TEMA 1Conceptos básicos

PAG 6F + = DonanteF - = Receptora

Cuando se forma un puente de conjugación se adoopta ésta nomenclatura.Si el puente se rompe más tarde (no deja de ser una estructura proteica relativamente blanda, es parte de la membrana) entonces el fragmento transferido será más grande.Si se rompe antes, el fragmento será pequeño.

Por esta regla de tres, genes pròximos serán transferidos (a la vez) con más probabilidad que genes distantes. (=Qüestión de probabilidad).

El DNA una vez interiorizado dentro de la celula receptora se inserta dentro del material genètico quedando de forma circular. Hay 2 tipos de ciclos:

- Lisogénico: Se incorpora en "attach-sites" peró no mata a la población. Hay un reatardo en el crecimiento.

-Lítico: Cuando se induce la transcripción del gen. Se puede inducir mediante h (UV) A veces formas aberrantes de DNA son encapsidadas, si tienen un tamanyo propicio y óptimo para poder hacerlo. Llevan parte de DNA del fago y parte de la bacteria. (S'utilitza bastant)

DESCUBRIMINETOS DE RELEVANCIA: (PAG 9)1.- PLÁSMIDOS NATURALES.

Són episomas que confieren actividad antibacteriana.

Verde = SensibleRojo = Resistente.

Al poner en contacto 2 bacterias de diferente cepa , entonces hay conjugación. El plásmido confiere resisténcia y F + entonces forma el puente de conjugación. El factor F + lo lleva el mismo plásmido. (muy importante).

2.- ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.

Tenemos 2 cepas. E.Coli K i C. Infectamos K con fago . Luego trasladamos e infectamos la C a partir de la K. Al cultivar observamos calvas; cada una de las bacterias infectadas produce una calva. EOP = 1 (Tanto por uno de eficiéncia = 1; osea todas).

Ahora infectamos C con . Luego trasladamos e infectamos K a partir de C. Se observa que al cultivar, las calvas disminuyen. Hay una restricción de crecimiento. EOP = 10-4. Se observó que las particulas K eran distintas que las C. Estaban metiladas.

El experimento consistió en: E.Coli K + K ( P32 ) + C ( H3 ). Hacemos sedimentación. El resultado fue que el P 32 estaba pero el H3 NO. Se descubrieron las endonucleasas restrictasas. La K no reconoce el metilado y degrada el DNA foráneo. 1 de cada 10.000 infecta; es por eso que el índice de calvas disminuye.

EX: Eco R1, ........

TEMA 2Recombinación de DNA "in vitro".

EXPERIMENTO DE CORTE (CUT & PASTE) (Pagina 1)

Cogemos un plásmido de dcDNA. Seleccionamos diana con una enzima de restricción. Dejamos extremos con una seqüencia concreta. En el DNA foráneo hacemos lo mismo. Entonces los extremos pertuberantes serán los mismos.Ahora es el momento de desnaturalizar-los y juntarlos. Aleatoriamente se uniran por dónde queremos, aunque es evidente que también se unirán por donde sea (=es al azar). Habrá de todo!!!!. Estará NO covalentemente unida, habrá un nick, necesitaremos la ayuda de una ligasa para sellar el nick y concluir.

ENZIMAS USADAS EN BIOLOGIA MOLECULAR (Páginas 2,3)

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (Tabla - Página 4)

Tipo I : Reconocen dianas específicas. Hacen de restrictasas.

Tipo II : Separadas en 2 actividades. Són más inespecíficas. Hacen cortes más "chungos", más malos.

Tipo III : Corte muy precíso. Reconoce palíndromos. Corta dentro de la diana.

ECO R1: Endonucleasa de restricción típica de Tipo II. (Pagina 5,6,7)

Reconoce GATTC (=diana). Dc DNA. Corta lugares concretos. Corta enlaces fosfodiester dejandolos fosforilados. Produce extremos cohesivos.Forma extremos 5' protuberantes AATT o complementarios. pG / pApApTpTpC.Reconoce un entorno de 10 pb aprox.

5' G A T T C 3' 5' G | A T T C 3' 3' C T A A G 5' 3' C T A A |G 5'

Hay pluralidad de enzimas de restricción. Hay 400 reconocidas con 150 dianas específicas.

Si cortan por el centro del palíndromo entonces formará extremos rombos, NO cohesivos.Hay algunas de Tipo II que no precisan tanto pero las englobamos aquí ya que estructuralmente són parecidas; no deja de ser una mera clasificación!!.

ISOESQUIZÓMEROS: És una relación que se establece en ciertas enzimas. Són enzimas que reconocen la misma diana pero que cortan por diferente sitio.

Suma I 5 ' CCCGGG 3 ' 5 ' CCC | GGG 3 ' 3 ' GGGCCC 5 ' 3 ' GGG | CCC 5 '

Xuma I 5 ' CCCGGG 3 ' 5 ' C | CCGGG 3 ' 3 ' GGGCCC 5 ' 3 ' GGGCC | C 5 '

* Star-activity: Condiciones en que la diana se hace menos restrictiva. Són condiciones NO optimas que desestabilizan la enzima y hacen que el corte no sea tan preciso. Corta en otros sitios. No todoas tienen start-activity. A veces puede ser útil si conocemos el grado de incertidumbre que tienen.

* Puede pasar que distintas enzimas de restricción reconozcan dianas parcialmente idènticas y produzcan extremos idènticos. La resultante puede ser reconocida por alguna de estas 2 o a veces ni siquiera por ninguna. Todo depende!!!! (Por lo general depende del nucleótido que queda solo).

EJ:

Sol I Xho I

5 ' ....G | TCGAC ..... 3 ' 5 ' .......C | TCGAG ..... 3 '3 ' ... .CAGCT | G ...... 5 ' 3 ' .......GAGCT | C.......3 '

Fem la suma:

5 ' ....G TCGAG ..... 3 '3 ' ....C AGCTC .......5 '

No es reconocida ni por "Sol I" ni por "Xho I"

EJERCICIO.Enzima Cortes

Xba I 24 , 24.5Xho I 15 , 33.5Kpn I 1.5 , 17 , 30Xba I + Xho I 9 , 15, 24.5Xba I + Kpn I 1.5 , 6 , 17 , 24

* Al hacerlo vemos que nos encontramos con un problema. Con estos datos somos incapaces de ver como estan ubicados en el espacio los cortes 30 , 1.5 , 17....entonces.....

Realizamos una digestión parcial.!!!

Colocamos Kpn I y NO permitimos que se haga toda la reacción. En algún fragmento se daran los 2 cortes, en otro quizá uno y en alguno, ningun corte. (=Es una qüestión de tiempo).

Ponemos Kpn I (limitado) se observa = 1.5 , 17 , 18.5 , 30 , 31.5 , 48.5 Total

Aparecen 2 fragmentos más: 31.5 y 18.5. Si nos fijamos tenemos :

18.5 = 17 + 1.5 Quiere decir que 1.5 va en medio de los dos . 31.5 =30 + 1.5 Freqüentemente nos encontramos frente a un problema. Tenemos un inserto de interes dentro de nuestro vector. Conocemos nuestro vector y probablemente habra una diana del DNA de interés que será común con nuestro vector entonces.........entra en juego...

(Fotocopia 10)EZIMAS DE TIPO II llamadas METILASAS.Las metilasas metilan bases. Entonces las endonucleasas de restricción NO cortan.!!! Si las bases estan metiladas las endonucleasas de restricción NO ejercen su función.

Las dianas se pueden ocultar mediante metilaciones. También podemos descubrir el estado de metilación en algunas partes ya que hay isoesquizómeros que digieren las dianas metiladas que otros NO pueden.

(Fotocopia 11)Usaremos Taq I cuando queramos cortar freqüentemente (Corta dianas pequeñas)Usaremos Sf I cuando queramos hacer cortes poco freqüentes. (Corta dianas grandes)METODO SAUZER (??)

NUCLEASAS:

Las nucleasas cortan DNA o RNA. Hidrolizan enlaces fosfodiester. Según corten sc/dcDNA o scRNA tendremos las variedades y segun su actividad tambien; pueden ser exonucleasas o endonucleasas.Exonucleasa: Degradan por los extremosEndonucleasa: Degradan por el medio.Pueden cortar:

5 ' pApCpTpG 3'

5 '....... pAp + HO-CpTpG..... 3 ' Ó 5'...... pA-OH + pCpTpG....... 3 '

Mirar TABLA 4.1

EJEMPLOS:

* S1 nucleasa: Actividad endonucleasa. Preferència por monohebra. (sc RNA / sc DNA). (Mejor por DNA)La usamos para cortar i discernir entre dc DNA o sc DNA. Utiliza Zn como cofactor.- Tambien és capaz de acabar de separar una dc si tiene un mella en alguna cadena. La S1 reconoce la monohebra y corta; asi pues obtendremos una doble hebra cortada.

- Tambien puede limar esxtremos protuberantes causados por una enzima de restricción.- Corta horquillas- Corta regiones desapareadas, huecos, inserciones- Corta todo aquello que sea monohebra.

* DNAasa I: Actividad endonucleasa. Hidroliza DNA (sc/dc). Corta en lugares adyacentes a pirimidinas. (C y T). Esta enzima tiene una particularidad y es que depende un poco del cofactor.

Mg+2 : Corta las dos cadenas por lugares al azar. Introduce "nicks" en las 2 cadenas.Mn+2 : Corta las doas cadenas por lugares "idènticos", así pues se prduce la rotura covalente del dcDNA.

- Se usa para introducir "nicks" al azar, para realizar "nick translation", para generar clones al azar, etc...

* RNAasa A y RNAasa T1: Actividad endonucleasa. Hidroliza sc RNA.Ataca al enlace entre fosfato i extremo 5' -OH.

.La RNAasa A = Hidroliza pirimidinas ( C y U ).. La RNAasa T1 = Hidroliza guaninas (G).

- Elimina regiones no hibridadas entre DNA: RNA (=ideal para degradar "primers")- Detecta desapareamientos entre cadenas DNA : RNA.

* BAL 31: Esta enzima tiene 2 actividades. Actividad exonucleasa y eactividad endonucleasa.

Exonucleasa: Mirar fotocopiaEndonucleasa: Mirar fotocopia

* EXO III: Actividad 3' exonucleasa. No degrada extremos 3' protuberantes. Requiere extremos romos o 5' protuberantes (és decir, 3' "hacia adentro").Utiliza Mg+2 como cofactor.Los productos que se obtienen son HO-Tambien tiene actividad 3 ' fosfatasa. DNA (dc/sc). Los enlaces fosfodiester internos no se hidrolizan.Tambien tiene actividad RNAasa H.Una aplicación bastante curiosa és que puede hacer degradaciones anidadas; és decir 1 a 1. Nosotros decimos cuando queremos que pare!!!!. Va bien para observar que bases controla un gen.No degrada grupos tiofosfatos.

* FOSFATASA ALCALINA: Desfosforila. DNA o RNA (sc / dc). Deja un grupo 5' desfosforilado. Produce una mella. Es capaz de degradar el extremo 5' pero NO del nick. Con un poco de desnaturalización alcalina entonces tambien ataca al extremo 5' del nick.

* FOSFATASA QUINASA: Fosforila extremos 5' hidroxilos. DNA o RNA (sc / dc). Añadimos ATP + Mg y el producto és fosforilación del extremo 5' + ADP. (=es quinasa)

És facil de marcar con 32 P. Tiene que ser muy pura ya que hay muchas reacciones parasitàrias.Podemos hacer intercanvio. Podemos marcar aunque esté el extremo 5' fosforilado. Hacemos intercambio y ademas marcamos con 32 P. Ponemos exceso de ADP para que la reacción esté un poco desplazado a la izquierda; no tan a la derecha. Usos:

- Marcar extremos- Visualizar diana (=los productos obtenidos són pequeños)- Dirigir unión de fragmentos ya que se necessita que esten fosforilados.

* T4 DNA LIGASAS: Liga extremos cohesivos y romos. Tiene mas eficiencia que E.Coli DNA ligasa. Necesita extremos 5' fosfatados.

* E.Coli DNA LIGASA: Sólo liga extremos cohesivos. Necesita extremos 5 ' fosforilados. És menos eficiente.

* NOTA: Si tratamos con fosfatasa NO hay extremos 5' fosforilados; entonces la ligasa NO une. És ahora cuando ponemos nuestro DNA de interés y ligamos.!! Evitamos así concatenarios.!!

CONECTORES: Fragmentos de síntesis que contienen una diana de interés. Són fragmentos de dc con una diana y un poquito más para facilitar el reconocimiento.

* NOTA: Siempre y solo siempre que NO hayan dianas dentro de nuestro DNA de interés o si están metiladas. Abrimos el plásmido y PUM !!! Lo metemos de forma orientada además. Podemos minimizar los productos secundários (=Logramos reducir los concatenários)

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* TRANSFERASA TERMINAL: Addicióna nucleótidos al extremo 3 ' pero tienen que ser protuberantes.. Utiliza DNA (sc/dc). No copia molde así que si añadimos T al medio genera una cola de poli T. Si ponemos 2 nucleótidos los añade al azar.!Para utilizarla en dc DNA mejor hacer una desnaturalización con Ca+2 en vez de con Mg+2. Apriori funciona mejor con extemos 3 ' protuberantes.

2 / 3 / 04 TEMA 3PLáSMIDOS

Conceptos Básicos:

Vector: Vehículo de clonación. Aporta un origen de replicación y aporta un gen marcador. Podemos observar entonces qué cel.lula ha recibido plásmido y cual NO. (Lleva implícito la supervivéncia). Hay una transformación de aquella cél.lula que lo ha recibido.

