Arbuskulární mykorrhiza

Základní informaceEkologický význam

Metody studia

Nejčastější typy mykorhizMykorhiza Vzhled Vlastnosti Skupina hub Hostitelé

arbuskulární hyfální klubka a arbuskuly, vesikuly

zygomycety(řád Glomales)

cévnaté rostliny (asi 60% druhů krytosemenných)

ektomykorrhiza plášť kolem kořene a Hartigova síť

basidiomycetyale i askom a zygom

naho- a krytosemenné, často dřeviny, v boreálu

erikoidní hyfální klubka, septátní hyfy

askomycety, vzácněji basidiomycety Ericales

orchideová hyfální klubka, septátní hyfy basidiomycety Orchidaceae

Jak vypadá AM?

Struktura AM 1Externí hyfy

(80-90% DW)

Mimo kořen setvořící spóra

Auxiliary cells

Endofytickéstruktury

podle M. Brundretta

Struktura AM 2

Taxonomie (fylogenetická) AM hub

kmen Glomeromycota, dvě dosti nezávislé linie

Evoluce AM hub• Nejstarší typ mykorrhizy (450 miliónů let),

pravděpodobně umožnil osídlení souše• Kompletní závislost na hostiteli• Na první pohled: omezená speciace (~200), nízká

hostitelská specificita. Druhy jsou založené na morfologii spor.

• Jenže pojem druh je sporný: asexuální, mnohojaderné (i ve fázi spór - genetická diversita), možná výměna jader. Selekce může působit na úrovni populace jader.

Významné rody: Glomus

• Výrazné arbuskuly, postupně se zužující větvičky

• Vesikuly v mezibuněčných prostorách, často citrónkovité

• Nemají auxiliární buňky• Spóry se tvoří v kořenech nebo

mimo ně, často ve shlucích

Významné rody: Scutellospora• Podobný rod je Gigaspora,

v Evropě možná méně častý?• Arbuskuly - jemné členění

kolem kyjovité basální hyfy• Netvoří vesikuly v kořenech,

místo nich auxiliární buňky mimo kořen

• Spóry tvoří mimo kořen, výrazně větší než Glomus

• Často velmi členité, "špagetovitě" nahloučené hyfy

• Dobře se barví

Významné rody: Acaulospora• Arbuskuly často vyplňují celou

buňku (cihličky)• Často tvoří vesikuly

(vnitrobuněčné, proto obvykle nepravidelný tvar)

• Netvoří akcesorické buňky, ale spóry obvykle mimo kořen

• Některé druhy se málo barví, obtížné pro kvantifikaci

Významné houby: fine endophyte• Neznámé taxonomické postavení• Špatně se izoluje, takže se

o něm ví málo, ale je mnohdy velmi častý

• Tenké hyfy (1 μm), malé spóry• Obvykle v povrchovějších vrstvách• Někdy dělá arbuskuly podobné

rodu Glomus, jindy deštníčky• Nemá vesikuly (?), ale má ”laloky"

Ale různé druhy žijí pospolu...

podle J.B. Mortona (INVAM)vytříděné druhy (od levého dolního rohu):Acaulospora koskei, Scutellospora heterogama,Archeospora leptoticha, Glomus sp.

Význam AM symbiózy pro kytky• Příjem půdních zdrojů (zejména P, ale i Zn, Cu, N, voda) -

některé druhy si bez AM symbiózy nevystačí• Ochrana kořenů před patogeny (houby, bakterie) - též na

úrovni společenstva• Vliv na interakci s hostitelskými herbivory (i nad zemí) -

též přímá interakce se svými herbivory (Collembola, Nematoda) v rhizosféře

• Významný vliv na úspěch hostitelských druhů ve společenstvu: často ve prospěch podřazených druhů (i les)

• Common mycelial network – propojení mnoha rostlin• Vliv na morfologické a fyziologické vlastnosti hostitele:

kontrolované pokusy bez AM často měří artefakty

Ekologie symbiotického vztahu• Jednotlivé AM houby se liší v užitečnosti pro hostitele,

v rámci rostlinného společenstva se tato užitečnost liší i pro jednotlivé hostitelské druhy. Tak mohou být vyrovnávány kompetiční poměry mezi rostlinnými populacemi. Totéž platí i pro AM houby – ty se v konkurenci udržují díky efektivní symbióze s určitým hostitelským druhem.

