Arafat Nassers Eksamensnoter
description
Transcript of Arafat Nassers Eksamensnoter
-
ARAFAT NASSERS EKSAMENSNOTER 2004 Noterne stammer fra Arafat Nasser og er fra 2004. De cirkulerer rundt p Farma og vi har fet dem fra Ayat Mohammed, forret 2008. NB: vi har ikke lst noterne igennem, s vi kan ikke st inde for rigtigheden, det ser dog rigtig pnt ud. Bemrk at kapitelnumrene og henvisninger, nppe er til den nuvrende lrebog. Husk at det altid er bedst, selv at arbejde med stoffet, f.eks. ved at lave dine egne noter, skemaer, o.l. Mvh Klaus B Andersen BROCK kap 4 Celle morfologi
Coccus = gformet/kugleformet bakterie
Stavbakterie = cylinder formet
Spirilla = stavbakterie som er spiral formet
Spirochete = tt snoede bakterie
Appendaged bakterie = bakterie hvis celle er forlnget med lange rr
Filament bakterie = lange tynde celler eller kder af celler.
Cocci og stav bakterier findes ogs som lange kder.
Microbial cellers strrelse
Prokaryotiske celler er meget mindre end eukaryotiske celler. Prokaryot cellers mindre strrelse har en hvis
effekt p deres biologiske egenskaber.
Cellers fysiske egenskaber ges jo mindre cellen er. Her er tale om get vkst hastighed, mere effektiv
udveksling af nringsstoffer med omgivelserne mm.
Nanobakterie = Man mener at der findes meget sm bakterier i naturen, og disse kaldes nanobakterier. Hvis
disse celler findes, s vil de vre de mindste nogensinde.
-------------------------- 0 -------------------------
-
Celle membran og celle vg Cytoplasmisk membran struktur
Cytoplasmisk membran er en tynd struktur som fuldstndig omringer cellen. Den separere cellens indre fra
dets milj.
Membraners kemiske opbygning
Membraners generelle struktur er en phospholipid bilayer.
Phospholipid = indeholder en hydrofobisk del (fedtsyre) og en hydrofilisk del (glycerol).
Nr phosholipider samler sig i en vandig oplsning, s danner de en bilayer struktur hvor fedtsyrerne vender
indad mod hinanden, mens glycerol forbliver i den vandige ydre milj.
Sterol og Hopanoid
Sterol ses i eukaryotiske cellers membran, og dens funktion er at stabilisere membranens struktur og gr den
mindre flexibelt.
Hopanoid (findes i nogle prokaryotiske membraner) har samme funktion som sterol og ses i mange
bakteriers membran. Den mest kendte er C30 hopanoid diploptene.
Hopanoid er ikke fundet i Archaea arter.
Archaeal membraner
Lipider i Archaea har ether linkage mellem glycerol og deres hydrofobiske side kder. Archaeal lipider
mangler fedtsyre, men istedet har de sidekder som bestr af flere isoprene enheder.
De mest kendte er glycerol diether og glycerol tetraether:
Det ses i tetraether molekylet at phytanyl sidekden fra hver glycerol molekyle er kovalent bundet. Dette vil
give en lipid monolayer istedet for bilayer:
Cytoplasmisk membran: funktion
Membranen fungere frst og fremmest som en permeabilitets barrier, dvs. forhindre cytoplasmisk
bestanddele i at trde ind /ud af cellen. Membran kan via proteiner(hvor nogle er enzymer) fungere som
portbner for transport af substanser ind eller ud af cellen.
Den cytoplasmiske membran fungerer ogs som cellens energi vedligeholder/kilde. Her findes membranen
som en energisk ladet form hvor protonerne er separeret fra hydroxyl ionerne.
Membranen er en meget tt barrier, hvilket skyldes dens hydrofobiske natur. Dette gr at hydrofiliske og
ladet molekyler ikke kan passere igennem membranen.
En molekyle der kan trnge gennem membranen er vand, som er tilstrkkelige lille til at passere
phospholipid molekylerne.
Aquaporiner = transport proteiner som accelere vands transport gennem membranen. Disse proteiner
indeholder membran omspndte kanaler som transportere vand ind eller ud af cytoplasma.
-
Membran transport systemer
Der findes tre klasser af membran-transport systemmer
1. Simple transport
2. Gruppe transport
3. ABC systemmet
Disse systemmer er alle energi afhngige.
Der findes 3 former for transport begivenheder:
Uniporter = proteiner som transportere en molekyle i en enkelt retning igennem membranen.
Symporter = proteiner som transportere substancer med andre substancer, mest normal H+.
Antiporter = proteiner som transportere substancer gennem membranen i en retning mens den p samme tid
transportere en anden substance i modsat retning.
Simpel transportr
Fig. 4,25 side 72 illustrere nogle simple transportrer.
Som eksempel ser vi p Lac Permease som er en symporter som transportere Lactose ind i E.coli celler
sammen med protoner.
Resultatet af denne simple transport system er ophobning af substans til hje koncentrationer som senere kan
metaboliseres til Energi.
Gruppe transport
Gruppe transport er en transport process hvor den transporterede substance er kemisk forandret under
passagen gennem membranen.
Den mest kendte gruppe transport system er phosphotransferase systemet. Fig. 4,26 side 73 illustrere
mekanismen.
Fr sukker transporteres gennem membranen, s sker der en phosphorylering og dephosphorylering af
proteinerne i phosphotransferase systemet. Nr ENZ IIc, som er lokaliseret i membranen, er phosphoryleret,
s phosphoryleres sukkeret og transporteres ind i cellen..
Den hje energi phosphat binding som levere energi til phosphotransferase systemet kommer fra PEP.
ABC systemet
ABC = ATP binding cassette
Periplasm = omrdet mellem den cytoplasmiske membran og en lipid rig ydre membran lag (i gram
negative bakteria)
-
Periplasmisk binding protein = proteiner i periplasm som bidrager til transport af substanser ind til cellen.
Fig. 4.27 side 73 illustrere ABC systemet.
Denne transport system indeholder 3 komponenter.
1. Periplasmisk binding protein
2. membran bner transportr
3. komponent som levere den ndvendige energi via ATP hydrolyse.
Det interessante i ABC systemet er at den periplasmiske binding protein har en hj substrat affinitet.
Proteinerne er mobile og binder sig til substrater uanset koncentrationen. Dvs. lige s snart substrat er bundet
til proteinet, s transporteres denne til membran bner komponentet og videre til den aktuelle transport del,
som drives af ATP hydrolyse.
Selvom gram positive bakterier mangler periplasm, s findes der ogs her binding protein afhngige
transport systemer. Her er specifikke proteiner ikke mobile, men istedet bundet til membranen.
Prokaryoters celle vg
Celle vg giver ikke kun cellen form og stivhed, men den modarbejder ogs turgortrykket.
Fig. 4,28 side 75 illustrerer forskellen p gram negative og gram positive bakteriers celle vg.
Peptidoglycan
Peptidoglycan = Celle vggens stive lag. En tynd flade bygget af N Acetylglucosamin, N acetylmuram
syre og nogle f amino syrer. Peptidoglycan kaldes ogs for murein.
Glycan tetrapeptid = Strukturen som indeholder bestanddelene N Acetylglucosamin, N acetylmuram
syre og aminosyrer, dette er illustrere i fig. 4.30 side 76.
Disse Glycan kder er bundet til hinanden via en peptid kryds-binding dannet af aminosyrer, hvilket er den
basiske struktur af peptidoglycan.
Glycosid bindingen mellem sukker i glycan kden er meget strk, men uden peptid kryds-binding s har
peptidoglycan ikke sin fulde styrke.
Fig. 4.31 side 76 illustrere kryds-bindingen i gram negative og gram positive bakterier.
I gram negative bakterier findes krydsbindingen direkte mellem DAPs amino gruppe og D-Alanins
carboxyl gruppe.
I gram positive bakterier sker krydsbindingen typisk via peptid mellem bro. F.eks. i staphylococcus aureus,
der er hver peptid mellem bro 5 molekyler aminosyrer (glycin).
-
Variation i peptidoglycan
Peptidoglycan ses kun i bakterier, dette skyldes at Archaea og Eukarya mangler N-Acetylmuram syre og
amino syren DAP (diaminopimeli syre).
DAP findes i alle gram negative bakterier og i nogle gram positive.
De fleste gram positive coccer har aminosyren Lysin istedet.
Teichoic acid
Gram negative bakteriers ydre membran
Gram negative bakterier indeholder en extra ydre lag bygget af lipopolysaccharider. Denne anden lipid
bilayer indeholder polysaccharid og protein.
Fig. 4.35 side 79 illustrere strukturen af lipopolysaccharid.
Det ses at polysacchariden er delt i to; 1) O polysaccharid og 2) den inderste polysaccharid.
Den inderste polysaccharid = indeholder ketodeoxyoctonat (KDO), syv - carbon sukker (Heptose), glucose,
galactose og N acetylglucosamin.
O polysaccaharid = denne er bundet til den inderste og indeholder normalt galactose, glucose, rhamnose
og mannose, svel som en eller flere dideoxy sukker ssom abequose, colitose, paratose eller tyvelose.
Lipid A = lipid delen af LPS. Dette er ikke en glycerol lipid men istedet er fedt syre bundet via ester amin
binding til en dissacharid, som er opbygget af N acetylglucosamin phosphat.
Porin og periplasmaet
Porin = Proteiner som findes p den ydre membran af gram negative bakterier. Den fungere som en kanal
for indgang og udgang af hydrofiliske lav-molekylrvgt substanser.
Poriner er transmembran proteiner og forbindes for herved at danne sm membran huller. Dvs den ydre
membran bliver gennemtrngelig for sm molekyler. Dette glder ikke enzymer og store molekyler, dvs.
den ydre membrans funktion er ogs at srge for at enzymer ikke diffundere vk fra cellen.
De ovennvnte enzymer findes i periplasmaet, som er lokaliseret mellem den cytoplasmiske membrans ydre
overflade og LPS indeholdende ydre membrans indre overflade.(se Fig. 4.37 s. 81).
Periplasmaet indeholder forskellige proteiner som er involveret i vigtige cellulr funktioner.
Gram farvening
-
Nr der sker en gram farvening s dannes et uoplseligt krystal violet-iodin koplex inden i cellen. Dette
komplex bliver fjernet i gram negative bakteria, pga. alkoholen trnger ind gennem den lipid rige ydre lag
(for herved at trykke komplexet ud) og peptidoglycan laget forhindre heller ikke solvent passage.
Gram positive bakterier som jo indeholder en tyk lag peptidoglycan vg bliver dehydreret af alkoholen.
Dette gr at pore i vggene lukker, og forhindre hermed at komplexet fjernes.
BROCK Kap 8
Overblik over regulering Regulerings metoder
Der findes to vigtige regulerings metoder i cellen.
1. regulering af enzym aktivitet - dette finder sted efter proteindannelse
- det er en hurtig proces
2. regulering af enzym syntese - kan finde sted ved translation eller transskription
- Translation = om mRNA oversttes til protein?