E.Coli como célula huésped:

- Generalidades:

De E.Coli se utiliza la cepa K-12. Es muy conocida genética y bioquímicamente. El DNA recombinante és estable dentro de E.Coli y puede llegar a acceptar varios plásmidos. Además E.Coli permite producir muchas proteïnas. És un húesped "hospitalario" NO modifica los plásmidos ni los estropea; los replica fielmente.

*NOTA: Para que E.coli accepte un plásmido hay que volverla COMPETENTE. Se hace un tratamiento a base de CaCl2 y luego un tratamiento de xoque térmico; así se logra que E.coli accepte el plasmido en qüestión.

Hay ciertas desventajas también. E.Coli produce una toxina (=lipoproteïna) que contamina.En eucariotas los RNA son sometidos a ciertas modificaciones pre o post-taducionales (=SPLICING) (Se eliminan intrones, se metilan o glucosilan, etc....). Esto E.Coli NO lo puede hacer, así pues hay que tenerlo en cuenta también a la hora de trabajar con ellas. Podemos eliminar intrones artificialmente o buscar rutas alternativas.

- Discriminación entre cél.lulas transformadas y NO transformadas.

De la cepa K-12 hay muchas sub-cepas. Se utilizan cepas mutadas con problemas de restricción de DNA (degradación), o de metilación. Depende de el protocolo ( = via de síntesis) que vayamos a utilizar.

MARCADORES DOMINANTES: Dan resisténcia a la célula a ciertos antibióticos. En cuanto entra junto al plásmido manda!!.

AMPR: (Degrada la paret bacteriana). B-lactamasa destruye la AMP (=ampicilina)

CAMR: Sintetiza una CAT (transferasa). Ésto metila al antibiótico y deja de ser nocivo para ella.

TETR: (Bloquea la síntesis de pared). Fabrica un transportador que bombea al exterior la tetraciclina.

KANR: (Bloquea la síntesis de pared). Esto metila al antibiótico y deja de ser nociva para ella.

SELECCIóN DIRECTA: Utilizamos sub-cepas mutadas, para que tengan que utilizar algún sustrato que nosotros añadamos al medio.

Pro AB: Cepas que necessitan prolina para vivir. Se llaman auxotrofas para prolina.Pro AB + : Ellas mismas fabrican prolina. En un medio SIN prolina son capaces de crecer.!!!

Otra manera de selección , és con el OPERON LAC. (PAG 2-3)

El operón lac transcibe para la B-glactosidasa. Generalmente está inhibido; hay una proteína que hace "saltar" a la polimerasa y no deja transcribir el gen. En preséncia de lactosa, ésta inhibe el inhibidor de tal manera que el operón lac ahora si que se transcribe!!!. Fabrica B-galactosidasa, ésta enzima degrada la lactosa.

La B-galactosidasa consta de 2 sub-unidades. La y la . Solas no funcionan, es decir, se necesitan las 2 para que la B-galactosidasa sea funcional.

Sabemos que B-gal y X-gal (5,Br - 4,Cl - 3,indol - B-D-galactosa ) forman un cromóforo de color azul.

Se suelen utilizar cepas que contengan 1 subunidad; por ejemplo la . El plásmido que añadimos contiene la información para codificar la sub-unidad y además nustro vector. Así pues , en un medio que contenga X-gal se puede discernir entre cepas transformadas y cepas NO transformadas. Las transformadas serán azules. (=se observaran a simple vista).

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dam: Metila adeninas. GATC --> G mATC.

dcm: Metila citosinas CC(AT) GG --> C mC(A

T) GG.

*NOTA: Muchas enzimas de restricción NO cortan DNA's metilados. Es mejor buscar cepas de E.Coli que NO tengan metilasas que interfieran en la diana que queremos !!

Plásmidos: Cerrados covalentemente; són elementos genéticos accesorios que se replican y se heredan de manera independiente al cromosoma bacteriano. Para replicarse necesitan la maquinária apropiada, y para transcribirse también. Muchos plásmidos confieren beneficios para la célula (=Resisténcia a ciertos antibióticos, posiblidad de "comer" otros sustratos, etc..).

En Ingenieria genética la mayoría són artificiales. (=Creados por el hombre a partir de plámidos naturales ya existentes.). Un plásmido tiene varios módulos. Uno imprescindible és el ORI (origen de replicación). Éste és imprescindible para que se lleve a cabo la replicación; todos lo llevan!! El origen de replicación má toda la zona que controla la replicación se llama REPLICóN.

NATURALES: Ejemplos.

Factor F: Va a salir bastante.Factor R.PMB I.COLE I.

Factor F: Expresa para una proteína de membrana. (=Pili sexual). Da sexualidad a la bacteria. La conjugación és unidireccional; se da de una bacteria F+ (con pili) o otra F- (sin pili).El factor F puede o NO introducirse en el cromosoma bacteriano; si lo hace, se habla de cepas Hfr (=High frequency replication). También puede salirse. A veces es possible que salga con una pequeña fracción de cromosoma bacteriano. Se habla entonces de F ' . Normalmente se puede llevar un fragmento de cromosoma llamado lac Z M15 (Extremo 3') que codifica para la sub-unidad (Vista anteriormente) .

* NOTA: El numero de copias del plásmido és variable; hay algunos que sólo están presentes 1 por célula (=Factor F), otros de 30-50 copias por célula (PBR) e incluso otros 500 copias por célula (pUC).

Si el Nº de copias es bajo, decimos que hay una replicación severa (menos de 10 copias)Si el Nº de copias és alto, decimos que hay una replicación relajada ( más de 50 copias)

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La proteïna Rop aumenta la replicación y por lo tanto augmenta el Nº de copias.

La proteïna Rep és imprescindible. Actúa directamente sobre el Origen de Replicación. Inhibe su propia expresión. (Crea un feed-back negativo). Hace que baje el Nº de copias. Es muy bueno para el control; siempre necessitamos síntesis de esta proteïna (=Rep).

Los plàsmidos puc pueden inhibir ésta síntesis proteïca; peró el plásmido se puede seguir replicando ya que éste sólo depende de Rop/Rep que són de vida larga/media. Cuando NO haya rep dejará de replicarse; SON IMPRESCINDIBLES !!

Cuando 2 plásmidos comparten el mismo O.R són incompatibles. Si no comparten el mismo O.R entonces serán compatibles. Se pueden tener varios en una misma cél.lula.

Lo más normal és que los plásmidos sean de 6 ó 7 Kb. Un plásmido cuando más bajo de PM mejor. Si són de 12 Kb o más la replicación és menos eficiente; se hace menos estable; perdemos eficiencia. Se replica mal y podemos obtener recombinaciones con DNA bacteriano.

TEMA 4" FAGO "

. GENERALIDADES.

Se clonan ellos mismos. Si infectamos una placa de bacterias entonces; apareceran calvas, lisan las bacterias. Todos los fagos de una calva povienen del fago perental; tenemos clones del primer fago. Aquí podemos insertar un DNA de 25 Kb aproximadamente. En plàsmidos lo normal és hasta 7 Kb. Los fagos són mucho más eficientes que los plàsmidos a la hora de introducir DNA en bacterias. En teoria aquí la eficiencia és de 10 10 - 109 aprox. Són 100 veces más que en plàsmidos.

Cuando se infecta una bacteria pueden suceder 2 cíclos:

- Lisogènico: Se integra en el cromosoma y se repica junto al cromosoma.- Lítico: Se integra en el cromosoma y se replica de forma bidireccional y después se forman

concatenàrios que serán el sustrato para formar nuevos fagos que lisarán la célula.

Como se sabe si un fago va a realizar un cíclo lítico o un cíclo lisogénico ?

Nos lo dice una relacion de proteïnas. Una relación de concentraciones.Proteïna C1==> LisogénicoProteïna CRO ==> Lítico

El genoma de "" contiene 49 Kb . La distáncia entre sitios "cos y cos" para poder encapsidar en el fago és de 37 - 52 Kb; esto nos deja muy poco margen para introducir nuestra DNA de interés. Podemos eliminar regiones del genoma dispensdables y así hacer hueco. Las regiones indispensables ocupan un 70 - 75 % del genoma: aproximadamente 35 Kb. Nos quedan unas 20 Kb para poder insertar nuestro DNA de interés.

El fago "" se puede cortar con Bam H1 y el DNA humano con Sav 3A ya que dejan extremos compatibles y se pueden unir mediante una ligasa!!!

Podemos encontrar 2 tipos de vectores:

Vectores de substitución: Sustituimos la región dispensable por nuestro DNA de interés.

Vectores de inserción : Se corta con una enzima de restricción y se introduce el DNA; lo que pasa es que aquí se vacia un poco más para que quepa más DNA de interés. Aproximadamente 5 - 7 - 10 Kb aproximadamente.

9 / 3 / 04Empaquetamiento "in vitro": Al expresarse la proteïna se forman las cápsidas y las colas de los fagos por separado. No se juntan hasta que el DNA entra en la cápsida. A partir de aquí clonar és muy fácil porque el fago tiene gran eficiencia en meter su DNA en bacterias y además tiene intacta la zona génica del cíclo lítico.

Podemos tener cepas lisogénicas con alguna mutación enb el DNA del fago.

Normalmente estas bacterias vivirían sin problemas; peró si irradiamos con UV el profago salta y se formará una "sopa" de cabezas, colas y DNA peró no se podra unir porque falta A o E respectivamente!!!

Si de las 2 cepas cogemos las proteïnas y añadimos DNA recombinante podremos formar nuevos fagos porque no le faltará nada y podrán entrar en el ciclo lítico.

Selección de recombinantes: Hay veces que se producen contaminaciones de DNA. Para distinguirlos hay varias maneras:

1.- Mediante el tamaño. Entre 37 - 53 Kb

2.- Mediante gt 10. És un vector de inserción de inmunidad. Introducimos DNA de hasta 7 Kb justo en el sitio que codifica para C1 (Activa lisogénico). Inutilizamos C1. Las que tengan el inserto van a tener ciclo lítico ya que no tendrán C1.

3.- Mediante gt 11. Funciona como vector de inserción. Tiene un fragmento que codifica para el fragmento de la -galactosidasa. Utilizamos una cepa lac negativa. Metemos el DNA de interés en el sitio de la que codifica justamente para el fragmento ; así pues no tendremos proteïna y la calva NO será azul.

Si el fragmento introducido lo hace en la pauta de lectura de lac z, se formarán proteïnas híbridas y podremos hacer el "screening" con anticuerpos. (PAG 365 del libro)

4.- Selección por fenotipo Spi. Hay cepas lisogénicas de E.Coli con el fago P2 donde el fago"" NO puede realizar su cíclo lítico. Si introduzco un fago "" con gen Red y Gam no pueden crecer en estas cepas pero quitando estos genes de "" si que van a crecer. (MIRAR MEJOR)

* Cósmidos: Es un plásmido peró con regiones "cos". Las regiones cos són los extremos de 12 pb; pero para que sean reconocidos por las proteïnas NU y A se necesitan unas 250 pb de alrededor. Aprox 524 pb.

Con digestiones parciales obtenemos 35 - 45 Kb de DNA genómico. Lo introducimos en el "polylinker". Añadiendo ligasa se pueden formar concatenámeros.

Si entre "cos y cos" hay entre 37 - 52 Kb se puede ir empaquetando en fagos e ir introduciedo el primer genoma en una bacteria.

* Fásmidos: Fago "" con el plásmido PBR 322 en la región dispensable y con un repressor (= inhibe ciclo lítico) sensible a la temperatura. A temperatura baja funciona como un plásmido; en cambio, al subir la temperatura "nos cargamos" el repressor ) y la bacteria entra en ciclo lítico.

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TEMA 5Vectores de DNA sc / dc

Se empezaron a utilizar para la necesidad de DNA de cadena sencilla. Los más importantes són: M13, fd, f1. Aproximadamente de 6.4 Kb. Són muy parecidos. Se necesita scDNA para la secuenciación, mutagénesis dirigida, sondas monohebra.... Su genoma está muy compactado. Tiene 10 genes. Presenta una región intragénica dónde hay los orígenes de replicación. Dentro de la cápsida hay la cadena "+ " y dentro del huésped se forma la "-". Tendremos la forma replicativa del fago de cadena doble.

Regió Intragènica: - Ori "+" i "-" . - Señal de empaquetamiento (mos)

NOTA: Es inprescindible utilizar cepas F+ , F' o Hfr porqué se necesitan pilos en la membrana.

PAG 15 (Fago filamentoso) Ciclo de vida

En el ciclo de vida del fago intervienen un montón de proteïnas denominadas PIII, PV, PVI, PVII PIX pVIII. Son productos para construir el fago, proteinas de la capsida i maquinaria para replicar el DNA.

En la cadena "+", la proteina V reconoce la señal de empaquetamineto para que sea ésta la que se empaquete y no la "-".

La más importante de todas estas és la PII. Esta proteïna reconoce el OR "+" del DNA. Tiene actividad de unión, és endonucleasa específica, polimerasa , helicasa y además ligasa.

PII reconoce una región intragénica y realiza un "nick". Luego polimeriza en sentido 3' -->5' mediante la técnica de circulo rodante. Ver esquema adjunto.

* NOTA: P II reconoce DNA. Lo corta (endonucleasa), polimeriza una nueva hebra (polimerasa/helicasa=deshaze la hélice) y finalmente une los 2 extremos (ligasa). Así pues tenemos 2 cadenas de DNA.

Este proceso va siguiendo hasta que tenemos suficientes formas replicativas (Aprox 25).

