
Universidade de Brasília
Faculdade de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Dissertação de Mestrado
BÁRBARA MERFORT FERREIRA
Título:
Aspectos genéticos e clínicos da síndrome de Robinow autossômica
dominante
Comissão examinadora:
___________________________________
Profª Drª Juliana Forte Mazzeu de Araújo
Faculdade de Medicina – UnB
___________________________________
Profª Drª Patrícia Natália da Silva Moretti
Instituto de Biologia - UnB
___________________________________
Profª Drª Ana Carolina Acevedo Poppe
Faculdade de Ciências da Saúde - UnB
___________________________________
Profª Drª Érica Carine Campos Caldas Rosa
Faculdade de Ciências da Saúde – UnB
Suplente
Brasília, 14 de dezembro de 2017
Dedico este trabalho ao meu irmão, Marcelo Merfort Ferreira.
Você me ensinou que o amor transcende o tempo e que
nada importa, além daquilo que realizamos hoje.
Carpe diem.
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradacer à minha família, que sempre me incertivou
incondicionalmente e me deu liberdade para fazer aquilo que gosto. A minha querida
mãe, Roseli de Cássia Merfort, uma mulher forte que me ensinou a importância de
não desistir de meus sonhos. Agradaço ao meu pai, Fernando César Ferreira, meu
amigo, que é simplesmente um exemplo de força e inspiração para mim. Agradeço ao
meu companheiro de vida, meu amor, Ravi Coelho Almeida Diniz, por tudo, mas
principalmente pela paciência e por estar ao meu lado em todos os momentos,
inclusive os mais difíceis.
Agradeço muitíssimo a professora Drª. Juliana Forte Mazzeu de Araújo, por
tantas horas e dias dedicados a realização deste trabalho, agradeço pela confiança e
pelo aprendizado alcançados neste período que estive sob sua orientação. Termino
este trabalho na certeza que és uma excelentíssima educadora, brilhante geneticista
e uma pessoa extremamente humana.
Agradeço também a professora Drª Íris Ferrari, que desde os dias de estágio
vem me dando lições diárias sobre a genética, mas principalmente sobre a vida. Drª
Íris, lhe admiro e levarei seus ensinamentos para toda a vida, com certeza.
Agradeço a professora Drª Lenora Gandolfi e ao professor Dr. Felipe Cardia,
coordenadores do projeto Saúde e Educação Integral, do qual participei durante todo
o curso de mestrado e que fez mudar minha percepção sobre a importância do amor,
da saúde preventiva, da educação e do meio ambiente na promoção de qualidade de
vida da população carente.
Agradeço imensamente a toda a equipe do laboratório de Genética Clínica da
Facudade de Medicina da Universidade de Brasília, por todo apoio, suporte e
momentos de descontração. Obrigada Nilza, Aluísio, Drª Mara, Drª Bia, Drª Rosenelle,
Drª Érica, Polly, Laís, Ana, Amanda, Ariadne, Pedro, Bruno e cada um que contribuiu
de alguma forma para a realização deste trabalho. Agradeço especialmente a minha
colega Shélida Braz, que se tornou uma amiga. Obrigada por nossas horas de estudo,
obrigada por compartilhar comigo suas dúvidas e experiências que contribuíram muito
para o meu aprendizado.
Obrigada aos professores e colegas do Instituto de Biologia da Universidade
de Brasília, as professoras Drª. Aline Pic Taylor, Drª. Silviene de Oliveira e Drª. Patrícia
Moretti, as alunas Marcela, Gabriela, Vanessa, Yasmin e Harumy, que deram suporte
técnico e muito apoio para a realização desse trabalho.
Agradeço todas as oportunidades de que me foram oferecidas pela
Universidade de Brasília que contribuíram não só para a conclusão deste trabalho,
mas para a minha formação como mestre. Agradeço a Universidade Católica de
Brasília e a Baylor College of Medicine nos Estados Unidos pelo suporte técnico na
execução dos procedimentos realizados neste trabalho. Agradeço também pelo
suporte acadêmico e administrativo fornecido pelo Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde da Universidade de Brasília, meu obrigada especial para os
funcionários da secretaria e do financeiro, Vitória, Luciana, Taynan e Beatriz que
foram extremamente eficientes em todas as ínumeras solicitações. Agradeço a Capes
pela bolsa concedida que possibilitou a minha dedicação exclusiva na realização
desse trabalho.
Sou grata a todos que somaram de alguma forma para a construção e
conclusão deste projeto, amigos, familiares, colegas e professores, deixo aqui meu
reconhecimento e meu muito obrigada a todos vocês.
Resumo
A síndrome de Robinow é um distúrbio esquelético raro em que as variantes
patogênicas conhecidas estão associadas a genes participantes da via de sinalização
Wnt, não-canônica, incluindo ROR2, WNT5A, DVL1 e DVL3. No entanto, grande parte
dos casos clinicamente diagnosticados com esta síndrome permanecem sem uma
solução molecular. No presente estudos realizamos um screaning para mutações nos
exons 14 e 15 dos genes DVL1 e DVL3, por sequenciamento Sanger, em 11 pacientes
diagnosticados com síndrome de Robinow autossômica dominate (DRS), dentre os
quais um paciente apresentou mutação em DVL3 e outros 4 apresentaram mutação
em DVL1. Nos 6 pacientes em que não foram observadas mutações em DVL1 ou
DVL3 foi realizado sequenciamento completo de exoma (WES), no intuito de revelar
novas variantes envolvidas. Foram então identificadas duas mutações em
heterozigose no gene WNT5A em outros dois pacientes do nosso estudo. O
sequenciamento completo de exoma (WES) também revelou uma variante
patogênica no gene FZD2 em dois membros afetados da mesma família. O gene FZD2
não havia sido previamente relacionado a síndrome de Robinow na literatura,
entretanto já havia sido indicado a estar envolvido em fenótipos Robinow-like. Dois
casos permanecem sem uma etiologia molecular definida. Esses dados revelam que
parálogos específicos de genes podem sugerir importantes dominios protéicos que
estão envolvidos no desenvolvimento embrionário e ainda apoiam a hipótese de que
a síndrome de Robinow resulta da perturbação da via Wnt/PCP. Nossos achados
demonstram a utilidade de estudos genômicos de doenças raras para esclarecer os
eventos envolvidos no desenvolvimento humano complexo e contribuem para a
melhor caracterização da síndrome de Robinow.
Abstract
Robinow syndrome is a rare skeletal disorder in which known pathogenic
variants reside in genes for noncanonical Wnt signaling including ROR2, WNT5A,
DVL1 and DVL3. However, a large part of clinically diagnosed cases remain
molecularly unsolved. In the present study we performed a screening for mutations in
DVL1 and DVL3, by Sanger sequencing, in 11 patients diagnosed with autosomal
dominant Robinow syndrome. Of this cohort, one patient presented mutation in DVL3
gene and another 4 patients presented mutation in DVL1. In patients in whom no
mutations in DVL1 or DVL3 were observed, we performed complete exome
sequencing (WES) that revealed heterozygous mutations in the WNT5A gene in two
patients and one pathogenic variant in the FZD2 gene in two affected members of the
same family. FZD2 had not been previously related to Robinow's syndrome, however
it had already been indicated to be involved in Robinow-like phenotypes. These data
reveal specific gene paralogs, suggest relevant protein domains involved, and further
support the hypothesis that Robinow syndrome results from perturbation of the
Wnt/PCP pathway. Our findings demonstrate the utility of rare disease genomic studies
to illuminate complex human developmental pathways and contribute to a better
characterization of the Robinow syndrome.
Lista de tabelas
Tabela I - Frequência de sinais clínicos em DRS e RRS - 2007 16
Tabela II -
Primers utilizados para amplificação da região codificante
do gene DVL1. Cada par de primer amplifica um exon do
gene DVL1 ou parte dele.
38
Tabela III -
Primers utilizados para amplificação da região codificante
do gene DVL3. Cada par de primer amplifica um exon do
gene DVL3 ou parte dele.
38
Lista de figuras
Figura I - Representação estrutural da proteína ROR2. 21
Figura II - Comparação de fenótipos de desenvolvimento em ratos Ror2 -
/ - e Wnt5a - / -. 22
Figura III -
Camundongos Wnt5a - / - têm defeitos anatômicos
fenotipicamente semelhantes a pacientes com síndrome
Robinow autossômica dominante
23
Figura IV - Visão global da via de sinalização Wnt. 32
Figura V - Segmentos de eletroferogramas do sequenciamento Sanger do
gene DVL1 nos pacientes 01, 02, 03 e 04. 42
Figura VI - Segmentos de eletroferogramas do sequenciamento Sanger do
gene DVL3 no paciente 05. 42
Figura VII -
Localização uniforme das variantes DVL1 e DVL3 relacionadas
a síndrome de Robinow. Todas as variantes se encontram no
último e penúltimo exon e resultam na mudança do quadro de
leitura destes genes.
44
Figura
VIII - Modelo de homologia WNT5A. 50
Figura IX - Representação esquemática dos domínios funcionais
conhecidos de FZD2 que interagem com DVL. 55
Figura X - Modelagem in silico da mutação Gly434Val em FDZ2. 55
Lista de quadros
Quadro I - Descrição de mutações nos genes DVL1 e DVL3 em
pacientes com DRS. 43
Quadro II - Frequência de sinais clínicos em pacientes com DRS2 e
DRS3. 46
Quadro III - Descrição de mutações nos genes WNT5A em pacientes
com DRS. 49
Quadro IV - Frequência de sinais clínicos em pacientes com DRS1. 52
Quadro V - Descrição de mutações no gene FZD2 em pacientes com
DRS e Omodisplasia. 54
Quadro VI - Frequência de sinais clínicos em pacientes com DRS e
mutação em FZD2. 57
Quadro
VII -
Frequência de sinais clínicos dos pacientes de nosso estudo
e daqueles descritos para pacientes com DRS e RRS 60
Lista de siglas e abreviaturas
AP-1 - Activator protein 1
APC - Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 46
Axina/AXIN1 - Axis Inhibition Protein
CamKII - Kinases Dependentes de Cálcio/Calmodulina II
CDC42 - Cell Division Control Protein 42 Homolog
CE - Movimentos de Extensão Convergente
CK1a - Casein Kinase 1 Alpha
COVESDEM - Defeitos de Segmentação Costovertebral com Mesomelia
CRD - Domínio Rico em Cisteína
DAAM1 - Dishevelled Associated Activator Of Morphogenesis 1
Diversin - Ankyrin Repeat Domain 6
Drok - Drosophila Rho-kinase
DRS - Síndrome de Robinow Autossômica Dominante
Dsh - Drosophila Dishevelled Segment Polarity Protein
DVL1 - Dishevelled Segment Polarity Protein 1
DVL2 - Dishevelled Segment Polarity Protein 2
DVL3 - Dishevelled Segment Polarity Protein 3
FLN1 - Proteína Filamin A
FZD - Member of the 'frizzled' Gene Family
FZD2 - Frizzled Class Receptor 2, Seven Transmembrane Spanning
Receptor
FZD5 - Frizzled Class Receptor 5, Seven Transmembrane Spanning
Receptor
FZD7 - Frizzled Class Receptor 7, Seven Transmembrane Spanning
Receptor
GSK3β - Glycogen synthase kinase 3 Beta
GTP - Trimeric G-protein
JNK - C-Jun N-terminal Kinase
LRP - Low-density Lipoprotein
LRP5/6 - Receptor de Baixa Densidade Relacionado a Lipoproteína
5/6
MKK7 - Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 7
NFAT - Fator Nuclear de Células T Ativadas
PCP - Via de Polaridade Planar Celular
PI3K - Fosfoinositida 3-Kinase
PKC - Proteína Kinase C
PRICKLE - Prickle Planar Cell Polarity Protein
Rac - Ras-related C3 botulinum toxin substrate
RhoA - Ras homolog gene family, member A
ROCK - Rho-associated protein kinase
ROR2 - Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 2
RRS - Síndrome de Robinow Autossômica Recessiva
RS - Síndrome de Robinow
SPECC1L - Sperm Antigen With Calponin Homology And Coiled-Coil
Domains 1 Like
TCF/LEF - T-cell factor/lymphoid enhancer factor
VANGL - VANGL Planar Cell Polarity Protein 1
Wnt/Ca2+ - Via Dependente De Cálcio
WNT3A Wingless-type MMTV integration site family, member 3A
WNT5A - Wingless-type MMTV integration site family, member 5A
Sumário
I. Introdução .............................................................................................. 15
I.1 HISTÓRICO DA SÍNDROME DE ROBINOW .............................. 15
I.2 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA RS ........................................ 16
I.3 ETIOLOGIA DA RRS .................................................................. 18
I.3.1 O gene ROR2 ................................................................. 20
I.4 ETIOLOGIA DA DRS .................................................................. 23
I.4.1 Os genes DVL1 e DVL3 ................................................... 26
I.5 VIA DE SINALIZAÇÃO WNT ....................................................... 30
II. Objetivo ............................................................................................... 36
III.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................... 36
III. Materiais e métodos .......................................................................... 37
III.1 SELEÇÃO DOS PACIENTES PARA ESTUDO ......................... 37
III.1.1 Coleta de Material Biológico .................................................... 37
III.2 TRIAGEM DE MUTAÇÕES ....................................................... 37
III.2.1 Extração de DNA ..................................................................... 37
III.2.2 PCR- Reação em cadeia pela polimerase ............................... 38
III.2.3 Sequenciamento Sanger ......................................................... 39
III.2.4 Clonagem ................................................................................ 39
III.2.5 Sequenciamento Completo de Exoma (WES) ......................... 39
IV. Resultados e discussão .................................................................... 42
IV.2 PESQUISA DE MUTAÇÕES NOS GENES DVL1 E DVL3 POR
SEQUENCIAMENTO SANGER ........................................................... 42
IV.3 CARACTERIZAÇÂO CLÍNICA DOS PACIENTES COM
MUTAÇÃO EM DVL1 E DVL3 ............................................................... 47
IV.4 PESQUISA DE MUTAÇÕES POR WES ................................... 49
IV.4.1 Mutações em WNT5A ............................................................. 49
IV.5 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES COM
MUTAÇÃO EM WNT5A ........................................................................ 52
IV.4.2 Identificação de novos genes associados a DRS por WES .... 54
IV.6 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES COM
MUTAÇÃO EM FZD2 ........................................................................... 57
IV.7 SÍNTESE DE RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................... 59
IV.7.1 Análise Molecular .................................................................... 59
IV.7.2 Análise Clínica ......................................................................... 60
V. Conclusão ........................................................................................... 64
VI. Referências ........................................................................................ 66
VII. Anexos .............................................................................................. 78
15
I. Introdução
I.1 HISTÓRICO DA SÍNDROME DE ROBINOW
Em 1969 Robinow et al. descreveram pela primeira vez um raro tipo de nanismo
sindrômico caracterizado por encurtamento mesomélico de membros, genitália
hipoplásica e face fetal típica. A desordem, denominada síndrome de Robinow (RS),
ficou conhecida como síndrome da face fetal devido a aparência facial característica
apresentada por indivíduos acometidos pelo distúrbio. O trabalho pioneiro de
Robinow et al. foi realizado a partir observação de filhos de casal não consanguíneo
que apresentavam nanismo mesomélico, genitália hipoplásica e anomalias faciais:
hipertelorismo, fissuras palpebrais alargadas, nariz curto e anomalias dentárias.
Devido ao grande número de afetados de ambos os sexos em gerações precedentes
nas famílias observadas, ficou sugerido que o padrão de herança para síndrome era
autossômico dominante.
No ano de 1978 uma nova síndrome de herança autossômica recessiva que
associava encurtamento mesomélico de membros à um padrão de características
faciais, genitália hipoplásica e defeitos de segmentação costovertebral foi sugerida
por Wadia et al. (1978). Esta síndrome recebeu o acrônimo COVESDEM
(costovertebral segmentation defects with mesomelia). No ano seguinte reconheceu-
se que a síndrome COVESDEM era uma variante da RS com um modo de herança
alternativo, denominada síndrome de Robinow autossômica recessiva (RRS).
A hipótese de mecanismo ligado ao X foi excluída com o relato do primeiro caso
da RS onde havia a transmissão de pai para filho. A RS teve, assim, seu padrão de
herança delimitado, revelando uma heterogeneidade genética (Shprintzen et
al.,1982).
A incidência da síndrome de Robinow permanece desconhecida, no entanto a
escassa apresentação de casos descritos na literatura sugere que esta frequência é
baixa. Intrigantemente, até o ano de 1997 haviam sido descritos 80 casos da RS,
dentre eles 19 eram de indivíduos nascidos na Turquia. Há indícios de que uma maior
ocorrência da RRS na Turquia e Oman, regiões que apresentam alto índice de
casamentos consanguíneos; cerca de 80% dos afetados pela forma recessiva são
fruto de casamentos consanguíneos. É importante salientar que a baixa incidência da
16
RS pode ser atribuída a um sub diagnóstico, causado pela variabilidade clínica dos
pacientes, o que torna o diagnóstico clínico diferencial e complexo, exigindo uma
descrição completa do fenótipo dos afetados (Akşit et al.,1997).
