Arabidopsis thaliana tip120Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzéseinszerciós mutáns jellemzése

Gazsó István

Témavezető: Dr. Szabados László Konzulens: Dr. Maróy Péter

Az eukarióta gének csoportjai

• I.-5.8S, 18S, 28S rRNS

• III.-5S rRNS, tRNS

• II.-fehérjék

TFIIHTFIIA

A transzkripciós iniciációs komplex A transzkripciós iniciációs komplex kialakulásakialakulása

TATA

TBP

POLIITFIIF

TFIIB

TIP120 TFIIE

A TIP120 fehérje néhány jellemzője

• 1230 AS, szimpla polipeptid

• Affinitást mutat a TBP-vel és az RNS Pol II Rpb5 alegységével

• Az iniciációs komplex összeszerelődését serkenti

• A funkció betöltésében fontos a molekula N-terminális 1/3-a

• A TIP120 fehérjét kódoló gént kimutatták patkányban, Coenorhabditisban, Drosophilában, emberben, Arabidopsisban

Inszerciós mutagenezis

Növényi génexon/intronpromóter 5' UTR 3' UTR

T-DNSLB RBT-DNS inszerció

Funkcióvesztéses mutációFunkcióvesztéses mutáció

A H911 vonalban azonosított mutáns

Columbia:normál

fenotípus

H911/4:apró fenotípus

A H911 mutáns virágja

Columbia:Normál fenotípus

H911/4:Majdnem teljesen steril

T-DNS inszerció pozíciója a H911 vonalban

Protein: feltételezett TBP kölcsönható fehérje (120 kD) (TBP Interacting Protein, TIP120)

T-DNS inszerció: 13. exon (3301bp)Gén: At2g02560

R L

2. Krom., BAC T8K22

Lokalizáció: 2. kromoszóma, AT2G02560 jelű lókusz

Exon-intron szerkezet: 28 exon

Az Arabidopsis tip120 gén

A H911 vonal szegregációs analízise

LB primerLB primerT-DNST-DNS

H911A

H911B5’ 3’

PCR primerek vad típus heterozigóta homozigótaH911A+B + + -H911B+LB - + +

1500bp1000bp

750bp

1500bp1000bp

750bp

800bp, H911A+H911B

600bp, LB1+H911B

Alvonal: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Fenotípus: n n n n n n n n a aGenotípus: +/+ +/+ +/- +/- +/- +/- +/- +/+ -/- -/-

PCR analízis eredménye

A tip120 gén expressziójának vizsgálata

1. Northern analízis: vad típusú Arabidopsis, illetve apró fenotípusú mutáns totál RNS felhasználásával: nincs detektálható jel.

2. Realtime RT-PCR analízis: tip120 CT értéke: 20.97actin kontrol CT értéke: 15.61

tip120 gén expressziós szintje 32x alacsonyabb az actin gén expressziós szintjénél.

A TIP120 fehérjét kódoló teljes hosszúságú cDNS klónozása

TIP2

ATG STOP

TIP1

PCR-amplifikálás (ELONGASE enzim, Invitrogen)BamHI- klónozás pBLUESCRIPT vektorbacDNS- klón: 3990 bp

pBS SK+

A cDNS szekvenálásának stratégiájaTIP1 H911A TIP3 TIP4 TIP5 TIP6 TIP2

BamHI

A tip120 cDNS-klón vázlatos térképe

5’ 3’BamHI SacI EcoRI BamHI

ESTT17 T17

ATG STOP

A tip120 cDNS további klónozása:pAS2 kéthibrid vektorpPCVB1 expressziós vektor

Összefoglalás- a H911 mutáns előállítása T-DNS inszerciós mutagenezissel- az apró fenotípust a tip120 génben bekövetkezett homozigóta inszerció okozza- a tip120 expressziója alacsony szintű-a tip120 cDNS klónozása pBS, pPCVB1 növényi expressziós vektorba-élesztő-kéthibrid rendszer kidolgozása folyamatban van

Köszönetnyilvánítás

-Dr. Szabados László-Dr. Kovács Izabella-Dr. Martha Alvarado-Dr. Ökrész László-Zsigmond Laura-Ábrahám Edit-Bíró Anikó -Dr. Maróy Péter-Dr. Boros Imre