A medida que la concentración de proteïnas aumenta, aumentan los sustratos. Tambien aumenta la proteïna pV y ésta és la que realiaza una función reguladora. Quando p V llega a una concentración suficeinte; se para la síntesis. (=Secuestra ssDNA). Finalmente mediante la proteina VIII vuelve a salir del huésped.

FAGÉMIDOS (PAG 16)

Los fagémidos són plásmidos que contienen un OR de un fago filamentoso. Un ejemplo de fagémido és el pGEM 3zf porque le hemos introducido la región intragénica de un fago filamentosos.

Encontramos también SPS promter. Se une a una RNA polimerasa. Sirve para hacer transcripciones "in vitro". Normalmente hay dos promotores, el SP6 , i T3 o T7, etc.... se introducen dos para poder clonar las dos cadenas. Justo despues del promter se pone lo que se vaya a clonar.

Puede quedar de 2 maneras; o en el mismo sentido del promotor o en sentido opuesto. Supongamos que insertamos un operon lac Z. Si éste se introduce en el mismo sentido del promotor tendremos una configuración +. Si se introduce en sentido opuesto la configuración será -. Por convenio:

+:sc a empaquetar contiene la seqüencia que codifica para lac z. Si infecto con esto tendre virus con lac Z.-: Normalmente se empaqueta la "+". Entonces si lac Z se introduce de forma "-" tendre virus sin lac Z

Si infectamos a un huésped con el fagémido no se formaran fagos!. Necesitamos de las diferentes proteïnas de dicho fago para poder encapsidar el scDNA.

Entonces que hacemos ?Necesitoamos de un "fago helper"!!

FAGO HELPER (=fago salvaje)

Le damos un flagémido que codifique para todas las proteïnas del fago (pV,pII,pIII, pVIII, etc..). Tienen que ser F+, F' o Hfr. Este fago "adicional" proporciona todos los elementos. Esto en un cultivo producirá el salvaje y el de interés. Lo que sucede és que la eficiéncia de empaquetamiento del fago salvaje és muy mala; se empaqueta mal porque hemos escogido una cepa que así lo haga. Así pues preferentemente se empaquetarán los de interés. (=Esta técnica está actualmete obsoleta)

FAGO - ZAP:

Combina fago con fagos filamentosos. Se utilliza mucho para realizar librerias. Una vez localizado el clon que queremos, trabajar con fago és muy laborioso. Si utilizamos - ZAP és mucho mejor. En la región dispensable de se introduce la región intragénica de un fegémido y el DNA para clonar. Con la ayuda de un "helper" podemos escindir la zona del fagémido con el DNA clonado.

FAGO M13: (Libro pag 286)

És una de los bacteriofagos filamentosos de E.Coli. Su genoma és de scDNA circular, y contiene 6400 nucleótidos. Sólo infecta cél.lulas de E.coli que poseen pili F. (mecanismo de entrada). Sólo las células F+ són susceptibles de ser infectadas por M13.

TEMA 6Sistemas vector-huésped eucarióticos (I)

CLONACIóN EN LEVADURAS

E.Coli: 5.6 * 106 bpHomo Sapiens : 3 * 10 9 bpLevaduras: 1.4 * 107 bp

Las ventajas de la célula eucariótica són las modificaciones post-transcripcionales del mRNA (Splicing) y post-traducionales de proteïnas (glicosilación, etc..)

Las levaduras van bastante bien ya que tienen un tiempo de duplicación de 1.5-2.5 horas.Las proteïnas producidas en levaduras están libres de toxinas tipo LPS.Pueden ser tanto haploides (17 cromosomas) como diploides. Se puede inducir a la célula que sea haploide, cortando su fuente de Nitrógeno de tal manera que inducimos a que forme espóras haploides.

Existe un tipo de vector que permite clonar grandes cantidades de DNA en levaduras; se trata de los YAC'sLos YAC's són muy útiles (=Yeast Artificial Cromosoma).

YAC's: Podemos introducir hasta 1000 Kb (1Mb).(En bacterias llegabamos como máximo a 50 Kb). Existen muchos mutantes en levadura. Se aprovechan para utlizar dicha mutación como marcador de selección. Va bastante bien. Los más utilizados són: Biosíntesis de:

HIS 3 : HistidinaLEU 3: LeucinaLYS 2: LisinaURA 3: UraciloTRP 1: Nu Ze

*NOTACIÓN: En minúscula són las autotrofas "para lo que sea" ( his3 ). En mayúscula las prototrofas (HIS3).(Sintetizan ellas mismas la histidina).

Las levaduras tienen una pared polisacárida muy resistente y és muy dificil "transformarla". Hay que destruir la pared cel.lular con un proceso enzimático suave y así obtenemos un "esferoplasto". Luego tratamos con CaCl 2 y ya está!!!Luego ellas son capaces de sintetizar pared otra vez. No són esferoplastos de por vida!!!

Plásmido Episomal: PAG 23

De por sí no se puede replicar ya que tiene OR bacteriano y no eucariótico. Si se agrega al genoma de la levadura entonces si que se replicará.

Encontramos un tipo de plasmido llamado 2-m. Este si que tiene OR de eucariotas que permite la replicación. Se denomina episomal!.2-m contiene ORI, Rep 1(trans), Rep 2 (trans) , Rep 3. (está en cis, se unen a Rep 1 y Rep 2)

Rep 1y Rep 2 están en trans, función de partición. Proteïnas para la partición.

*NOTA: Se comporta como un plásmido (Episomal en levaduras!)

Plàsmido Replicativo: (Contiene un origen de Replicación ARS.) (Libro PAG 299)

Existen también unos origenes parecidos, llamados ARS (=Secuencia de replicación Autónoma) de 100 pb o menos. Estos orígenes actúan como ORI 2-m. Todas las secuencias ARS contienen un oligonucleótido común esencial para su función. Toda molécula bicatenaria circular que contenga ARS puede servir como vector de levadura y puede ser utilizado para la clonación directa en éstos organismos.En vez de 2-m ponemos ARS y entonces se mantiene de manera episomal. Lo que pasa es que ARS es inestable. La partición es muy irregular; al realizarse las divisiones se pierden, NO son equitativas.Normalmente 10-20copias / cell.Puede suceder que por azar las 20 copias vayan a parar a una célula. Decimos que se "disuelve".

Plásmido Centrómero:

YCp actúa como un centrómero de cualquier cromosoma. Perdemos Nº de copias ( normalmente de 2 a 5 por célula) .Lo bueno es que es estable, ganamos en estabilidad. Al relizarse las particiones, darán una copia a cada hija.

* NOTA: En general, todos los YAC's són circulares, pero podemos ponerlo linealmente. Al entrar, las exonucleasas lo degradan. Le ponemos telómeros y ya está solucionado el problema!!!. Permite trabajar con genes más grandes que en cósmidos (1Mb)

PFGE: Electrofesis de campo pulsante. Se pueden separar por tamaño, fragmentos muy grandes. Obligamos a reorientar las moléculas, debido a que vamos cambiando el campo eléctrico a incrementos de tiempo relativamente pequeños. Esta técnica es buena para separar fragmentos de DNA de peso molecular elevado.

Recombinación homóloga (PAG. 27)

Es bastante frequente, más que en otro tipo de celulas. Los extremos del DNA són mejores para recombinar que el DNA circular

Si tenemos un YFG que no sabemos que hace lo podemos cortar y eliminar. Cortamos y añadimos el gen URA3; entonces YFG ya no és funcional. Si tenemos entonces una DOBLE recombinación homóloga obtendremos un YFG funcional. Sabemos que URA3 és funcional porque crecen sin uracilo. Si inducimos a espurular tendremos 2 celulas sin YFG y 2 con YFG y podremos ver su actividad.

* NOTA: las levaduras són muy útiles para esto dada su alta proporción y capacidad de formar recombinaciones homólogas.

Los extremos lineales son mejores que los circulares. La recombinación tiene lugar en sitios homólogos.

Vectores lanzadera. (Libro PAG 296)

Un vector capaz de replicarse en hospedadores diversos presenta varias ventajas. Por ejemplo, los sistemas hospedador-vector de E.Coli permiten la clonación y el aislamiento de segmentos de DNA para sua análisis estructural, proporcionando un abanico amplio y rutinario de posiblidades. Sin embargo si lo que se desea realizar és un análisis funcional del inserto, debe recurrirse, por regla general, a la espécie de orígen. El DNA puede clonarse en E.Coli, separarse, reinsertarse en un vector que sea compatible con las células hospedadoras de interés. Peró la tarea se simplifica si realiza un vector capaz de "ir y venir" entre E.coli y las demás células sin mayor manipulación. Éstos vectores diseñados para replicarse en células de 2 espécies diferentes, són los vectores lanzadera. Poseen 2 origenes de replicación, cada uno adecuado a una de las especies, además de los genes requeridos para la replicación que no són proporcionados por las células hospedadoras.

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TEMA 7Sistemas vector-huesped eucarióticos (II)

TRANSFECCIóN DE CéLULAS ANIMALES.

Nos interesa trabajar con células animales porqué las modificaciones post-traduccionales són mucho más fieles que con levaduras. Si estudiamos proteínas que intervienen en procesos como la contracción muscular, en levaduras NO veremos nada.

Con las células animales podemos estudiar una proteína en su contexto. Trabajar con ellas, ha sentado las bases de la diagnósis génica.

Podemos trabajar con cultivos primários: cel.sanguíneas, hepatocitos, etc....Lo más frequente és trabajar con líneas celulares transformadas para darles inmortalidad.

P.Ej: * "cos": Célula transformada con Tag SV40.* Hela: Immortalizadas como antes con antígenos de virus HPV16 ---> E7* K562: Transformación cromosómica con la translocación T9, se formará una proteïna híbrida. ber-abl.

* NOTA: Por lo general, si tenemos un gen clonado y lo estudiamos estructuralmente, lo haremos en E.Coli.Para estudiar su función utilizamos células animales.

Para relizar la transfección podemos utilizar muchos procesos como la inyección (mediante una pistola que dispara bolas de tungsteno con DNA en el interior), liposomas, electroporación , etc... (PAG 30)

De hecho la transfección és más entendida como la introducción de DNA por endocitosis con ayuda de Ca 3 (PO4) 2 . Todos éstos métodos són fisico-químicos. Los métodos biológicos són mediante virus detectivos que contienen el material que queremos introducir. Són vectores en sentido de transferéncia génica y no de clonación.

Pero no es sficiente entrar el cDNA sinó también un promotor y una cola poli A (Casette de expressión). Este casette puede ser más o menos complicado. Si hay intrones parece que aumenta la eficiéncia. Al introducir los plásmidos con el casette, éstos se mantienen, y la transfección és transitória. Entra; se expresa ; y con las divisiones se va diluyendo su efecto.

Ésta integración és al azar y muy poco freqüente, y difícil de detectar. Se puede detectar grácias a marcadores de selección.

P.Ej:

NeoR = NeomicinaHygroR = Higromicina BPuroR = Puromicina acetil-transferasa.

Si introducimos éstos marcadores en plásmidos, sólo las que lo tengan activo sobrevivirán. Al cabo de unos días, sólo estarán vivas las células que hayan integrado el plásmido y formarán colonias. En cada clon , se integra en diferentes lugares del genoma.Si ponemos células TK - , sólo pueden crecer en un medio MAT si ponemos en el casette de selección el gen que codifica para TK.

Co-Transfección: Tenemos un marcador de selección en un fragmento de DNA y otro fragmento con el DNA que nos interesa. Se parten en proporción 1:10. Ponemos el DNA en células; se forma un precipitado de fosfato cálcico y añadimos el DNA a células TK- en medio MAT. Sólo crecerán las células dónde se haya incorporado el gen marcador TK. Hacemos crecer las colonias TK + por separado, analizamos el DNA y vemos que con alta frequéncia se ha integrado el DNA de interés.

PAG 34VECTORESDERIVADOS DE VIRUS SV 40:

El SV40 és un virus esférico de dc-DNA circular cerrado. El genoma ésta compuesto por ésta molécula de DNA. Codifica para 5 proteïnas. VP1(más importante), VP2, VP3 de cápsida del virus, etc...y también para t pequeña y T grande (si hay splicing). Aproximadamente tiene un tmaño de 5.3 - 3.9 Kb.

Ésta expresión sigue una secüencia temporal precísa; és por eso que encontramos un promotor de genes tardíos (Genes L) y un promotor de genes tempranos (Genes E) (= proteína T i t) cerca del OR. Encontramos también un sitio de poliadenilación. (Formamos el casette de expresión)

* NOTA: Se sabe que la proteína T grande és esencial para la replicación de DNA vírico que comienza poco después de la aparición de las proteínas tempranas (=Genes E). (Aunque luego, ésta proteína NO esté presente)

Si metemos SV40 en células "cos" con "T grande" les gustará esta secüéncia y se llevara a cabo la replicación a destajo !! (Sobre-expresamos)(=105 plásmidos).Si lo inserto en células "Hela" (carentes de "T grande") NO sucederá nada. A éste virus le gustan células con antígeno "T grande" !!

Encontramos distintos vectores determinados de SV40. Se eliminan regiones del genoma vírico y se sustituyen por el DNA de interés. Eliminamos genes E i/o L e insertamos un cDNA, por ejemplo, ó un YFG, etc...En función del tipo de vector que se quiera crear se remplazan una zonas detrminadas o otras. Distinguimos 3 tipos de vectores:

1.- V. Transductores:És esencial tener OR y PA. No podemos pasar de 5.3 Kb ni ser inferior 3.9 Kb. Por último tiene que existir proteína "T grande", VP1, VP2 y VP3; peró NO necesariamente aportadas por el vector. De hecho és imposible que las aporte el vector vírico ya que sobrepasaría en tamaño. La estrategia general és hacer uso de un virus "helper" que aporte todo aquello que hemos desestimado en el genoma del vector vírico.