A RS também apresenta expressividade altamente variável, tornando
necessária a observação de sinais clínicos para a determinação do padrão de herança
e para o diagnóstico diferencial com síndromes que apresentam manifestações
clínicas semelhantes.
I.2 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA RS
A RS é uma displasia esquelética associada a características dismórficas
faciais e genitália hipoplásica. Dentre os sinais mais marcantes da RS destacam-se o
hipertelorismo e a baixa estatura, que são observados em suas duas formas de
herança. Como grande parte de casos descritos estão relacionados a eventos
esporádicos, determinar a forma de herança para cada paciente torna-se por vezes
impossibilitado. Entretanto, observou-se que em relatórios da RRS todos os indivíduos
afetados apresentavam defeitos na segmentação costovertebral e fusão de costelas,
características estas que não tinham sido observadas em pacientes com a forma de
herança dominante da síndrome. A síndrome de Robinow autossômica dominante
(DRS) apresenta manifestações clínicas mais moderadas em relação ao
acometimento ósseo, podendo apresentar estatura normal além de acometimento
cardíaco e renal nos indivíduos afetados (Mazzeu et al., 2007).
Para uma melhor visualização das formas de herança da RS e de suas
respectivas manifestações clínicas, Mazzeu et al. (2007) relataram a frequência de
sinais clínicos considerados importantes para a discriminação das variantes
dominantes ou recessivas a partir da observação de 38 pacientes examinados
pessoalmente pelos autores e de 50 indivíduos afetados descritos na literatura (Tabela
I). Foi utilizada a presença de fusão de costelas como diagnóstico da variante
recessiva, além do padrão de herança em casos familiares. Desta forma, 37 pacientes
foram classificados como tendo RRS e outros 51 como tendo DRS. Os sinais clínicos
presentes em mais de 75% dos acometidos por qualquer forma, e, por conseguinte,
os mais importantes para a caracterização da síndrome foram: hipertelorismo,
características nasais, hipoplasia do terço médio da face, encurtamento mesomélico
de membros, braquidactilia, clinodaquitilia, micropênis e baixa estatura. Hemivertebra
17
e escoliose estavam presentes em mais do que 75% dos pacientes com a RRS, mas
em menos do que 25% dos pacientes com DRS. Hérnia umbilical (32,3%) e dentes
supranumerários (10,3%) foram encontradas exclusivamente em pacientes com a
forma dominante. A aparência facial dos indivíduos diagnosticados com a RS muda
com o tempo e a semelhança com a face fetal torna-se menos marcada na fase adulta.
Tabela I - Frequência de sinais clínicos em DRS e RRS - 2007
Característica Prevalência em DRS (%) Prevalência em RRS (%)
Hipertelorismo (ocular) 100 100
Narinas antevertidas 96 96
Ponte nasal ampla 97 95
Micropênis 84 100
Narinas voltadas para cima 87 97
Encurtamento mesomélico de membros 80 100
Baixa estatura 81 97
Hipoplasia do terço médio da face 81 94
Nariz curto 81 93
Braquidactilia 81 91
Cantos da boca voltado pra baixo 63 95
Clinodactilia 70 88
Testa proeminente 79 77
Boca triangular 65 86
Mãos curtas 62 84
Má oclusão dentária 49 94
Criptorquidismo 72 67
Hipoplasia de pequenos lábios 50 81
Ponte nasal baixa 78 49
Clitóris hipoplasico 46 80
Micrognatia 57 68
Hemivertebra 23 98
Cílios longos 54 59
Hiperplasia de gengiva 36 71
Filtro longo 65 39
Língua bífida 39 59
Escoliose 18 77
Macrocefalia 64 26
Palato alto arqueado 52 14
Tabela I. Distribuição dos 75 sinais clínicos de acordo com suas frequências em pacientes com
síndrome de Robinow autossômica dominante (DRS) e recessiva (RRS). A tabela sofreu uma
modificação e foram excluídos sinais com frequência menor que 50%. Dados retirados de Mazzeu et
al. (2007).
Atualmente o diagnóstico diferencial entre a RRS e a DRS está bem
consolidado, entretanto há a necessidade de se avaliar um grupo de informações
como o histórico familiar e a manifestação de sinais clínicos e seu enquadramento
18
dentro do grupo de sinais já descritos para cada variante da síndrome. Além de que,
o uso de técnicas moleculares de diagnóstico que buscam por alterações genéticas
especificas podem ser importantes para explicar os fenótipos encontrados. Tais
ferramentas são indispensáveis para confirmação da suspeita clínica da RS (Tufan et
al., 2005).
Devido a expressividade variável, pacientes com RS tipicamente têm uma
ampla gama de possíveis diagnósticos diferenciais, incluindo outros distúrbios
esqueléticos, principalmente a síndrome Aarskog-Scott, (MIM#305400) e síndrome de
Opitz G/BBB (MIM#145410).
Assim como os sinais clínicos da RS são diversos, sua etiologia também é
geneticamente heterogênea. A RRS foi definida por mutações no gene que codifica o
receptor órfão de tirosina-kinase 2 (ROR2) (van Bokhoven et al., 2000; Afzal e Jeffery,
2003). Mutações no gene WNT5A (Wnt Family Member 5A), que codifica um ligante
típico de ROR2, também são encontradas em alguns indivíduos com DRS, mas estes
não estão presentes em todos os casos (Person et al., 2010). Outros genes, que
codificam proteínas participantes da via Wnt de sinalização vêm sendo associados a
fenótipos de RS dominante. Criticamente, os genes ROR2, WNT5A,
DLV1(Dishevelled Segment Polarity Protein 1) e DVL3 (Dishevelled Segment Polarity
Protein 3), genes associados a RS, são mediadores fundamentais da via Wnt de
sinalização. Assim, enquanto os achados clínicos para RS mostram uma certa
heterogeneidade, as mutações nesses genes demostram estar ligadas
funcionalmente através de uma via comum.
I.3 ETIOLOGIA DA RRS
Posteriormente a descoberta da herança autossômica recessiva ligada a RS
vários trabalhos foram publicados descrevendo pacientes ao redor do mundo que
apresentavam manifestações clínicas semelhantes. No estudo de Mazzeu et al.
(2007) foram delineadas detalhadamente essas características, através de uma
comparação clínica entre as formas de herança. Tais sinais incluem baixa estatura,
encurtamento mesomélico de membros, fusão de costelas, braquidactilia, defeitos
cardíacos congênitos, hipoplasia genital e uma aparência facial dismórfica. A
aparência facial inclui testa proeminente, hipertelorismo, hipoplasia facial, boca larga
19
e nariz curto com narinas antevertidas. As anomalias orais incluem hipertrofia da
gengiva, anormalidades dentárias e fenda lábio palatina.
Uma outra comparação entre os fenótipos craniofaciais e intra-bucais de 9
pacientes com DRS e três outros com RRS foi apresentada por Beiraghi et al., 2011.
Apesar de haver sobreposições, em especial no que diz respeito às características
mais prevalentes, como o hipertelorismo, o nariz curto e largo e as narinas
antevertidas, a dismorfologia craniofacial foi mais grave em pacientes com a RRS. Em
contraste, as características intra-orais foram mais graves em pacientes com a
desordem de herança dominante, incluindo ampla cume retromolar, deformação
rebordo alveolar, má oclusão, aumento gengival, apinhamento dentário e hipodontia.
Em ambos os tipos, as características faciais tornaram-se menos pronunciadas em
indivíduos mais velhos. O estudo sugeriu que o diagnóstico diferencial entre DRS e
RRS pode ser reforçado a partir da observação de diferenças no padrão de
deformação da crista alveolar e da gravidade de outras características intrabucais
(Beiraghi et al., 2011).
A RRS configura-se como uma displasia esquelética grave que promove
anomalias esqueléticas acentuadas que levam ao acometimento da estrutura óssea
de seus afetados. Tal fato tem instigado pesquisadores a buscarem uma melhor
compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no fenótipo da síndrome. Em
busca de uma causa genética van Bokhoven et al. (2000) estudaram 11 famílias, 10
das quais foram derivadas de Turquia e uma do Paquistão. Os pais de todos, exceto
de uma das famílias, eram consanguíneos, sendo a maioria primos de primeiro grau.
Os autores mapearam e sequenciaram um gene para esta desordem na região 9q21-
q22 e encontraram mutações nos exons 5, 8 e 9. Tais mutações encontravam-se no
gene ROR2 e resultavam em códons de parada prematuros ocasionando proteínas
não funcionais. A morfogênese anormal característica do rosto e genitais externos,
juntamente com nanismo, encurtamento de membros e anomalias de segmentação
costovertebrais foram enfatizadas como características clínicas da RRS pelos autores.
Simultaneamente e independentemente, Afzal et al. (2000), realizaram o
mapeamento por homozigose para também identificar o gene envolvido na RRS. O
estudo sucedeu-se por meio de uma ampla pesquisa do genoma envolvendo cinco
famílias de casais consanguíneos e descendentes afetados. A partir do mapeamento
foi localizada uma única região de homozigose ocorrendo também em um segmento
20
de 3-4 CM na região 9q22, entre os marcadores D9S1836 e D9S1803. (Afzal, et al.,
2000). Em um trabalho subsequente os autores desenvolveram um estudo para
localizar o gene no intervalo identificado, a partir da análise de polimorfismo
conformacional de fita simples (SSCP) e sequenciamento, onde identificaram
mutações nos exons 5, 7 e 9 do gene ROR2 em 26 dos 27 pacientes investigados.
Consolidando assim, o gene ROR2 como principal candidato a causar o fenótipo da
RS (Afzal et al., 2003).
No ano de 2004 foi realizado um significativo trabalho em modelo animal a partir
de uma detalhada análise de camundongos Ror2 -/- comparado ao desenvolvimento
dos sinais clínicos apresentados por afetados pela RRS. Análise da expressão de
Ror2 na região craniofacial foi realizada em embriões em diferentes fases de
desenvolvimento. Os resultados demonstraram que as malformações vertebrais em
camundongos Ror2 -/- são devidos a reduções no mesoderma pré-somítico e defeitos
na somitogênese. O encurtamento mesomélico de membros em camundongos Ror2
-/- é uma consequência da diferenciação alterada de condrócitos. Além disso,
mostrou-se que o fenótipo craniofacial é causado por um crescimento excessivo da
linha média. A expressão Ror2 no tubérculo genital e seu tamanho reduzido em
camundongos Ror2 -/- sugere que Ror2 esteja também envolvido no desenvolvimento
genital (Schwabe et al., 2004).
Além de demonstrar que ROR2 é essencial nas fases iniciais da embriogênese
e na formação óssea, o estudo apresentado por Schwabe et al. (2004) ressaltou o
papel da interação do gene ROR2 na atividade das proteínas Wnt. Tais proteínas
exercem uma diversidade de funções como a proliferação e polaridade celular durante
todo processo de embriogênese de vertebrados (Komiya e Habas, 2008).
Curiosamente, camundongos Ror2 - / - e Wnt5a - / -, exibem fenótipos semelhantes
(Yamaguchi et al., 1999). Este trabalho em modelo animal propõe o gene ROR2 como
principal candidato a causar da RRS e sugere a possível interação de ROR2 com
proteínas da família Wnt. Tais achados fornecem evidências para a melhor
compreensão mecanismos que desencadeiam a clínica dos afetados pela RS.
I.3.1 O gene ROR2
O gene ROR2 (receptor tyrosine kinase-like orphan receptor) codifica uma
proteína pertencente a uma superfamília de glicoproteínas transmembrânicas que
21
funcionam como receptores de fatores de crescimento na superfície celular. As RTKs
desempenham um papel no controle da maioria dos processos celulares básicos,
incluindo a proliferação celular, diferenciação, migração e metabolismo (Afzal
e Jeffery, 2003). O gene ROR2 está localizado em 9q22.2, possui cerca de 222 kb é
constituído de nove exons (Ali et al., 2007).
A estrutura da proteína ROR2 está bem descrita, seus domínios exercem
funções já conhecidas em outros receptores tirosina kinase que participam de vias de
transdução de sinal. O que a torna diferente é sua participação na regulação celular
envolvida no desenvolvimento ósseo. A atividade normal dessa proteína desencadeia
a ativação de uma via de sinalização intracelular, que leva informações até o núcleo
controlando, assim, a expressão e produção de proteínas. Alterações em
determinados domínios de ROR2 podem levar a perda da função normal da proteína
ou ainda uma atividade parcial prejudicando as vias onde ela atua (Liu et al., 2008).
O mecanismo geral de ativação do gene ROR2 funciona pela interação do
ligante ao domínio de ligação extracelular estimulando a dimerização do receptor o
que resulta na fosforilação da tirosina alvo o que leva ao recrutamento de proteínas
sinalizadoras que ativam a cascata de sinalização intracelular (Schlessinger, 2000).
Esses receptores possuem três domínios extracelulares: um domínio semelhante ao
da imunoglobulina Ig-like, um domínio rico em cisteína e um domínio Kringle. Os dois
domínios intracelulares que tem atividade de tirosina kinase são ricos em serina e
treonina e um domínio rico em prolina, como mostrado na Figura I.
22
.
Figura I - Representação estrutural da proteína tirosina kinase ROR2 com apresentação de seus
domínios extracelulares e intracelulares. Adaptado de Afzal e Jeffery, 2003.
O domínio rico em cisteína extracelular medeia a ligação de receptores FZD
(members of the 'frizzled' gene family) e Wnts além de uma variedade de outras
proteínas. As proteínas Wnts são uma família de 19 glicoproteínas que participam de
processos biológicos vitais durante a embriogênese, entre eles, a proliferação celular,
migração e autodiferenciação celular (Wodarz et al., 1998; Huelsken e al., 2001).
O receptor ROR2 liga-se a várias proteínas Wnts das vias canônica e não-
canônica, incluindo ligantes como WNT3A (Wnt Family Member 3A) e WNT5A (Hikasa
et al., 2002; Oishi et al., 2003; Mikels e Nusse, 2006). Funcionalmente, ROR2 potencia
ou inibe a sinalização Wnt canônica, dependendo do tipo de célula e da especificidade
da proteína Wnt examinada (Billiard et al., 2005). No entanto, é a interação entre
ROR2 e o ligante WNT5A não-canônico, que recebeu a maior atenção nos últimos
anos devido a camundongos Ror2 -/- e Wnt5a -/- exibirem fenótipos semelhantes,
incluindo nanismo, membros encurtados, anormalidades faciais, defeitos do septo
ventricular do coração e anormalidade no desenvolvimento do pulmão (Figura II)
(Oishi et al., 2003).
23
Foi demonstrado que ROR2 é expresso por condrócitos da Anlagen
cartilaginosa e da placa de crescimento. Em condrócitos de adultos, ROR2 é expresso
na cartilagem da superfície das articulações e nos meniscos fibrocartilágenos do
joelho (DeChiara et al., 2000). Billiard et al. (2005) também observou que a expressão
do RNAm de ROR2 foi altamente regulada de forma bifásica durante a diferenciação
de osteoblastos humanos, sendo praticamente indetectável em células-tronco
pluripotentes, aumentando 300 vezes em preosteoblastos comprometidos e
desaparecendo novamente em osteócitos. Além disso, a expressão de ROR2 em
osteoblastos foi suprimida pelo antagonista Wnt. Tais dados sugerem que ROR2 pode
regular a formação óssea.
Figura II – Comparação de fenótipos de desenvolvimento em ratos -/- e Wnt5a -/- Aparência geral do
tipo selvagem (WT), Ror2 -/-, e Wnt5a -/- recém-nascidos. Tanto ROR2 -/- e WNT5A -/- recém-nascidos
exibem nanismo, anormalidades faciais e membros e cauda encurtados. Adaptado de Oishi et al., 2003.
Nomachi et al. (2008) demonstraram que ROR2 também tem papel
fundamental na migração celular induzida por WNT5A, este ligante regula a formação
de lamelopódios e a reorientação de microtúbulos. Essa resposta é medida pela
ativação de JNK e só ocorre quando ROR2 está associado à proteína Filamin A
(FLN1). Mutações no gene FLN1 causam diversas doenças genéticas dentre elas a
síndrome Oto-palato digital (MIM#311300), que compartilha diversos sinais clínicos
com a RS. Tais dados apontam para a possibilidade de outros genes da via WNT5A-
ROR2 estarem envolvidos na etiologia de síndromes malformativas semelhantes a RS
e, portanto, mutações nesses genes devem ser investigadas como responsáveis pela
desordem.
I.4 ETIOLOGIA DA DRS
Os primeiros estudos em modelo animal mostraram que camundongos
knockout para os genes Wnt5a e Ror2 exibiam fenótipos semelhantes aos
24
encontrados em pacientes com RS, incluindo dimorfismo facial, hipoplasia mandibular,
hipoplasia genital, encurtamento de membros e defeitos cardíacos. Estes trabalhos
também indicaram que a sinalização não canônica de Wnt, que regula a direção de
migração celular, era necessária para fusão do palato secundário durante o
desenvolvimento embrionário (Oishi et al., 2003; He et al., 2008 e Person et al., 2010).