- Transskription = Hvor meget mRNA der dannes
- Processen er meget langsom
Se fig. 8,1 side 208
-------------------- 0 -------------------- Regulering af enzym aktivitet Enzym aktivitet hmning
Feedback hmning:
Feedback hmning ses nr en hel biosyntese vej reguleres. Produktet i en biosyntese vej kan feed backe til
frste trin og hermed regulere dets egen biosyntese. Dette sker ved at hmme aktiviteten af det frste enzym
i syntese vejen. Hvordan kan slut produktet hmme et enzyms aktivitet?
Dette skyldes en egenskab hos det hmmede enzym kaldet allosteri. Et allosterisk enzym har to vigtige
bindings sider.
1. aktiv side, hvor substratet bindes
2. allosterisk side, hvor hmmeren/effektoren bindes(reversibelt).
Det der sker nr en effekter bindes til enzymets allosteriske side (noncovalent), er at enzymets konformation
ndres sledes at substratet ikke lngere kan binde effektivt til den aktive side. Se fig. 8,3 side 209
-
Nogle biosyntese veje reguleres ved at benytte isozymer. Disse enzymer katalysere den samme reaktion men
er subjekter til forskellig regulatorisk kontrol. Eksempel p isozymer er illustreret i fig. 8,5 side 210.
-------------------- 0 --------------------
Regulering af transskription: negativ og positiv kontrol For at transskription skal fungere, s skal RNA polymerase genkende en specifik promoter p DNAet.
Regulering af transskription involvere derfor proteiner (kaldet regulatoriske proteiner) som kan binde til
DNA.
DNA binding proteiner
Regulering af transkritiption sker indirekte ved at proteiner, kaldet regulatorisk proteiner, binder til
specifikke sider af DNA.
Interaktion af proteiner med nuklear syre
Der findes to former for interaktion:
- ikke-specifik, binder hvor som helst
- specifik, dvs. orden-specifik
Histoner: ex. p protein som binder uspecifikt med DNA. Histoner er sm proteiner med hjt indhold af
positive ladet amino syre, og da DNA har en stor mngde negativ ladet phosphat grupper p ydersiden
binder Histoner sig uspecifikt til DNAet. Nr DNA er dkket af histoner s vil andre proteiner som RNA
polymerase ikke kunne binde sig og transskriptionen finder ikke sted.
DNA binding proteiners struktur
DNA bindings proteiner indeholder protein substrukturer som binder til proteinerne til DNA. Her vil
flgende 3 blive beskrevet:
- helix-turn-helix: Denne indeholder et stykke aminosyrer som danner et -helix sekundr
struktur (ogs kaldet genkendelses helix). Denne del er forbundet med et kort stykke af 3
aminosyrer, som har den funktion at dreje proteinet (turn). Den anden side af turn er
forbundet med en anden helix, som stabiliserer den frste. Se fig. 8,8 side 214.
- Zink finger: denne findes hyppigt i eukarotisk regulatoriske proteiner som binder til DNA.
Zink finger er en protein substruktur som binder til en zink ion, og det er denne del som
danner -helix og hermed genkendelses helix. Se fig. 8,9a side 214.
- Leucin lynls: leucine lynls reagerer ikke selv med DNA, men den benyttes til at holde
to andre -helixer i den korrekte position til binding med DNA. Se fig. 8,9b.
-
Negativ kontrol af transskription
Enzym Repression (undertrykkelse)
Corepressor = substans som repressere produktion af enzym
Enzymer som katalyserer syntesen af et specifik produkt, er ikke syntetiserede hvis produktet findes i mediet.
Dvs. ydre produkt repressere syntesen af enzymer. Dette er illustreret i fig. 8,10 side 215, her er Arginin
brugt som eksempel.
Her ses at hvis arginin tilsttes s vil vkst fortstte med samme hastighed, men enzym dannelsen stopper.
Dette er en specifik effekt, idet at syntesen af andre enzymer i cellen vil fortstte.
Mekanismen:
Denne er illustreret i fig. 8,12 side 216.
Enzym syntesen falder nr mRNA produktionen stoppes. Hvordan sker dette?
Corepressoren binder til et specifikt repressor protein. Og da repressor proteinet er et allosterisk protein s
forandres konformationen. Denne forandret repressor protein kan s binde til et spefikt omrde p DNAet
nr genets promoter (operator omrdet). Nr dette sker s blokeres syntesen af mRNA fordi at RNA
polymerase kan hverken binde eller fortstte. Og dette medfre at proteiner specificeret af denne mRNA
ikke kan syntetiseres.
Enzym induktion
Inducer = substans som starter enzym induktion
Enzym induktion er det omvendte af enzym repression, dvs. enzym syntetiseres nr der er substrat tilstede.
Dette er illustreret med -galactosidase i fig. 8,11 side 216. Nr laktose tilsttes s begynder syntesen af
enzymet.
Mekanismen:
Denne er illustreret i fig. 8,13 side 217.
Her ses at mRNA syntesen er blokeret af en repressor. Men nr inducer tilsttes s binder det til repressoren
og inaktivere det. Hermed dannes mRNA og enzym syntesen finder sted.
Alle systemer som involvere en repressor har den samme mekanisme, nemlig hmning af mRNA syntesen
med en specifik repressor protein som selv er under kontrol af et lille specifikt molekyle inducer eller
repressor. Og da repressorens rolle er at hmme, s vil regulering som involvere repressor nvnes som
negativ kontrol.
Effekter = corepressor og inducer, som altid er sm molekyler
-
Nogle gange kan analoger til inducer og corepressor have effekt p enzym syntesen. Fx.
Isopropylthiogalactosidase (IPTG), er en inducer af -galactosidase.
Positiv kontrol af transskription
Positiv kontrol = en regulatorisk protein fremmer binding af RNA polymerase, for herved at ge mRNA
syntesen.
Maltose regulon
Enzymer for udnyttelsen af sukkeret maltose i E. Coli syntetiseres kun hvis maltose er tilstede.
Syntesen af enzymerne er styret ved transskriptionen, men her af en aktivator. Maltose aktivator protein
binder ikke til DNA medmindre proteinet er bundet med maltose, effektoren. Nr aktivator proteinet binder
til DNA s begynder transskriptionen. Se fig. 8,14 side 217.
Aktivator binder specifikt til et omrde p DNA og dette omrde kaldes her for aktivator binding side.
Nogle aktivator proteiner interaktere med RNA polymerase, enten tt ved promoter eller flere hundred base
par vk fra promoter. Se fig. 8.16 side 218.
Regulon = nr mere end en operon er under primr kontrol af samme regulatoriske protein.
Global kontrol og lac operon
Global kontrol systemer = regulatorisk system som reagerer p miljbestemte signaler.
Katabolit repression = global kontrol, som srger for at cellerne benytter den bedste carbon kilde fr
enzymer induceres for laktose eller maltose.
Figuren side 219 viser kurven nr 2 carbon kilder benyttes samme tid. Der sker en diauxic growth. Cellerne
vokser bedst p glukose og derfor hmmes syntesen af -galaktosidase. Nr glukosen er opbrugt s starter
enzym dannelsen og hermed laktose udnyttelse. Men der skal lige siges at der ses et lag fase fr vksten
fortstter p laktose.
Katabolit repression involverer kontrol af transskription via en aktivator protein. RNA polymerase binder til
DNA via catabolit activator protein (CAP). CAP binder kun til DNA hvis den frst er bundet til cAMP. Nr
glukose transporteres ind til cellen s vil cAMP koncentrationen falde og RNA polymerase binding til
promotor finder ikke sted.
To krav til at transskription i lac operon kan finde sted (genetisk elementer i lac operon se side 220):
1. cAMP koncentration skal vre hj nok til at CAP protein binder til CAP bindings side (positiv
kontrol).
2. der skal vre en inducer s som laktose s at laktose repressor ikke blokerer transskriptionen ved at
binde til operator (negativ kontrol)
-
BROCK Kap om bakterie genetik
Mutation og rekombination Mutationer og mutanter
Mutation = arvelig ndring i base sekvensen af nukleinsyrer genomet af en organisme.
Mutant = en stamme som brer ndring i base sekvensen.
En mutant er per definition forskellig fra fader stammen i genotypen (den prcise genetiske udseende af en
organisme).
Mutant fnotype = ndring i fnotypen, dvs. de observerable karakteristika af en organisme.
Vild type stamme = stammer isolerede fra naturen.
Genotypen af en organisme angives med 3 sm bogstaver efterfulgt af et stort bogstav, som f.eks. E.coli
genet hisC. Mutationer af hisC vil angives som hisC1, hisC2 etc. afhngig af rkkeflgen af isoleringen.
En organismes fnotype angives med + eller -. His+ f.eks. fortller at stammen har evnen til selv at
fremstille histidin, mens His- ikke kan.
Mutationer kan vre selectable eller nonselectabel.
nonselectable mutanter kan findes ved screening, som er en metode hvor man eksaminerer en rkke
kolonier og kigger efter dem som er anderledes. Eksempel er tab af farve i pigmenteret organismer, se. s.
266.
selectable???
Replika udpladning = teknik hvor man kan detekterer nringsmutanter. Teknikken er illustreret p side
268.
Auxotrof = en organisme som har opbygget en nrings krav gennem mutation.
Prototrof = vild-type faderen hvori auxotrofen blev dannet.
Penicillin-selektions metode = mutanter der krver vkstfaktor har en drligere fordel end den arvede
celle. Penicillin drber kun voksende celler, dvs. hvis penicillin tilsttes en population som vokser i et
medie som mangler mutantens vkstfaktor, s vil arvelige celler d, men de ikke voksende mutanter er
uberrte. Denne metode kaldes negativ selektion da den selektionen ikke er for mutanter men mod de
arvelige typer. Se. side 267 fig. 10.1a.
Typer mutanter og hvordan de detekteres se tabel 10.1 side 269.
Molekylr basis af mutationer
Spontane mutationer = finder sted pga. naturlig radiation som ndrer strukturen af baser i DNA et.
-
Punkt mutationer = mutationer der involverer en eller meget f base par. Mutationen resulterer i insertion
eller slettelse af base par. Se senere.
Hvis et punkt mutation finder sted, s vil enhver ndring i fnotypen vre resultat af ndring i aminosyrer
sekvensen af proteinet der nskes dannet. Fig. 10.3 s. 269 viser eksempler p base par substitutioner.
Figuren viser almindelig replikation og tre mutationer:
1. silent mutation = mutationen som stadig giver normal protein, f.eks. er UAU ogs en tyrosin codon.
2. nonsense mutation = her dannes et stop codon som resulterer i at der sker en forhastet translation,
som giver en ikke komplet protein som hjt sandsynligt ikke vil fungerer.
3. missense mutation = ndringen fra UAC til AAC giver asparagin i stedet for tyrosin. Kaldes
missense fordi at aminosyrer sekvensen er ndret.
Missense mutationer kan frer til enzymer der er temperatur-sensitive. Temperatur sensitive
mutanter gr at bakterier f.eks. ikke kan vokse ved de hje temperaturer, pga. mutant proteiner bliver
denatureret ved hj temperatur.