Utilizamos un virus salvaje mutado. Lo ponemos junto a una célula que no tenga antígeno T. Tendremos proteinas t, T, Vp's, lo que pasa es que eliminamos el OR del salvaje. Así pues tendremos sólo virus recombinante. Esta técnica sólo afecta a células de mono.

Ésto es un "helper", nos ayuda a construir un virus recombinante. Se podria hacer igual si al helper le ponemos T y al nuestro , VP's. Podemos ir jugando con esto.!!! Esta técnica ésta ya bastante obsoleta!

También podemos prescindir de "helper". Lo insertamos en célllas "cos" y tenemos células empaquetadoras que se transforman en productoras.

2.- V. Plasmídicos:Són capaces de replicarse peró NO de empaquetarse. És esencial que retengan el OR y que exista proteína T grande. Se eliminan genes L (tardíos) , VP1, VP2, VP3. La proteína T grande puede ser proporcionada por celulas "cos" o por el propio vector. Su utilidad es más bien de vectores lanzadera ya que al NO ser empaquetados pueden superar el tamaño de 5.3 Kb. Problema: Son bastante inestables; NO aguantan mucho.

3.- V. Transformantes:Incapaces de replicarse de forma independiente. Son más bien un vehículo para la inserción de segmentos clonados de DNA en un DNA celular. Las células resultantes se replican cunado lo hace el genoma. Se pueden detectar con simples marcadores de selección.

DERIVADOS DE BACULOVIRUS

Fabricados para replicar proteínas para "hacer dinero". Básciamente su función és económica. Són células de insecto. Dan proteínas de gran calidad y en gran cantidad.!! Tienen una proteína que se expresa en gran cantidad; está sobre-expresada. NO és imprescindible para el baculovirus. Lo és para la naturaleza. La proteína en cuestión és la polihedrina. Forma una matriz extraña con hidrocarburos y más moléculas: Forma una espécie de biofilm en plantas, hojas, ramas de ciertas plantas; entonces los "bichitos" al comer dichas plantas se mueren; és muy perjudicial para ellos; en 15 dias mueren. (Se les deshace el estómago).

Los baculovirus són circulares de dc-DNA. Tienen un promotor muy "duro". Justo el fragmento que codifica para la polihedrina se elimina y dejamos espacio para poder introducir un gen de interés y clonarlo en un plásmido convencional.

Hacemos colonias y tenemos varias placas. Obtendremos células salvajes, células recombinantes y algunos que hayan incorporado genomas de los 2 (1/1000). Un 1% será recombinante. De todas formas el aspecto de las calvas será diferente así que podremos discernir unas de otras.

La gran ventaja que tiene és que són inocuos para los hombres , además són de fácil manipulación y contienen un promotor muy potente!!!.

DERIVADOS DE RETROVIRUS (Moluney Murine Leukemia Virus) (=Mo Mu LV)

Virus de RNA. Genrelamente són 2 moleculas de RNA idénticas. Éste virus pasa de RNA a DNA mediante la acción de una transcriptasa inversa.

5 ' R | V5 --------------------------------V3 | R 3'

La secuencia R és de repetición; está repetida!Contiene 3 genes:- gag = Grupos de antígenos

- pol = Poliproteínas; Transcriptasa inversa, Integrasa, Proteasa- env = proteïnas de la envuelta

Una vez integrada en el genoma tiene esta froma denominada pro-virus. Se integra al azar !!

5 ' V3 |R | V5 --------------------------------V3 | R | V5 3'

LTR idéntico LTR idéntico

Normalmente tienen una capa lipídica. És un virus que sale de la célula; NO la mata. En ésta envuelta se encuentra el producto de env. Són 2 proteïnas que hacen de receptor Prot S y CAT-1 que és la que infecta.Se llaman ecotrópicos; sólo infectan a células de ratón.

Los RNA són 90 % idénticos; éste 10 % de diferéncia és el que hace que se reconozca a uno y NO al otro a la hora de replicarse.El DNA del virus se integra en el genoma al azar. La región V3 tiene secuencias reconocidas por DNA polimerasas. Hace de promotor y se trancribe en dirección 3 '. Justo en V5 hay señal de poliadenilación y se termina la transcripción.

5 ' V3 |R | V5 --------------------------------V3 | R | V5 3' | | | ^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^-^- |

Una vez transcritos se encapsulan. És por eso que tienen el aspecto anterior ya que V3 y V5 no se transcriben.Si al lado tenemos un gen oncógeno nos da lugar a un tumor!!!

ADENOVIRUS

Hay células resistentes a retrovirus. Por eso se han desarrollado otros vectores. Los adenovirus NO tienen envoltorio, sólo cápsida. Su genoma és de dcDNA (36 Kb). "In vitro" són muy útiles porqué expresan mucha proteína.El adenovirus NO se integra, se mantiene episomal. Hay diferentes estrategias. En su genoma hay los genes E1, E2, E3,E4. El E1 interviene en la replicación peró si se lo quitamos sólo se puede replicar en células HEIC293 que contienen E1. E3 es totalmente dispensable . En un adenovirus sin E1 y E3 podemos meter hasta 8 Kb de material génico. Són patógenicos.

* VIRUS ADENO-ASOCIADOS:No són patogénicos. También tienen señales invertidas. El tamaño és un problema (4.8 Kb) y sólo tienen 2 genes.

ITR---------------------------------------------------------------ITRREP CAP

Se puede sustituir REP y CAP por nuestro DNA de interés; sólo hay que mantener los ITR.

24 / 3 / 04

TEMA 8PCR

Podemos purificar DNA, meterlo en un vector, pasarlo a E.Coli, hacer una genoteca y trabajar con ello. PCR nos permite una amplificación de fragmentos de DNA de forma geométrica. A partir de una molécula diana, en 32 repeticiones conseguimos más de mil millones de moléculas diana de dcDNA. Los problemas són la especificidad y la contaminación.

El ciclo se resume en: Desnaturalización, Anillamiento de primers, elongación.

Hay una primera fase de crecimiento exponencial y otra de saturación debido a que se acaban los nucleótidos. En los primeros ciclos la especificidad de los cebadores hacia el DNA tiene que ser muy alta. Los cebadores y sustratos tienen que estar en cantidad suficiente. La desnaturalización se da a unos 95 ºC y dura unos 20 - 30 seg. La temperatura del anillamiento depende de la sequéncia de los primers pero se sitúa hacia los 50 º C. La elongación és óptima hacia los 70 ºC. Las PCR suelen ser de 3 Kb, pero se pueden hacer de hasta 40 Kb con polimerasas muy progresivas; lo que pasa és que bajan la producción. Las polimerasas más frequentes són: Taq, Pfu y Vent.

La taq al NO tener proof-reading tiene alta la tasa de error. Las otras 2 tienen tasas más bajas de error. La vent NO tiene actividad 5' - 3' exonucleasa y eso la hace más procesiva. Vent también aguanta mucho más a temperaturas altas. Debido a éstas 2 cosas ésta polimerasa nos convendrá más para realizar PCR largas.

La Taq añade 1 nucleótido a los extremos que después tendrá que ser limado. En cambio, Vent y Pfu en más del 95 % producen extremos romos!. (PAG 5)

REACTIVOS BÁSICOS DE PCR

* Tampón: A 20 ºC el PH a 8.3. Cuando aumenta la Temperatura bajamos el PH hasta 6.8 - 7.8.* MgCl2 : El Mg+2 és cofactor de la mayoría de polimerasas.* d NTP's : Normalmente 200 M. A ésta [ ] no se limita la reacción* Cebadores "primers": Són nucleótidos sintéticos. La [ ] final és de 0.1 - 0.3 M. Normalmente tienen entre 20 - 25 nucleótidos. La temperatura de anillamiento es inferior a la temperatura de "melting". Depende de las bases.

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Los 2 "primers" de la reacción deben tener una Tm parecida porque el anillamiento ha de ser simultáneo. Las C y G tienen que estar entre 40 - 60 %, no más. Los "primers" NO deben ser complementarios, ni consigo mimos ni con otros porque anillarian incorrectamente. El extremo 3' NO debe ser de T porque tiene más error; y tampoco puede contener muchas C y G juntas porque puede permitir apareamientos erróneos. (PAG 6)

*DNA molde: Se utilizan unos 100 ng de DNA. Puede ser DNA genómico, producto de RT, plasmídico, producto de PCR, etc... Es importante la calidad, un DNA con impurezas bajará la actividad de Taq. Se pueden añadir agentes desnaturalizantes pero diminuirán los "primers" también. También se desnaturalizarán. (PAG 7)

Si en una PCR , por cualquier motivo, un "primer" se anilla en una zona con miss-match, elongamos una hebra de DNA con una diana NO original. En siguientes ciclos amplificaremos éste DNA, sin nuestra diana, de forma específica. Hay posibles soluciones:

- Hot start: Adicción de una enzima cuando la reacción está a más de 74 ºC.- Nested PCR: Hacemos 2 rondas de amplificación usando un total de 4 "primers".(PAG 8)

VISUALIZACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR. (PAG 9)

Gel de agarosa: Resuelven " a grosso modo" bandas de 0.2 - 20 Kb.Gel de acrilamida: Gran resolución a < 1 Kb.

El revelado de fragmentos de DNA se puede hacer de forma radioactiva o de forma NO radioactiva.

30 / 3 / 04

APLICACIONES DE PCR

* Miss-match PCR: (PAG 10)

Sirve para crear una diana de restricción. (=Screening). És más ràpido que amplificar y sequenciar.

Sec. Natural: Sec. Mutada:

------G---- ------A------

------C---- -------T------

---C-----G---- ---C-----A----

---G-----C---- ---G-----T----

Hemos modificamos la que esta en negrita; así pues será sensible a una enzima de restricción. La secuencia mutada modificada (és decir la derecha-abajo) no será cortada por la enzima de restricción

* Mutagènesis Dirigida:

Al modificar el ADN estamos realizando una mutagénesis dirigida!!!

* RT-PCR (Reverse Transcription PCR): (PAG 11)

Como ya sabemos el sistema PCR se basa en DNA polimerasas. Amplificamos DNA. Que pasa si tuvieramos que amplificar un RNA?. Entonces necessitamos una transcrpitasa inversa. Pasamos este RNA de interés a DNA y entonces ya trenemos un molde de DNA para poder hacer PCR.

Hay muchas maneras de hacer esto y elongar un RNA....

1.- Tenemos un mRNA poli A. Pues ponemos aligonucleotidos poli T y elongamos. Obtenemos todos los representantes que sean poli A.

2.- Amplificamos con oligonucleòtidos varios. Fragmentamos en posiciones distintas. Obtenemos fragmentos mas bien cortos.

3.- Amplificamos con un "primer" específico. Evidentemente és específico. Obtenemos un único transcrito!!.

Y ahora podemos hacer una PCR con un "primer" específico. Entonces creamos una doble hebra limitada por la posición de los 2 "primers" que utilizemos en la PCR, claro està.!

EJEMPLO:Termófilus (Termoestable). Copia directamente un molde; tanto como transcrpitasa como PCR.Lo queremos para amplificar mRNA de interés.Se utiliza para mirar que aspecto tienen las mutacionesSe utiliza también para un análisis quantitativo de concentración de RNA. (és el sistema más sensible)!

* PCR Asimètrica (PAG 12)

La simetría radica en la concentración de "primer" utilizada. Cuando la concentración de un "primer " supera a la otra hay una progressión aritmética. 2,4,6,8....(2n). És muy útil para la secuenciación mecánica.

EJEMPLO:Tenemos 4 tubos

dd ATP dd CTP dd GTP dd TTP+ d 'NTP + d 'NTP + d 'NTP + d 'NTP

5 ' ----------------------------------------------------- 3 '

3 ' ATP-----------^^^^^^ 5 '3 ' GTP--------------------- ^^^^^^ 5 '3 ' CTP-------------------------------------- ^^^^^^ 5 '3 ' TTP ----------------------------- ^^^^^^ 5 '

Tendremos una colección de todo: Mucho de ATP, de CTP, de TTP, de GTP; así pues sabre la secuenciación.

* NOTA: Con PCR asimétrica se hace todo en UN TUBO y se mira con fluorescència. (fluoróforo). Cada nucleótido tiene un color distinto!Luego se hace una cromatografía y YA ESTÁ!!!!! (Secuenciación automática de DNA).

TEMA 9GENOTECAS

Muchas genotecas se compran echas o se venden kit's dónde uno puede hacer-se su propia genoteca.Vienen con protocolos y demás.

1.- Cómo hacer una genoteca? (Con que DNA?)

- Mediante DNA cortado con enzimas de restricción. (100 Kb)- Mediante rotura mecànica "cuidadosa" (20 Kb)- Mediante unos fragmentos de PCR- Mediante fragmentos derivados de síntesis química (30 pb)

Existen 2 tipos de DNA: el DNA genómico y el DNA que proviene de un mensajero; és decir un cDNA. El genoma humano tiene 108 pb. Necesitamos fracionarlo!No podemos cortar a sako ya que no sabemos qué fracción està al lado de cuál. Hay que cortar haciendo solapamientos. !!

Ordenamos el genoma con marcadores (minisatèlites). Metilamos, etc...

Ahora hacemos una digestión parcial con enzimas de restricción, o rotura parcial mecánica al azar. Una vez ordenados cada fragmento podemos realizar genotecas de cromosomas o fragmentos FACS, etc...