Figura III - Camundongos Wnt5a - / - têm defeitos anatômicos fenotipicamente semelhantes a pacientes
com síndrome Robinow autossômica dominante. Camundongos Wnt5a - / - no estágio E16.5 (B) têm
olhos amplamente espaçados (hipertelorismo) e uma boca triangular quando comparados aos controles
(A). C, D: Vistas laterais revelam achatamento do perfil facial, micrognatia, e orelhas pequenas e baixas
nos Wnt5a - / - embriões (D) em comparação com irmãos controle (C). E, F: preparações esqueléticas
no nascimento mostram hipoplasia mandibular em Wnt5a mutantes (F), em comparação com os
controles (E). G: Porcentagem de resultados relatados em pacientes com síndrome Robinow dominante
comparação com fenótipos em camundongos Wnt5a - / -. Adaptado de Person et al., 2010.
Notando que os camundongos Wnt5a -/- apresentam características
semelhantes a RS (Figura III) e que o ligante Wnt5a interage com Ror2, gene este que
está mutado na RRS, Person et al. (2010) analisaram o gene WNT5A em membros
25
afetados da família com DRS originalmente relatado por Robinow et al. (1969). Os
pesquisadores identificaram uma mutação em heterozigose e patogênica no gene
WNT5A além de uma outra mutação, não relacionada com a ocorrência esporádica
do distúrbio, em um dos pacientes. Mutações no gene WNT5A não foram encontradas
em mais 23 pacientes relacionados com um diagnóstico clínico da síndrome DRS,
sugerindo heterogeneidade genética. Os ensaios de expressão funcional em embriões
de peixe-zebra mostraram que as proteínas mutantes representavam alelos
hipomórficos em vez de mutações dominante-negativas. Os resultados relacionam a
via de genes WNT5A/ROR2 com o desenvolvimento craniofacial, esquelético e genital
humano.
Em membros afetados de outras 3 famílias com DRS, Roifman et al. (2015)
identificam duas diferentes mutações missense heterozigóticas no gene WNT5A.
Embora mutações heterozigóticas no gene WNT5A já tivessem sidos descritas em
todos os membros afetados das duas famílias previamente observadas por Person et
al. (2010), os casos apontavam mutações herdadas, portanto, faltava a prova de que
estas mutações genéticas fossem a causa real da condição nestes indivíduos. As
famílias 1 e 2, do trabalho de Roifman et al., são os primeiros relatos de mutações de
novo no gene WNT5A associadas com a DRS na ausência de outros genes
candidatos identificados por todo o sequenciamento de exoma. Isto confirma que o
gene WNT5A é causador da DRS nas famílias estudadas.
Neste mesmo estudo, Roifman et al. (2015) observaram que todas as famílias
RS com mutações em WNT5A teriam um clássico tipo de DRS, enquanto que vários
pacientes menos tipicamente afetados testados (com nanismo com encurtamento de
membros sem padrão mesomélico, menos dimorfismo facial típico e/ou ausência de
hipoplasia genital) não apresentaram tais mutações.
O gene WNT5A está localizado no braço curto do cromossomo 3, 3p21-p14,
nas posições 55.465.714 - 55.505.260 pares de base (hg 19). Faz parte da família dos
genes Wnt, que codificam proteínas de sinalização com atividade de regulação dos
eventos morfogênicos, padronização (patterning) durante a embriogênese,
diferenciação celular, crescimento, migração e oncogênese (Oishi et al., 2003). No
modelo de homologia do gene WNT5A proposto por Roifman et al. (2015), todos as
quatro mutações relacionadas a DRS pareciam estar localizadas no mesmo lado da
proteína 104, que é palmitolado. É possível que mutações nestes resíduos alterem a
26
estrutura da superfície e, assim, afetem as interações com outras proteínas na via de
Wnt.
A atividade de sinalização intracelular do ligante WNT5A ocorre a partir do
complexo receptor-ligante com os receptores FZD e ROR2. O receptor ROR2 está
envolvido com o fenótipo encontrado em pacientes na forma recessiva, as proteínas
Wnt ligam-se diretamente ao seu domínio rico em cisteína extracelular. Essa interação
entre o receptor e as proteínas Wnt desencadeia uma de via de transdução de sinal,
que tem atividade no desenvolvimento craniofacial e esquelético, da qual participam
muitas outras proteínas (Nusse et al., 2005).
Os relatos que relacionam as mutações de novo em WNT5A com a DRS
confirmam que as mutações neste gene são uma importante causa para a DRS.
Porém, a maioria dos indivíduos clinicamente diagnosticado com DRS não têm ainda
mutações em genes com uma conhecida associação com esta desordem, como o
ROR2 e o WNT5A. Diante deste cenário, uma grande parcela de pacientes com RS
permanecem sem um diagnóstico molecular definido. Entretanto, é possível que a
maioria dos indivíduos afetados tenham mutações em genes distintos potencialmente
envolvidos na mesma via de sinalização Wnt (White et al., 2015).
A forma da RS causada por mutações no gene WNT5A foi recentemente
classificada como síndrome de Robinow autossômica dominante do tipo 1 (DRS1
MIM#180700) (OMIM). Estudos mais recentes sugerem que, além das mutações já
conhecidas, alterações nos genes DVL1 (DRS2 MIM#616331) e DVL3 (DRS3
MIM#616894), codificantes das proteínas Dishevelled, localizadas à dowstream da via
de sinalização WNT5A-ROR2, também podem estar relacionadas a fenótipos
semelhantes à de pacientes com DRS (White e cols., 2015; Bunn et al., 2015 e White
et al., 2016). Tais achados reforçam a hipótese de que mutações nesta via podem
levar a fenótipos semelhantes.
I.4.1 Os genes DVL1 e DVL3
Os sinais clínicos observados entre os pacientes diagnosticados com RRS e
suas alterações genéticas relacionadas à RS apresentam uma maior homogeneidade
quando comparados aos pacientes com DRS. Em busca de novos genes candidatos
para a DRS White e cols., 2015 sequenciaram o exoma de quatro pacientes, e de
seus progenitores, com diagnóstico clínico de DRS. O sequenciamento revelou
27
mutações no gene DVL1 em três dos pacientes estudados. Na segunda fase do
estudo mais 62 indivíduos com fenótipo similar à DRS tiveram seu genoma
investigado para mutações no gene DVL1. Ao todo, seis mutações diferentes no DVL1
foram identificadas em 11 dos pacientes pesquisados.
O DVL1 (dishevelled segment polarity protein 1) é um gene que codifica um dos
três ortólogos humanos da proteína Dishevelled em drosophila (dsh). Esta proteína
tem seu nome derivado da interrupção na polaridade de cerdas de cabelo causada
por sua mutação. A dishevelled de drosophila tem uma isoforma, ao passo que os
mamíferos têm três (DVL1, 2, e 3 em seres humanos), no entanto, a estrutura básica
de cada DVL é fortemente conservada entre seus parálogos (Yokoyama et al., 2010
e Schwarz-Romond et al., 2007).
A proteína dsh é componente importante das vias de sinalização Wnt e
desempenha papel tanto na via canônica quanto não-canônica. Muitas vezes, as
DVLS são descritas como proteínas "scaffold-like", que atuam diretamente
downstream do receptor Wnt transmembrânico (geralmente um FZD, mas às vezes
um LRP ou ROR2) (Lee et al., 2008).
A ligante solúvel extracelular WNT5A é reconhecida pelo ROR2, e, juntos, eles
empregam a família DVL para transdução de sinal que ativa a via Wnt não-canônica
(Komiya e Habas, 2008). O gene DVL1 está localizado no braço curto do cromossomo
1, 1p36.33, e codifica uma fosfoproteína citoplasmática reguladora da proliferação
celular, atuando em processos do desenvolvimento, incluindo a segmentação e a
especificação de neuroblastos. A estrutura do gene DVL1 compreende 15 exons,
entretanto, todas as variantes patogênicas relatadas têm sido encontradas no exon
14. Estudos funcionais das variantes encontradas não foram realizados, mas uma
pesquisa em células de dois pacientes com mutações nesse exon mostraram que
proteínas truncadas foram expressas (White et al., 2015).
Bunn et al. 2014 identificou três mutações heterozigóticas diferentes no gene
DVL1 em outros três pacientes que apresentavam um tipo esporádico de RS com
osteoesclerose atípica (RS-OS). Tais indivíduos apresentavam manifestações clínicas
de RS dominante com dismorfismo facial característico (hipertelorismo marcado, nariz
curto, boca larga e hipoplasia do terço médio da face), camptodactilia e braquidactilia,
fenda palatina e anomalias dentárias. Mesomelia, outro achado comum da RS, variou
de leve a ausente nestes indivíduos. As radiografias revelaram osteoesclerose do
28
crânio, que foi particularmente proeminente na base do crânio. Os pais de todos os
três indivíduos eram clinicamente normais. Os resultados deste estudo mostraram que
as mutações no gene DVL1 resultaram na terminação prematura da proteína e na
adição de uma sequência C-terminal anormal, altamente básica. A análise das células
de um dos doentes mostrou que a mutação (c.1519del; 601365,0004) foi traduzida
para uma proteína estável e não degradada pelo decaimento do RNAm mediado por
mutações nonsense. Os estudos in vitro mostraram que a expressão celular da co-
transfecção com a mutação DVL1 de tipo selvagem resultou num aumento da
atividade Wnt canônica. Assim, a RS parece ser resultado da desregulação da via que
envolve os genes WNT5A, ROR2, DVL (White et al., 2015).
Quanto à observação das manifestações clínicas, o fenótipo dos indivíduos
com mutações DVL1 é concordante com as descrições clínicas anteriores
relacionadas a DRS. Entre elas, características faciais típicas, anomalias dentárias e
mesomelia que foram observadas em 100% dos indivíduos relatados. Em contraste
com os indivíduos portadores de mutações no gene WNT5A, que possuíam estatura
normal, apenas 75% dos indivíduos com mutações em DVL1 apresentaram essa
característica. Outro diferencial possível entre os dois tipos de DRS é macrocefalia
observada em 100% dos indivíduos com mutações no DVL1. Além de que, em alguns
pacientes com mutação no gene DVL1 foi observada osteoesclerose (White et al.,
2015; Bunn et al., 2015).
Devido à natureza uniforme das variantes encontradas em DVL1, relacionadas
a RS, e à redundância funcional de seus homólogos DVL2 e DVL3, White et al. (2016)
elegeram tais genes para dar prosseguimento ao sequenciamento de seus penúltimos
exons, procurando por potenciais variantes relacionadas à síndrome. O estudo,
realizado em 34 indivíduos com possível diagnóstico clínico de RS, foi executado a
partir do sequenciamento direto de Sanger dos penúltimo e último exons dos genes
DVL1, DVL2 e DVL3 onde foi identificado um paciente com uma deleção de 1pb dentro
do exon final do gene DVL3. Curiosamente, estudos mostram que o C-terminal de
DVL3 e suas repetições de único aminoácido 637,638 e 647,648 são essenciais para
a ativação WNT5A da via não-canônica (Li Ma et al., 2010).
Subsequentemente, o sequenciamento dos penúltimo e último exons destes
genes foi realizado em mais 17 casos de RS a partir de um banco de dados próprio.
Novamente, identificou-se quatro pacientes com mutações no gene DVL3, incluindo
29
duas deleções de 1 pb, duas mutações no sítio de splicing e uma mutação em DVL1
em mais um dos pacientes (White et al., 2016).
Dentre os pacientes testados que correspondiam ao quadro clínico de RS,
cinco possuíam variações no penúltimo exon do gene DVL3 e um indivíduo possuía
variação no gene DVL1 (White et al. 2016).
A investigação a cerca dos transcritos mutantes e os do tipo selvagem do gene
DVL3 revelou que ambos foram expressos em uma linhagem celular de
linfoblastóides, assim como observado anteriormente em DVL1. O gene DVL3 que
também estava mutado não mostrou alterações na expressão de mRNA. Em conjunto,
estes dados suportam a previsão de que as mutações em DVL3 escapam à NMD
(White et al., 2016).
Em camundongos, Dvl1 e Dvl3 se co-localizam dentro do tubo neural em
desenvolvimento, ademais todas as três proteínas Dvl possuem padrão de localização
semelhante. Enquanto o camundongos Dvl1 -/- possuem um fenótipo leve incluindo
anomalias sociais, camundongos Dvl2 -/- e Dvl3 -/- demonstram, de forma
independente, letalidade parcial e defeitos conotruncais. Duplo knockout de Dvl1 e
Dvl2 ou Dvl2 e Dvl3 resultam em defeitos no tubo neural, sugerindo papéis
redundantes entre estes homologos. No entanto, camundongos Dvl1 -/- e Dvl3 -/- não
apresentam defeitos no tubo neural, indicando divergência funcional entre os
homólogos Dvl (Etheridge et al., 2008; Lijam et al., 1997 e Hamblet et al., 2002).
O fenótipo clínico de indivíduos portadores de mutações no gene DVL3 é
semelhante ao de indivíduos com mutações em DVL1 e concordante com as
descrições clinicas de DRS previamente identificadas. A macrocefalia foi observada
em dois dos quatro indivíduos com mutações em DVL3, portanto, essa característica
não pode ser usada para distinguir pacientes com RS mediados por DVL1 e DVL3.
Vale ressaltar que todos os indivíduos com mutações em DVL3 possuem baixa
estatura, enquanto indivíduos com mutações em DVL1 apresentam uma estatura final
normal (White et al., 2016).
Considerando que grande parte dos pacientes com diagnóstico clínico de RS,
principalmente da DRS, permanecem sem uma etiologia molecular definida, a
elucidação e a confirmação de mutações gênicas relacionadas a esta desordem são
imprescindíveis para a melhor compreensão da síndrome e para o estabelecimento
30
de uma correlação entre o fenotipo e o genótipo dos afetados. Como já elencado, as
mutações até o momento encontradas estão todas relacionadas à via de sinalização
WNT5A/ROR2/DVL. Desta forma, a investigação de mutações em genes que
codificam proteínas atuantes nessa via, contribuem para a compreensão do papel
desta sinalização nos processos biológicos que estão alterados em indivíduos
acometidos pela RS.
I.5 VIA DE SINALIZAÇÃO WNT
Na medicina molecular moderna, muito esforço tem sido feito para se
desvendar das vias de sinalização e os mecanismos moleculares que controlam o
desenvolvimento de um organismo. Este esforço é enraizado na ideia de que a
compreensão dos mecanismos que controlam desenvolvimento normal pode
aumentar exponencialmente nossas possibilidades de evitar e tratar as patologias
pleiotrópicos que surgem quando esses mecanismos estão desregulados. Uma via
chave que tem recebido muita atenção pela sua diversificada função no
desenvolvimento e sua alta complexidade é a via de transdução de sinal Wnt (Komiya
e Habas, 2008).
A via de sinalização Wnt é uma via conservada em animais metazoários. As
proteínas Wnt regulam uma variedade de processos celulares, incluindo especificação
autônoma, motilidade, polaridade, formação do axis primário e organogênese (Komiya
e Habas, 2008). A desregulação da via Wnt tem consequências catastróficas para o
desenvolvimento do embrião, além de ser um fator causal de uma série de patologias
pleiotrópicas humanas. Estas patologias incluem câncer de mama, cólon e pele,
defeitos do esqueleto e distúrbios de defeitos no nascimento, além de espinha bífida
(Nusse, 2005). Estudos sugerem que vários membros da via Wnt são expressos
durante o desenvolvimento craniofacial e de membros em múltiplos sistemas modelo
(Sisson e Topczewski, 2009; Geetha-Loganathan et al., 2009; Yu et al., 2010; Nohno
et al., 1999; Visel et al., 2007).
O sinal Wnt extra-celular estimula várias cascatas de transdução de sinal
intracelular, o que inclui a via canônica, ou dependente de β-catenina, e a via não-
canônica, ou β-catenina-independente que possui dois ramos, a via de Polaridade
Planar Celular (PCP) e a via dependente de cálcio (Wnt/Ca2+) (Niehrs, 2012).
31
A via canônica de sinalização Wnt tem como papel principal ativar a proliferação
e mudar o destino celular (Heisenberg et al., 2000). Já os produtos das cascatas não-
canônicas regulam, principalmente, rearranjos do citoesqueleto e a migração celular
durante o desenvolvimento (Niehrs, 2012).
No metabolismo ósseo, a via Wnt é bem conhecida. Em termos gerais, a via
canônica está associada a regulação da massa óssea e as vias não canônicas PCP
e Wnt/Ca2+ estão relacionadas com a padronização esquelética e com alguns
aspectos de “mechanosensing”, respectivamente. O funcionamento dessa via é
fundamental na osteoblastogênese e osteoclastogênese, interferências na atuação do
receptor ROR2, localizado no ramo PCP da via Wnt não-canônica, podem influenciar
no desenvolvimento do esqueleto durante a embriogênese, como relatado nos
diagnósticos dos pacientes com a RRS (Bunn et al., 2015). Assim, o estabelecimento
de polaridade celular planar é vital para o desenvolvimento de vertebrados com
mutações humanas ligadas a defeitos de esqueleto.