Enhver slettelse eller insertion af base-par resulterer i en lseramme skift (reading frame shift), og
translationen af genet er helt forstyrret, dette er illustreret p side 270 fig. 10.4. Frameshift mutationer finder
kun sted ved den del af protein-indkodet gen som inkluderer lserammen. Dvs. enkelte base-par indsttelser
i promoter gen er ikke frameshift mutation.
Genoprettelse af vild-type fnotypen efter mutation kan finde sted ved revertant. Revertant kan deles i to
typer:
1. samme side revertants = mutationen som skal genoprette aktiviteten finder sted p samme side
som den originale mutation.
2. anden side revertant = mutation finder sted et andet sted p DNA. En sdan mutation er
suppressor mutation, som erstatter den originale mutations effekt. Der er forskellige typer
supprerssor mutationer:
a) mutation et sted p samme gen kan genoprette enzym funktionen, ssom frameshift
mutation.
b) Mutation i et andet gen kan genoprette funktionen af det originale muterede gen og vild type
fnotypen.
c) Mutation i et andet gen som danner et nyt enzym som kan erstatte det muterede ved at
introducerer en anderledes metabolisk vej end den brugt for mutant enzymet.
Slettelser af DNA dele, der involverer hundred eller tusinder base par, er kendt. Sdanne slettelser kan ikke
genoprettes ved videre mutationer, men ved genetisk rekombination, se senere.
Mutagenesis
Mutagener = midler som inducerer mutation.
-
Der findes kemiske mutagener, radiation, ioniserede radiation mm. Til dette afsnit henvises til bogen siderne
271-275.
Ames test
Denne test er en mutagenisitets test for carcinogener (midler der forrsager cancer). I Ames test der vil en
produktion af enzymer fra rotte lever bruges til at danne et aktivt kompleks. Dette kompleks bliver s taget
op p et filter-papir, som s placeres i midten af en plade som er belagt med bakterie stamme. Efter 24 timers
inkubation s vil man kunne observerer et net af back mutations i omrdet rundt om papir skiven. Se. side
276.
Genetisk rekombination
Mekanismen for denne er vist p side 277 figur 10.9. Den starter med at endonuklease laver et hak i et af
DNA molekylerne. Det hakket streng fjernes fra den anden streng og s binder SSB proteiner (single-
stranded binding) til den single strenget segment. Der sker s en streng invasion som skyldes RecA proteinet.
RecA binder til den enkelte streng fragment for at danne et kompleks der lettere gldningen med en
supplerende sekvens i den modsatte dupleks og flytter hermed den indbyggede streng. Der sker hermed en
parring hvor udveksling af homolog DNA molekyler finder sted. Denne udveksling frer til dannelsen af
rekombinations intermediater der indeholder heteroduplex omrde, hvor hver streng stammer fra forskellige
kromosomer. Til sidst skilles de linkede molekyler via nukleaser og DNA ligaser for at danne to rekombinant
molekyler.
Rekombinations mekanismen hos prokaryoter involverer DNA overfrelser via processerne transformation,
transduktion og konjugation, se senere.
-------------------------0-------------------------
Bakteriel Genetik: In vivo Processer hvor bakterier kan udveksle genetisk materiale:
1. Transformation = involverer donor DNA fri i miljet.
2. tranduktion = donor DNA overfrelse er formidlet af en virus og
3. Konjugation = overfrelse involverer celle-til-celle kontakt og en konjugativ plasmid i donor cellen.
Disse er sammenfattet p fig. 10.11 side 279, men bliver beskrevet nedenstende.
Transformationen er illustreret p side 282 fig.10.13. For at en celle skal kunne optage DNA og
transformeres s skal den vre kompetent. Sdanne celler kan have kompetens specifikke proteiner,
bindingsproteiner der sidder p membranen, celle vg autolysin og forskellige nukleaser.
Hvordan optages disse DNA s? Det varierer lidt mellem stammerne, men en ting glder for dem alle og det
er at, ds DNA binder mere effektivt til cellen. DNA et der skal transformeres er bundet til DNA bindings
-
proteiner p celle overfladen. Det er enten hele DNA der optages eller ogs degraderes en streng af nuklease
og kun en optages.
Det optaget DNA associeres med kompetens-specifikke proteiner som skal beskytte DNA mod nuklease
angreb. RecA proteinet overtager og integrerer DNA ind i modtager genomet via rekombination. Der dannes
s en arvelig DNA molekyle og en rekombinant.
Transfektion = DNA transformation fra bakteriel virus. Hvis DNA kommer fra lytisk bakteriofag s frer
transfektion til normal virus produktion og kan bestemmes via en standard fag plaque assay.
Kunstig kompetence forgelse: Man har fundet ud af at E.coli kan behandles med hj koncentration af
calcium ioner og s opbevares i kulde, og hermed fs transformable E.coli.
En anden teknik er elektroporation hvor cellen udsttes for elektrisk felt for at bne sm porte i
membranen. DNA molekyler kan hermed trde ind i cellen. Elektroporation kan ogs overfrer et plasmid
direkte fra en celle til en anden hvis de begge er tilstede under elektroporation.
Transduktion er delt ind i to. Der er de generelle, hvor vrt DNA kommer fra hvilket som helst del af vrt
genomet, og de specielle, hvor et specifikt omrde p genomet integreres direkte i virus genomet.
Transducerende virus partikler er defekte som virus.
Plasmider
Plasmider = Plasmider er genetiske elementer der replicere uafhngig af vrt kromosomet.
Plasmider har ikke en ekstracellulr form, men findes i cellens som en simpel nukleinsyre.
Plasmiders fysiske natur
De fleste plasmider er ds DNA og cirkulrer, men der findes ogs linere plasmider. Isolering af plasmid
DNA sker ved at benytte sig af Supercoiled konfiguration, se senere.
Replikation af plasmider
Copy number = antal plasmid molekyler per celle. Copy number kontrolleres af plasmid gener og
interaktioner mellem vrt og plasmid.
Plasmider i Gram-negative bakterier replicere p samme mde som den beskrevet for kromosomer, se
sektion 7.6.
Plasmider i Gram-positive bakterier replicere ved en Rolling circle mekanisme som den for fagen X174,
se sektion 16.2.
-
Individuelle bakterier kan indeholde forskellige typer plasmider. Replikation af to forskellige plasmider i
samme celle er styret af plasmid gener involverede i regulering af DNA replikation.
BROCK kap 10, (nste side)
-
In vitro teknikker af bakteriel genetik Forml Strategi Trin 1 Trin 2 Trin 3 Trin 4 Trin 5 Molekulr kloning
Isolerer store mngder specifikke gener eller kromosomale fragmenter i ren form.
Fjerner det nsket gen eller omrde fra et stort komplekst genom til en lille simpel en.
Isolering og fragmen-tation af DNA kilden. F.eks. ved restriktion af DNA.
Forbinder fragmenterne med en kloning vektor via DNA ligase. Der sker hermed en in vitro rekombination hvor der produceres hybrid DNA molekyle
Introduktion og vedligeholdelse. Introduktion kan ske ved transformation. Overfrelsen af DNA til vrt giver normalt blanding af kloner, nogle indeholder de nsket andre kloner opstet fra rekombination af DNA til vektor. Denne blanding kaldes DNA bibliotek.
Plasmid pBR322
At identificerer bakterielle celler
Indstter et fremmede DNA ved et af resistens omrderne. Herved mistes resistensen = insertional inactivation
BamHI skrer det fremmede DNA og Tetracyklin resistens delen.
Det fremmede DNA indsttes via DNA ligase og antibiotika resistensen mistes. Fig. 10.42 s.309
Bakteriofag Lambda1
At benytte Lamda som klonings vektor, idet den kan indeholde strre mngder DNA end plasmider.
At pakke rekombineret DNA in vitro for herved at overfrer det host celle
Isolering af vektor DNA fra fag partikler og digestion med restriktions enzym
Samling af de to lambda fragmenter med fremmede DNA fragment via DNA ligase
Pakning af DNA ved at tilstte ekstrakter indeholdende hoved og hale proteiner og hermed dannelse af fag partikel.
Infektion af E.coli og isolering af fag kloner ved at vlge plaques p vrts stammen.
Tjekke rekombinafor tilstedevrelsensket fremmede Dsekvens ved at brunukleinsyrer hybriprocedure. Se fig. s.311
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Udvider DNA molekyler. Hermed fs store mngder specifikke gener til kloning, sequencing eller mutagenesis.
Polymerase chain reaction, hvor DNA polymerase kopier DNA molekyler.
To oligonukleotide primers dannes og tilsttes med stor overskud til varme-denatureret target DNA
Mens blandingen kler ned s sikre overskud af primers at DNA strengene ikke sammenkobles igen.
DNA polymerase udvider nu primers ved at bruge target strengene som skabelon.
Efter inkubation varmes blandingen igen for at separerer strengene. Blandingen kles ned for at primers hybridiserer med de nye syntetiseret DNA, og hele processen gentages. Se. fig.10.45 s. 312
1 Meget store DNA fragmenter kan ikke klones. Derfor kan Cosmider benyttes. Disse er plasmider vektorer indeholdende fremmede DNA og kun cos (cohesiv sider) af lambda genomet. Cos sider krves for at pakke DNA inden i lambda virioner. Se. mere side 311.
-
BROCK Kap 16
Eukaryote viruser Positiv-strenget RNA viruser (Dyr)
Picornavirus familie = en meget vigtig positiv-strenget RNA dyr virus, som indeholder viruser der rammer
mennesker, ssom hepatitis A virus og polioviruser.
Fig. 16,12 side 532 viser poliovirusen og dens multiplikation. Det ses at poliovirus har en liner RNA
molekyle, hvor der ved 5 er et protein kaldet VPg protein, og ved 3 en poly-A hale.
RNAet kan bruges direkte som mRNA, hvor den oversttes til en polyprotein som senere brydes til
individuelle proteiner. Hele replikations processen sker i cytoplasmaet.
Side 533 frste spalte, der er Poliovirus cyklusen beskrevet kort.
Replikation af poliovirus
Replikationen af viral RNA finder sted kort efter infektionen og er katalyserede af RNA-afhngig RNA
polymerase (replicase).
Replikasen transskribere det virale RNA, med plus komplementaritet, til RNA molekyle, med negativ
komplementaritet. Denne negative RNA virker s som skabelon for gentagende transskription af
efterkommere (progeny) plus strenge.
Negativ-strenget RNA viruser (Dyr)
Negativ strenget RNA viruser kan ikke benyttes direkte som mRNA, som nvnt tidligere i kapitel 9, om
generel virologi.
To vigtige negativ-strenget RNA viruser er Rhabdoviruser og orthomyxoviruser.
Rhabdoviruser
Hundegalskab viruser er rhabdoviruser. Rhabdoviruser er enveloped viruser, med en stor og kompleks
lipid envelope som omringer nukleocapsiden. Illustreret p figur 16,13 side 534.