2.- Juntamos a un vector

- Mediante extremos cohesivos hechos con una determinada enzima de restricción.- Mediante unión de extremos romos.- Moléculas de lica (=?????)

3.- Lo introducimos

- Mediante un fago T recombinante- Mediante plásmidos.- Mediante package "in-vitro" con ayuda de "fago "

4.- Marcadores de selección (Imaginación al poder!!!)

- Mediante análisis genético- Mediante hibridación con sonda- Mediante detección química (Resisténcia a antibióticos)

20 / 4 / 04

TEMA 10Identificación y aislamiento de recombinantes en

genotecas."Screening de librerias"

www.probes.com / handbook / print / 0802.htmlwww.probes.com / handbook / print / 0805.html

Hi ha moltes maneres de seqüenciar una llibreria. Una primera classificació ràpida és pot basar en el coneixement del que estem treballant. Si treballem amb:

1.- Seqüència d'un gen o cDNAA) Microseqüència de la proteïnaB ) Anticossos contra la proteïna codificadaC ) Gens expressats diferencialment

2.- Funció d'una proteïna codificada.A ) Assajos d'activitatB ) Interaccions Prot-Prot

Prot - lligand Two hybrid / Phage Display

C ) "Screenings" de fenotip o de selecció (p. Ex: per complementació)

2.C )La majoria dels "screening" per fenotip han quedat obsolets ja que són molt laboriosos i costosos. Implica la creació de 100 soques del tirón i mirar-ne el fenotip. Pèrdua de temps important.

La forma més "elegant" de clonar un gen és per complementació. Resulta bo per a llevadures. Escollim unes llevadures sense gen A ( -A). Posem un plàsmid de llibreria d'A junt amb una població de llevadures "-A". Es produeix la transformació i PUM, ja està!!!!! Cultivem un medi selectiu. (PAG 2)

1.-A ) Selecció de cDNA's de mRNA's majoritaris. (traducció impedida per l'híbrid) (PAG 3)

Es basa amb la detecció de la proteïna que codifica aquell mRNA. Quan un mRNA s'hibrida ja no es pot traduir. Ho detectem mitjançant una electroforesis amb gel. És per aixó que serveix per mRNA abundants i majoritaris ja que son aquests els que produiràn una gran concentració de proteïna que s'observarà fàcilment al gel. Si el DNA s'hibrida amb el seu corresponent mRNA ja no observarem proteïna.Anem especificant-los i anem acurant la nostre búsqueda per tal d'obtenir-lo ben detectat.

Selecció de híbrids

Tenim 800 clons. Ara doncs els dividim, mitjançant discos de nitrocelulosa (puls). Fem 10 discos de 80 clons. Hibridem amb mRNA's de fetge que és d'on provenen. Diluim els "puls" i fem electroforesis.

Observem si algun clon és portador del mRNA que codifica per alguna proteïna en concret. Anem diluïnt i ens anem centrant amb el que volem.

"Screening" per hibridació (PAG 4)

Disposem d'una llibreria. Plaquejem amb plaques , generalment de Amp R . S'han de ralitzar moltes colònies; per anar bé més de 100. Es fa una rèplica amb un disc de celulosa. Trenquem les colonies de la rèplica, es desnaturalitza el DNA i s'hibrida amb una sonda de DNA o RNA marcada radiactivament. Ens serà fàcil detectar on s'haurà hibridat ja que veurem marques radiactives. Fem un revelat mitjançant una autorradiograma sobre una película de rajos X. (p.Ex: Observem que en la colonia 1 i 6 s'ha hibridat)

Aquest métode també es pot realizar amb fags. Tenim una placa de calves de bacteriófags sobre cèl.lules susceptibles. Fem una rèplica amb filtre de nitrocelulosa. Fem la desnaturalització pertinent e hibridem amb una sonda RNA o DNA marcada radiactivament.Tornem a fer un autorradiograma per saber quines calvas contenen l'insert d'interès.

1.- A/B) Hibridació amb sonda produida per Retrotranscrpitasa Inversa

Volem clonar el gen de la rodopsina. Anem a les cèl.lules de la retina es clar!!! Agafem polisomes (=ribosomes de la membrana plasmàtica; aixó s'utilitza quan vols estudiar proteïnes de membrana). Si agafem polisomes estem enriquint amb proteïnes de membrana que és el que volem.

En un anticos també van enriquir mRNA que codificava per rodopsina. Amb aquest mRNA van fer un cDNA amb fags (aixó ja ho sabem fer). Van obtenir 2.5 * 10-5 calves.

Per una altre banda van micro-secuenciar un péptid de la rodopsina. 5 aa. Tenia només 2 metionines (codifocades només per ATG lo qual resultaba molt bo perque reduïa les possiblitats; podem dir que van tenir bastant de sort!!). Mitjançant la Retrotranscripció van obtenir una sonda més gran. No volem 5 aa tan sols; volem més especificitat, axí doncs hem de fer la sonda més gran. Un cop fet aixó és quan s'ha de hibridar a a una llibreria.

Obtenim 500 clons. Només 8 corresponen a la rodopsina. Aixó és degut a la RT. Van realitzar altres coses ademés de la rodopsina. En humans aquets experiment és va duur a terme; en canvi en drosophila NO podien fer-ho.!!! (Sencillament perque NO ens assemblem a les mosques!)Ara es van veure obligats a realitzar-ho amb RNA - RNA. La estabilitat és millor, és més gran que en DNA - DNA ó DNA - RNA.Ho van passar per un gel de ____________ el qual NO reté els sc RNA. Els de dc queden retinguts. Ara és amb aixó amb el que "s'escrina".

1.- B) "Screening" per anticossos.

* Expressió en E.COLI (PAG 7)

Si un gen eucariotic s'inserta en un vector i aquest s'utilitza per transformar una bacteria (E.Coli), la proteïna codificada per el mRNA d'aquell gen NO serà produïda per la bacteria. En canvi si fem un tractament previ del gen per tla d'eliminar els introns i ho dipositem al vector; llavors sí que al transfomar E.coli, aquesta presentarà el producte codificat per aquell gen.

* Selección por anticuerpos. Proteína de fusión mediante gt11. (PAG 8)

Clonación de cDNA en el vector de expresión gt11. Este és un genoma de modificado con una longitud de 44 kpb que contiene una copia del gen de E.Coli para la B-galactosidasa. La inserción de nuestro cDNA interrrumpe la región codificante para lac Z bloquenado la producción de b-galactosidasa funcional. Si éste cDNA se introduce de forma "sense" se produce una proteína de fusión. Las calvas de fagos recombinantes són fáciles de distinguirr respecto de las NO recombinantes, gracias a que són capaces de producir B-galactosidasa de forma activa. Para aislar un clon utilizamos un filtro de

nitrocelulosa empapado de IPTG (=inductor de la transcripción de lac Z), así se permite la síntesis de la proteína de fusión.

* PAG 9 lo mismo però en levaduras!!

2.- A) Ejemplo de CD-2 (PAG 12)

No és ben bé clonació funcional; és una barreja amb anticossos. Ho van fer amb cèl.lules cos. Tenien una llibreria de linfòcits T d'expressió. S'injecta a cèl.lules cos. El plàsmid es va replicant autònomament. Tenim doncs una alta quantitat de plàsmid. Si es traduiex CD-2 la membrana tindria CD-2. Afegim doncs un anticos que s'uneix a la proteïna CD-2. Ademés afegim un anticos marcat radiactivament que té afinitat per aquets anticos. Es deixa incubar i s'extreu el DNA plasmàtic enriquit amb CD-2 suposadament. Ho van repetint fins obtenir un sol clon!!!.

21 / 4 / 04

2.-B) Hibridació diferencial (PAG 15)

La situació ideal és tenir 2 poblacions de mRNA idèntiques peró en una d'elles tenir 1 mRNA de més.Quan més ens apropem a aquesta situació ideal, més éxit tindrem!!

A B

1 ------------------- 1 ------------------2 ------------------- 2 ------------------3 ------------------- 3 ------------------

4 -------------------

Fem una llibreria d'expressió cDNA amb els L.Els clons positius s'han d'enriquir ( positius = expresen de forma màxima l'enzim carboxilasa). S'elueixen i s'enriqueixen. Es van descartan els negatius i ens quedem amb els positius.

Tenim 2 poblacions de mRNA. Una L i l'altre D.La L té sobreexpressió de l'enzim.Fem fraccions d'aquesta població. (La 5 suposem que és la que més s'ha enriquit)Hibridem aquesta nº 5 amb RNA de tipus L i D.Busquem el lloc on s'ha hibridat molt de L.

LLIBRERIA DE SUSTRACCIó. HIBRIDACIó DIFERENCIAL.

Treballem amb receptors T. Aillem RNA de cèl.lules T. Fem retrotranscriptasa. Eliminem RNA. Tenim doncs, DNA. Barrejem amb una alta concentració de mRNA de linfòcits B. Les sequències iguals entre T i B formaran una dc. Ho passem per una columna d'hibridacó la qual reté la dc i fa sortir la sc sense cap problema. (Es ara quan enriquim amb sc que són molt probablament de linfòcits T). Amb aixó fem una llibreria de sustracció. Terminasa terminal......Llibreria enriquida de cDNA de linfòcits T.

Com fem la sonda ?

Aïllem RNA de linfòcits T. Fem retro-transcriptasa amb d'N*TP's marcats radioactivament. Aquests DNA marcat s'hibrida amb un excés de RNA de linfòcits B. Fem una columna y surt la sc que són de linfòcits T marcats radioactivament. Volem una sonda que sigui sc, doncs ja la tenim.!! Ara doncs procedima a tamisar la biblioteca per hibridació mitjançant una sonda marcada radioactivament.!!

2.-B) Doble Híbrid (PAG 21-26)

Es basa en el sistema de transcripció GAL - 4 que detecta interaccions proteïna - proteïna en llevats.Només en el cas en que "bait" i "ad" estiguin molt properes e interactuïna, llavors activaràn el gen per poder viure sense presència d'histidines. Auxotròfa per histidines. Quan hi ha interacció aentre les 2 proteïnes esmentades anteriorment lac Z es transcriu!!!. Per poder observar-ho podem fer una selecció a ull blanc - blau mitjançant X-gal.Aquesta tècnica clona molts falsos positius així doncs s'ha de tornar a a comprovar. Si ho comprobem i torna a donar positiu llavors sí que podem dir que el procés s'ha realitzat amb èxit!!!.

26/ 4 / 04

TEMA 11Caracterización de genes clonados.

Per a la caracterització de gens clonats trobem 2 técniques molt emprades actualment:

1.- Seqüenciació

Hi ha que dir,que previ a la seqüenciació es fa un mapatge mitjançant enzims de restricció. Es digereix el DNA i observem les bandes en un gel Aixó ho realitzem per veure el PM en qüestió.

El que ha tingut més éxit ha estat la seqüenciació mitjançant "didesoxi". Es basa amb la síntesis de didesoxinucleótids. La DNA polimerasa NO discerneix entre aixó i DNA. La síntesis s'atura quan s'introdueix un "didesoxi"; per tant NO es pot introduir un altre nucleótid. L'oligo pot ser de sc o dc. Disposem de un dideoxinucleótid complementari al plásmid que introduim (normalment)La quantitat de "ddo" respecte d'NTP normals ha d'èsser ben definida. Si posem pocs "ddo" NO s'incorporarán, tindrem una mesura massa justa.

Necessitem 4 tubus (MIRAR PCR ASIMèTRICA):

Posem en cada tubu DNA + "oligo" + d'NTP normals + 1 ddoNTP + polimerasa

A) Tub ddo ATPB) Tub ddo GTPC) Tub ddo CTPD) Tub ddo TTP

En cada tub hi ha certa probabilitat de que s'incorpori un ATP o un ddoATP. Els "oligos" estàn marcats. Ara doncs fem un gel de acrilamida!! Podem distinguir fins a 1 nucleótid de resolució. De 300 - 800 nucleótids aprox.La seqüència que veiem és la que es polimeritza. El que fem és anar llegint manualment cap amunt !!!.Actualment la tècnica és la mateixa , el que succeeix és que ho fem amb 1 sol tub i es llegeix per fluorescència, s'observen uns pics. Va tot computeritzat. Ho correm amb un sol pou.!!

Petit incís de bioinformàtica (=Segurament NO entra a exàmen)

Hi ha pàgines web que són algoritmes informàtics que peremten saber si hi ha gen allí o NO.Regions de simetria: 2 genomes diferents són molt iguals en una determinada regió. La quantitat d'informació que podem trobar "in silico" és brutal. Sense fer res al laboratori!!!.

A quin cromosoma está el meu YFG ? Construcció d'Híbrids Cel.lulars somàtics.

Obtenir cél.lules híbrides entre ratolí / humans, etc...Tenim una cèl.lula donadora: Humana (=tota la dotació humana) i la fusionem amb cél.lules receptores de ratolí. !! Ho posem en condicions selectives. Fem crèixer cèl.lules que tenen cromosomes de ratolí i humans. Les híbrides NO crèixen. Per raons desconegudes al crèixer els híbrids (=reproduir-se) el genoma del ratrolí es queda i el de humans va mimbant de manera aleatória. Tenim clons amb tot el genoma de ratolí i parts diferents de genoma humà. Podem saber aquests fragments a quins cromosomes corresponen !!! Marquem la nostra sonda de DNA i fem un Sauber.

Del 1 al 6 ens dóna informació d'on està el híbrid. Els híbrids están caracteritzats. Sabem quins fragments de cromosoma tenim !!! Totes tenen 1 tros de cromosoma 17 excepte 1. Aleshores podem afirmar que el nostre fragment d'interés és troba al cromosoma 17. (= de fet és en el que més hi hagi).Lo bó és que aquests híbrids ja estàn caracteritzats; vénen congelats !!!!.