A embriogênese é um processo complexo, em que uma única célula prolifera e
dá origem a células altamente especializadas que se desenvolvem em tecidos
específicos e órgãos de um organismo vivo. Isto é possível através de vários eventos
de sinalização, diferenciação celular e movimentos celulares combinados. No
processo de gastrulação, que ocorre durante o desenvolvimento embrionário, verifica-
se quatro tipos de movimentos celulares de regiões específicas: invaginação,
involução, epibolia e movimentos de extensão convergente (CE) (Brinkmann, 2015).
Os movimentos CE, ocorridos durante a gastrulação, demonstraram estar
alterados em pacientes com a RS. Ademais, a via Wnt β-catenina independente (não-
canônica), particularmente a via PCP, é uma importante reguladora desses
movimentos. (Schambony and Wedlich, 2007; Seitz et al., 2014; Torres et al., 1996;
Veeman et al., 2003; Wallingford et al., 2002).
Proteínas Wnts como as Frizzleds (FZDs), as Dishevelleds (DVLs) e outras
proteínas PCP têm sido diretamente relacionadas a regulação de movimentos CE em
anfíbios, peixes e mamíferos. (Djiane et al., 2000; Heisenberg et al., 2000; Carreira-
Barbosa et al., 2003; Kilian et al., 2003; Torban et al., 2000; Moeller et al. 2006; Wang
et al., 2006a; Kim et al., 2008). Além de que, relatórios recentes confirmam o
envolvimento na via PCP de proteínas FZD e DVL regulando o direcionamento do axis
mediado por Wnt (Shafer et al., 2011; Shimizu et al., 2011).
32
Aparentemente, os componentes participantes da via Wnt que, até o momento,
demostraram estar associados ao desencadeamento de fenótipos semelhantes a RS,
participam de ambas as vias canônica e não-canônica. No entanto, é justamente a
interação alterada entre o receptor ROR2 e o ligante WNT5A não-canônico que
demonstrou, a partir do modelo animal, ter participação na etiologia desordem
(Schwabe et al., 2004). Ainda, estudos apontam o ramo PCP, como componente
importante na cascata de sinalização que envolve o receptor não-canônico Wnt5a no
desenvolvimento esquelético de membros (Wang et al., 2010).
As proteínas Wnt geralmente ligam-se a um receptor de membrana FZD e à
um co-receptor de baixa densidade relacionado a lipoproteína 5/6 (LRP5/6), o que
resulta em alterações na transcrição de genes alvo. As proteínas FZD e LRP5/6 são
as proteínas receptoras ligantes de Wnts mais amplamente descritas, mas não são as
únicas (Hsieh et al., 2004). O receptor ROR2, que demostrou ser um receptor Wnt
alternativo (Nusse, 2005), contêm um homólogo CRD para encontrar o domínio Wnt
de ligação, também observado em receptores FZD (Saldanha et al.,1998). Pesquisas
bioquímicas in vitro indicam o receptor ROR2 liga-se a WNT5A diretamente através
do seu domínio CRD FZD-like, servindo como um co-receptor na que induz a cascata
de sinalização (Oishi et al., 2003).
O ligante WNT5A atua como um ligante solúvel extracelular que é reconhecido
pelo ROR2, e, juntos, eles empregam os homólogos DVL para transduzir a via
independente de β-catenina. A via PCP de sinalização inicia-se com uma interação
entre WNT5A e ROR2, que agem isoladamente ou como um co-receptor, associado
ao uma FZD apropriada. Esta interação inicial conduz à polarização de uma
extremidade proximal FZD-DVL-Diversin para o sinal e PRICKLE-VANGL distalmente,
estabelecendo assim uma polaridade ao longo do eixo da célula (Gao e Chen, 2010).
As Dishevelleds 1, 2, e 3 são unicamente essenciais para a ativação da via Wnt não
canônica (Li Ma et al., 2010). Assim, cada DVL, subsequente a sua polarização,
interage com uma proteína de ligação GTP, RhoA, via DAAM1. Um estudo em
drosophila mostrou que DVL-RhoA ativados vão interagir com Drok (ROCK em seres
humanos) que afeta a polimerização de actina (Winter et al., 2001). DVLs também
podem ativar uma outra pequena proteína de ligação GTP, Rac, a qual vai, por sua
vez, ativa c-Jun kinase N-terminal (JNK), o que influencia na formação no
33
citoesqueleto de actina e na transcrição de genes. O mecanismo desta interação DVL-
Rac ainda é desconhecido (Figura IV) (Rosso et al., 2005).
Figura IV - Visão global da via de sinalização Wnt. (A) Via da β-catenina. Na ausência de sinalização
de Wnt, a β-catenina solúvel é fosforilada por um complexo de degradação constituído pelas kinases
GSK3β e CK1a e as proteínas de andaimes APC e Axina. A β-catenina fosforilada é alvo de degradação
proteasomal após ubiquitação pelo complexo da proteína SCF. No núcleo e na ausência de β-catenina,
a atividade do fator de transcrição TCF/LEF é reprimida; A indicação da sinalização canônica Wnt
/FZD leva à fosforilação de DVL/Dsh, que por sua vez recruta Axin1 e GSK3β adjacente à membrana
plasmática, evitando assim a formação do complexo de degradação. Como resultado, a β-catenina se
acumula no citoplasma e transloca para o núcleo, onde promove a expressão de genes alvo através
da interação com fatores de transcrição TCF/LEF. (B) Via PCP (independente de β-catenina). Sua
ativação ocorre através da ligação de Wnt a FZD e seu co-receptor. O receptor então recruta DVL, que
usa seus domínios PDZ e DIX para formar um complexo DAAM1 (Dishevelled-associated activator of
morphogenesis 1). DAAM1 então ativa o pequeno Rho da proteína G através de um fator de troca de
guanina. Rho ativa a kinase associada a Rho (ROCK), que é um dos principais reguladores do
citoesqueleto. DVL também forma um complexo com Rac1 e medeia a adesão de profilina à actina.
Rac1 ativa o JNK e também pode levar à polimerização da actina. A ligação de profilina à actina pode
resultar na reestruturação do citoesqueleto e da gastrulação. Esta interação inicial também conduz à
polarização de uma extremidade proximal FZD-DVL-DIVERSIN e PRICKLE-VANGL distalmente,
estabelecendo assim uma polaridade ao longo do eixo da célula. (C) Via Ca2+ (independente de β-
catenina): A ativação dos receptores FZD desencadeia a liberação de cálcio que afeta múltiplos
efetores a jusante, incluindo kinases dependentes de cálcio/calmodulina II (CamKII), proteína kinase C
(PKC) e transcrição por fator nuclear de células T ativadas (NFAT). Adaptado de Bunn, 2015.
Em um estudo desenvolvido por Nishita et al. revelou-se que o receptor ROR2
também regula a polimerização induzida por WNT5A de DVL. Nesta regulação, ocorre
a associação com FZD7, através do seu domínio extracelular rico em cisteína, para
34
formar um complexo receptor necessário para a regulação de DVL após a estimulação
de WNT5A. A expressão suprimida da FZD7 resulta na inibição de polimerização
induzida por WNT5A de DVL.
É importante ressaltar que tanto domínio DIX quanto o DEP de DVL são
necessários para a polimerização DVL e subsequente ativação de AP-1 após a
estimulação WNT5A, porém os diferentes conjuntos de DVL também parecem usar
diferentes cascatas para ativar os diferentes ramos da via Wnt. Mutações deletérias
no domínio DEP de DVL causam a disrrupção em movimentos CE (Wallingford et al.
2002). A sobre-expressão de FZD7 também demostrou inibir movimentos CE através
de DVL. Além de FZD7, o receptor ROR2 pode associar-se com os receptores FZD
não canônicos FZD2 e FZD5, para atuar como um co-receptor (Djiane et al., 2000).
A proteína FZD2 tem sido associada a ambas as vias canônica e não-canônica
de sinalização Wnt em células de mamíferos (Liu et al., 1999; Ma e Wang, 2007;
Verkaar et al., 2009; Sato et al., 2010). Estudos prévios reportaram que FZD2 é
amplamente expressa no desenvolvimento da cabeça e membros em modelo animal
(Sisson e Topczewski, 2009; Geetha-Loganathan et al., 2009; Yu et al., 2010; Nohno
et al., 1999; Visel et al., 2007). Isso mostra que, como outras proteínas Wnts, FZDs
individuais podem sinalizar através de ramos independentes, dos quais alguns podem
exigir DVL. Sendo assim, tanto FZDs quanto DVLs são componentes requeridos para
a estabilização da via PCP em colaboração com a participação de sinalizadores
completamente distintos (Vinson et al., 1989).
A via WNT5A-ROR2 foi sugerida como constituinte de um ramo adicional não
canônico da rede de sinalização Wnt, exigindo provavelmente fosfoinositida 3-kinase
(PI3K), CDC42, MKK7 e JNK, para ativar sua sinalização, no lugar de RhoA e Rac1,
que são ativadas por FZD7 (Schambony e Wedlich, 2007).
Mutações heterozigóticas em SPECC1L, gene que codifica uma proteína chave
da via Wnt não canônica, foram descritas em pacientes com síndrome de Opitz G/BBB
autossômica dominante. Esta síndrome possui diagnóstico diferencial com a RS, e
apresenta sinais clínicos como dismorfias faciais, incluindo hipertelorismo, fissuras
orais, anomalias cardíacas e geniturinárias (Kruszka et al., 2015). Na síndrome de
Hipertelorismo de Teebi, foram encontradas mais mutações em SPECC1L, está
síndrome também apresenta algumas sobreposições fenotípicas com a RS, entre elas
hipertelorismo, fissuras palpebrais elevadas, testa proeminente, ponte nasal larga e
35
deprimida e nariz curto (Bhoj et al., 2015). Em um ensaio de reparação de feridas, o
knockdown de Specc1l levou à adesão e migração defeituosa das células e à
incapacidade das células de reorganizar seu citoesqueleto de actina em resposta a
estímulos como Ca2+ e WNT5A (Nathan et al., 2016).
Diferentemente da via Wnt canônica, que está largamente descrita, os ramos
da via b-independente ainda não estão bem delimitados. A principal razão para isso é
o fato de que a sinalização de β-catenina independente permanece relativamente
pouco caracterizada a nível molecular. Como resultado, nos falta informações
robustas na literatura para investigar a via Wnt não canônica. Felizmente, estamos
ganhando cada vez mais compreensão dos componentes moleculares envolvidos e
no desenvolvimento de eventos controlados pela sinalização Wnt alternativa.
Sabe-se que a via Wnt de sinalização não-canônica está envolvida em
orquestrar a migração celular e morfogénese de tecidos, incluindo movimentos CE na
gastrulação de vertebrados. Coletivamente, a RS parece ser um resultado da
desregulação na via de genes WNT5A-ROR2-DVLS. Esse desajuste envolve
diferentes proteínas que, certamente, alteram o desenvolvimento embrionário. Uma
vez que a maioria dos afetados pela RS permanece sem um diagnóstico molecular
definido, mutações em genes distintos que codificam proteínas constituintes deste
ramo da via Wnt, tornam-se fortes candidatos a causarem esta desordem.
36
II. Objetivo
Este estudo teve como objetivo identificar mutações em genes envolvidos com
o fenótipo de pacientes com DRS e contribuir com a integração de suas características
fenotípicas em uma caracterização clínica mais ampla da RS.
III.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. A partir do sequenciamento Sanger, investigar mutações nos genes DVL1 e
DVL3 em pacientes com DRS.
2. Identificar novos genes que possam estar envolvidos no fenótipo DRS através
do sequenciamento de exoma (WES).
3. Caracterizar clinicamente os pacientes em estudo e comparar a frequência de
seus sinais clínicos.
4. Identificar características clínicas consistentes entre os casos em estudo e
relaciona-las aos genes alterados.
5. Determinar características clínicas que possam discriminar os genes
envolvidos na DRS para contribuir com um diagnóstico específico.
37
III. Materiais e Métodos
III.1 SELEÇÃO DOS PACIENTES PARA ESTUDO
Foram selecionados 11 pacientes com características clínicas de DRS que
aceitaram participar da pesquisa. Os pacientes foram atendidos no Serviço de
Genética Clínica do Hospital Universitário da Universidade de Brasília, no Centro de
Estudos do Genoma Humano na Universidade de São Paulo ou encaminhados pela
Robinow Syndrome Foundation, EUA. Os pacientes ou genitores preencheram termo
de consentimento livre e esclarecido.
O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Faculdade de
Medicina da Universidade de Brasília (CEP FM: 079/2009; 25/11/2009). Parte dos
pacientes deste estudo também fizeram parte do trabalho do aluno Pedro Guilherme
Alves Rodrigues.
III.1.1 Coleta de Material Biológico
As amostras de sangue foram obtidas por punção venosa, em tubos de coleta
com sistema a vácuo e EDTA como anticoagulante. Apenas um paciente teve amostra
de saliva coletada.
III.2 TRIAGEM DE MUTAÇÕES
A pesquisa de mutações foi realizada por sequenciamento Sanger direto em
todos os pacientes com a forma dominante da síndrome no nosso laboratório de
Genética Clínica da FM-UnB. O sequenciamento das regiões codificantes do gene
DVL1 e DVL3 foi realizado utilizando sequenciamento Sanger. Os pacientes que não
obtiveram resultados positivos para alterações nos genes já conhecidos foram
submetidos à análise de exoma para identificação de novos genes candidatos.
III.2.1 Extração de DNA
A extração de DNA foi feita a partir do sangue periférico pelo método Puregene
“Salting out”. Este método é dividido em etapas, sendo a primeira de lise celular, onde
foi utilizado 5mM MgCl2, 1mM EDTA pH 8,0 em uma reação e, 10mM Tris pH 7,5,
1mM EDTA pH 8,0 e 1% SDS em outra, para cada reação a solução foi centrifugada
38
a 3400 rpm por 10 minutos. Para a segunda etapa utilizou-se 1 ml da solução de
precipitação de proteína ao lisado celular. Esta solução contém 7,5M de NH4 Ac.
Centrifugou-se a 3400 rpm por 10 minutos. As proteínas precipitadas formam um
pellet marrom escuro e compacto.
Na etapa de precipitação de DNA, o sobrenadante foi transferido para um tubo
falcon contendo 3ml de isopropanol. O tubo foi invertido lentamente até que se
formasse um novelo de DNA. A reação foi centrifugada a 3400 rpm por 3 minutos.
Retirou-se o sobrenadante, e adicionou-se 3ml de etanol absoluto. A reação foi
novamente centrifugada. Depois disso, drenou-se o tubo e deixou-se o DNA secar a
temperatura ambiente por 15 minutos.
Na última etapa, acrescentou-se ao tubo com o DNA 200-250 µl de TE 1x ou
água milliQ, que resultou em uma concentração aproximada de 400 ng/µl. O DNA foi
armazenado a 2-8ºC. O DNA obtido foi quantificado no espectrofotômetro Nanodrop
(Thermo Scientific).
III.2.2 PCR- Reação em cadeia pela polimerase
Para as reações de PCR, num volume total de 25l, foram utilizados 80-200ng
de DNA genômico, 2,5l de dNTP (200M de dCTP, dTTP, dGTP e dATP); 2,5U da
enzima Taq polimerase (Invitrogen, Carlsbad, USA) e 2,5l de tampão específico
dessa enzima; MgCl2 em concentração otimizada para cada par de primer, 1l
(1,5M), de pares de primers específicos na tabela 1 e quantidade complementar de
água. As condições de amplificação foram as seguintes: cinco minutos de
desnaturação inicial a 94°C, 35 ciclos de um minuto a 94°C, um minuto à temperatura
de annealing calculada para cada par de primer e um minuto a 72°C, seguidos de uma
etapa de extensão de 10 minutos a 72°C.
O resultado da amplificação por PCR foi verificado por meio de eletroforese em gel de
agarose a 2,0%, coloração com brometo de etídio (0,5g/ml) e visualização sob luz
ultra-violeta.
39
Tabela II - Primers utilizados para amplificação da região codificante do gene DVL1. Cada par de primer
amplifica um exon do gene DVL1 ou parte dele.
Exon Sequência
14F 5' - CAAGATCACCTTCTCCGAGC – 3'
14R 5' - GCCCAAGTACACAGCAGGAG – 3'
15F 5' - CTCAAGCATCGGGGTGAG – 3'
15R 5' - GACACAGGTGCTGTCAGGAG – 3'
Tabela III - Primers utilizados para amplificação da região codificante do gene DVL3. Cada par de
primer amplifica um exon do gene DVL3 ou parte dele.
Exon Sequência
14F 5' - ACCAGGGTCTCTCTCATCCA– 3'
14R 5' - AAGACGGACGGATGGAGAGA – 3'
15F 5' - ACCAGGGTCTCTCTCATCCA – 3'
15R 5' - AAGACGGACGGATGGAGAGA – 3'
III.2.3 Sequenciamento Sanger
A purificação das amostras para sequenciamento foi realizada com kit Illustra™
ExoProStar™. O sequenciamento Sanger foi realizado todos os pacientes
participantes da pesquisa. Para o sequenciamento Sanger foi utilizado o sequenciador
ABI 3130XL da Applied Biosystems, no Laboratório de Biotecnologia do Programa de
Pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de
Brasília, seguindo o protocolo de sequenciamento de rotina do laboratório.