Virionet indeholder forskellige enzymer som er ndvendig for infektionsprocessen. F.eks. RNA-afhngig
RNA polymerase. Dette enzym er ndvendigt idet at negativ-strenget virus genom ikke kan fungere direkte
som mRNA, men frst skal transskriberes til plus komplement, og vrt enzymer som transskribere RNA til
RNA findes ikke.
Transskription finder sted i cytoplasmaet, og RNAet kan transskriberes til to forskellige RNA. Se fig. 16,14
side 534. Her ses at i den frste type, der dannes en rkke mRNA. Den anden er en plus RNA som er en
-
prcis kopi af det virale genom. Den kan s bruges til at danne negativ-strenget RNA molekyler som virker
genomer af efterkommer virioner.
Translation af viral mRNA frer til dannelse af viral coat proteiner. Der findes to former for coat proteiner:
nukleocapsid proteiner og enveloped proteiner. Nukleocapsid proteiner dannes frst for at dkke det virale
RNA.
Enveloped proteiner dannes p ribosom komplekser som selv er bundet til membraner. Under dannelse af
disse proteiner adderes sukker rester, som frer til dannelse af GLUCOPROTEINER. Disse proteiner
transporteres til det cytoplasmatiske membran hvor de erstatter vrt proteiner. Nukleocapsiden migrere til
dette omrde og genkender disse virus-specifikke glucoproteiner. Nukleocapsiden bliver herefter omringet af
glucoproteiner og slut resultatet er hermed en enveloped virion med nukleocapsid i midten.
Vrten delgges ikke under ovenstende proces og udskillelse af virioner p denne mde kan ske igen og
igen.
Orthomyxoviruser (influenza virus)
Orthomyxoviruser er ogs meget vigtige, en sdan virus er influenza virus.
Udtrykket myxo = betyder at viruset interakterer med mucus (slim) p celle overfladen.
Udtrykket ortho = er for at genkende forskel mellem den og paramyxovirus gruppen.
Orthomyxoviruser er enveloped viruser hvor det virale RNA er prsenteret i virionet i et antal separeret
dele. Genomet siges at vre segmentet.
Fig. 16.15 side 535 illustrerer influenza virion strukturen. Influenza virus siges at vre polymorfisk, idet den
ikke har et defineret form nr den forlader cellen.
Som det ses p figuren s er der mange pigge p membranen der omringer nukleocapsiden. En af disse er
Hemagglutinin. Hemaglutinin forrsager agglutination af rde blod celler. Blod celler er ikke vrt celler som
viruser normalt inficere men den indeholder, p overfladen, sial syre, som mucous membran celler i
luftvejene indeholder. Blodceller bestemmer kun agglutination aktiviteten.
Influenza virus hemagglutinin kan neutralisere virusen via antistoffer, og det sdan at immunitet til influenza
finder sted.
En anden af piggene er neuraminidase, som nedbryder sial syrer komponenten. Neuraminidase fungere ved
virus samlings processen, ved at delgge vrt membran sial syrer som ellers ville have blokerede samling
eller blive optaget i den modne virus partikel.
Influenza virus cyklus er beskrevet p side 535 nederst.
Virus RNA syntesen ligner den for Rhabdoviruser.
-
Antigen shift = fnomen hvor dele af RNA genomet fra to genetisk forskellige strenge som har inficeret
samme celle bliver genblandet. Dette resultere i ndring af overflade antigener af viruset, og gr hermed
virus resistent mod antistofferne som er dannet af immunsystemet. Dvs. ny dannet virus kan inficere vrts
celler selvom fader viruset ikke kunne.
Replikation af ds-DNA viruser (Dyr)
Dette afsnit omhandler virus familien polyomaviruser, og man ser p SV40 som str for simian virus 40
isoleret fra en abe. Det skal lige siges at denne virus inducerer tumors i dyr.
Jeg henviser hermed til side 537-539. her bliver den genetiske mappe beskrevet og hvordan celle
transformation via DNA tumor virus finder sted.
BROCK Kap 20 Mikrobiel kontrol bestemmelser inkluderer decontamination, desinfektion og sterilisering.
Fysisk antimikrobiel kontrol Varm sterilisering
Kinetik
Hje temperatur mikroorganismer mister deres struktur og evne til at fungere, en proces kaldet
denaturering.
Fig. 20.1 side 697. her ses at mikroorganismerne dr eksponentielt (frste ordens) nr der varmes. Det ses
ogs at jo lavere temperaturen er des lngere tid tager det at drbe bakterierne.
Decemeringstid = den tid det tager at reducere populationen 10 fold. Symbol; D.
Ved at plotte log D mod temp., s ses en ret linje (fig.20.2 side 697). Hldningen af denne rette linje
fortller os om mikroorganismens flsomhed overfor varme.
Termisk dds tid / termal death time = den tid det tager at drbe alle celler ved en given temperatur.
Denne er afhngig af mikroorganismernes populations strrelse. Jo strre populationen er jo lngere tid
tager det at drbe alle celler. Dette er en anden mde at bestemme organismers varme flsomhed.
Ovenstende udfres ved at varme en celle suspension prve ved forskellige tider, blande den opvarmede
suspension med kultur medie og inkubere. Hvis alle celler er blevet drbt, s vil vi ikke kunne observerer
vkst.
Spore og varme sterilisering
Bakteriel endosporer er de mest varme-resistense strukturer der findes. Hvad er rsagen til at de er s
modstandsdygtige?
-
En vigtig faktor i varme resistens er mngden og tilstanden af vand indeni endosporerne. Under endospore
dannelsen der reduceres protoplasma volumen, hvilket skyldes akkumulation af calcium, SASP og syntesen
af dipicolinisk syre, hvilket giver en gele lignende struktur.
Varme resistensen er nu afhngig af vandindholdet og SASP koncentrationen i protoplast.
Lav SASP og hj vandindhold Lav varme resistens
Hj SASP og lavt vandindhold Hj varme resistens
SASP = small acid-soluble spore proteins.
Pasteurisering
Pasteurisering drber de fleste pathogeniske mikroorganismer, reducere mikrobiel byrde og reducere
vksten af delggende mikroorganismer.
Flash Pasteurisering og bulk pasteurisering er forskellige metoder at drbe bakterier p, de er beskrevet p
side 700 midt.
Autoklavering er en sterilisations procedure hvor damp placeres under tryk for at opn hj temperatur og
hermed drbe mikroorganismer. Fig. 20.3 side 698.
------------------------- 0 -------------------------- Kemisk antimikrobiel kontrol Kemisk vkst kontrol
Bakteriocidal = stoffer som delgger eller drber bakterier, men ikke ved celle lysis.
Bakteriostatisk = stoffer som hmmer bakteriel vkst. Dette er hmning af protein syntesen ved at binde
til ribosomer.
Bakteriolytisk = stoffer der drber celler ved celle lysis. Dette sker p grund af hmning af celle vgs
syntesen. Et godt eksempel penicillin.
Disse tre former for antimikrobielle midler er illustreret p fig. 20.9 side 704.
MIC = minimum inhibitory concentration. En metode til at bestem antimikrobiel aktivitet. Se velser og fig.
20.10 side 705. Reagens glasset med lavest koncentration af midlet som fuldstndig hmmer vkst af test
organisme defineres som MIC.
Faktorer som pvirker: test organismens natur, inokulations tid, opbygning af kultur mediet, inkubations
forhold og tid, ssom temperatur, pH.
En anden metode er agar diffusions metoden. Fig. 20.11 side 705. kort s sker der det at filter papir med
antimikrobielt stof placeres p overfladen af agar plade, hvor kulturen er pladret ud. Hmnings zone finder
sted og diameter af zonen er proportional med mngden af antimikrobielt stof.
Antiseptisk = midler der drber eller hmmer vkst af mikroorganismer.
Desinfektions midler = drber mikroorganismer og bruges p dde objekter.
Germicider = desinfektions middel som bruges nr varme eller radiation til dekontaminering eller
sterilisation ikke er mulig.
Tabel 20.3 side 706.
-
BROCK Kap 21
Gavnlige mikrobielle interaktioner med mennesker Overblik over Menneske-Bakterie interaktioner
Nr vi taler om normal flora, s taler vi om de hundrede/billioner individuelle mikroorganismer mennesket
udsttes ved normal menneskelig aktivitet.
Parasiter = organismer som vokser p eller i en vrt organisme for herved at delgge vrten.
Patogen = mikrobiel parasitter
Virulens = graden af pathogenisiteten dannet af et pathogen.
Infektion = vkst af organismer i vrten
Sygdom = beskadigelse af vrt som skader vrtens funktion.
------------------------- 0 -------------------------
Skadelige mikrobielle interaktioner med mennesker Pathogenesis starter med mikroorganismers tilslutning til vrtscellen, efterfulgt af kolonisation og vkst
resulterende i delggelse af vrten. Dette er illustreret i fig. 21.12 side 710.
Patogen indtrdelse
Bakterier og viruser tilsluttes specifikt til epithelial celler (overfladen af kroppen, som bestr af mange lag af
hud etc.) via protein-protein interaktioner p overfladen af pathogen og vrts cellen (2). Et eksempel er
Neisseria gonorrhoeae (gramnegativ bakterie, giver sygdommen gonorrhoeae, en sex trasmitted sygdom)
beskrevet p side 710. Her binder vrt cellen specifikt til proteinet Opa med en protein kaldet CD66 som
kun findes p menneskelige epithelial celler.
Capsul = en polymer coat, indeholdende en tt og veldefineret lag, der tt omringer cellen.
Glycocalyx = Et lst netvrk af polymer fibre strkker sig udefra cellen.
Slim lag = spredt masse af polymere fibre, tilsyneladende ubundet til enhver single celle.
Fimbriae og pili er bakterielle celle overflade proteiner som ogs kan fungere i tilslutnings/bindings
processen. Begge pili og fimbriae fungerer ved at binde vrt celle glycoproteiner, for herved at starte
bindingseventen.
De fleste pathogener trnger gennem epithelium for at starte pathogenisitet, og dette kaldes invasion (3).
Kolonisation og vkst (21.7)
-
Nr pathogenet har fet adgang til vvet, s kan det multiplicere, dette kaldes kolonisering. Da pathogenet
ikke s ofte forrsager delggelse med det samme, s sger pathogenet bestemte nringsstoffer eller
miljmssige forhold (temperatur, pH mm) for at vokse.
Organismer kan vokse lokalt ved invasionsomrdet, eller sprede sig ud i kroppen. Det sidst nvnte sker ved
at organismerne spreder sig via lymfen og ud i blodet. Nr de nr til blodet s vil de spredes til de andre vv,
idet der sker en systematisk infektion af kroppen.
Virulens (21.8)
Virulens = en parasits relative evne til at medfrer sygdom.
Bestemmelse af virulens
Virulens af et pathogen kan bestemmes ud fra LD50 studier. LD50 = Lethal Dose50, dvs. dosen af et middel
der drber 50 % af dyrene i en test gruppe.
Fig. 21.16 side 713 illustrerer forskellen p mikrobiel virulens baseret p antal celler af to forskellige
bakterier krvet til at drbe mus.