27 / 4 / 04

Tècnica Fish

La resolució pot arribar a ser molt gran. Detecta DNA del cromosoma. Sondes marcades amb fluorescència. Es realitza en cromosomes en metafase ja que es coneix bé la morfologia. Detectem una resolució de entre 100 - 1000 pb. És una resolució bastant alta!

Southern (PAG 21)

Detecta una zona específica dins el genoma. El DNA s'aïlla i es talla en trossos petits mitjançant enzims de restricció!Es carrega el DNA en un gel d'agarosa. Correm el gel. El DNA es desplaça en el gel, en funció del tamany. Ara transferim el DNA que hi ha al gel a una membrana de nitrocel.lulosa / nylon, etc..La transferéncia es realitza per capilaritat. (O/N) Per comprovar-ho ho pasem per reigos X.

El tractament del gel perqué aixó tingui efecte és amb OH- ó H+ .Es trenquen adenines i guanines. Els trossos són petits. Les transferències són més eficients si el tamany a transferir és menor. També s'ha de desnaturalitzar. Volem sc, No dc. Al desnaturalitzar tenim sc. Ja está llest per sonda !! Fem una sonda amb contacte amb DNA. Rentem i detectem !!!.

Detecció amiotónica per southern (PAG 23)

A la part 3 ' d'aquets gen tenim repeticions de (CTG)n on n = 6 Kb (p.ej). Les repeticions són difícils de detectar per PCR. Per sauthern és més fàcil. El mRNA té una alta concentració de GAC, el qual és molt dolent, perque és inhibidor. Aïllem DNA d'aquestes 6 persones i fem un sauthern en aquesta zona.

NORTHERN (PAG 24)

Partim de tota la població de mRNA. Volem saber en quin teixit es troba, el tamany i la quantitat. Tenim una sonda marcada. Aïllem mRNA total ó mRNA"poli A". Carregem en un gel desnaturalitzant. El RNA forma una E 2º ja que és sc. Per aixó desnaturalitzem!. Transferim a nitrocel.lulosa. Es fixa a la membrana. Hibridem amb una sonda marcada radiactivament 32P (p.ej) i rentem per eliminar inespecífics.En el 1 veiem molts. Tenim altres gens similars al nostre. Rentem llavors.En el 2 aumentem la estringència. Conservem 1 banda. Aquesta és la banda bona.

(PAG 26)

Si la sonda NO es complementaria la RNAasa la degrada. No ho detectarem. Aïllem mRNA i en solució l'incubem amb la sonda. Desnaturalitzem degut a les estructures 2ª i deixem que s'hibridi.

Els híbrids parcials 2 i 3 són degradats. Si haguessin fet un Northern els haguessim detectat; per aixó la partició amb RNAasa és més específica. Eliminem híbrids parcials. Fem directament una radiografia amb raigos X.

(PAG 28)"Primer" exclusiu!! (PER SABER QUIN ES L'EXTREM 5')

Partim d'una població de mRNA. Tenim part de la seqüència. Dissenyem un "oligo" (sonda) marcada que hibrida en un cert lloc. Fem ara doncs una retrotranscriptasa Inversa. Treballará fins arribar a un extrem 5'. (=s'aturará allí). Desnaturalitzem, correm un gel i detectem a través de una radiografía amb raigos X.

28 / 4 / 04

Tècnica RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)

Partim d'una població de RNA. Tractem amb CIP i TAD i ens queda un extrem fosfat lliure a 5 '. Amb T4 RNA lligasa, lligem una adaptador a 5 '.

Utilitzem un "oligo" per fer una trancripció inversa. Després fem una PCR amb aquest "oligo" i un complementari a la seqüència del adaptador RACE (que coneixem). Seqüenciem el producte de la PCR i el primer nucleótid després del adaptador: és l'inici de transcripció.

Amb 3' fem el mateix.

TEMA 12Mutagénesis "in vitro".

De mutacions hi han de 2 tipus:

- Al atzar- Dirigida : és el més utilitzat. (Actualment s'usa molt en oligos!)

CASETTE DE MUTAGENESIS

Tenim un plásmid. Necessitem tan sols 2 dianes de restricció. (chungo). Aquestes 2 dianes limiten la zona. Sintetitzem oligonucleótids que abarquin tota aquesta zona. La zona en qüestió ha d'ésser bastant gran, la cual cosa aumenta la dificultat de l'experiment. El complementari també; i s'han d'anillar. (=poc eficient)

El nostre oligo ja está mutat. Tindrem doncs un nou plásmid. Transformem bacteris i PUM !!!

Per moltes mutacions aixó NO serveix. Es produeix molt d'error. !

(PAG 40)Aquesta tècnica és més nova. Fosforilem l'extrem 5 ' d'un oligo complementari a alló que volem; és a dir, que contingui la seqüencia complementaria de les mutacions que volem obtenir:

Volem ==> A G T 5 ' A A T C A G T T T A T C 3 '

3 ' T T A G T C T C A T A G 5 ' - P

Afegim una polimerasa i lliguem. Tindrem un "heterodúplex".És a dir:

Una cadena salvatge + un oligo que conté el complementari de la mutació que volem. La mutació ha de ésser petita ja que quanta més mutació introduïm més difícil será obtenir un bon resultat. Ara doncs, transformem bacteries. Obtindrem 2 poblacions a priori:

50 % salvatge50 % mutats.

Mais es donaven aquests porcentatges donat, a qué hi havien molts problemes en la lligació, l'anillament, metilacions del DNA (=degraden) , etc....Seleccionem el muatat en detriment del salvatge.

Per evitar problemes hem d'evitar: (PAG 39)

- Homologia d'altres regions- Evitar palíndroms intracatenaris (=No s'anellen bé)- A 5 ' no hi ha d'haver A ni T ( L'anillament és menys estables = 2 ponts d' H2 ).

METODE DE KUNKEL (PAG 41)

Ha d'ésser un gen clonat amb un fagèmid. Agafem una bacteria mutada per "dut - / ung - " . Aquestes bacteries contenen uracils en el DNA. Insertem un "helper". Tenim doncs 2 cadenes, una amb uracils i l'altre NO. Transformem amb una soca "dut + / ung + " i la cadena que porta uracils és degradada. Tan sols el mutagen es replica doncs. Aixó ens dóna que més d'un 80 % de la població conté la mutació.

(PAG 45)

Ara doncs sintetitzem 2 oligos mutagénics complementaris. Fem polimeritzar mitjançant la PfTurbo ja que té una baixa taxa de mutacions. Utilitzam també l'enzim DpnI que només degrada DNA metilat. No toca per res el DNA mutat, simplement degrada el metilat.La selecció es fa prèviament en transformar E. COLI. Abans de fer la transformació tenim dc DNA mutat, aquest és el pas clau del procés. Aixó és molt més pràctic. Dòna millor rendiment.

MUTAGÉNESIS PER PCR.

Sintetitzem 4 oligos.Oligo 1 i 2 (El 2º va desplaçat una base respecte el 1º)Oligo 3 i 4 (El 3º conté la mutació. El 4º va desplaçat una base també).

Tenim un DNA lineal. Desnaturalitzem i deixem que es re-anellin. Obtenim 4 tipus de molécules.

La 1-2 i la 3-4 = NO transformen E. COLILa 1-3 i la 2-4 = Són circulars peró amb 2 "gaps" (bueno, 4 gaps).

Ara doncs si que podem transformar E.COLI. La cél.lula repara els nicks i forma un nou plásmid.L'error és més baix perqué aquí hem fet PCR; i hi han moltes polimeritzacions. !!

3 / 5 / 04

TEMA 13Expresión de genes clonados.

Volem expressar la nostra proteïna en algún sistema per saber la seva funció o per saber quines zones són importants en la seva regulació. Necessitem un assaig funcional (o NO si es desconeix la seva funció) i sempre necessitem un anticos per detectar-la. Potser ens interesa realitzar una proteïna recombinant, expresar-la en grans quantitats, o saber el paper fisiológic que realitza en la cél.lula i en l'organisme, etc..

Sistemes d'expressió:

-Traducció "in vitro"- E.Coli = Augmenta la producció de proteïnes recombinants.- Cel. d'insecte = Expressen la nostra proteïna per bacilovirus.- Cel. de llevat.- Cel. de mamífer.- Animals transgènics.

TRADUCCIó "IN VITRO"

Volem traduir el nostre mRNA en una proteïna. Necessitem un extracte cel.lular on hi hagi tota la maquinária per dur a terme la traducció. Hi ha 2 tipus:

- Gèrmen de trigo.- Reticulòcits de conill.

Si la proteïna ha de sortir de la cèl.lula utilitzarem microsomes pancreàtics. Contenen proteïnes de membrana i de secreció.Necessitem també un codó de STOP. (AUG), i un "gap" ja que sense ell l'eficiència de la traducció baixa bastant. Aquets sistema s'utilitza sobretot per estudiar el plegament de proteïnes. Podem partir d'un mRNA o d'una població enriquida en una determinada proteïna. Afegim l'extracte de la cèl.lula (tractat amb RNAasas per NO tenir endògens) i si la proteïna és abundant, doncs correm un gel!!.

VECTOR D'EXPRESSIó

Qualsevol plàsmid que contingui un casette d'expressió. El més important del casette és el promotor. Els promotors fan augmentar l'expressió de la nostra proteïna.

- Bacteris: T7lac, ara BAD, etc...- Cèl. de mamífer: CMV, SV40...

Segons el nostre objectiu utilitzarem ún promotor o un altre.

De casette d'expressió hi ha de 3 tipus. Sempre té 1 promotor i senyals de control a 5 ' i a 3 ' . A 3 ' sempre hi ha la senyal de "poli A". A 5 ' les senyals també fan que augmenti la traducció, són llocs del cap, unió de ribosomes, etc...

1.- A partir del casette formem RNA i després la nostre proteïna.

2.- S'utilitza quan hem clonat una proteïna sense el codó iniciador; per tant NO la podrem traduïr. A 5 ' posem trossos de proteïnes que dònen estabilitat a la nostra (proteïna). Formem una proteïna de fusió. A 5 ' sovint es posen sequències que són reconegudes fàcilment per anticossos.(llavors detecten la nostre proteïna.)

3.- Entre les sequències protèiques que hem ficat i al nostre proteïna d'interés, afegim unes sequències d'aminoàcids que són dianes de proteases. Així doncs, podem aïllar la nostre proteïna.

EXPRESSIó A BACTERIS

Utilitzem soques especialitzades (BL21) que fan augmentar l'expressió de la proteïna. Al casette d'expressió tenim: promotor, lac, codó d'inici, 2 tag , trossos de proteïna, polylinker (lloc on fiquem la nostre proteïna) i terminació. En clonar dins el bacteri tenim expressió basal, gairabé zero ja que dins el bacteri hi ha el repressor de la poly. Amb IPTG s'inactiva el repressor i la RNA polimerasa de T7 estará dedicada a l'expressió del nostre gen, degut a que NO hi ha cap altre gen amb promotor T7. Aixó fa augmentar molt l'expressió de la nostre proteïna.

Amb l'arabinosa pasa més o menys el mateix. La diferència és que aquets sistema és molt sensible a la concentració d'arabinosa. Així doncs, podem regular molt bé l'expressió. Amb lac és una expressió del tot o res.

En el tercer exemple expressem la nostra proteïna juntament amb una altre , per que es plegui correctament. (Ex: tioredoxina o altres proteïnes.).

4 / 5 / 04

EXPRESSIó A CÈL.LULES EUCARIOTES.

Com menys complexe és l'organisme que utilitzem, més fàcil és treballar, peró més lluny estem de la realitat.

- Llevats: - S. cerevisiae - S. pomba - Pichia pastoris : Adequat per expressar una proteïna en gran quantitat i per treballar amb ptroteïnes de membrana.

- Insectes: Expressió a baculovirus: Encara millor que pichia pastoris per expresar molta proteïna i per treballar amb proteïnes de membrana.

- Oocits de Xenopus: És un sistema per anàlisis funcional de proteïna- Cèl.lules de mamífer: Hi ha mltes líneas cèl.lulars diferents. Hem d'escollir en quina línea expresem la proteïna segons el que vulgem estudiar. Podem fer una transfecció a cèl.lules de mamífer transitòria o estable. Podem expresar la proteïna de forma constitutiva (no podem regular-la) o de forma induïble / repimible.

S'han generat vectors virals per augmentar l'eficiència de transfecció. Ens permeten transfectar líneas cèl.lulars que NO eren transfectables i també transfectar cultius primaris obtinguts directament d'un animal.

TET ON / TET OFF

Ens permet regular de forma fina la quantitat d'expresssió de proteïna. Ens serveix per si la proteïna és tòxica.

TET OFF: Tenim una línea cel.lular amb el plàsmid regulador p tet-off integrat. Quan NO hi ha TET la proteïna de fusió tTA s'uneix a TRE i s'activa la transcripció de la nostra proteïna. Quan hi ha molt TET al medi NO hi ha transcripció, la repressió és total. Si anem treient TET del medi, anirà augmentant la concentració de proteïna.

TET ON: Es va realitzar una mutagènesis del repressor TET. Ara quan hi ha TET al medi hi ha expressió. Just al revés que TET-OFF.

* Tenim 2 sistemes per eliminar una proteïna d'una línea cel.lular.