III.2.4 Clonagem
Os fragmentos de PCR foram clonados utilizando o TOPO TA cloning kit
(Thermo Fisher, Carlsbad, EUA) e posteriormente sequenciados por sequenciamento
Sanger.
III.2.5 Sequenciamento ciompleto de Exoma (WES)
As amostras de DNA remanescentes de indivíduos "não resolvidos" que não
possuíam variantes patogênicas em DVL1 ou DVL3 foram submetidas ao WES. Todo
o sequenciamento de exoma foi realizado pela equipe do Centro Baylor-Hopkins pela
iniciativa Mendelian Genomics em Houtoun-Estados Unidos, os resultados obtidos
pela técnica de WES foram discutidos em parceria com nosso grupo de pesquisa do
laboratório de Genética Clínica da FM-UnB.
40
O WES foi realizado no BCG-HGSC, as bibliotecas pré-capturadas foram
reunidas e, em seguida, hibridado em solução usando o projeto VCRome 2.1 interno
da BCM-HGSC (Bainbridge, et al., 2011) de acordo com o protocolo do fabricante
NimbleGen SeqCap EZ Exome Library SR com pequenas revisões.
Todas as amostras alcançaram 96% das bases do exoma alvo cobertas a uma
profundidade de 20 × ou maior com uma profundidade média de cobertura de 95 ×. A
escolha do software de anotação variante tem uma forte influência para a identificação
de variantes relevantes para a doença; As ferramentas de software de anotações
diferentes fornecem frequentemente interpretações distintas e níveis variáveis de
falso-positivos e achados falso-negativos, isso parece particularmente verdadeiro
para indels (McCarthy et al., 2014).
Para maximizar a descoberta de variantes a partir dos dados de
seqüenciamento de Illumina, foi utilizado dois métodos de descoberta de variantes em
paralelo a partir do pipeline de análise BCM-HGSC Mercury (Reid, J. G. et al., 2014),
que move os dados da geração da sequência inicial no instrumento para as chamadas
variantes anotadas através de várias ferramentas de análise.
Além disso, foi usado o Genome Analysis Toolkit (GATK) HaplotypeCaller para
gerar arquivos chamados conjuntos com realinhamento de indel e recalibração de
base em todas as famílias que foram submetidas ao WES. Foram identificadas
mutações de novo usando informações de profundidade de leitura extraídas dos
arquivos BAM de ambos os pais e probandos usando o software interno da Baylor
DNM-Finder (Eldomery, et al., 2017). As variantes de candidatos foram filtradas contra
dados de exoma em bancos de dados disponíveis publicamente, incluindo o 1000
Genomes Project, o Servidor Exome Variant da NHLBI Exome, o banco de dados do
ARIC (Atherosclerosis Risk in Communities Study) e o banco de dados interno da
Baylor-Hopkins Centers para Mendelian Genomics, analisador de variantes de mais
de 6.400 exomas.
Além disso, todos os pacientes foram rastreados para as variantes do número
de cópias (CNV) com dados do exoma utilizando XHMM (Fromer, M. et al., 2012) e
um algoritmo desenvolvido internamente na Baylor para detectar deleções homólogas
exônicas, HMZDelFinder (Gambin, T. et al. , 2016). Foram avaliadas as possíveis
variantes associadas à doença identificadas via WES para co- segregação com o
fenótipo usando amplificação de PCR padrão. Os produtos de PCR foram purificados
41
com ExoSAP-IT (Affymetrix) e sequenciados com sequenciamento Sanger de di-
desoxi-nucleótido no Seqüenciamento de DNA e Núcleo de vetor de genes na
Faculdade de medicina de Baylor.
42
IV. Resultados e discussão
O presente estudo teve como um de seus objetivos detectar mutações
relacionadas ao fenótipo de pacientes com DRS. Como resultado, identificamos
variantes herdadas e de novo em quatro diferentes genes diretamente relacionados a
via de sinalização Wnt não-canônica.
IV.2 PESQUISA DE MUTAÇÕES NOS GENES DVL1 E DVL3 POR
SEQUENCIAMENTO SANGER
A partir da análise de sequenciamento Sanger, foram identificadas mutações
em DVL1 em quatro dos pacientes estudados e, em um paciente, foi observada uma
mutação no gene DVL3. A descrição clínica destes pacientes se encontra em sessão
subsequente.
Os pacientes com mutação no gene DVL1 (caso 01, 02, 03 e 04) apresentam
variantes que afetam o exon 14 de DVL1, causando uma mudança no quadro de
leitura deste gene, isto é, preditando a alteração da estrutura de leitura de tradução
da extremidade C-terminal da proteína DVL1. Estas mutações não estão presentes
em nenhum banco de dados público disponível e foram classificadas como
patogênicas. Na Figura V estão representados segmentos dos eletroferogramas dos
pacientes com mutação em DVL1.
O primeiro resultado positivo para mutações no gene DVL1 foi observado no
paciente 01, que teve sua mutação identificada pela mudança de fase no
eletroferograma como mostra a Figura V (A). A clonagem dos fragmentos ainda não
foi concluída, portanto a posição exata da mutação não pôde ser confirmada. A análise
in silico sugere uma deleção de 13pb. Na paciente 02 também identificamos uma
deleção de 13 pares de bases, a clonagem de fragmentos revelou a posição
c.1496_1508; (p.Pro499_Argfs*146).
O terceiro resultado positivo para mutações no gene DVL1 foi observado no
paciente 03 onde foi identificada mais uma deleção de 13 pares de bases na posição
c.1505_1517 (p.His502_Profs*143), confirmada pela clonagem do fragmento.
O paciente 04 também teve resultado positivo para mutações no gene DVL1,
porém a alteração no quadro de leitura neste paciente se deu por uma inserção de 5
pares de bases na posição c.1612_1616 (p.Ser539_Argfs*112).
43
Figura V – Segmentos de eletroferogramas do sequenciamento Sanger do gene DVL1 nos pacientes
01, 02, 03 e 04. A: Deleção de 13 pares de base no exon 14 no paciente 01 causando mudança no
quadro de leitura. B: Deleção de 13 pares de bases no exon 14, posição c.1496_1508 no paciente 02,
causando mudança no quadro de leitura. C: Deleção de 13 pares de bases na posição c.1505_1517
no exon 14 causando mudança no quadro de leitura, paciente 03. D: Inserção de 5 pares de bases na
posição c.1612_1616 do exon 14 do paciente 04 causando mudança no quadro de leitura.
A análise de sequenciamento Sanger do DNA do paciente do caso 05
identificou uma variante patogênica no gene DVL3. A deleção de 1 par de base na
posição c.1617 (p.Gin539_Hisfs*129) afeta o exon 14 do gene DVL3. Esta variante
causa uma mudança no quadro de leitura durante a transcrição do C-terminal na
proteína DVL3, resultando em possíveis consequências patogênicas.
Para confirmar a mudança no quadro de leitura, a deleção de 1pb no paciente
1 foi clonada e ambos os alelos foram sequenciados independentemente. O resultado
pode ser conferido na Figura VI.
Figura VI – Segmentos de eletroferogramas do sequenciamento Sanger do gene DVL3 no paciente
05. Deleção de 1 par de base na posição c.1617 afetando o exon 14 e causando mudança no quadro
de leitura.
44
Em conformidade com estudos anteriores da DRS mediada por DVL3
(DRS3), esta variante, localizada no penúltimo exon, está prevista a mudar o quadro
de leitura e gerar um códon de terminação prematuro no último exon.
Os alelos truncados altamente uniformes em dois dos homólogos humanos
do gene Dishevelled de Drosophila, codificados por DVL1 e DVL3, são talvez a
principal causa da DRS. Até o momento haviam sido descritas, de acordo com o
GenBank, 12 mutações no gene DVL1 e cinco mutações no gene DVL3 relacionadas
com a síndrome, como mostra o Quadro I. Comparando os nossos resultados com os
anteriormente descritos, observamos que nenhuma das mutações encontradas em
nosso trabalho havia sido reportada na literatura.
Quadro I – Descrição de mutações nos genes DVL1 e DVL3 em pacientes com DRS.
Paciente Gene Exon
alterado Tipo de mutação
Variação de bases Origem
geográfica
Caso 01 DVL1 14 Frameshift ? EUA
Caso 02 DVL1 14 Frameshift c.1496_1508del Inglaterra
Caso 03 DVL1 14 Frameshift c.1505_1517del Argentina
Caso 04 DVL1 14 Frameshift c.1612_1616dup EUA
White et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1505_1517delACCC
GGCTGCCC Dinamarca
White et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1505_1517delACCC
GGCTGCCC EUA
White et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1508delC Portugal
White et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1508delC Portugal
White et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1519delT -
Bunn et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1519delT EUA
White et al. 2016
DVL1 14 Frameshift c.1522delC -
White et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1529delG EUA
Bunn et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1562delC Nova Zelândia
White et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1570_1571delC EUA
Bunn et al. 2015
DVL1 14 Frameshift c.1576_1583delG -
Caso 05 DVL3 14 Frameshift c.1617delG EUA
White et al. 2016
DVL3 14 Frameshift c.1585delG -
White et al. 2016
DVL3 15 Frameshift c.17152A>G -
White et al. 2016
DVL3 15 Frameshift c.17151G>A -
Quadro I - Continua
45
Paciente Gene Exon
alterado Tipo de mutação
Variação de bases Origem
geográfica
White et al. 2016
DVL3 15 Frameshift c.1716delC -
White et al. 2016
DVL3 15 Frameshift c.1749delC -
Quadro I – Nas linhas em cinza estão representadas as mutações encontradas no presente trabalho e
nas linhas brancas aquelas reportadas na literatura em pacientes com a forma autossômica dominante
da síndrome de Robinow. Dados obtidos de White et al., 2015 e 2016 e Bunn et al., 2015.
A Figura VII demonstra a distribuição uniforme de todas as variantes de DVL1
e DVL3 já relatadas. A tradução do alelo mutante no paciente 05 prevê que a variante
irá escapar a NMD e gerar um C-terminal truncado a partir da mudança de -1 no
quadro de leitura. Todas as variantes estão localizadas dentro de uma faixa de
aproximadamente 110 nucleotídeos no penúltimo exon. O alelo mutante está previsto
para encontrar um codon de parada e gerar um C-terminal mutante altamente básico,
rico em prolina.
Devido a redundancia funcional e a localizção uniforme das variantes
encontradas em DVL1 e DVL3, a mesmas consequências geradas pelas mutações na
proteína de DVL1 podem acontecer em DVL3 (White et al., 2016).
Figura VII – Localização uniforme das variantes DVL1 e DVL3 relacionadas a síndrome de Robinow.
Todas as variantes se encontram no último e penúltimo exon e resultam na mudança do quadro de
leitura destes genes. Em preto os exons que não estão descritos para estarem alterados na RS, em
46
vermelho os exons mutantes e em verde a indicação aproximada da região C-terminal altamente
conservada prevista para estar truncada em pacientes com mutação nestes genes. A: Localização
aproximada das variantes encontradas em nosso estudo e daquelas descritas na literatura para o gene
DVL1. Dados obtidos de White et al., 2015 e 2016 e Bunn et al., 2015. B: A localização aproximada
das variantes encontradas em nosso estudo e daquelas descritas na literatura para o gene DVL3.
Dados obtidos de White et al., 2016.
O C-terminal de DVL é uma das partes mais variáveis das proteínas DVL, sendo
que o DVL3, em particular, mostra uma série de resíduos únicos. No entanto, a maioria
da sequência ainda é conservada entre seus parálogos. O DVL-C-terminal (em alguns
dos trabalhos agrupados com o domínio DEP) contém: locais críticos para regular a
fosforilação da DVL, locais que regulam a estabilidade através de interações com
ubiquitina ligase e uma enzima degradante, ligação sites para as tirosina quinases;
um domínio de ligação FZD, sequências envolvidas na localização nuclear, um local
de ligação de uma enzima desubicitante e uma região que interage com ROR2 (Bunn
et al., 2015).
A família de proteínas Dishevelled, originalmente descoberta em Drosophila
melanogaster, é essencial para padronização tecidual. Drosophila Dsh evoluiu três
ortólogos em mamíferos: os genes homólogos DVL1, DVL2, e DVL3, que
compartilham de 59% - 67% de homologia de aminoácidos, e tem uma localização
uniforme de variantes associadas a doenças na RS. No modelo animal, DVL1 e DVL3
são localizados no interior do tubo neural em desenvolvimento, e todas as três
proteínas DVL têm padrões de localização semelhantes (Gray et al., 2009).
A patogenicidade dessas proteínas truncadas pode resultar em ganho de
função ou função dominante negativa, e essas possibilidades devem ser ativamente
investigadas, mas dados experimentais preliminares sugerem que ela não é
conduzida pela perda do C-terminal sozinha (White et al., 2015).
O fato das mutações em DVL1 (DRSII) serem similares as variantes
encontradas no gene DVL3 e resultarem na mudança de -1 no quadro de leitura
durante a transcrição gênica, indica que estas mutações específicas podem ser uma
causa comum da DRS.
No total, as variantes patogênicas identificadas em DVL1 e DVL3 são
consistentes com todos os relatos anteriores, em que as variantes estão agrupadas
no penúltimo exon e resultam em -1 frameshift, suportando a hipótese de que a
mudança do quadro de leitura é necessária para o efeito patogênico, devido a um
ganho de função ou mecanismo dominante-negativo.
47
É possível ainda que os C-terminais das proteínas DVL tenham uma habilidade
para suprimir a sinalização Wnt canônica e promover a transdução não-canônica de
Wnt. Assim, a DRS mediada por DVL pode ser o resultado de mutações que afetam
a fosforilação das regiões C-terminais de DVL1 e DVL3. Evidências deste fato são
observadas pela interação entre proteínas DVL3 fosforiladas e o receptor Wnt não-
canônico ROR2: estimulado pela hiperfosforilação de DVL3 por CK1ε, ROR2 mostrou
interagir com esta proteína (Nishita et al, 2010; Witte et al., 2010). Curiosamente, a
interação DVL3-ROR2 depende do C- terminal de DVL, que está alterado em todos
os mutantes DVL observados.
É necessário continuar as investigações para a melhor elucidação do
mecanismo pelo qual essas mutações específicas em DVL1 e DVL3 resultam na DRS
e suas interações dentro da via Wnt não-canônica.
IV.3 CARACTERIZAÇÂO CLÍNICA DOS PACIENTES COM MUTAÇÃO
EM DVL1 e DVL3
De forma geral, os achados clínicos dos pacientes aqui estudados, que
possuem mutações no gene DVL1 ou DVL3, estão em concordância com as
descrições previamente relatadas na literatura para DRS (Quadro II).
Nos pacientes portadores de mutações em DVL1, sinais como macrocefalia,
dismorfias faciais, língua bífida, anomalias dentárias e hipoplasia genital tiveram
prevalência de 100%, concordante com a literatura. Também concordante com sinais
previamente descritos, os pacientes apresentaram estatura normal, que se contrapõe
a forma recessiva da síndrome, e outras anomalias congênitas como defeitos
cardíacos, hérnia umbilical ou inguinal, escoliose e infecções respiratórias recorrentes.
Quadro II – Frequência de sinais clínicos em pacientes com DRS2 e DRS3.