Attenuation: Nr en organisme mister sin virulens evne. Dette sker fx nr en organisme passes i laboratoriet
ikke p dyrceller, dvs. den lever ikke i optimale forhold, vil dens virulens styrke blive svagere/mistet.
Et patogen er virulens pga. to vigtige faktorer, som er: toxicity og invasiveness.
Toxicity: Et organismes evne til at skadeliggre/drbe host (vrt)cellen vha. toksiner. Fx bakterien C. tetani
forrsager sygdommen tetanus (stivkrampe) vha. exotoksiner produceret af bakterien selv.
Invasiveness: En organismes evne til at vokse p et hostcellens vve i s store tal at patogenet (parasit)
hmmer hostcellen.
Virulens i Salmonella (s. 714)
Salmonella hmmer en hostcelle ved bde brug af toksiner og invasiveness. Salmonella producerer 3
toksiner; (1) enterotoxin, (2) endotoxin og (3) cytotoxin (denne virker ved at hmme cellens proteinsyntese
og derefter f Ca2+ til at vandre ud af hostcellen). Figur 21.17 illustrerer de vigtigste elementer i salmonella,
som hjlper den i at vre patogen.
------------------------- 0 -------------------------- Virulens faktorer og toksiner Ekstracellulr virulens faktorer og toksiner der produceres af organismer for at fremme patogenesis.
Exotoksiner (21.10)
Exotoksiner er proteiner der udskilles ekstracellulrt nr organismer vokser. Disse er inddelt i:
1. cytolytiske toksiner, disse angriber enzymatisk celler og medfrer lysis (vrtcellensdd).
-
2. A-B toksiner, indeholder 2 underenheder hvor B binder til celle overflade receptor. Hermed kan A
overfres gennem membranen og delgge celle.
3. Superantigen toksiner som stimulerer store mngder immun respons der medfrer inflammatorisk
aktion.
Hmolysiner = cytolytiske toksiner som lysere (drber) rde blod celler.
Leukocidiner = delgger hvide blod celler og formindsker vrts resistensen.
Diphtheriae er en A-B toksin udskilt af C. diphtheriae. Hvordan dette toksin virker er illustreret p side 717.
Kort s gr det ud p at B enheden srger for binding til membran. Herefter sker en proteolytisk brydning af
binding mellem A og B. A trder ind i cellen og forstyrre protein syntesen ved at inaktivere elongation
faktor 2 (fx C2 C4).
En vigtig faktor for dannelse af toksinet er jern. Hvis jern findes i store mngder s vil det binde til
regulerings protein og fungerer negativ kontrol element, og medfrer forhindre diphtheria toksin i at dannes.
Exotoksin A virker p samme mde som ovenstende.
Tetanus toksin = (ogs en A-B protein toxin) blokerer udskilning af glycin s motorneuronet ikke kan
hmmes, og dette medfrer fortsat acetylcholin udskillelse og ukontrollerede kontraktion af forgiftet
muskler. Resultat er spasme mm. fig. 21.21 side 719.
Botulinum toksin = blokerer udskillelse af acetylcholin, s forgiftet muskler ikke kan kontraherer sig og
dette medfrer slap lammelse. Se fig.21.20 side 718.
Enterotoksiner (21.12)
Enterotoksiner er exotoksiner som pvirker tyndtarm ved at udskille vske ind i tarm lumen og medfrer
opkast eller diarre. Disse toksiner inkluderer A-B, cytotoksiner og superantigen toksiner.
Et godt eksempel er Cholera toksin som resulterer i hj vand indstrmning til tarm lumen og medfrer at
patienter dr pga. ekstrem dehydrering. Behandles ved at bruge elektrolyt oplsninger der kan erstatte vske
og ioner, som regel salt vand. Cholera toksin virkningen er illustreret godt p side 747. Kort handler det om
at A enheden aktiverer dannelse af cAMP via adenyl cyklase. Denne cAMP forgelse medfrer Cl strmning
ind i lumen, medens Na udflux hindres. Dette medfrer forget vand strm til lumen.
Endotoksiner
Endotoksiner er generelt celle bundet og udskilles i store mngder nr cellen lysere.
Gram negative bakterier producerer lipopolysakkarider som del af deres ydre lag af deres celle envelop, som
er toksisk.
-
Endotoksiner ger feber ved at stimulerer cellen til at danne proteiner kaldet endogenous pyrogener, som har
effekt p temperatur kontrol center i hjernen (hypothalamus).
Limulus assay = en endotoksin assay se side 748.
Sammenligning af exo-og endotoksiner
Egenskab Exotoksiner Endotoksiner Kemiske Proteiner udskilt af bestemte gram
positive eller gram negative bakterier. Generelt varme ustabil
Lipopolysakkarid-lipoproteinkompleks. Udskilles ved cell lysis af gram negative bakterier.
Virkning; symptomer Specifikt; binder normalt specifikt til celle receptor; er enten cytotoxin, enterotoxin eller neurotoxin med defineret specifik virkning p celler eller vv
Toksitet Hj og fatal Svag og ikke srlig fatal Immunogenisitet Hj; stimulerer produktion af antitoksiner Svag immunogen: immun respons ikke
god nok til at neutraliserer toksin Toxoid potential Behandling med formaldehyd vil
delgge toksiteten, men toxoid beholder immunogen effekten.
Intet
Feber potential Producerer ikke feber Pyrogen virkning: inducerer ofte feber.
BROCK Kap 22
Overblik over immunsystemet Immun systemets celler og organer
Blod og lymfe komponenter
Blod indeholder Erythrocyter, som er rde blod celler. Erythrocyters funktion er at transportere ilt fra
lungerne og ud til vvene.
Blod indeholder ogs hvide blod celler, som kaldes leukocytter. Leukocytter inkluderer celler s som
monocyter og lymfocytter.
Lymfocytter = er involveret i immun respons.
Lymf = vske som ligner blod, men mangler rde blod celler.
Plasma = den del blod vske med cellerne fjernet. Protein fibrinogen nogle komplekse reaktioner der
forrsager klumpning af blod. Dette kan celler deaktiveret ved addering af anticoagulant, som f.eks. kalium
oxalat..
Serum = blod vske med klumpede proteiner og fjernet celler.
Leukocytter
-
Alle leukocytter deltager i uspecifik eller specifikke immune funktioner.
Lymfocytter findes koncentreret i lymfe knuder og milten hvor den reagerer med antigener.
Lymfocytter er delt i to:
1. B celler dannes og vokser i knogle marven og er forlber for antistof dannende plasma celler.
2. T celler dannes i knogle marven, men disse bevger sig til thymus for at vokse.
Fig.22.1 s. 758 viser de vigtige celler involveret i immun responsen.
Uspecifik immunitet
For at immunitet skal finde sted s skal celler i kontakt med pathogenet. Sdanne celler er fagocytter.
Phagocyter = celler som drber pathogener og patogen produkter
APC = antigen-presenting cell, som er fagocytter der danner peptid antigener som skal aktiverer det
specifikke immun respons.
PMN = polymorphonuclear leukocytter. En fagocyt som er tiltrukket bakterier og bakterielle komponenter.
Makrofager er store celler som kan spise og delgge de fleste pathogener.
Monocyter er cirkulerende celler der differentierer for at blive makrofager.
De sure forhold i fagolysosomer medfrer dannelsen af toksisk oxygen forbindelser. Disse toksiske former
benyttes til at drbe bakterie celler opslugt af fagocytten.
Hmning af phagocyter
Nogle pathogener har udviklet mekanismer som neutraliserer effekten af toksisk fagocyt produkter.
Eksempler:
Staphylococcus aureus danner farvet forbindelser som kaldes carotenoider.
Mycobakterium tuberculosis vokser og vedvarer inden i fagocytiske celler. Disse bakterier bruger
glykolipider til at skylles de toksiske forbindelser vk.
Leukocidiner er proteiner som produceres i intracellulre pathogener. Pathogenet opsluges som normalt,
men drber fagocytten og udskilles.
Andre mikrobielle forsvar mod fagocytter er bakterielle kapsler, idet at kapslen forhindrer tilslutning af
fagocyt til bakteriel celle. Anden overflade komponent der hmmer fagocytter er M protein, som forandrer
overfladen p cellen og hmmer fagocytosis.
Det specifikke immune respons
De uspecifikke phagocyter overbringer antigener til specifikke T celler, for herved at danne effektive T celler
eller antistoffer. Immune T celler og antistoffer reagerer direkte eller indirekte for hermed at neutralisere
eller delgge antigenet.
TCR = T celle receptor. Som specifikt binder sig til antigenet.
-
TC = cytotoksiske celler. Disse angriber direkte og delgger antigen brende celler.
TH = T hjlpe celler. Disse fungerer indirekte ved at udskille proteiner kaldet cytokiner. Cytokinerne
aktivere andre celler for at delgge antigen brende celler.
Nogle T hjlpe celler stimulerer B celler til at danne antistoffer. Disse antistoffer er oplselige proteiner
som reagerer specifikt med antigen i kredslbssystemet for at neutralisere eller delgge antigen.
Specifik immun respons kan deles i to:
1. Cell mediated immunity = celle delggelsen sker via genkendelse af antigen p en patogen
smittede celle.
2. antibody mediated immunity = disse er effektive mod pathogener i blod og lymfen.
Immune responset er karakteriseret via 3 egenskaber:
1. Specificity = Specifik for antigenet
2. Memory = evnen til at svare mere kraftigt ved ny udsttelse for det samme antigen, fordi at initial
antigen udsttelse inducerede vkst og deling af antigen-reaktive celler, som resulterer i multiple
kopier af antigen-reaktive celler.
3. Tolerance = evnen til at skelne mellem egen antigener fra andre antigener, idet at makromolekyler i
vrten er potentielle antigener, og immunsystemet skal derfor lrer ikke at genkende disse proteiner,
da vrtscellen kan d.
Fig. 22.7 side 763 illustrerer de tre egenskaber.
-------------------------- 0 --------------------------
Antigener, T celler og cellulr immunitet Immunogener og antigener
Immunogener er antigener, som har evnen til at fremkalde et immunt respons. Vi skal her se p deres
karakteristiske trk som immunogener.
Indre virkende:
Hvis molekyle strrelsen er lille s er det drlig immunogen.
Molekylr kompleksitet er god predictor af immunogenisitet.
Fysisk egenskab som uoplselighed af makromolekyle er god prediktor af immunogenisitet.
Ydre virkende:
Dose mellem 10g og 1 gram er mest effektivt.
En anden faktor er ruten.
Den effektive immunogen skal vre fremmede for vrtscellen, da vi ved at immunsystemet er designet til at
genkende fremmede antigener.
-
Hvordan antigenet prsenteres for T celler
T celle receptor(TCR)
En TCR indeholder 2 proteiner, en kde og en kde, som hver indeholder en variabel og en konstant,
hvor variablerne og danner bindings stedet for antigenet. Illustreret i fig. 22.9 s. 766.
KRAV: TCR kan kun genkende et antigen hvis det frst er bundet til MHC proteiner.
MHC = major histocompatibility complex.