1.- Produir una RNA "antisense" de la nostra proteïna. S'utilitzen els mateixos plàsmids; peró es clona el cDNA a l'inrevés. Aquest RNA "antisense" s'uneix amb el mRNA endógen de la proteïna i l'´híbrid és degradat. El problema és que és poc específic i d'eficiència baixa !!

2.- Interferència de RNA : Veure FOTOCOPIA !

5 / 5 / 04

KNOCK OUT (=Recombinació homòloga)

Els animals transgènics a Knock out ens han servit per estudiar el desenvolupament de mamífers, per tenir models de malalties humanes géniques, etc....

Volem col.locar el nostre gen d'interés en un determinat lloc; i per aixó hem d'eliminar el que NO ens interesa. Ho fem mitjançant una recombinació homòloga; el que succeeix és que és molt difícil que aixó és doni en animals. Necessitem una tècnica de selecció i un medi de detecció sensible per dur a terme la recombinació homòloga.

Tenim 2 tècniques:

1.- Volem eliminar un gen "X". L'interrumpim amb un gen, per exemple "KanR " sense promotor.Si hi ha una interacció NO homòloga al infectar-les, tindrem cèl.lules que NO s'expresaràn, és a dir, que moriran si les plaquejem en Kan. Moriran les que NO hagin sofert R.H.Si hi ha recombinació homòloga les sequències seràn indistingibles i es transcriurà tot !!! Aquestes cèl.lules seràn resistents a Kan. Sobreviuran. S'aillen i per PCR o Sauthern es troba que porten el nostre gen !!.

2.- Positive Negative Selection: Aquesta és la que més s'utilitza. Tenim el nostre YFG i a 3' afegim Tk (timdinokinasa) i "aph R ". Aquests 2 tenen el seu propi promotor.

Si NO hi ha recombinació homòloga tot el fragment de DNA s'haurà integrat al "atzar". S'expresaràn els 2 ja que tenen el seu propi promotor. La cèlula viurà en presència de "aph" però morirá en presència de "gancycloric" ja que contenen Tk.

Si hi ha recombinació Homóloga deguda al propi mecanisme només s'integra la zona de "aph" ,; la zona de Tk NO s'integra. Ara doncs les cèl.lules sobreviuràn en presència de "aph" i "gancycloric".

Ara doncs podem fer una PCR per detectar els homòlegs. Ha d'èsser una PCR prou sensible. Necessitem una petit fragment que trenqui la pauta de lectura. Per fer la PCR posem un "primer" just a la zona que trenca la pauta de lectura i un altre "primer" fora del transgen però a prop de on s'hauría d'integrar si hi hagès recombinació homòloga (=D'aixó s'en diu prop la regió up-stream).

* Si NO hi ha recombinació la PCR surt negativa.* Si hi ha recombinació NO homòloga els 2 "primers NO estaràn a prop" i la PCR amplificarà un fragment més gran del esperat.* Si hi ha recombinació homòloga s'amplificará el fragment esperat, de 500 pb p.ex. Lés positives les subdividim en diferents poblacions, més petites, i realitzem una altra PCR. Anem realitzant subdivisions i PCR's i finalment arribarem a un punt on tots presenten el mateix gen !! Per realitzar tot aixó necessitem tenir seqúenciat el gen previament!

INTEGRACIó DE GENS EXòGENS A ANIMALS SENCERS (=Transgènics) PAG 3

S'utilitzen ratolins perquè són agraïts i perquè tenen un temps de generació relativament curt. En mesos obtens resultats.

A una famella de ratolí se la fa "super-ovular" (30 - 35 òvuls). Se li treuen els òvuls. Es fertilitzen i s'injecta la nostra seqüencia de DNA. Generalment s'injecta al pronucli masculí ja que es més gran que el femení. (Qüestió de manipulació). Es lineal, i lliure de seqüencies de procariotes per evitar problemes. (1º fase crítica).

Es trasplanta a una mare "pseudo-prenyada". L'aparellament indueix l'úter a preparar-se per l'embaràs i rebre els ous fertilitzats. (2 fase crítica).

Per detectar-ho se'ls talla un trosset de la cua i es realitza un southern o una PCR. Cada animal tindrà el transgen en un lloc o un altre. La integració és al altzar. Normalment 3 / 6. Cadascú d'aquets 3 ratolins és probablement diferent als altres. També poden tenir més d'una còpia integrada!. L'eficiència d'aquest procès és molt baixa 3 - 5 %

Aquest transgen es manté al llarg de generacions? Es transmet de forma Mendeliana?

La resposta és SI. És manté com qualsevol altre gen, s'hereda de forma mendeliana, i NO cambia la seva posició en el genoma.Si volem un homozigot (raça pura) creuem un heterozigot amb un que sigui transgen i segons Mendel; un 25 % serà homozigot.

En un transgènic podem inserir-li quelcom en un teixit, sempre hi quan hi hagi una seqüencia específica per aquell teixit.

Es va probar de ficar un promotor d'insulina de rata davant d'un oncògen. Es va injectar el DNA i es van expressar només a les cèl.lules - pancreàtiques produint tumors. Es morien tots.També es poden fer transgens en vaques de manera que l'insulina de l'home s'expressi en la llet de vaca. Agafem i munyim!.

Cel. Totipotents: Dònen lloc a qualsevol cosa (Embrion System cells). A la fase de "blastocis" trobem unes cèl.lules exteriors i unes d'interiors; les interiors són les totipotents. Es posen en una placa de cultiu; es fan crèixer i es disocien mitjançant tripsina. Plaquejem amb una placa que conté una monocapa de fibroplast tractat per que NO es divideixin. (=Capa alimentícia) . Les totipotents són capaçes de dividir-se i crèixer. (=És comporten com una línea cel.lular normal.) Tractem aquestes cèl.lules amb el nostre

transgen, i seleccionem aquelles on hi ha hagut una recombinació homòoga. Obtindrem cèl.lules "ES" heterozigòtiques per al transgen. Ara doncs. Les tornem a injectar en un "blastocis" !!

S'agafa un "blastocis" de ratolí negre (=homozigot per color negre). Les "ES" s'han aïllat de ratolins aguti (homozigots per aguti). Simplanten a una famella i obtindrem fills de 2 tipus: aa >an

- Negres (provenen de "blastocis"; no incorporen transgen)- Aguti (Homozigots)

Les aguti NO s'han incorporat a la línea germinal. La progènie serà sempre negre. En canvi si en algún cas dòna progènie aguti voldrà dir que SI.Seràn heterozigots per el transgen el 50 % dels aguti. Ara doncs, fem un southern o PCR. Els creuem entre ells un cop detectats. Llavors 25 % seràn homozigots per el transgen. Tindrem un animal KNOCK-OUT.

10 / 5 / 04

TEMA 14Estudio de la expresión de genes en eucariotas.

Quan mesurem quantitat de mRNA veiem que en un teixit hi ha més, que en d'altres teixits és constant, etc... La causa de la variació pot ser un canvi en la taxa de degradació del mRNA, canvis post-transcripcionals, etc... Generalment són a nivell de trasncripció. Per mesurar l'estabilitat d'un mRNA necessitem un model cel.lular. Tractem amb un inhibidor de la transcripció anomenat ACTINOMICINA. (Per northern veiem com va disminuint el nivell de RNA)A diferents temps de la inhibició fem mesures de quantitat de mRNA El mRNA té una vida mitjana "x".

A B La taxa de degradació de BAugmenta molt .

Aixó no sòl pasar. Normalment la disminució és transcripcional.Esbrinem, doncs, quines regions són les transcripcionals: Promotor + Enhancer.Fem mutagènesis d'aquests promotors i "artensas". Aixó es pot mesurar directament per la quantitat de mRNA o bé mitjançant un gen reporter!!. Un cop coneixem la regió que es responsable de l'activitat transcripcional, es verifiquen proteïnes que siguin responsables de la transcripció. (Id i clonar).

RUN-ON (PAG 3): Mesurem la radioactivitat incorporada als transcrits que s'estàn realitzant en aquell moment.Es necessiten molts nuclis per a tenir sensibilitat. Han de ser funcionals ademés. Hem d'agafar punts de la zona lineal.

PAG 5

PAG 7 : Anem mutant poc a poc. Veiem si hi ha s'intesis de RNA. Si NO hi ha síntesis, la zona mutada és important. Normalment s'utilitzaen gens reporter (=PAG 8)Transfectem el plàsmid amb el nostre promotor. Necessitem cèl.lules on s'activi el promotor. Si hi ha transcripció es veu CAT (cloranfenicol acetil tranferasa). Aquets gen afegeix acetils al cloranfenicol. Afegim les cèl.lules a una placa de colanfenicol . Aquestes pasaran el cloranfenicol a acetil-cloranfenicol.Ara doncs, realitzaem una cromatografia en capa fina (=Assaig CAT).

LUCIFERASA (PAG 10)

La luciferasa dòna luminiscència en contacte amb el substrat.Aquest és el més utilitzat. Necessitem 4 plàsmids normals. Podem col.locar una regió de promotor o "enhancer". 1 plasmid control. Regió luciferasa.Ara hem d'identificar i clonar.

17 / 5 / 04 LOCALITZACIó DE LLOCS D'UNIó DE FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ.

Tenim 2 tècniques: Són tècniques "in - vitro". Parteixen de 2 components iguals. La nostra seqüència de DNA i un extracte nuclear de proteïnes on hi ha el Factor de Transcripció.

* Foot - Printing: Marquem el nostre DNA als extrems. Tractem amb DNAasa, tallem de forma inespecífica el DNA. Tallem 1 vegada, fem un gel i obtenim un patró. Si s'uneix una F.T la DNAasa NO pot accedir al DNA on hi ha la proteïna. Podem determinar de forma precisa, de base a base, on s'ha unit la proteïna.

PAG 12 (Més sencill, menys informació)

Tractem amb un agent que metila G. (dimetil sulfat)De promig tenim una metilada només. Tallem allà on la G esta metilada. Tenim un patró de bandes. Allà on hi ha complexe és la zona on hi ha complexe proteïna-DNA.

* Band -Sihft (PAG 13): Afegim una proteïna que es fixa al DNA i forma un complex DNA-proteïna.El DNA está marcat radioactivament. Ara doncs fem un gel de poliacrilamida (matriu que té la propietat de separar ADN o proteïnes segons el seu tamany mitjançant un pas de corrent elèctrica.) Diem que és un retràs de ADN en gels.

* Super Band-Shift: Afegim un anticos específic contra un determinat factor de transcripció. També augmenta el tamany !!.

PAG 14.: A partir del DNA marcat s'afegeixen els F.T importants. Aquests factors provoquen canvis de mobilitat. S'han d'afegir en un ordre determinat, en cas contrari NO s'observarà res!.

CLONACIóN DE F.T (=Examen)

1.- Clonació per afinitat:

Tenim una resina i unim covalentment el DNA (=Columna d'afinitat).Hem de tenir una font rica amb aquest FT de manera funcional. Pasarem l'extracte per una columna. Només le nostre FT s'unirà a la columna. Podem eluir i l'btenirlo. Fem un gel d'acrilamida (1 banda).Secuenciem aquesta proteïna. Fem una sonda. Amb aquesta sonda marcada radioactivament, anem a una genoteca, hibridem i PUM!!

2.- Southern - Western

Agafem la secuència F.T i la fem servir com a sonda marcada en una llibreria d'expressió. Aquí trobem un problema i és que a lo millor es desnaturalitza !!. Detectem aquells clons que probablement expresen el nostre F.T.

3.- F.T de la proteïna Myc.

Per trobar seqüencies consensu de certes proteïnes. Agafem dcDNA que suposadament conté la nostra seqüència consensus que volem "afinar". Ho posem en contacte amb la proteïna en qüestió; en aquest cas, proteïna MYC. Fem electroforesis amb un gel NO desnaturalitzant. Els fragments que hagin donatpositiu per el complex DNA-Myc els aïllem i realitzaem una PCR usant "primers" A i B. Tornem a fer electroforesis i aïllem. Un cop aïllat tornem a amplificar mitjançant PCR. Aquests cicles els anem realitzant fins a obtenir una seqüència consensus més acurada.

SEMINARIOS

Seminario 2 : PURIFICACIóN DE PLáSMIDOS

Mini-preparación: 1 - 5 ml de bacterias (10 - 20 g)Maxi-preparación: 500 - 1 L (500 g)

1.- Centrifugamos y resuspendemos : Añadimos RNAasa A.

2.- Provocamos lisis cel.lular : NaOH + SDS (lisis alcalina)

3.- Añadimos KAc ( 3 M) que da lugar a un PH de 4'8 y se eliminan proteïnas, restos de cé.lulas y DNA cromosómico. El K+ + SDS forman complejos que precipitan y arrastran éstos tipos de partículas. Centrifugamos; en el "pelet" queda lo que NO necesitamos y en el sobrenadante tenemos el plásmido y otros productos.

Seminario 3: PURIFICACIóN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

- Purificación de DNA.

Hay diferentes técnicas:1.- Intercambio aniónico2.- Gradiente de cloruro de cesio. En ésta técnica se aprovecha la diferencia de densidad entre ácidos nucleicos. El bromuro de etilo se intercala. Emite una luz naranja. Al hacer el gradiente quedan diferentes bandas y utilizamos las que más nos interese. Una vez encontrada la banda eliminamos el Cs Cl. El Bromuro de etilo se puede eliminar con butanol e isopropanol.

A que concentración tengo el DNA?

Para purificar DNA de fagos que quedan en el sobrenadante, los hacemos precipitar con PEG; resuspendemos y purificamos con fenol.