Paciente Caso 05 Caso 01 Caso 02 Caso 03 Caso 04 Est. atual
Mazzeu
Gênero M M F M M % %
Gene DVL3 DVL1 DVL1 DVL1 DVL1 DVL1 DRS
Mutação c.1617delG - c.1496_150
8del c.1505_151
7del c.1612_161
6dup
Consequência
*129 Mudança no quadro de
leitura
-
p.Pro499Argfs*146
Mudança no quadro de
leitura
p.His502Profs*143
Mudança no quadro de
leitura
p.Ser539Argfs* 112
Mudança no quadro de
leitura
Zigosidade Heterozigoto Heterozigoto Heterozigoto Heterozigoto Heterozigoto
Crescimento
Baixa estatura + - - - - 0 81
Quadro II - Continua
48
Paciente Caso 05 Caso 01 Caso 02 Caso 03 Caso 04 Est.
atual* Mazze
u
Gene DVL3 DVL1 DVL1 DVL1 DVL1 DVL1 DRS
Características faciais
Macrocefalia - + + + + 100 64
Testa proeminente # # # + # 100 79
Testa ampla # # # + # 100 -
Hipoplasia do terço médio da face
+ + + + + 100 81
Hipertelorismo + + + + + 100 100
Cílios longos + - - - - 0 54
Olhos proeminentes + + + - + 75 36
Narinas antevertidas - + + - + 75 96
Ponte nasal ampla + + + + + 100 97
Lábio superior fino - + - - + 50 50
Hiperplasia de gengiva + + + + + 100 36
Língua bífida - + + + + 100 39
Anomalias dentárias + + + + + 100 50
Baixa implantação de orelhas + + + # # 100 28
Esqueleto
Mãos curtas + + + - - 50 62
Membros
Encurtamento
proporcionado
Mesomelia Mesomelia
Encurtamento
proporcionado
Mesomelia - 80% Mesomelia
Braquidaquitilia + + + + + 100 81
Clinodactilia + + + + + 100 70
Camptodactilia - - - - - 0 -
Sindactilia + - - - - 0 15
Fusão de costelas - - - - - 0 0
Genitália
Micropênis # + NA + + 100 84
Criptorquidia # + NA + + 100 72
Hipoplasia de pequenos lábios NA NA # NA NA # 50
Hipoplasia de grandes lábios NA NA # NA NA # 35
Clitóris hipoplásico NA NA # NA NA # 46
Outros achados
Hérnia umbilical,
pectus carinatum,
onfalocele e anomalias
renais
Hérnia umbilical e inguinal, infecções
respiratórias e pulmões colapsados
Hérnia umbilical e
defeitos cardíacos
Escoliose, infecções
respiratórias e de ouvido recorrentes
H. umbilical, infecções
respiratórias, def.
cardíacos, espi. bífida,
tórax estreito e
surdez
Quadro II - Características clinicas dos pacientes investigados no presente estudo e frequência desses
sinais na forma autossômica dominante da síndrome segundo Mazzeu et al., 2007.+ presente / -
ausente / NA não se aplica / # não avaliado / *Est. atual - Estudo atual
Entretanto, cílios longos, que está descrito para uma prevalência acima de
50%, não foi observada em nossa amostra. Mesomelia de membros superiores e
inferiores foi observada em todos os pacientes diagnosticados com DRS2 descritos
na literatura, entretanto em nossa amostra de quatro pacientes, um apresentava
49
encurtamento proporcionado de membros. Fusão de costelas esteve ausente em
nossa amostra, reforçando este sinal como importante diferencial entre a RRS e a
DRS.
O paciente portador de mutação em DVL3 apresentou baixa estatura, assim
como descrito para outros pacientes diagnosticados com a DRS3, o que pode ser um
sinal importante para diferenciar fenotipicamente pacientes portadores de mutações
em DVL1 e em DVL3. Além da baixa estatura sinais típicos da RS como características
faciais e anomalias dentárias foram observadas. A macrocefalia, sinal significativo
para a DRS, esteve ausente em nosso paciente, entretanto trabalhos anteriores
observaram macrocefalia em dois pacientes com esta forma da síndrome, assim, esta
característica não pode ser usada para distinguir clinicamente a DRS3 da DRS2.
Outros sinais importantes observados em nosso paciente foram sindactilia, hérnia
umbilical, anomalias renais, pectus carinatum e onfalocele. Este paciente, apresentou
encurtamento proporcionado de membros, em contraste com descrições prévias para
a DRS3, que observaram apenas o encurtamento mesomélico. Características
consideradas de maior importância para DRS3 como a fissura labial e/ou palatina e
defeitos cardíacos estavam ausentes neste paciente.
IV.4 PESQUISA DE MUTAÇÕES POR WES
IV.4.1 Mutações em WNT5A
Após a busca por mutações em DVL1 e DVL3, através do sequenciamento
Sanger, aqueles pacientes que obtiveram resultado negativo para mutações nesses
genes foram estudados através da técnica de WES.
Foram então identificadas mutações em WNT5A em dois dos pacientes
estudados. O primeiro paciente (caso 5) apresentou uma troca de base com perda de
sentido (c.479C>G; p.Ser160Cys;) em heterozigose e localizada no exon 4 de
WNT5A.
Na segunda paciente (caso 6) foi encontrada, também em heterozigose, uma
inserção de novo de seis pares de base (c.487_492dup; p.G163_C164dup) no exon 4
do gene WNT5A, sem alteração no quadro de leitura. Esta variante foi observada em
16/70 (23%) das leituras , o que é condizente com um quadro de mosaicismo do alelo
mutante.
50
Mutações em heterozigose no gene WNT5A foram a primeira causa descrita
para a DRS (Person et al., 2010). Na literatura, até o presente momento, haviam sido
descritas seis mutações neste gene, todas relacionadas a DRS1 (Person et al., 2010;
Roifman et al., 2015). Comparando nossos dados com os previamente descritos
observamos que nenhuma das duas mutações aqui encontradas haviam sido
reportadas anteriormente. A descrição das mutações encontradas em nosso estudo e
daquelas reportadas na literatura se encontra no Quadro III.
Quadro III - Descrição de mutações nos genes WN/T5A em pacientes com DRS.
Paciente Gene Exon
alterado Tipo de mutação Variação de bases
Origem geografica
Caso 06 WNT5A 4 Troca de sentido c.479C>G Etiópia
Caso 07 WNT5A 4 Troca de sentido c.487_492dup EUA
Roifman et al. (2015)
WNT5A 3 Troca de sentido c.206G>A -
Person et al. (2010)
WNT5A 3 Troca de sentido c.248G>C -
Xiong et al. (2016)
WNT5A 3 Troca de sentido c.249C > G China
Roifman et al. (2015)
WNT5A 3 Troca de sentido c.257A>G -
Roifman et al. (2015)
WNT5A 3 Troca de sentido c.257A>G -
Robinow et al. (1969) e Person et al. (2010)
WNT5A 4 Troca de sentido c.544–545 CT>TC -
Quadro III - Nas linhas em cinza estão representadas as mutações encontradas no presente trabalho
e nas linhas brancas aquelas reportadas na literatura em pacientes com a forma autossômica
dominante da síndrome de Robinow. Dados obtidos de Robinow et al., 1969, Roifman et al. 2015,
Person et al., 2010 e Xiong et al., 2016.
Entretanto, todas a mutações descritas para WNT5A afetam os exons 3 e 4 e
causam uma troca de sentindo durante a tradução de aminoácidos. No trabalho de
Roifman et al. (2015) foi estudado um modelo de homologia WNT5A, observou-se que
todas mutações, até o momento descritas, parecem afetar o mesmo lado da cisteína
104, que é palmitolado (Figura VIII). Este local coincide com a região das mutações
encontradas em nosso estudo. Ainda segundo Roifman et al., é possível que
mutações nesses resíduos alterarem estruturas da superfície da proteína e afetem
interações com outras proteínas da via Wnt.
51
Figura VIII - Modelo de homologia WNT5A. Mutações encontradas em todos os WNT5A associadas
aos casos DRS parecem estar localizados de um lado da proteína e podem afetar as interações com
outras proteínas na via Wnt. Adaptado de Roifman et al., 2015.
Resíduos C69 e C83 são modelados como cisteínas livres e sua função
especifica na multimerização e/ou estabilização deste complexo é desconhecido. No
entanto, a mutação destes resíduos em tirosina e serina, respectivamente, poderiam
afetar essa atividade putativa. O resíduo Y86 também está localizado na superfície
proteica, sua cadeia lateral é grande e aromática e poderia desempenhar um papel
na formação do complexo. A mutação converte esse resíduo em cisteína, que é menor
e não pode realizar as mesmas interações. Além da perda da cadeia lateral da tirosina,
esta mutação também pode introduzir uma nova ligação de cisteína com a cisteína
livre na posição 83. No modelo utilizado neste trabalho, o resíduo C182 faz uma
ligação dissulfeto com o resíduo C164, isso irá estabilizar o local do domínio e a
superfície de interação da proteína. A mutação C182R irá perturbar essa ligação
dissulfeto. Além disso, um lado maior da cadeia é introduzido nesta posição, que
também mudará a superfície da proteína (Roifman et al., 2015).
O WNT5A é um sinalizador da via Wnt não-canônica, responsável por modular
a migração celular independente da β-catenina (Slusarski et al., 1997; Heisenberg et
al.,2000). A sinalização Wnt não-canônica é necessária para migração direcional de
células originarias das ilhotas pancreáticas durante a formação de pâncreas em peixe-
zebra e camundongos (Kim et al., 2005). Além disso, a sinalização não canônica
Wnt5a regula o direcionamento da migração celular necessária para a fusão do palato
secundário fusão o desenvolvimento do rato (He et al., 2008).
52
Recentemente foi realizado um trabalho com embriões de galinha que possuem
uma homologia de 91% de Wnt5a com a sequência humana. Foram expressos o tipo
selvagem e outras duas versões mutantes de WNT5A humana na mandíbula destas
aves. Posteriormente foram examinados os efeitos morfológicos, celulares e
moleculares destas alterações: os vírus mutantes wtWNT5A, WNT5AC83S e
WNT5AC182R causaram o encurtamento da mandíbula no lado em que foram
injetados quando comparados aos controles GFP (Green fluorescent protein). Embora
os fenótipos dos pacientes estudados tenham, inicialmente, parecido semelhantes, foi
descoberta uma interrupção específica da polaridade e forma de condrócitos, inibição
da migração celular, diferenças na expressão do gene alvo e ausência de sinalização
JNK, quando presente WNT5A mutante. Além disso, as mutações com troca de
sentido não parecem bloquear a ligação ao receptor, pois em experiências parácrinas,
a proteína mutante inibe a migração celular. Neste estudo, foi descartado o ganho
direto ou perda de função causada pelas mutações em WNT5A. Em vez disso, as
mutações provavelmente redirecionam a sinalização Wnt para longe de JNK-PCP,
para outras vias não-canônicas. Assim, as mutações com troca de sentido, em
WNT5A. que estão relacionadas a RS, apresentam efeitos neomórficos dominantes
que interferem na função da proteína do tipo selvagem (Hosseini-Farahabadi et al.,
2017).
Embora outros modelos animais em galinha (Baranski et al., 2000; Geetha-
Loganathan et al., 2009; Hosseini-Farahabadi et al., 2013) e em rato (Yamaguchi et
al. 1999), também tenham demostrado a importância do ligante WNT5A e da via Wnt
não-canônica no desenvolvimento craniofacial e de membros, mais estudos a nível de
proteína são necessários para determinar quais componentes estão envolvidos e qual
caminho de transdução do sinal resultam no fenótipo da RS.
IV.5 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES COM MUTAÇÃO EM
WNT5A
Assim como em DVL1 e em DVL3, as mutações em WNT5A relatadas em
nosso trabalho resultaram em fenótipos semelhantes àqueles descritos na literatura
para DRS. Os achados mais frequentes encontrados em nosso estudo para esses
pacientes foram as dismorfias faciais características, que incluem o hipertelorismo
marcado, o encurtamento mesomélico de membros associado a baixa estatura e
53
anomalias dentarias. Descrições anteriores para a DRS1 já haviam revelado que
todos os pacientes acometidos por mutações em WNT5A apresentaram mesomelia
de membros e baixa estatura, achados esses que se diferenciam daqueles
observados para DRS2 e DRS3. Outro achado concordante com a literatura e que
aponta diferenças entre a DRS1 com as demais formas dominantes da RS foi a
macrocefalia, que esteve ausente em nossa amostra de pacientes. As frequências de
sinais clínicos observados em nossos pacientes com mutação em WNT5A, assim
como aqueles descritos na literatura se encontram no Quadro IV.
Quadro IV – Frequência de sinais clínicos em pacientes com DRS1.
Paciente Caso 06 Caso 07 Est. atual* Mazzeu
Gênero M F % %
Gene WNT5A WNT5A WNT5A DRS
Mutação c.479C>G c.487_492dup
Consequência p.S160C p.G163_C164dup
Zigosidade Heterozigoto Heterozigoto
Crescimento
Baixa estatura + + 100 81
Características faciais
Macrocefalia - - 0 64
Testa proeminente + + 100 79
Testa ampla + + 100 -
Hipoplasia do terço médio da face + + 100 81
Hipertelorismo + + 100 100
Cílios longos + + 100 54
Olhos proeminentes + - 50 36
Narinas antevertidas + + 100 96
Ponte nasal larga + - 50 97
Lábio superior fino - - 0 50
Hiperplasia de gengiva + - 50 36
Língua bífida + + 100 39
Anomalias dentárias + + 50 50
Baixa implantação de orelhas + # 100 28
Genitália
Micropênis + NA 100 84
Criptorquidia + NA 100 72
Hipoplasia de pequenos lábios NA # # 50
Hipoplasia de grandes lábios NA # # 35
Clitóris hipoplásico NA # # 46
Esqueleto
Mãos curtas + + 100 62
Membros Mesomelia Mesomelia Mesomelia 80%
Mesomelia
Braquidactilia + + 100 81
Clinodactilia + + 100 70
Sindactilia + - 50 15
Fusão de costelas - - 0 0
Outros achados
Hemivertebras,
pectus excavatum, e
hérnia inguinal
bilateral
Estrabismo,
escoliose,
microrretrognatia
54
Quadro I – Características clinicas dos pacientes investigados no presente estudo e frequência desses
sinais na forma autossômica dominante da síndrome segundo Mazzeu et al., 2007. + presente / -
ausente / NA não se aplica / # não avaliado / *Est. atual – Estudo atual
Além desses sinais, nossos pacientes apresentaram outras alterações de
membros como a braquidactilia e a clinodactilia. Um dos pacientes apresentou
também sindactilia dos dedos da mão. A fusão de costelas não foi observada, mas
um de nossos pacientes revelou hemivertebra. Outros achados foram estrabismo,
hiperplasia gengival, hérnia inguinal bilateral, pectus excavatum e escoliose. Um sinal
não descrito previamente para a DRS1, a microrretrognatia, esteve presente em
nossos dois pacientes com mutação nesse gene.
Apesar da nossa amostra ter apresentado um fenótipo um pouco mais grave
em relação ao comprometimento craniofacial, quando comparado com outros casos
de mutação em WNT5A, os pacientes aqui relatados não apresentaram fissuras orais,
problemas respiratórios e anomalias renais e ou/cardíacas, como observados em
pacientes com mutações em DVL1 e DVL3.
IV.4.2 Identificação de novos genes associados a DRS por WES
Após analisar nossa amostra para genes conhecidos, com alguma associação
a DRS, mais de um terço de nossa amostra (4/11, 36%) permaneceu sem um
diagnóstico molecular. Em seguida, a partir dos dados gerados pela técnica de WES,
realizamos uma análise do genoma para identificar variantes raras e potencialmente
prejudiciais que poderiam representar novos genes subjacentes a DRS. Observamos
que dois indivíduos afetados de uma mesma família (Caso 08 e 09), apresentaram
variantes que afetam FZD2, gene este, nunca antes descrito como causativo da RS.
Nas duas pacientes que possuem mutação no gene FZD2 foi observada a
variante (c.301g>T;p.Gly434Val). Esta alteração foi encontrada em heterozigose e
afeta o único exon de FZD2, gerando, provavelmente, uma proteína truncada e não
descrita em nenhum banco de dados controle. É importante ressaltar que FZD2
exerce papel importante na Via Wnt e que interage diretamente com outras proteínas
relacionadas ao fenótipo de DRS.
O gene FZD2 codifica uma proteína transmembranar altamente conservada e
faz parte da família Frizzled de receptores de membrana. Frizzled foi originalmente
identificada por Vinson e Adler em Drosophila melanogaster onde foi observada uma
55
desorientação das cutículas capilares , sendo assim foi denominada "frizzled" (Vinson
e Adler, 1987). FZD2 está envolvida tanto na via Wnt / β-catenina quanto na via Wnt /
PCP, independente de β -catenina. Estudos demonstram que as proteínas Frizzled
funcionam como receptores e co-receptores Wnt (Mikels et al., 2006; Bhanot et al.,
1996).
Mutações nesta proteína não foram, até o momento, relacionadas diretamente
a nenhuma forma de RS. Entretanto, mutações no gene FZD2 já haviam sido descritas
como candidatas para a Omodisplasia tipo 21 (MIM#164745) por Saal et al., 2015.
Esta displasia esquelética tem diagnostico diferencial com a RS e possui sobreposição
de vários sinais clínicos como dismorfias faciais, anomalias de membros e
genitourinárias. Além disto, a mesma variante (c.301g>T; p.Gly434Val) encontrada em
nosso estudo foi descrita em uma paciente também com Omodisplasia tipo 2
(Türkmen et al., 2017), curiosamente, esta paciente havia recebido diagnostico
anterior de RS, devido a suas características fenotípicas muito semelhantes aquelas
encontradas na DRS. Detalhes nas mutações encontradas em nosso trabalho se
encontram no Quadro V. É necessário destacar que um grupo de pacientes com
diagnostico de DRS e mutações em FZD2 também está descrito por White et al. em
um trabalho que está em processo de publicação.
Quadro V - Descrição de mutações no gene FZD2 em pacientes com DRS e Omodisplasia tipo 2.
Paciente DC Gene Exon
alterado Tipo de mutação Variação de bases
Origem geográfica
Caso 08 DRS FZD2 1 Troca de sentido c.301G>T EUA
Caso 09 DRS FZD2 1 Troca de sentido c.301G>T EUA
Türkmen et
al. (2017) Omodisplasia
tipo 2 FZD2 1 Troca de sentido
c.301G>T Turquia
Saal et al.