• Hostitel dodává houbě zhruba 5-20% fixovaného C, ale nemusí to představovat zátěž: jednak se snížením limitace P může zvětšit fotosyntetická plocha, jednak může být fotosyntéza omezována spotřebou (sink-limited)

• AM symbióza může rostlině umožnit rychlejší přístupk organickému materiálu – přímý rozklad či jeho urychlení fragmentací organických částic

Základní metody výzkumu AM

• kvantifikace v kořenech hostitele: pozorovací (morfotypy)• kvantifikace spór v půdě• navození AM symbiózy v skleníkovém pokusu: inokulum• potlačení AM symbiózy v skleníkovém pokusu• omezení AM symbiózy v terénu• izolace houbových symbiontů z terénu• molekulární identifikace v kořenech (příp. spór)• kvantifikace půdního mycelia

Metody: kvantifikace v kořenech• Barvení v prostředí laktoglycerolu

– vyprání kořenů– rozpuštění buněčného obsahu (KOH)– případné odbarvení– okyselení (HCl)– barvení v laktoglycerolu: Chlorazol Black E, trypanová nebo

anilínová modř, i další (inkoust)– ”odbarvení” v laktoglycerolu bez barviva– (polo)trvalé preparáty

• Autofluorescence (zejména arbuskuly)• Imunofluorescence („druhově-specifické barvičky“)• Vitální barvení: sukcinát-dehydrogenáza• Kvantifikace: grid-line intersect method, problémy

Metody: kvantifikace spór• Izolace spór v sacharózovém gradientu:

– odstranění kamínků; (homogenizace v mixéru)– zvlhčení a přesátí (32/38 μm síto; případně druhé 500/710 μm)– centrifugace v sacharózovém roztoku– vypláchnutí, třídění, preparáty (Melzerovo činidlo)

• Nefunguje, je-li moc organického materiálu, pak jen vyplavit• Spóry vytvořené v terénu nejsou vždy dobrou charakteristikou

reálného "společenstva" => trap cultures– terénní materiál (půda, segmenty kořenů) zředit sterilním pískem– vysít hostitelské rostliny (kukuřice, čirok, jetel, jitrocel)– po ukončení rozvoje indukovat sporulaci– vypreparovat spóry - viz výše– nicméně i zde problémy

Metody: izolace AM symbiontů• Trap cultures => izolace a vytřídění spór => inokulace

Metody: izolace AM symbiontů• Trap cultures => izolace a vytřídění spór => inokulace• Opakovaná purifikace• Problém se zlenivěním kultur• Problém s "čistotou" spór:

Kvantifikace metodami molekulární biologie

• Většina studií založena na porovnání DNA sekvencíz různých částí genu kódujícího SSU pro rRNA (např. ITS)

• Nutné selektivní namnožení pomocí PCR, s použitím primerů specifických pro arbuskulární mykorrhizní houby nebo pro jednotlivé rody (čeledi)

• Místně vyladěné aplikace PCR (nested PCR) jsou zárukou úspěchu, proto je laboratoří s dobrými výsledky málo

• Zlepšuje se schopnost charakterizovat přítomné genotypy (semi)kvantitativně: rt-PCR, immunofluorescence

• Další metody: isoenzymy

Metody: navození AM symbiózy• Základem kvalitních pokusů jsou izoláty (inokulum) - pozor,

některé skupiny (Glomus, Acaulospora) na produkci spór moc nespoléhají

• Inokulum terénní, pokud nekontrolujeme identitu houby - může ale být problém s hostitelskou specificitou (optimálnost vztahu)

Metody: potlačení AM ve skleníku• Sterilní substrát (vyvařený písek)• Sterilizace půdy (gamma záření, teplo) - problém mrtvolek• Přefiltrovaný půdní extrakt, sítem 32 um (zkontrolovat!)• Selektivní fungicid - jen velmi nepřesně selektivní

Metody: omezení AM v terénu• Benomyl (komerčně: Benlate => Bavistin => Fundazol)• Potlačuje i vybrané skupiny patogenních hub• Problém se zajištěním proniknutí ke kořenům• Nutné opakovat každých 4 - 6 týdnů• Kombinace s přísunem živin, často P