Major Histocompatibility Complex (MHC)
MHC proteiner er dannet via en rkke gener i MHC og de kaldes human leukocyte antigens (HLA).
MHC gener indkoder 2 forskellige proteiner, klasse 1 og klasse 2.
Klasse 1 MHC proteiner = findes p overfladen af alle nucleatedceller
Klasse 2 MHC proteiner = findes kun p overfladen af B lymfocytter, makrofager og andre antigen
presenting cells (APCs).
Fig. 22.10 side 766 illustrerer strukturen af MHC proteinerne.
Klasse 1 MHC proteiner indeholder 2 polypeptider, en alfa kde indkodet i MHC gen regionen, og en
mindre protein kaldet beta 2 microglobulin, som er indkodet af en ikke MHC gen.
Klasse 2 MHC proteiner indeholder 2 ikke kovalent bundet polypeptider, kaldet alfa og beta.
Antigen prsentation
Antigen prsentationen er illustreret p fig. 22.11 side 767 for klasse 1 MHC og klasse 2 MHC proteiner.
Klasse 1 antigen prsentation:
Trin1: Protein antigener dannet inden i cellen nedbrydes i cytoplasmaet og transporteres gennem det
endoplasmatiske reticulum membran.
Trin 2: Peptiderne bindes til klasse 1, og transporteres herefter til cellens overflade
Trin 3: MHC komplekset bindes til TCR p overfladen af TC celler.
Trin 4: CD8 corereceptor p TC cellen binder ogs til MHC, hvilket giver et strkere kompleks.
Denne celle celle binding ger TC cellers evne til at danne cytotoxiner og cytokiner som drber virus-
ramte celler.
Klasse 2 antigen prsentation:
Trin1: Klasse 2 proteiner dannes i det endoplasmatiske retilucum, hvorefter den bindes til en blokerings
protein kaldet Ii, som forhindrer klasse 2 i at danne kompleks med andre peptider.
Trin 2: Klasse 2 bevger s hen mod phagolysosome hvor Ii og et fremmed protein fordjes
Trin 3: klasse 2 proteinet bindes nu til det fordjet fremmed peptid. Dette kompleks transporteres herefter til
cellens overflade
-
Trin 4: Her genkendes komplekset af TCR og binder til det.
Trin 5: CD4 corereceptor p TH cellen binder ogs til MHC.
TH cellen udskiller inflammatoriske cytokiner som indvirker p andre celler for herved at aktivere et immunt
respons, eller stimulere antistof produktionen via specifikke B celle kloner.
Hvordan TC celler drber Antigen-bundet celler
KRAV: TC celler og ml celler skal have kontakt for at cellen skal d.
Denne kontakt forrsager udskillelse af sm korn (granuler) fra TC cellen (degranulering). Disse sm korn
indeholder perforiner, som trder ind i ml cellens membran for herved at bne nogle porte.
Herefter kan granzymer (kommer fra de sm korn) passere disse porte og forrsager apoptosis, og cellen dr.
Det skal lige siges at TC cellen dr ikke, idet det kun er celler med det fremmede antigen der angribes.
Fig. 22.12 side 769 illustrerer ovenstende.
Natural Killer cells (NK cells)
NK celler er hverken T celler eller B celler. Deres antal stiger ikke og udviser ikke hukommelse efter
stimulering.
NK celler ligner TC i deres evne til at drbe fremmede celler ved at benytte perforiner og granzymer (men
NK celler genkender ikke antigenet og der er heller ikke kontakt med det fremmede antigen.)
NK celler genkender almindelige celler og deres klasse 1 protein gennem en rkke speciale klasse 1
receptorer. Binding af disse receptorer til klasse 1 deaktiverer drber mekanismen, men mangel p binding
gr at NK celler drber de ugenkendelige celler.
T-hjlpe celler: aktivering af Immune respons
T-hjlpe cellerne er delt i to:
TH1: spiller en rolle i makrofag aktivering. Makrofager drber fremmede celler, en evne stimuleret af TH1
celler. Aktiveringen sker ved at TH1 udskiller cytokiner der aktiverer makrofagen som s kan drbe
fremmede patogen eller tumor celler. Se. fig.22.12 s. 769.
TH2: interaktion med B celler og stimulerer antistof produktion. B celler er omringet med antistoffer som
fungerer som antigen receptorer. Nr antigen binder til B celle antigen receptorer, s dannes der ikke antistof
med det samme, men den fungerer som APC og laver interaktion med TH2 celler. Det bundne antigen
endocytoseres og nedbrydes i B cellen. Peptid fra nedbrudt antigen prsenteres via klasse 2 MHC protein til
TH2 cellen. T cellen udskiller cytokiner som reagerer med B cellen og aktiverer denne til antistof dannelse.
-------------------------- 0 --------------------------
Antistoffer og immunitet Antistoffer (immunoglobulin)
-
Immunoglobuliner kan inddeles i:
1. IgG
2. IgA
3. IgM
4. IgD
5. IgE
IgG strukturen
Dens molekylevgt er ca. 150 000 og den er opbygget af fire polypeptid kder, som illustreret i fig. 22.14
side 772.
To identiske light kder (25 000 MW) er koblet med to identiske heavy kder (50 000 MW).
Hvert antistof har to antigen bindings enheder (bivalente), som hver indeholder en tung kde og en let
kde.
Light og heavy kden ender med den variable domne, og det betyder s at antistoffer er forskellige fra
hinanden i deres aminosyrer sekvens.
Antigen bindings side
Tung og let kdens variabler danner bindings stedet for antigenet.
De andre klasser af immunoglobuliner
IgM = denne er illustreret i figur 22.17 side 773. Det ses at den findes som en total masse af fem
immunoglobulin molekyler bundet via mindst en J kde. Den har ti antigen bindings steder. Har lav antigen-
bindings affinitet, men hj aviditet. Aviditet = beskriver styrken af binding ved multivalent antigen-bindings
molekyler.
IgA = udskilles fra MALT. Den bestr af 2 immunoglobuliner der er bundet via J kde.
IgE = findes i serum i lave koncentrationer, men er vigtig mod allergi.
IgD = findes i sm koncentrationer i serum.
Antallet af konstant domner adskiller nogle af immunoglobiner. Nogle indeholder 3 og andre 4.
B lymfocytter og antistof produktion
Produktion af immunoglobuliner er illustreret i fig. 22.13 side 770. B cellen er den antigen prsenterende
celle med et antigen - specifik Ig p dets overflade. Antigenet bliver s prsenteret til TH2 cellen via TCR.
TH2 stimulerer B cellen til at producere antigen-specifikke antistoffer.
Lad os se p produktionen trinvis:
Trin 1: Antigener spredes via den lymfatiske og blod kredslbet ud til lymfoid organer ssom lymfe knuder,
MALT og milten.
-
Trin 2: De antigen stimuleret B celler forges og skilles ad for herved at danne plasma celler og memory
celler.
Plasma celler har en kort levetid, men producerer og udskiller store mngder IgM i den primr antistof
respons. Se fig. 22.19 side 775.
Trin 3: Memory celler har en lngere levetid, de kan leve op til flere r. Hvis der reinjiceres antigener p et
senere tidspunkt, s behver memory cellerne ikke T celle aktivering. De forvandles hurtig til plasma celler
og begynder s sin produktion af IgG
Mngden af antistoffer er her forget 10 100 gange mere end ved den frste injektion af antigen, dette
kaldes den sekundre antistof respons. Fig. 22.19.
Dette skift fra IgM til IgG kaldes klasse skift.
Komplement, antistoffer og patogen delggelse
Komplement er en rkke proteiner der aktiveres ved interaktion med antigen-antistof komplekser p
bakterielle celler. Dette forrsager delggelse og lysis af cellulr indhold.
Hvordan finder dette sted?
1. Antistofferne IgG og IgM binder til antigener p celle overfladen og danner komplekset.
2. C1 (komplement 1) binder til komplekset. Dette frer til at binding af C4 og C2. Herefter binder C3.
3. membran C3 katalyserer dannelsen af C5-C6-C7 kompleks.
4. C8 og C9 afsttes p ovenstende kompleks og det er disse komplementer der medfrer membran
delggelse og lysis.
Som det ses s dannes en rkke af komplementer, som aktiverer hinanden. Dette er illustreret p fig. 22.20
side 776. ovenstende kan finde sted p Gram-negative bakterier.
Gram-positive gennemgr opsonization. Phagocyter har antistof receptorer og C3 receptorer. Disse
receptorer binder til antistof konstant domner og C3 komplement. Hermed ges phagocytosis ved
komplement kaldet OPSONIZATION.
-------------------------- 0 --------------------------
Benytte immunsystemet til at forhindre sygdom Immunization til at forhindre sygdom
Agmmaglobulinemia = genetisk fejl hvor antistoffer ikke produceres pga. defekte B celler.
Man kan opn immunitet p forskellige mder:
1. Naturlig aktiv immunitet som er immunitet efter infektion.
2. Kunstig aktiv immunitet som er antigen udsttelse for at inducerer antistof produktionen, en sdan
metode er vaccination.
3. Kunstig passiv immunitet er nr en person fr injiceret antiserum fra en anden person som tidligere
har produceret antistoffer.
-
4. Naturlig passiv immunitet som findes i spdbrn. De nyfdte har moderlig IgG antistoffer som
skal beskytte dem mod sygdom til deres eget immunsystem er blevet moden.
Sammenligning mellem aktiv og passiv immunitet, se side 778.
Aktiv immunitet bruges ofte til at beskytte en person for fremtidige angreb medens passiv immunitet bruges
til at behandle en person som har sygdommen nu.
Vaccine fremstilling: mikroorganismerne drbes med kemiske midler ssom phenol eller formaldehyd eller
fysisk ved varme. De dde/inaktiveret bruges i vaccinen.
Ved toksin forrsaget sygdomme, der dannes et toxoid. Toxoid er det modificeret exotoxin, som ikke er
toksisk.
Immunisation med levende celler eller virus er mere effektive. Man kan ofte isolere mutant strenge fra et
patogen som har mistet virulensen, men stadig har immunisations antigener. Denne type kaldes attenuated
strains.
Nye Immuniserings strategier se sider 779-781.
-------------------------- 0 --------------------------
Sidste del af kapitlet omhandler immun respons sygdomme, dvs. sygdomme der opstr nr kroppen udvikler
immun respons. Her er taler om immediate hypertensitivity (type 1), delayed hypersensitivity (type 4) og
autoimmune sygdomme (Type 2 og 3). Den sidste del af kapitlet omhandler superantigener, som medfrer
sygdom.
Se siderne 781 til 785.
BROCK Kap 23
Immunoglobulin gen superfamilie Celle overflade receptorer og immunitet
Antigen-binding immunoglobuliner, T celle receptorer og MHC proteiner tilhrer alle tre immunoglobulin
gen superfamilien.
-
--------------------------- 0 -------------------------- Major Histocompatibility Complex (MHC) MHC protein struktur, MHC gener og polymorfisme
MHC protein
Hvor findes de?
Konstant domn
Variable domn
Strrelse af peptid antigener
Gen steder
Polymorphism
Klasse 1
P overfladen af alle celler med kerne.