(2015) Omodisplasia
tipo 2 FZD2 1 Sem sentido c.1644G>A -
Quadro V -Nas linhas em cinza estão representadas as mutações encontradas no presente trabalho e
nas linhas brancas aquelas reportadas na literatura em pacientes com a forma autossômica dominante
da síndrome de Robinow. Dados obtidos de Türkmen et al., 201719 e Saal et al., 2015.
1 A Omodisplasia tipo 2, autossômica dominante, foi recentemente extinta pela Sociedade Internacional de Displasias Esqueléticas em sua 13ª reunião que ocorreu em 20 de setembro de 2017 em Bruges-Bélgica. Os pacientes classificados com esta forma de Omodisplasia serão agora classificados como portadores da síndrome de Robinow autossômica dominante.
56
O resíduo Gly434, encontrado alterado nos pacientes do nosso estudo, é
conservado em todos os vertebrados e está localizado na borda de um domínio
transmembranar; o loop intracelular adjacente é um dos três pontos que se mostraram
necessários para a ligação e estabilização da interação com DVL1 (Tauriello et al.,
2012). Portanto, as alterações no Gly434 podem interferir na afinidade ou na
estabilidade da interação FZD2-DVL (Punchihewa et al., 2009), sendo, o último,
previsto para ocorrer através do C-terminal de DVL1, incluindo o domínio DEP.
Curiosamente, semelhante a todas as outras proteínas associadas a RS, FZD2
desempenha um papel vital na ativação dependente de WNT5A dos efeitos do
downstream do RAC e Wnt/PCP e é necessário para o recrutamento mediado pela
WNT5A de DVL2 para a membrana. Além disso, o FZD2 interage diretamente com o
ligante WNT5A através do seu domínio rico em cisteína. A ligação de WNT5A, na
presença de ROR1, ROR2 e DVL2 induz internalização de FZD2 através de clatrina,
o que é necessário para a ativação de RAC1 em células HEK293 (Sato et al., 2010).
Figura IX – Representação esquemática dos domínios funcionais conhecidos de FZD2 que interagem com DVL. A primeira seta indica uma variante da Glycina 434, encontrada alterada no nosso estudo em duas pacientes com DRS, esta variante também está descrita para Omodisplasia tipo 2. Uma variante adicional (p.Trp548 *) da literatura, relatada em associação com Omodisplasia tipo 2 também está incluída. Dados obtidos de Türkmen et al., 2017 e Saal et al. 2015.
Figura X - Modelagem in silico da mutação Gly434Val em FDZ2. No tipo selvagem, o Gly434 é
representado como esferas vermelhas na hélice TM5 (laranja). A problemática estérica desta
configuração mostra obstáculos estéreis de Val434 com a hélice vizinha (amarelo). Adaptado de
Türkmen et al., 2017.
57
Türkmen et al. (2017) também identificou uma mutação patogênica
compartilhada por um probando e sua filha afetada, com diagnóstico clínico de
Omodisplasia tipo 2 (Figura X). Foi identificada uma única mudança de par base
(c.1644G> A) dentro do quadro de leitura do gene FZD2. Esta mutação sem sentido
muda um resíduo de triptofano no aminoácido 548 para uma parada prematura. A
mutação causal p.Trp548* identificada nestes pacientes prevê o truncamento da
proteína FZD2 na periferia do domínio de interação canônico DVL (Figura IX) o que
pode ter consequências significativas para a sinalização canônica. Este estudo
mostrou que a interação FZD-DVL é modulada por um motivo descontínuo em
Frizzled, que está localizado ao longo de três loops intracelulares do receptor FZD. A
mutação p.Trp548* evitaria a tradução de alguns dos resíduos neste modelo de
ligação com DVL também.
Estudos relataram que FZD2 é amplamente expressa em todo o
desenvolvimento de cabeças e membros em vários modelos animais (Sisson e
Topczewski, 2009; Geetha-Loganathan et al., 2009; Yu et al., 2010; Nohno et al., 1999;
Visel et al., 2007). No trabalho de Saal et al., foi confirmado esse achado realizando
hibridização in situ para FZD2 em um modelo experimental de ave. FZD2 foi expresso
em toda a cabeça em desenvolvimento e dentro do mesênquima do membro proximal
que contribui para os elementos esqueléticos em desenvolvimento. Além disso, a
proteína FZD2 foi detectada tanto no desenvolvimento da cabeça como nos membros.
Coletivamente, há ampla evidência na literatura de que a interrupção da
sinalização Wnt/Frizzled não-canônica leva a um atraso ou bloqueio na maturação de
condrócitos e encurtamento de elementos esqueléticos (Hartmann e Tabin, 2000; Li e
Dudley, 2009). Esses fundamentos biológicos são susceptíveis a serem responsáveis
pela baixa estatura observada e mesomelia em pacientes com RS.
IV.6 CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES COM MUTAÇÃO EM
FZD2
As informações clínicas pertinentes a todos os pacientes com variantes em
FZD2 são mostradas no Quadro VI. A apresentação clínica dos indivíduos afetados
pode ser considerada um conjunto de características que representam uma desordem
distinta que inclui baixa estatura, defeitos dos membros e características faciais
58
dismórficas compartilhadas: testa alta e larga, face plana, baixa implantação de
orelhas, ponte nasal ampla e narinas antevertidas. Além disso, os dois indivíduos
afetados apresentam encurtamento mesomélico de membros e braquidactilia. A baixa
estatura significativa esteve presente nas duas pacientes também, apontando uma
diferença com a DRS2 (Quadro VI).
Quadro VI – Frequência de sinais clínicos em pacientes com DRS e mutação em FZD2.
Paciente Caso 08 Caso 09 Est. Atual* Mazzeu
Sexo F F % %
Gene FZD2 FZD2 FZD2 DRS
Mutação c.1301G>T c.1301G>T
Consequência p.Gly434Val p.Gly434Val
Zigosidade Heterozigoto Heterozigoto
Crescimento
Baixa estatura + + 100 81
Características faciais
Macrocefalia - + 50 64
Testa proeminente + + 100 79
Testa ampla - - 0 -
Hipoplasia do terço médio da face + + 100 81
Hipertelorismo + + 100 100
Cílios longos + + 100 54
Olhos proeminentes + + 100 36
Narinas antevertidas + + 100 96
Ponte nasal larga - + 50 97
Lábio superior fino + + 100 50
Hiperplasia de gengiva + + 100 36
Língua bífida + + 100 39
Anomalias dentárias + + 100 50
Baixa implantação de orelhas + + 100 28
Esqueleto
Mãos curtas + + 100 62
Membros Mesomelia Mesomelia Mesomelia 80%
Mesomelia
Braquidaquitilia + + 100 81
Clinodactilia + + 100 70
Camptodactilia - - 0 -
Sindactilia - - 0 15
Fusão de costelas - - 0 0
Genitália
Micropênis NA NA NA 84
Criptorquidia NA NA NA 72
Hipoplasia de pequenos lábios + + 100 50
Hipoplasia de grandes lábios + + 100 35
Clitóris hipoplásico + + 100 46
Outros achados Recorrente UTI pectus excavatum,
hérnia inguinal.
Quadro VI – Características clinicas dos pacientes investigados no presente estudo e frequência desses
sinais na forma autossômica dominante da síndrome segundo Mazzeu et al., 2007. + presente / -
ausente / NA não se aplica / # não avaliado / *Est. atual – Estudo atual
Outros achados que também estiveram presentes em 100% de nossa amostra
foram as anomalias dentárias e a hipoplasia genital. Macrocefalia, sinal importante
para a DRS está presente em uma das pacientes com mutações em FZD2. Entretanto,
59
assim como no nosso coorte de pacientes com mutação em WNT5A, não foi
observado nesses pacientes anomalias renais e cardíacas e infeções respiratórias
recorrentes, diferenciando assim o fenótipo de pacientes com mutações em FZD2
daqueles com mutações em DVL1 e DVL3 (DRS2 e DRS3).
Alternativamente, como resultado da ampla expressividade variável de
características associadas à RS, indivíduos com variantes em FZD2 podem ser
considerados casos de RS atípicos. Na realidade, FZD2 foi proposto como um gene
candidato para Omodisplasia tipo 2, que se sobrepõe significativamente com a RS. A
característica "face fetal" está presente em todos os indivíduos afetados com defeitos
esqueléticos e de membros atendendo ao critério de diagnóstico para DRS. A
identificação de outros pacientes com mutação em FZD2 permitirá uma melhor
caracterização dessa forma da síndrome.
IV.7 SÍNTESE DE RESULTADOS E DISCUSSÃO
IV.7.1 Análise Molecular
A partir dos 11 pacientes (6 homens e 5 mulheres) estudados foram detectadas
9 mutações potencialmente patogênicas em quatro diferentes genes para a DRS, os
conhecidos WNT5A, DVL1 e DVL3 e o gene candidato FZD2, todos participantes da
via Wnt não canônica de sinalização. Tais dados confirmam a heterogeneidade
genética que compõe essa desordem e contribuem para a compreensão desta via na
embriogênese humana.
Em nosso estudo foram detectadas cinco mutações de ponto nos genes DVL1
e DVL3 gerando um C-terminal truncado a partir da mudança de -1 no quadro de
leitura. Outros dois pacientes apresentaram mutações no gene WNT5A afetando a
proteína no lado da cisteína 104, mutações nesses resíduos podem alterar estruturas
da superfície da proteína e afetar interações com outras proteínas da via Wnt. Mais
um gene participante desta via foi encontrado alterado em nosso coorte de pacientes,
FZD2 já havia sido indicado a estar envolvido em fenótipos Robinow-like.
Na literatura, o rastreio genético em Drosophila identificou muitos dos
componentes da via Wnt PCP, incluindo os dois frizzled (Vinson e Adler, 1987) e
disheveled (Brunner e van Driel, 2004). A sinalização não-canônica Wnt regula,
através da via PCP, movimentos de extensão convergentes, um processo de
60
migração celular essencial durante a gastrulação de vertebrados. Os movimentos de
extensão convergente desregulados em vertebrados controlados por proteínas de
sinalização PCP do núcleo, são um fenômeno evolutivamente conservado com os
mecanismos moleculares básicos conservados desde Drosophila até mamíferos (Qian
et al., 2007).
Os processos de desenvolvimento em diferentes organismos acima
mencionados são em grande parte controlados pelo mesmo conjunto de proteínas
PCP do núcleo, que foram originalmente identificadas em Drosophila. No entanto, em
comparação com a Drosophila, a via PCP de vertebrados é mais evoluída e
diversificada por especificação e emergência de vários homólogos, muitas vezes de
um único gene de mosca, em quase todos os componentes essenciais desta via. Não
surpreendentemente, estudos recentes demonstraram que os genes de mosca com
mais de um homólogo humano são mais propensos a estar associados a síndromes
humanas do que os genes de mosca com um único homólogo, potencialmente
indicando duplicação e uma maior especialização de genes parálogos durante a
evolução. Isso indica que os genes com múltiplos homólogos humanos que
normalmente possuem algumas funções sobrepostas, ainda podem manifestar um
fenótipo humano, embora a patogenicidade não seja devida à falta de eficiência
(Yamamoto et al., 2014).
Estamos começando a notar a relevância desses alelos raros, observados em
genes da via Wnt/PCP que causam a RS, isto inclui alelos truncados agrupados em
DVL1 e DLV3, variantes recorrentes em FZD2 e alelos hipomórficos em WNT5A. Mais
estudos acerca dessa via são necessários para a melhor compreensão dos
mecanismos que desencadeiam essas desordens de desenvolvimento.
IV.7.2 Análise Clínica
A descrição clínica dos 11 participantes da pesquisa está esquematizada no
Quadro VII. Detalhes da caracterização clínica de cada caso se encontram na sessão
de anexos ao final deste trabalho. Ao todo foram discriminadas 27 das características
clínicas mais importantes sugeridas por Mazzeu et al. em 2007, no trabalho que reuniu
os principais sinais e sintomas clínicos em pacientes com DRS e RRS. A frequência
relativa de cada característica foi calculada e comparada ao resultado obtido no
trabalho de Mazzeu de 2007.
61
De forma geral o fenótipo dos pacientes aqui estudados demostra ter
consonância com sinais clínicos relatados anteriormente para DRS (figura. 1). Dentre
eles podemos destacar as dismorfias faciais características como hipertelorismo,
hipoplasia do terço médio da face e narinas antevertidas. Outros achados clínicos
concordantes com as descrições anteriores para DRS foram as alterações de
membros como clinodactilia, braquidactilia e encurtamento de membros. O trabalho
de Mazzeu observou uma frequência de 80% para encurtamento mesomélico de
membros, em nossa amostra encontramos 73% para encurtamento mesomélico e
27% para encurtamento proporcionado.
A hipoplasia genital, característica importante tanto para a RRS quanto para a
DRS, não pode ser avaliada em todos os nossos pacientes, entretanto para aqueles
cujo exame físico foi realizado constatamos uma frequência alta de micropênis,
criptorquidia em homens e hipoplasia de pequenos lábios em mulheres, concordantes
com a literatura. Metade das pacientes do sexo feminino de nossa amostra, que foram
examinadas, apresentaram também hipoplasia de grandes lábios e clitóris.
Quadro VII – Frequência de sinais clínicos dos pacientes de nosso estudo e daqueles descritos para
pacientes com DRS e RRS.
Gene
DV
L1
DV
L3
WN
T5
A
FZ
D2
S/
eti
olo
gia
m
ole
cu
lar
de
fin
ida DRS
Estudo atual
DRS Mazzeu et al. (2007)
RRS Mazzeu et al. (2007)
Frequência dos sinais % % % % % % % %
Crescimento
Baixa estatura 0 100 100 100 100 63 81 97
Características faciais
Macrocefalia 100 0 0 50 100 77 64 25
Testa proeminente 100 # 100 100 50 90 79 78
Testa ampla 100 # 100 0 100 66 - -
Hipoplasia do terço médio da face
100 100 100 100 50 90 81 94
Hipertelorismo 100 100 100 100 100 100 100 100
Cílios longos 0 100 100 100 0 54 54 59
Olhos proeminentes 75 100 50 100 0 63 36 13
Narinas antevertidas 75 0 100 100 50 73 96 96
Ponte nasal larga 100 100 50 0 100 80 97 95
Lábio superior fino 50 0 0 100 50 45 50 29
Hiperplasia de gengiva 100 100 50 100 50 81 36 71
Língua bífida 100 0 100 100 0 72 39 59
Anomalias dentárias 100 100 50 100 100 91 50 94
Baixa implantação de orelhas 100 100 100 100 100 100 28 50
Quadro VII - Continua
62
Gene
DV
L1
DV
L3
WN
T5
A
FZ
D2
S/
eti
olo
gia
m
ole
cu
lar
de
fin
ida DRS
Trabalho atual
DRS Mazzeu et al. (2007)
RRS Mazzeu et al. (2007)
Frequência dos sinais % % % % % % % %
Esqueleto
Mãos curtas 50 100 100 100 100 81 62 84
Membros
60% Mesomel
ia 40%
Encurtamento
proporcionado
Encurtamento
proporcionado
Mesomelia
Mesomelia
Proporcionado e Mesomel
ia
73% Mesomel
ia 27%
Encurtamento
proporcionado
80% Mesomel
ia
100% Mesomeli
a
Braquidactilia 100 100 100 100 100 100 81 91
Clinodactilia 100 100 100 100 100 100 70 88
Camptodactilia 0 0 50 0 0 14 - 18
Sindactilia 0 100 0 0 0 11 15 18
Fusão de costelas 0 0 0 0 100 9 0 100
Genitália
Micropênis 100 # 100 NA 100 100 84 100
Criptorquidia 100 # 100 NA 100 100 72 67
Hipoplasia de pequenos lábios # NA # 100 # 75 50 81
Hipoplasia de grandes lábios # NA # 100 # 50 35 40
Clitóris hipoplásico # NA # 100 # 50 46 80
Quadro VII – Frequência de sinais clínicos dos pacientes investigados no presente estudo e frequência
desses sinais em DRS e RRS segundo Mazzeu et al., 2007. Foram adicionadas apenas as
características com frequência > 25% de acordo com o trabalho de realizado por Mazzeu et al., 2007.
NA não se aplica / # não avaliado
A macrocefalia, sinal importante para distinguir as duas formas de RS foi
encontrada presente em 77% de nossa amostra, mas não foi observada em pacientes
com mutação em WNT5A (DRS1). A baixa implantação de orelhas que havia sido
descrita na literatura com uma frequência baixa esteve presente em 100% de nosso
coorte em que esta característica foi avaliada. Outro achado que também havia sido
relatado com uma baixa frequência e que em nossa amostra teve uma prevalência de
81% foi a hiperplasia de gengiva.
Os pacientes com DRS2 e DRS3 (mutações em DVL1 e DVL3) apresentaram
uma recorrência maior para anomalias renais e cardíacas, infecções pulmonares de
repetição e hérnia umbilical, e um paciente, portador de mutação em DVL1,
apresentou surdez. Sinais como hérnia inguinal, pectus excavatum e escoliose e
foram observadas frequentemente em pacientes com mutações em todos os genes
aqui identificados.
