EDUCACIN QUMICA ENERO DE 2015 ENERO DE 2015 EDUCACIN QUMICA50 PREMIO NOBEL 2014

Educ. qum., 26(1), 50-51, 2015. Universidad Nacional Autnoma de Mxico, ISSN 0187-893-XPublicado en lnea el 11 de diciembre de 2015, ISSNE 1870-8404

PREMIO NOBEL 2014

*Instituto de Qumica de la UNAM, Mxico.

Correo electronico: jpeon@unam.mx

La microscopa ptica es una de las herramientas ms importantes de las ciencias biolgicas, empezando con el descubrimiento de las clulas en 1665 por Robert Hooke. A travs de los aos se han desarrollado numerosas tcnicas para mejorar el contraste y la calidad de las imgenes obtenidas, ayudando inmensamente a la investigacin cientfica. Sin embargo, estas tcnicas se encontraban limitadas por la resolucin con la que se podan observar los sistemas vivos.

Cuando la luz entra en un microscopio es refractada por los lentes utilizados para iluminar y formar la imagen; sin embargo, efectos de difraccin imponen un lmite al rea de la muestra que es irradiada, como sucede en microscopa confocal. En el caso de la microscopa de fluorescencia en general esto sucede en dos instancias: para la luz de excitacin y para la emisin de las molculas. Lo anterior produce que las molculas fluorescentes no se vean como puntos de luz en el plano focal, sino como pequeas manchas de luz conocidas como discos de Airy, que son cientos de veces mayores al tamao del emisor, es decir, de una molcula individual. Cuando dos o ms molculas se encuentran juntas, estos discos de luz se sobreponen, dando una imagen cuya resolucin es del orden de la longitud de onda de la luz utilizada (Novotny & Hecht, 2006).

La distancia mnima para que dos componentes de un sistema puedan diferenciarse con un microscopio se aproxima con el lmite de difraccin de Abbe, quien encontr que la resolucin mnima que se podra alcanzar con luz visible es de aproximadamente 200 nm (Abbe, 1873).

El uso de longitudes de onda de luz ms pequeas, en la regin del ultravioleta y los rayos X, permite una mayor resolucin en las imgenes, pero la preparacin de las muestras y la irradiacin con luz de alta energa no son compatibles con el uso de clulas vivas, por lo que durante muchos aos no se pudo observar la estructura fina y los procesos a nanoescala en muestras biolgicas vivas (Koster & Klumperman, 2003).

Premio Nobel de Qumica 2014Microscopa de fluorescencia

con super-resolucinAndrs Arroyo-Pieck y Jorge Pen*

ABSTRACT (Super-resolved fluorescence microscopy)The Nobel Prize in Chemistry 2014 was awarded to the developers of modern optical fluorescence microscopy techniques that allow imaging of living systems with nanometer resolution. These methodologies also allow for the timeresolved tracking of chemical and biochemical processes at the single molecule level. The works of Eric Betzig, Stefan W. Hell and William E. Moerner have given us extraordinary tools to study biological systems at unprecedented levels of spatial resolution.

KEYWORDS: Nobel Prize 2014, chemistry, superresolved microscopy

ResumenEl Premio Nobel de Qumica del 2014 se otorg a los desarrolladores de las tcnicas ms modernas de microscopa ptica de fluorescencia. Estas metodologas permiten obtener imgenes de sistemas vivos con una resolucin espacial de nanmetros. Adems, gracias a estos desarrollos hoy en da es posible dar seguimiento temporal a procesos qumicos y bioqumicos al nivel de una molcula individual. Los trabajos de Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner nos han dado herramientas extraordinarias para estudiar los sistemas biolgicos a los niveles ms fundamentales.

Palabras clave: Premio Nobel 2014, qumica, microscopa de superresolucin

En el orden acostumbrado: Eric Betzig, William E. Moerner y Stefan W. Hell. (Los crditos de las fotos son, respectivamente: Matt Staley/HHMI; Ber-nd Schuller, Max-Plank Institute; K. Lowder va Wikimedia Commons, CC-BY-SA-3.0).

EDUCACIN QUMICA ENERO DE 2015 ENERO DE 2015 EDUCACIN QUMICA 51PREMIO NOBEL 2014

El lmite de Abbe no pudo ser superado sino hasta ms de 100 aos despus del desarrollo del microscopio ptico, con la invencin de la microscopa de campo cercano (Nearfield Scanning Optical Microscopy, o NSOM), en la cual el detector debe encontrarse a unos pocos nanmetros del objeto estudiado (Ash & Nichols, 1972). Esta tcnica permite obtener imgenes con alta resolucin y ha seguido evolucionando desde su inicio, por ejemplo con el uso de fibras pticas. Sin embargo, este mtodo permite estudiar solo una delgada capa en la superficie de las muestras, lo que limita su uso.