Den ene er membran integreret og kaldes kde. Den anden er ikke integreret og kaldes 2m2.
En 1 og 2 domne. Closed groove.
8-10 aminosyrer
HLA-A, B og C.
JA
Klasse 2
Kun p overfladen af B celler, makrofager, dvs. APC er.
Begge konstanter er membran integreret og kaldes og kder.
Domner 1 og 1 danner en tilsvarende bindings side, men denne er ben. Open groove.
Mere end 10 aminosyrer
HLA-DR, -DP og -DQ
JA
Se figurerne p side 789 og 790.
Hvad er polymorfisme?
Det er forekomsten af multiple alleler ved et locus i et frekvens som ikke kan forklares ved forekomst af ny
normal mutation. Alleler er variation i gener, men med samme funktion. F.eks. forekommer der 95
forskellige alleler ved HLA-A.
Motif = bevaret aminosyrer sekvens som findes i alle peptid antigener som binder til et givet MHC protein.
F.eks. hvis alle 10 aminosyrer peptider der binder til en bestemt MHC klasse 1 protein har tyrosin ved
position 2 og leucin ved 7, s vil alle x-tyrosin-xxxx-leucin-xxx binde til MHC proteinet.
Anchor residue = de ikke varierende aminosyrer i motif. Dvs. at MHC protein kan binde til et stort antal
forskellige peptider, hvis den har den anchor resisue der krves.
-------------------------- 0 --------------------------
Antistoffer Antistof proteiner og antigen binding
Som sagt s varierer Igerne fra hinanden pga. variation i aminosyrer sekvens ved V domnet. De
hypervariable omrder kaldes 3CDR er, som ogs srger for molekylr kontakt med antigener.
2 Beta-2-mikroglobulin 3 complementarity determining regions
-
CDR1 og CDR2 er forskellige mellem immunoglobuliner medens CDR3 er forskellige fra hinanden (dvs. at
CDR3 p heavy chain er forskellig fra den p light chain.). Heavy chain har en kort variations omrde D
efter CDR3 og en forbindings omrde J. se. fig.23.4 s. 792.
CDRerne foldes sammen og danner antigen-bindings siden.
Antistof gener og variation
Gener for V, D, J og C delene er separeret fra hinanden i genomet, men samles for at danne den modne Ig
gen i udviklingen af B cellen.
Fig. 23 side 794 illustrerer gen omordningen af Ig. Som det ses s rekombineres generne for at danne en
heavy kde eller light kde. Det aktive gen (indeholdende en intervening sekvens mellem VDJ og C
genet) transskriberes og den primre RNA transkript splejses med VDJ for at danne mRNA. mRNA kan s
oversttes og danne heavy og light kderne.
Denne metode giver stor variation. Man kan danne uendelige antal antistoffer, idet at gen omordning
(rearrangement) kan give op til 3 000 000 antistoffer.
Somatic hypermutation giver ogs antistof variation. Dette sker typisk efter anden udsttelse for antigen.
Ligesom vi s i kap. 22 med switch fra IgM til IgG.
Affinitet mutation = forgelse af antigen-binding affinitet.
Abzymer = antistoffer der fungerer som enzymer. Bruges eksperimentel som bevis p somatisk mutation.
Se. fig. 23.6 side 795.
-------------------------- 0 --------------------------
T-celle receptorer TCR proteiner og antigen binding
TCR er et protein der binder til peptid antigener som sidder p MHC proteiner. TCR er membran integreret
og findes kun p overflade af T celler. Bindingen sker via V domner og , og disse indeholder ogs CDR
1, 2 og 3, der binder til antigen.
Agretope = den del af peptid antigen hvor MHC proteiner binder.
Apitope = den del hvor TCR binder.
CDR3 er den del som har kontakt med epitop, medens CDR 1 og 2 binder til MHC proteinet.
Se. fig. 23.7 side 796.
TCR gener og variation
De gener der skal kode og kder er ligesom Ig gener forskellige for de konstante og variable domner.
V domnet for kden kodes af V, D og J gen segmenter. V domnet for kden kodes af V og J gen
segmenter.
-
Variation dannet ved rekombination, reassortment af gen produkter, muligheden for at transskriberer D
omrder i tre mulige lserammer og almindelig N-nukleotid addering sikre at der er mange ubegrnset
muligheder for forskellige antigen-binding TCRer. Der er tale om 1015 muligheder.
Se fig. 23.8 side 797.
-------------------------- 0 --------------------------
Molekylre signaler i immunitet Her bliver de molekylre mekanismer der kontrollerer aktivering af immun respons gennemget.
Klon selektion og tolerance
Klon selektion: Nr B eller T celler stimuleres ved interaktion med et enkelt antigen, s vokser cellerne og
differentierer. Som resultat s vil de antigen-stimulerede celler dele sig og danne en pool af celler som
udtrykker samme antigen-specifik receptor. Disse kopier kaldes kloner og er illustreret p fig. 23.9 side 798.
For at undg at egne antigener skades, s er immunsystemet bygget p den mde at det kun er kloner som
virker mod fremmede antigener der vlges (tolerance).
T-celle selektion: selektionen finder sted i thymus, en primr lymfoid organ som spiller en central rolle i
udviklingen af antigen-reaktive T celler. Lymfocytter der vil omdannes til T celler forlader knogle marven
og trder ind i thymus. Her vil T-celler der ikke binder til MHC proteiner d via apoptosis. Dette kaldes
positiv selektion. Negativ selektion kan s finde sted. De voksende T celle kloner som laver interaktioner
med egne antigener og MHC drbes (hermed undgs autoimmunitet, dvs. delggelse af egen vv). T celle
kloner der reagerer med ikke egne antigener forlader thymus og trder ind i den lymfatiske cirkulation igen,
og medvirker i immunresponsen mod fremmede antigener. Fig. 23.10 side 799.
Ovenstende form for selektion kaldes klon slettelse.
B-celle tolerance er ogs vigtigt fordi at antistoffer dannet via self-reaktive B celler kan delgge vv. Dette
forhindres ogs via klon slettelse.
Klon anergy = umodne B celler der er self reaktive udvikles ikke, ogs selvom de udsttes for hje
koncentrationer af self antigener i knogle marven.
Second signals
self reaktive T-celler kan undg klon slettelse (idet at ikke alle self antigen findes i thymus), men
deaktiveres gennem interaktioner i de sekundre lymfoid organer (MALT, milten mm). Uforpligtet T-celler,
dvs. celler som ikke har lavet interaktion med antigen, kan aktiveres i de sekundre lymfoid organer ved
frst at binde med peptid: MHC via TCR (signal 1). Signal 2 er binding mellem B7 APC protein og CD28 T-
celle protein. Hvis signal 2 ikke finder sted s kan T-cellen ikke aktiveres. Dette kaldes klon anergy, og man
siger at T cellen er anergized. Se fig. 23.11 side 800.
Cytokiner og chemokiner
Cytokiner = gruppe oplselige proteiner produceret af leukocyter og som regulerer celle funktion.
Lymfokiner = cytokiner dannet af lymfocytter.
-
Autokriner = cytokiner der stimulerer egne celler.
Interleukiner = cytokiner der formidler interaktioner mellem leukocytter.
Tabel 23.1 side 801 beskriver en rkke cytokiner.
Fig. 23.12 side 801 giver et godt eksempel p hvordan cytokiner er involverede i antigen-specifik antistof-
formidlet immunrespons.
Kort s udskiller makrofagen nogle IL-1 cytokiner. Disse binder til IL-1 receptorer p TH2 celle. Denne
aktiveres og udskiller autokrine IL-2 cytokiner. Disse cytokiner bevirker at cellen deler sig og danner klon
kopier. Eller IL-2 kan producerer IL-4 som binder til specifik receptor p B celler, som differentierer til
plasma celler og danner antistoffer.
Chemokiner = sm proteiner der virker som kemoattraktante for fagocytter eller T celler. De produceres af
lymfocytter men ogs fra andre celler som svar p bakteriel produkter, viruser og andre produkter der skader
cellen. Fagocytter og T celler tiltrkkes af chemokiner til det beskadiget omrde og stimulerer et
inflammatorisk respons og et virkningsfuldt immun respons (specifik).
BROCK Kap 24
Immunologi og klinisk diagnostisk metoder Immunoassays
Antistof titer
Bestemmelse af antistof titeren for et mistnkt patogen er en alternativ metode til undersgelse af infektion.
Det man gr, er at man opstiller en fortyndings rkke af patientens serum, for herved at bestemme den
hjeste fortynding hvori antigen-antistof reaktionen finder sted. Dette er illustreret i fig. 24.9 side 819.
En enkelt bestemmelse er ikke nok til at indikere aktiv infektion, og for at sikre sig at en akut sygdom
skyldes en bestemt patogen, s er det ndvendigt at bevise en stigning i antistof titter i akut og forbedret
serum prve fra den samme patient. Her vil antistof titeren vre lav under den akutte periode og stige under
bedring.
Antistofs tilstedevrelse i serum prven kan ogs skyldes for nylig immunisering, og dette er ogs en god
metode til at bestemme at immuniseringen er effektiv.
Hud test
Den mest kendte metode er tuberkulin testen. Her injiceres en oplselig ekstrakt af Mycobackterium
tuberculosis under huden. En positiv betndelses reaktion i lbet af 48 timer indikerer nuvrende infektion
eller tidligere udsttelse.
-
Polyclonale og monoclonale antistoffer Polyclonal = antistoffer som er lavet af mange forskellige B celle kloner.
Monoclonal = antistoffer lavet af et enkelt B celle klon.
Polyclonal Monoclonal - Indeholder mange antistoffer - indeholder et enkelt antistof, og genkender kun
et determinant.
- Genkender mange determinanter p et antigen - Kun en klasse antistoffer
- Forskellige klasser af antistoffer - Kan producere et specifikt antistof ved at
benytte et urenset antigen
- Kan lave et specifikt antistof ved kun at
benytte et oprenset antigen.
- Reproducerbart
- Ikke reproducerbart
- Vanskelig at standardisering.
Antistof producerende B lymfocytter dr normalt efter nogle uger i celle kulturer (in vitro). Disse celler m
derfor modificeres. Dette sker ved at B lymfocytter sammensluttes med myeloma celler som er B-celle tumor
og der dannes Hybridoma.
Hybridoma er celler som brer begge fusion cellers egenskaber. Disse celler vokser ogs p ubestemt tid og
producerer antistoffer.
Hybridoma teknik, som kan bruges til at danne monoklon antistoffer er illustreret p s. 821. Kort s injicerer
man antigener ind i en mus. Antigen-specifikke B celler vil under de nste uger formerer sig og producerer
antistoffer i musen. Milten som er rigt med B celler fjernes fra musen og sammensluttes med myeloma
celler. Da disse hybridomaer kun er en lille brkdel af populationen s tilsttes HAT (hypoxanthin,
aminopterin og thymidin) til in vitro celle kulturen. Herved stopper vksten af myeloma celler, men
hybridoma vokser videre idet at de kan forbig aminopterin blokeringen og vokse p de to andre stoffer, da
den fr sine genetiske informationer fra B celle delen. B cellerne vil d efter nogle f celle delinger.