A baixa estatura esteve presente em 63% de nossa amostra contra 81% da
literatura, tal fato se deve ao grande número de pacientes portadores de mutação no
63
gene DVL1 (DRS2), única forma da síndrome que não apresenta baixa estatura. Por
outro lado, anomalias dentárias, sinal mais prevalente na forma recessiva da
síndrome, esteve presente em 91% de nossa amostra contra 50% da literatura. A
fusão de costelas é outra característica importante e é usada para diferenciar a DRS
da RRS, e esteve presente em uma de nossas pacientes sem etiologia molecular
definida.
64
V. Conclusão
Nossa pesquisa contou com uma amostra de 11 pacientes clinicamente
diagnosticados com DRS. Destes 9 possuíam mutações em genes participantes da
via Wnt não canônica de sinalização.
Nenhuma das mutações encontradas no presente trabalho, em genes já
relacionados a DRS, DVL1, DVL3 e WNT5A havia sido previamente descrita, o que
contribui para composição do quadro de mutações patogênicas associadas à
síndrome.
Nosso estudo também identificou, através da técnica de WES, um novo gene
candidato para a DRS. O gene FZD2 esteve mutado em mãe e filha afetadas pela
síndrome. Tal achado reforça a heterogeneidade genética que compõe a DRS e nos
fornece evidências de que o sequenciamento completo de exoma pode ser uma
ferramenta chave na busca por genes envolvidos em fenótipos Robinow.
Nossos dados corroboram com a ideia de que mutação em genes distintos
pode levar a fenótipos semelhantes. Distúrbios geneticamente heterogêneos, como a
RS, proporcionam uma oportunidade para uma visão mais ampla das vias e bases
biológicas de doenças, fornecendo pistas para o intercomunicador aberrante ou para
a cascata de sinalização alterada.
Nossos dados reforçam a ideia de que o fenótipo da RS é resultado da via
Wnt/PCP desregulada e também apoiam a hipótese de que proteínas adicionais
subjacentes à RS estejam envolvidas na causa dos demais casos.
O fato de dois pacientes de uma amostra de 11 não apresentarem uma
etiologia molecular definida sugere que há a possibilidade de outros genes estarem
relacionados à síndrome. Portanto, é necessário que a busca pela causa genética da
DRS continue.
A caracterização clinica detalhada de nossos pacientes mostrou que a
frequência de alguns sinais foi discordante da literatura, elencando a importância de
uma caracterização precisa de um grupo maior de pacientes principalmente para se
estabelecer um melhor entendimento da relação genótipo/fenótipo desta desordem.
De forma geral os pacientes aqui estudados apresentaram consonância de
sinais clínicos, entretanto, os pacientes com mutação em DVL1 não apresentam baixa
65
estatura na idade adulta, como já sugerido na literatura. Pacientes com mutação em
DVL1 e DVL3 apresentaram uma frequência maior de anomalias renais e cardíacas.
A macrocefalia, que esteve presente em mais de 70% de nossa amostra, esteve
ausente em pacientes com mutação em WNT5A.
Finalmente, o presente trabalho contribui para uma melhor caracterização da
DRS, que, até pouco tempo, permanecia elusiva. Nossos dados reforçam a
necessidade de se fazer uma caracterização fenotípica individual e completa para
afastar outras síndromes com diagnostico diferencial, afastando assim o sub
diagnóstico.
66
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S1, Saraiva JM, Hove H, Skovby F, Kayserili H, Estrella E, Vulto-van Silfhout
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Mendelian Genomics, Lupski JR, Brunner HG, van Bon BW, Carvalho CM. DVL1
frameshift mutations clustering in the penultimate exon cause autosomal-
dominant Robinow syndrome. Am J Hum Genet. 2015 Apr 2;96(4):612-22.
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HG, Carvalho CM. DVL3 Alleles Resulting in a -1 Frameshift of the Last Exon
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van Bon BWM5, Gezdirici A, Gulec EY, Ramond F, Touraine R, Thevenon J,
Shinawi M, Beaver E, Heeley J, Hoover-Fong J, Durmaz CD, Karabulut HG,
79
Marzioglu-Ozdemir E, Cayir A, Duz MB, Seven M, Price S, Ferreira BM, Vianna-
Morgante AM, Ellard S, Parrish A, Stals K, Flores-Daboub J, Jhangiani SN, Gibbs
RA; Baylor-Hopkins Center for Mendelian Genomics, Brunner HG, Sutton VR,
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G, Wiszniewski W, Sandoval H, Haelterman NA, Xiong B, Zhang K, Bayat
V, David G, Li T, Chen K, Gala U, Harel T, Pehlivan D, Penney S, Vissers
LELM, de Ligt J, Jhangiani SN, Xie Y, Tsang SH, Parman Y, Sivaci M, Battaloglu
E, Muzny D, Wan YW, Liu Z, Lin-Moore AT, Clark RD, Curry CJ, Link N, Schulze
KL, Boerwinkle E, Dobyns WB, Allikmets R, Gibbs RA, Chen R, Lupski
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82
ANEXO I – TERMO DE CONSENTIMENTO UTILIZADO PARA PESQUISA EM DNA
Termo de consentimento livre e esclarecido
A pesquisa intitulada “Pesquisa de genes candidatos para a Síndrome de
Robinow” pretende buscar as causas genéticas da síndrome de Robinow.
Você está sendo convidado (a) a participar do projeto acima citado. O presente
convite contém informações sobre a pesquisa que estamos fazendo. Sua colaboração
neste estudo será de grande importância.
Para a realização da pesquisa será necessária a retirada de 4-8 mL de sangue
de uma das veias do antebraço para exame feito rotineiramente no laboratório. Este
procedimento de coleta de sangue é de risco mínimo para a saúde podendo,
entretanto, provocar pequeno desconforto, será realizado por pessoa qualificada.
Resultando o teste positivo, será garantido um relatório explicativo sobre esta
condição.
A Doutora Juliana Forte Mazzeu de Araújo é a pesquisadora responsável pelos
procedimentos envolvidos, bem como da utilização dos dados produzidos durante a
realização desta pesquisa. A identidade do paciente será mantida em segredo
absoluto no caso de qualquer forma de divulgação desta pesquisa.
A recusa em participar da presente pesquisa não resultará em qualquer
prejuízo presente ou futuro na prestação de assistência profissional pela equipe do
Serviço de Genética Clínica do HUB, ficando também ressaltado que, mesmo após a
assinatura do presente termo de consentimento, poderá abandonar a pesquisa a
qualquer momento.
Os exames e coleta de sangue para análise só serão realizados se houver
concordância do paciente em participar deste estudo. Para tal, pedimos gentilmente
83
que o paciente ou seu responsável assine o presente documento que será entregue
em duas vias, uma para o paciente e outra que será mantida no Laboratório de
Genética Clínica da Faculdade de Medicina - UNB.
Participando desta pesquisa, estará ajudando no diagnóstico, aconselhamento
genético e melhor delineamento da síndrome.
Eu,_____________________________________________________,
profissão _______________________________________________ residente e
domiciliado na rua
__________________________________________________________, portador da
Cédula de Identidade, RG _______________________, e inscrito no
CPF/MF_________________________ nascido(a) em ___/___/_____ , abaixo
assinado(a), concordo de livre e espontânea vontade em participar do estudo
“Pesquisa de genes candidatos para a Síndrome de Robinow”, e afirmo que obtive
todas as informações que considero necessárias.
Caso tenham sido tiradas fotografias:
( ) Concordo que sejam incluídas em publicações científicas, se necessário.
( ) Concordo que sejam apresentadas em aulas para profissionais da saúde.
( ) Não concordo que sejam incluídas em qualquer tipo de publicação ou
apresentação.
Brasília, _____de __________________ de 20__.
____________________________________________________
84
Assinatura do participante
_______________________________________
Dra. Juliana Forte Mazzeu de Araújo
Pesquisadora responsável
Telefone para contato: (61) 3307 2505
Declaração de Responsabilidade
Declaro que na pesquisa intitulada “Pesquisa de genes candidatos para a Síndrome
de Robinow”, sob minha responsabilidade, a coleta de dados somente será iniciada
após a aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FM/UnB, estando ainda o seu
início condicionado à aprovação pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
(CONEP) caso se trate de projeto de Área Temática Especial, Grupo I.
Brasília, ___ de________ de 20__.
____________________________ _________________________
Juliana Forte Mazzeu de Araújo
Responsável pela pesquisa
Dra. Íris Ferrari
Colaboradora
85
ANEXO III – CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES
Caso 01 (Mutação de 13 pb no exon 14 de DVL1)
Paciente do sexo masculino com 50 anos de idade, nascido nos Estados
Unidos, filho de pais não consanguíneos. Nasceu de parto normal, medindo 46 cm (<
3º percentil) e pesando 2,5 kg (< 3º percentil). Foi diagnosticado com a síndrome aos
sete anos de idade. Fez cirurgia para aproximar os olhos e corrigir fissura palatina. Ao
exame clinico observou-se macrocefalia, cabelo esparso, calvície frontal, frontal
proeminente, hipertelorismo, fissuras palpebrais alargadas, fácies achatada, nariz
curto, narinas antevertidas, boca triangular, lábio superior fino, má implantação
dentária, hipodontia, orelhas simplificadas e longas, encurtamento mesomélico de
membros, hiperextensibilidade articular, clinodactilia de 5os dedos, braquidactilia,
genitália hipoplásica e encurtamento de pododáctilos. Refere múltiplas infecções
renais.
Caso 02 (c.1496_1508del em DVL1)
Paciente do sexo feminino, nascida na Inglaterra, filha de pais não
consanguíneos. Ao exame clinico observou-se macrocefalia, olhos proeminentes,
nariz bulboso, narinas antevertidas, ponte nasal larga, filtro longo, boca triangular,
língua bífida, micrognatia, hiperplasia gengival, displasia mesomélica, braquidactilia e
hérnia umbilical.
Caso 03 (c.1505_1517del em DVL1)
Paciente do sexo masculino com 46 anos de idade, nascido na Argentina, filho
de pais não consanguíneos. Ao exame clinico observou-se estatura normal, porém
abaixo do canal familiar, macrocefalia, hipertelorismo, testa larga e proeminente, nariz
curto, ponte nasal larga, língua encurtada, hipertrofia de gengiva, apinhamento
dentário, micrognatia, encurtamento mesomélico discreto, braquidactilia, genitália
hipoplásica, criptorquidia, escoliose discreta. Relata infecções de ouvido frequentes
na infância, perda de audição, problemas respiratórios e refluxo gastroesofágico.
86
Caso 04 (c.1612_1616dup em DVL1)
Paciente do sexo masculino com 20 anos de idade, nascido nos Estados
Unidos, filho de pais não consanguíneos. Ao exame clinico observou-se macrocefalia,
bossa frontal, olhos proeminentes, nariz bulboso, narinas antevertidas, ponte nasal
larga, filtro longo, boca triangular, cantos da boca voltados para baixo, lábio superior
fino, palato alto, hiperplasia gengival, língua bífida, anormalidades dentárias, genitália
hipoplásica e ambígua, fosseta sacral e hérnia umbilical.
Caso 05 (c.1617delG em DVL3)
Paciente do sexo masculino, nascido nos Estados Unidos, filho de pais não
consanguíneos e não afetados. Apresentou ao exame físico hipertelorismo, epicanto,
olhos proeminentes, esclera azulada, fissuras palpebrais voltadas para cima e cílios
longos. Observou-se também hipoplasia do terço médio da face, nariz bulboso, ponte
nasal larga, boca triangular e com cantos voltados para baixo, fenda palatina, língua
curta, hiperplasia gengival, micrognatia e anomalias dentárias. Em relação aos
membros superiores o paciente apresentou mãos pequenas, clinodactilia (2, 5 D / 2
,4 ,5 E), braquidactilia, sindactilia, displasia de unhas e membros proporcionalmente
encurtados. O exame físico de membros inferiores do paciente também mostrou
displasia de unhas e sindactilia. Além disso o paciente apresentou hérnia umbilical,
anomalias cardíacas e renais, escoliose e pectus carinatum.
Caso 06 (c.479C>G em WNT5A)
Paciente do sexo masculino nascido de pais não consanguíneos, origem
geográfica Etiópia. Ao exame clínico apresentou baixa estatura (<3º percentil),
dismorfias faciais (bossa frontal, calvície frontal, hipertelorismo, dobras epicânticas,
olhos proeminentes, esclera azulada, fissuras palpebrais voltadas para cima, cílios
longos, nariz curto, narinas antevertidas, ponte nasal baixa e ampla, filtro longo, boca
triangular com cantos voltados para baixo, língua bífida, hiperplasia gengival, palato
ogival, microrretrognatia e hipoplasia de face média e orelhas de baixa implantação.
O exame dos membros revelou displasia mesomélica, as mãos mostraram
clinodactilia, sindactilia, prega palmar única, polegares grandes e duplicados. Os pés
também apresentaram clinodactilia, sindactilia, grandes e háluces duplicados e pregas
plantares profundas. O paciente apresenta genitália ambígua, micropênis,
criptorquidismo e fosseta sacral. Outros achados importantes foram pectus excavatum
87
e hérnia inguinal bilateral. Testes complementares também revelaram hemivertebras
(T6, T7, T13).
Caso 07 (c.487_492dup em WNT5A)
Paciente do sexo feminino, filha de pais não-consanguíneos e sem casos
familiares. Ao exame clínico apresentou baixa estatura (<3º percentil), dismorfias
faciais como hipertelorismo, bossa frontal, dobras epicânticas, estrabismo, cílios
longos, narinas antevertidas, filtro longo e microrretrognatia. A paciente também
apresentou língua bífida e palato alto arqueado. A avaliação de membros revelou
encurtamento mesomélico, clinodactilia de 5º dedo nas mãos e displasia de unhar com
polegar alargados nos pés. A paciente também apresentou escoliose.
Caso 08 (c.301G>T em FZD2)
Paciente do sexo feminino com 47 anos de idade, nascida nos Estados Unidos,
filha de pais presumidamente consanguíneos de comunidade menonita. Ao exame
clinico observou-se baixa estatura, macrocefalia, bossa frontal, hipertelorismo, olhos
proeminentes, estrabismo, cílios longos, boca em forma de triangulo, lábio superior
fino, língua bífida, hiperplasia gengival, fissura do palato mole, anomalias dentarias,
encurtamento mesomélico de membros, limitação da supinação dos cotovelos,
braquidactilia, clinodactilia, polegares alargados, displasia das unhas, pectus
excavatum, hérnia inguinal, genitália hipoplásica com clitóris pequeno e agenesia dos
pequenos lábios, fosseta sacral. Refere anomalias renais. Fez cirurgia plástica facial.
Possui um filho normal e uma filha afetada (Paciente 10). Refere que seu pai é
também afetado, mas como ele vive em comunidade menonita não tivemos acesso a
ele, nem mesmo fotos.
Caso 09 (c.301G>T em FZD2)
Paciente do sexo feminino atualmente com 15 anos de idade, nascida nos
Estados Unidos, filha de pais não consanguíneos, sendo a mãe também afetada (caso
08). Ao exame físico observou-se baixa estatura, bossa frontal, hipertelorismo, olhos
proeminentes, cílios longos, nariz curto, narinas antevertidas, ponte nasal larga,
hiperplasia gengival, boca triangular e em forma de cupido, lábio superior fino, língua
bífida, anomalias dentarias, micrognatia, encurtamento mesomélico de membros,
clinodactilia, primeiro dedo largo, braquidactilia, clitóris pequeno e agenesia dos
pequenos lábios.
88
Caso 10
Paciente do sexo masculino com 30 anos de idade, nascido nos Estados
Unidos, adotado, pais biológicos desconhecidos. Nasceu com múltiplas
malformações e dismorfias dentre elas: macrocefalia, testa alta, hipoplasia de face
média, hipertelorismo, fendas palpebrais amplas, narinas antevertidas, hiperplasia
gengival, língua curta e bífida, anomalias dentarias, encurtamento mesomélico de
membros, braquidactilia, clinodactilia, criptorquidia bilateral micropênis, hérnia
inguinal, defeitos cardíacos e onfalocele. Foi submetido a um total de 23 cirurgias e
foi examinado por nós após as correções cirúrgicas.
Caso 11
A paciente do sexo feminino, nascida de pais não consanguíneos. Não foram
relatados casos familiares. Ao exame clínico apresentou baixa estatura (1,46 m, <3º
percentil), hipertelorismo marcado, dobras epicânticas, narinas voltadas para cima,
ponte nasal larga, palato alto arqueado e má oclusão dentária. A paciente também
mostrou pregas palmares desorganizadas, braquidactilia, unhas hiperconvexas e
clinodactilia do quinto dedo nas mãos. O exame dos membros inferiores revelou pés
curtos com braquidactilia. Outros achados importantes foram costelas fundidas, hérnia
umbilical, incontinência urinária, problemas pulmonares, dor cardíaca e arritmia,
problemas nas articulações e ataques de pânico.