Es gracias a la invencin de las tcnicas de superresolucin por los ganadores del premio Nobel 2014, que se han obtenido por primera ocasin imgenes con resolucin de cerca de 10 nm de sistemas biolgicos vivos, y que incluso sea posible reconstruir las estructuras finas de las clulas en tres dimensiones.

Aunque recibieron el premio en conjunto, los tres investigadores, Eric Betzig, Stefan Hell y William Moerner, desarrollaron diferentes mtodos para lograr resolver las imgenes por debajo del lmite de difraccin impuesto por la naturaleza de la luz. En 1994, Stefan Hell (Hell, 1994) desarroll la tcnica de agotamiento de emisin estimulada (STED por sus siglas en ingls: Stimulated Emission Depletion Microscopy), la cual disminuye el tamao del rea iluminada por un lser por debajo del lmite de difraccin. Esto se logra utilizando dos rayos lser para iluminar la muestra: uno en configuracin confocal que ilumina una regin limitada por difraccin, y otro que desactiva las molculas en la orilla de esta zona por emisin estimulada. El segundo lser logra lo anterior gracias a que tiene un modo transversal en forma de dona, el cual rodea la iluminacin lograda con el primer lser. Con esto se logra que el rea que produce la fluorescencia realmente sea de solo unos cuantos nanmetros. Midiendo la intensidad de la fluorescencia emitida por las molculas que se encuentran solo en la regin central del primer haz, se forma una imagen con una resolucin hasta diez veces mayor a la obtenida con un microscopio confocal convencional.

Las investigaciones de William Moerner y Eric Betzig etal. (2006) se basan en la localizacin de molculas individuales. Cuando la distancia entre molculas fluorescentes es mayor al lmite de difraccin, es posible obtener un perfil de intensidad del patrn de Airy formado en el microscopio, cuyo anlisis permite encontrar el centro del disco (esto es, la posicin real de la molcula), con una exactitud que depende sobre todo del nmero de fotones que se detectan. En una muestra real, la densidad de las molculas fluorescentes debe ser alta para poder observar las estructuras, y la distancia promedio entre emisores es mucho menor al lmite de difraccin. Para poder observar a los emisores individualmente, es necesario que solo una molcula por cada regin espacial del orden de un disco de Airy este emitiendo luz, lo

que se logra utilizando molculas que pueden ser activadas con pulsos de luz de manera selectiva y estudiadas transitoriamente hasta que son destruidas por el haz de excitacin. Esta activacin se lleva a cabo mediante transformaciones fotoinducidas que llevan a los marcadores moleculares de una forma nofluorescente a una forma fluorescente cuya emisin es detectada. Una vez marcada la posicin de cada emisor, se reconstruye una imagen en forma de un mapa de localizacin que tiene una resolucin diez veces mejor a la obtenida por tcnicas convencionales. Este principio fue demostrado en 2006.

A partir de sus respectivas publicaciones, estas metodologas se han seguido desarrollando y han dado lugar a la invencin de una gran familia de tcnicas que siguen los mismos principios, y son denominadas colectivamente como microscopa de superresolucin (Allen et al., 2013). El rpido avance que se ha dado en esta rea ha ido a la par de una gran cantidad de estudios que han arrojado informacin sin precedentes sobre las estructuras de las clulas y su conformacin, as como las propiedades, funciones e interacciones de protenas in vivo.

Esta lnea de investigacin es altamente multidisciplinaria, donde grupos de investigacin incluyen tanto a fsicos como qumicos y bilogos, cada uno con diferente formacin y conocimiento y es una muestra de la importancia de la comunicacin entre diferentes reas de la ciencia.

ReferenciasAbbe, E., Beitrage zur theorie des mikroskops und der

mikroskopischen wahrnehmung, Arch Mikroskop Anat, 9, 413420, 1873.

Allen, J. R., Ross, S. T. y Davidson, M. W., Sample preparation for single molecule localization microscopy, Physi-chal Chemistry Chemical. Physics, 15, 1877118783, 2013.

Ash, E. A. y Nicholls, G., Superresolution Aperture Scanning Microscope, Nature 237(5357), 510512, 1972.

Betzig, E., George H. Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S.; Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., LippincottSchwartz, J. y Hess, H. F., Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution, Science, 313(5793), 16421645, 2006.

Hell, S. W. and Wichmann, J., Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulatedemissiondepletion fluorescence microscopy, Optics Letters, 19(11), 780782, 1994.

Koster A.J. y Klumperman J., Electron microscopy in cell biology: Integrating structure and function, Reviews Molec-ular Cell Biology, 4(Suppl), S6S10, 2003.

Nobel Prize in Chemistry. Laureates. Consultada en octubre 13, 2014, en la URL http://www.nobel.se/chemistry/laureates/index.html

Novotny, L. and Hecht, B., Principles of Nano-Optics. Nueva York, EUA: Cambridge University Press, 2006.