ELISA bruges til at identificerer hybridoma som producerer monoklon antistoffer.
Monoklon antistoffer bruges i kliniske, diagnostiske og forsknings forsg.
Serologi
Serologi = studier af antigen-antistof reaktioner.
Serologiske test afhnger af nedenstende.
Specificitet = antistoffers evne til at genkend et enkelt antigen.
Sensitivitet = laveste mngde antigen som kan undersges eller findes.
Antigen - binding tests som producerer synlige resultater som involverer antigen-antistof reaktioner:
-
Neutralisation = interaktion mellem antigen og antistof, hvor antistof reducerer antigenets biologiske
aktivitet. Eksempel er neutralisation af mikrobiel exotoxiner via specifik antistof, se fig. side 825. Antitoxin
= antiserum indeholdende antistoffer der neutraliserer toxin.
Precipitation =
Agglutination
Agglutination er synligeklumpen af antigener nr disse blandes med antistoffer.
Direkte agglutination er resultatet af interaktionen mellem oplselige antistoffer og antigener (som er del af
en celles overflade). Den mest kendte direkte agglutination er den brugt til at finde blod typer hos
mennesker. Her findes antigenerne p overfladen af rde blod celler. En njere beskrivelse af sdan en
undersgelse ses p side 826. et lille eksempel: Type
A individer producerer antistoffer mod gruppe B antigener og omvendt.
Antistofferne kan ogs medfre hmolyse (lysis af rde blod celler) ved komplementation.
Passiv agglutination er agglutination af oplselige antistoffer/antigener der har koblet til celler, latex kugler
eller trkul partikler. Dvs. efter de er koblet til cellen/partiklen, som fungerer som inaktiv carrier, s kan de
gjort uoplselige antigener detekteres via agglutination. Metoden er beskrevet p side 827. men kort s
handler det om at blande patient serum og antigen overtrukket latex kugler p mikroskop skive. Efter kort
tids inkubation s undersges om det hvide latex klumper nr patient antistof binder til antigenet p latex
kuglen.
Immunoelektron mikroskopi
Immunoelektron mikroskopi er en metode til at lokaliserer antigener (normalt proteiner) i cellen. Dette bestr
i at antistoffet er konjugeret med et tungt metal, normalt guld/platin. Binding af disse antistoffer kan s
detekteres som sorte prikker p fotografier (man har brugt elektron mikroskop, idet at de tunge metaller
spreder elektron strlen).
Denne metode er tidskrvende, krver ekspertise og specielle udstyr, og det gr at den er upraktisk til
diagnose procedure.
Fluorescens antistoffer
Antistoffer modificeres med fluorescens farver, og bruges til at detekterer antigener p ubeskadiget celler.
Der findes en direkte og indirekte procedure, se. side 829.
Direkte: det fluorescerende antistof er bundet direkte til overflade.
Indirekte: ikke fluorescerende antistof er bundet direkte til overflade. Det fluorescerende antistof binder til
det ikke fluorescerende.
-
P side 829-831 der gives der eksempler p klinisk anvendelser af fluorescerende antistoffer. Eksempler:
diagnose af pathogener, definerer antallet af bestemte celler i blodet, ssom T celler.
HUGO OG RUSSELL Kap 5 -laktam antibiotika
Pencilliner og mecillinamer
Henvises til s.92 og nogle sider frem.
Tetracycliner
Tetracycliner er ring systemer med fire ringe. Den grundlggende struktur + tetracyclin antibiotikaer er
illustreret p side 104 fig. 5.7.
Tetracycliner virker mod Gram-positiv og Gram-negative bakterier. Resistens mod tetracyclin antibiotika
sker meget langsomt, men der er kryds-resistens, f.eks. en organisme resistent til en af antibiotika er normalt
resistent mod alle de andre fra gruppen.
Sulfat indeholdende tetracyclin, kaldet thiacyclin er mere aktiv end minocyclin mod tetracyclin resistens
bakterie.
Glycylcycliner
Glycylcycliner er tetracyclin analoger. Glycylcycliner har en ekstra substituent ved C-9, nemlig en
dimethylglycylamido side kde. Disse virker mod bakterier som har udtrykt resistens mod tetracycliner via
en udstrmnings mekanisme. Struktur se side 105 fig. 5.8.
Rifamyciner
Rifampicin, illustreret p side 106 fig. 5.9, virker mod Gram-positive bakterier (inklusiv Mycobacterium
tuberculosis) og nogle Gram-negative (p nr enterobakterier eller pseudomonads). Den har en hj effekt
mod M. tuberculosis end andre antibiotika.
Rifampicin virker ved lave koncentrationer mod staphylococci. Da mutation resistens kan opst, s kan
rifampicin kombineres med andre antibiotika, som f.eks. vancomycin, ved behandling af staphylococci
infektion.
Aminoglykosid-aminocyclitol antibiotika
-
Aminoglykosid antibiotika indeholder amino sukker i deres struktur. Nogle aminoglykosid antibiotika er vist
p side 107 fig.5.10. aminocyclitol antibiotika indeholder ikke amino sukker.
Streptomycin virker mod M.tuberculosis og bruges som primr stof til behandling af tuberculosis.
Streptomycin bruges normalt i kombination med isoniazid og p(4)-aminosalicyl syrer. Den virker ogs mod
andre bakterie typer, for eksempel Gram-negative og nogle staphylococci strains.
Gentamicin virker mod Gram-positive og Gram-negative bakterier. Den administreres ofte i konjunktion
med carbenillin for at forsinke resistens opbyggelse.
Kanmycin virker, ved lave koncentrationer, mod Gram-positive bakterier (inklusiv penicillin-resistens
stahylococci) og Gram-negative bakterier.
Paomomycin bruges ved behandling af tarm amoebiasis og akut bacillr dysenteri.
Se yderligere side 108.
Amikacin har pga. en substitueret aminobutyryl i amino gruppen i 2-deoxystreptamin ringen get resistens
mod nogle aminoglykosid-modificeret enzymer, fordi den har frre sider at modificere (fig. 5.10D).
Makrolider
Makrolider er karakteriseret ved at have en molekylr struktur der indeholder store lakton ringe bundet med
amino sukker via glykosid binding. Dette er illustreret p side 109 fig. 5.11.
Den mest vigtige gamle makrolid er erythromycin, oleandomycin, triacetyloleandomycin og spiramycin.
Erythromycin virker mod de fleste Gram-positive bakterier men ikke enterobakterier. Aktiviteten er pH
afhngig og stiger med pH optil 8,5.
Krydsresistens kan finde sted mellem de fire ovennvnte antibiotika.
Nyere makrolider er semisyntetiske molekyler der har substituenter p lakton ring systemet. Se. s. 110
fig.5.12 og 5.13.
Polypeptid antibiotika
1. Bacitracin som kun virker mod Gram-positive bakterier.
2. polymyxiner som er aktive mod mange typer Gram-negative bakterier, men ikke gram-positive.
3. 2 antituberculre antibiotika capremycin og viomycin.
Bacitracin bruges eksternt pga. dens toksitet.
Capremycin og viomycin virker mod M. tuberculosis.
Miscellaneous antibakteriel antibiotika
Se side 113 fig. 5.14.
Chloramphenicol har bakteriostatisk effekt. Den har anti-rakitissal aktivitet og har hmmende effekt p
store viruser.
-
Nogle bakterier kan producere et enzym, kaldet chloramphenicol acetyltransferase, som acetylere hydroxyl
grupperne i side kden af antibiotikaet, som gr at den mister sit antibiotikum effekt.
Fusid syrer er aktiv mod mange typer af Gram-positive bakterier. Streptococci er resistens.
Lincomycin virker mod Gram-positive cocci, p nr Enterococcus faecalis. Gram-negative bakterier er
mindre sensitive og enterobakterier er resistente. Kryds resistens af staphylococci kan finde sted mellem
lincomycin og erythromycin, men nogle erythromycin resistente organismer kan vre lincomycin sensitive.
Syntetisk antimikrobielle stoffer
Sulfonamider er illustreret p side 116 fig. 5.16.
Sensitive bakterier: strep. Pneumoniae, -haemolytisk streptococci, E. coli og proteus mirabilis.
Resistente bakterier: Enterococcus faecalis, Ps. Aeruginosa, indol-positive Proteus og Klebsiella.
Sulfonamider bruges til behandling af ikke kompliceret urin infektion forrsaget af E.coli i hus praksis.
Nitrofuran forbindelser er illustreret p side 119 fig. 5.18.
Disse forbindelser bestr af en furan som har en nitro gruppe p position 5 nr den er 2-substitueret. De
vigtigste nitrofuraner indeholder azomethin gruppe ved C2 og nitro ved C5.
Den biologiske effekt mistes nr:
1. nitro ringen reduceres
2. nr azomethin gruppen gennemgr hydrolytisk dekomposition, eller
3. Nr vinyl linkagen oxideres.
Furazolidon virker mod de fleste enterobakterier og har vret brugt til behandling af diarrhoea og
gastrointestinel forstyrrelse af bakteriel afstamning.
Se flere nitrofuraner side 119.
Nitrofuraner siges at vre mutagene.
Stof kombinationer
En kombination af to antibiotika giver:
1. synergistisk effekt, dvs. joint effekten er hjere end summen af hver stofs effekt alene.
2. additiv effekt, hvor den kombinerede effekt er lig med det regnede sum af de to individuelle stoffers
effekt.
3. antagonisme, hvor der er mindre effekt af blandingen end det mere potente stof effekt alene.
-
HUGO OG RUSSEL kap 9
Kapitel 9 Bakteriel resistens mod antibiotika Indre og opnet resistens
Antibiotika resistens kan inddeles i to hoved typer: indre og opnet resistens.
Indre resistens er arvelige egenskaber fra bakterierne som er ansvarlig for forhindring af antibiotika
aktivitet. Dvs. resistensen er medfdt. F.eks. s er mange antibiotika aktive mod Gram-positive bakterier,
men kan s vre inaktiv i Gram-negative bakterier og omvendt. Tabel 9.1 side 182 viser aktiviteten af flere
antibakterielle antibiotikum.
Opnet resistens finder sted nr bakterier som tidligere har vret modtagelig bliver resistente, normalt men
ikke altid, efter de er udsat for antibiotika.
Opnet resistens sker ved mutationer i kromosomet eller ved erhvervelse af genetiske kode for resistens fra
ydre kilder, normalt plasmid eller transposon.
Genetisk basis af opnet resistens
Resistens mod specielle antibiotika kan finde sted som en konsekvens af mutering af kromosomale gener
pga. ndring i DNA rkkeflgen.
Transition involverer substitution af en purin (A/G) for en anden og derfor en pyrimidin (C/T) for en anden.
Transversion involverer ndring fra pyrimidin til purin og omvendt.
Frameshift mutation finder sted nr en eller to baser indsttes inden i DNA rkken, og resultere i en
forandret reading frame og derfor en forandret gen produktion.
Plasmider er ekstra