- Purificación de RNA y mRNA

Es importante trabajar sin RNAasa. GTC las rompe, b-mercaptoetanol rompe sus puentes disulfuro (las inactiva) y EDTA las secuestra. Estos 3 elementos estàn presentes en el tampón "tris", dònde haremos la lisis celular. A partir de la lisis se hace la purificación por diferentes métodos:

- Fenol / Cl3CH- Cs Cl ==> Como que RNA > DNA > PROT al centrifugar el RNA queda en el fondo.

El "pelet" de RNA se resuspende para tener RNA puro. En el caso del fenol se satura con agua. Los restos de fenol se quitan con cloroformo.Después de la purificación podemos precipitar el RNA con EtOH ó IP.

10 ml de RNA+ 1 ml NaAc 3M ( PH 5.2 )+ 2-3 volumenes de EtOH ó 0.8 - 1 volumenes de IP

Centrifugamos y obtenemos un "pelet" con RNA y sales que se eliminan con EtOH 70 % . Si partimos de 1 gr de tejido, esperamos obtener 1mgr de RNA. 107 células són aprox. 100 g RNA. En un gel de agarosa miramos la calidad de nuestro RNA

Para purificar mRNA se aprovecha la cola "poly A" la qual unimos a una matriz oligo dT. (En agarosa queda difundido)

- Purificación de DNA genómico.

Las DNAasas no suponen tanto problema como las RNAasa. El problema és que se rompe con facilidad. Para hacer la lisis, congelamos con N líquido y hacemos polvo el tejido. Después se incuba con SDS y proteinasa K para digerir el tejido. El DNA NO se vé muy afectado. Para purificar utilizamos fenol, Cl3CH y isoamilalcohol (Antiespumante) (proporción 24 / 24 / 1).

Extraemos con sumo cuidado. Para realizar un southern o para introducir-lo en un fago "lambda" necesitamos unas 40-50 Kb; peró para un cósmido necesitamos unas 200 Kb; hay que ir con cuidado para evitar que se rompa!. Si se quiere hacer còsmidos, el lisado se pone con formamimda 80 %. En lugar de precipitar se hace una diàlisi hasta eliminar la formamida. El DNA tendrà tamanyo grande. Para mirar la calidad, miramos con un gel de agarosa dónde podemos observar entre 0.1 : 20 Kb. Para mirar la concentración gacemos una espectometría.

Seminario 4: "IN SILICO CLONING"

Con nustro DNA de interés ya sequenciado podemos hacer un BLAST. El blast consiste en comparar nustro DNA con el DNA de una base de datos y buscar secuéncias homólogas.

CLUSTLAW ( www2.eb.ac.uk/clustlaw/)

Esto és un programa que busca el mejor anidamiento posible para una misma secuència. Te sale una lista de todas las secuencias introducidas y te hace un % de pb o aa introducidos. Al final te sale el multianillamiento. Cluslaw: Aliniamos una familia de sequéncias de aa. Ahora hacemos un blast traductor (blastn) y pasamos de sequència de aa a secuència de nucleòtidos.

Cogemos nuestro DNA problema y lo lanzamos contra ETS humano. Encontramos una lista del nuestro y las otras 7 de la misma familia; como és lògico. A veces encontramos alguno que NO esperamos. Puede ser debido a:

- Error del que hizo la base de datos- Un mensajero nuevo en la familia (descubriemiento)Ahora és el momento de hacer otro "query" con las 6 familias y NO encontramos ningún parecido; así pues decimos que és NUEVO!!

Si queremos encontrar una secuència íntegra, hacemos un blast especializado. Hacemos un blast contra genoma humano!!!. Esperamos encontrar los exones del gen. Encontramos también los parecidos. (Lo hacemos también en las 6 familias). De hecho és encontrar el gen !!!. Encontramos los exones también.

Al final nos puede salir un parecido de 35 % por ejemplo. Esto se considera que és de la misma familia (simpre y cuando cumplan con unos requisitos funcionales parecidos) ya que se desestiman aquellas % de parecidos inferior a 25 %. (No se si me he explicado!)

Seminario 5: Genoteca de cDNA y expresión en oocitos de Xenopus

Se estudiaron cél.lulas renales de conejo. Se miraron los mensajeros que codificaban para un aumento de transporte de un determinado aminoácido; concretamente la Arginina. Para ello se utilizaron oocitos de rana "Xenopus" los cuales clonan muy bien!

La idea és pasar todos estos mensajeros de conejo a cDNA. Se utilizó bluescript+ y NO - ZAP.

CONSTRUCCIóN DE UNA LIBRERIA DE cDNA

1.- Preparación del vector.

Cogemos bluescript+. Tiene AmpR , 2 sitios T3,T7, y el multi-cloning site que es cortado por EcoRI y XhoI.Hacemos la digestión con estas 2 enzimas y fosfatamos con la ayuda de una fosfatasa para evitar productos secundarios que NO nos interesan.Por una banda tenemos el vector.

2.- Síntesis de cDNA.

Tenemos una población de mRNA de corteza renal de conejo con una cola de poli A. Desnaturalizamos a temperaturas altas para linealizarlos. Añadimos nucleótidos para formar una cola poli T complementaria a la que tenemos (poli A) y además nucleótidos que sean diana de una enzima de restricción que conozcamos y que más adelante utilizaremos.

5 ' ---------------------------AAAAA 3 '3 ' ---------------------------TTTTTT----(diana de restricción)---(AG)10 5 '

Utilizamos una retrotranscriptasa inversa más nucleótidos. Además metilamos con CM TP's. Formamos una población de cDNA sc con citosinas metiladas.

Ahora usamos Rnasa H. Ésta forma "nicks" en la cadena de mRNA sólo. Añadimos DNA polimerasa, la cual tiene actividad 3' --> 5' polimerasa y 5' --> 3' exonucleasa. Añadimos nucleòtidos para sintetizar la

cadena , éstos nucleótidos NO estàn metilados (=MUY IMPORTANTE). Esto sirve para realizar "nick translation".

* NOTA: Logramos un DNA dc. Hemos añadido antes una cola de (AG)10 porqué la actividad exonucleasa de la polimerasa degrada este extremo 5'. Ahora utilizamos polimerasas T4 para polimerizar rellenar y pulir todo este dc DNA. Tenemos extremos romos.

Añadimos una T4 ligasa y adaptadores de Eco RI però con el extremo 5' romo fosforilado mediante una quinasa. Se enganxarán a los extremos de nuestro fragmento.

Queremos que a la hora de entrar en el vector lo haga orientado. Necesitamos otro extremo que no sea de Eco RI ya que si no fuere así encontrariamos vectores con las 2 orientaciones. Ahora cortamos con Xho I y sólo se va a cortar por donde nosotros queremos ya que no esta metilado!!!!! Al metilar antes lo hemos hecho para evitar otros cortes NO deseados.

Una vex cortado con Xho I tendremos 2 fragmentos: el nuetro de interés y otro de PM más bajo. Los separamos mediante una cromatografía de exclusión. Nos interesa la de PM más alto. Ahora sí que podremos introducirlo en el vector deseado de una manera orientada!!!

3.- Ligación al vector

Tenemos una población de cDNA dc de 1.5 - 3.5 Kb. Lo introducimos y tenemos el vector con todo nuestro cDNA con la cola poli A. Ahora hay que poner todos estos plàsmidos en bacterias y amplificarlos!!

EJEMPLO:

Obtenemos 20 L de ligación. Cogemos 5L de ligación + 100 L de celulas competentes (usamos una cepa que accepte hemimetilados). El procéso para hacerlas competentes mediante tratamient térmico és:

- hielo 30'- luego 42 º C durante 90 ''- hielo otra vez

Utilizamos de medio 900 L LB e incubamos durante 1 hora a 37 º C. Obtenemos 1 ml de transformación.

Cogemos 10 L de transformantes e incubamos con 990 L LB en placas + agar + Amp.

Hacemos 3 placas. Supongamos : 10 L 30 colonias 20 L 60 colonias 50 L 150 colonias

20 L ligación * (3 colonias/ 1 L) * (10 3L dil. / 10L dil madre) * (10L dil madre/ 100L transf) * (100 L trans/ 5 L ligación) = 1.2 *106 colonias que formarà mi libreria en 20 L de ligación.

La placa de 150 colonias (50 L) la realizamos en una placa de 15 cm de diàmetro. Es buena para recuento a ojo desnudo. Podemos plaquear 20 colonias de cada una.

También podemos replicar mediante trapo de celulosa y de ésta manera amplificar.

Linearizamos el plàsmido cortando por el extremo 3' del cDNA e inyectamos los mRNA en oocitos de "Xenopus". Observamos qué és lo que pasa!! Hay alguno que hace aumentar el transporte de Arginina.

Con la otra réplica hacemos particiones de la placa mediante cuadrantes. Buscamos que cuadrante de la placa codifica para mi mRNA que está haciendo aumentar el transporte de dicho aminoácido en los oocitos de "Xenopus". Amplificamos ese trozito de placa y buscamos de entre esas 8 - 10 colonias cuál és la que está aumentando el transporte de Arg.

Seminario 6: MARCAJE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Per clonar DNA es necessita un marcatge. Necesitem un sistema específic i sensible. Tenim diferents técniques que ens dónen sondes marcades.

1.- Marcatge uniforme. Dònen alta sensibilitat específica.2.- Marcatge als extrems: Incorporació quantitativa de nucleòtids marcats als extrems del DNA. Per marcar els nucleótids normalment s'utilitza P32 i S35 que és menys perillós. 3.-Marcatge NO radioactiu:Menys perillós i permet que la sonda pugui ser guradada durant molt de temps.

1.- UNIFORME

A) NICK TRANSLATION: Es basa en l'activitat exonucleasa 5 ' a 3 ' de la DNA polimerasa. Tenim DNA de doble cadena, es tracta amb DNAasa que realitza nicks al DNA. Després amb la DNA polimerasa es va reparant de forma més o menys uniforme remplassant nucleótids marcats.

B) RANDOM PRIMER: Desnaturalitzem el DNA per després anellar uns oligonucleótids al atzar. Després afegim la DNA poly i obtenim el DNA marcat; obtenim fragments de 200 bases.

* NOTA: En aquests 2 métodes hem d'eliminar els nucleótids sobrants al acabar l'experiment.

C) REPLACEMENT REACTION: S'utilitza l'activitat exonucleasa 3 ' a 5 ' . Si posem T4 DNA poly en absència de nucleótids, domina l'activitat exonucleasa. Després fiquem nucleòtids i degut a l'activitat endonucleasa marquem el DNA. Aquesta tècnica permet marcar una sola cadena.

D) MARCATGE SELECTIU DE RNA: "TRANSCRIPCIÓ IN VITRO": Tenimun plásmidm, a banda i banda del polylinker tenim 2 promotors per 2 RNA poly diferents. Clonen el nostre DNA al polylinker. Segons el promotor que activem trindrem una còpia en forma de RNA d'una de les 2 cadenes de DNA. Obtindrem una sona "sense" i una altra "anti-sense".

2.- ALS EXTREMS (molt utilitzat per seqüenciació fará un temps.....!)

A) EXTREM 5 ' : Utilitzaem la polinucleotidquinasa de T4.

- La fosfatasa alcalina elimina el fosfat de l'extrem 5 '. Després amb ATP marcat i l'enzim en qüestió es torna a introduir el P als extrems 5 ' peró aquest cop, marcat.-Reacció d'intercanvi: Funciona igual de bé que l'altre.

B) EXTREM 3 ': Marcatge amb nucleótids.

- "filling": Necessitem DNA amb extrems cohesius. Afegim poly que omple aquests extrems amb nucleótids marcats.-Intercanvi: Utilitxem T4 DNA poly ( activitat 5 ' a 3 ' poly i 3 ' a 5 ' exonucleasa). Només s'addiciona un nucleótid marcat.- Addicció d'un nucleòtid mitjançant una transferasa terminal.

3.- NO RADIOACTIU

Afegim una molécula al nucleótid que volem marcar. Per exemple, la biotina. La biotina s'uneix a la citosina i té una alta sensibilitat també per al P32 (=aprox). Aquest métodes són molt sensibles perque poden utilitzar anticossos per detectarlos. L'anticos detecta la biotina, una altre anticos detecta el primer anticos i aixó va amplificant el marcatge. Aixó pot anar unit a enxims que formen un precipitat que es veu directament al microscòpic (= BO !!)

Seminario 7: CERCA DE GENS IMPLICATS EN PATOLOGIES

Trobem 2 estratègies:

- Cerca en la totalitat del genoma: "screening per linkatge"- Cerca en una regió del genoma: Estudi d'associació.

L'estudi d'associació ens serveix quan ja tenim algún gen sota sospita. Utilitzem marcadors genétics, que és qualsevol caràcter mendelià. No ens interessa estudiar mutacions; sinó polimorfismes (=canvis de nucleótids o altres marcadors genètics) d'alta freqüència en la població.

Alguns polimorfismes són: Grups sanguinis, RFLP's (=aparició/des d'una diana d'un enzim de restricció), SUP's (=canvis d'un nucleòtid, microsatél.lits)

Estudi d'associació: Un marcador está associat amb una patologia quan les freqüéncies del marcador són diferents entre la població cas i la control. És simplement la observació estadística de la concurréncia d'al.lels amb fenotips. L'associació defineix regions candidates més petites que un estudi de lligament.

Ex: Funció del gen DORF

1.- DORF és un gen amplificat en nombrosos cáncers.2.- És coactivador transcripcional de nombrosos receptors nuclears d'hormones.3.- La seva expressió és essencial per al correcte desenvolupament embrionari4.- Té expressió en nombrosos teixits.

Com s'estudien els SUP's ?

Centrifugem sang, del "pellet" de leucócits extraïem el DNA, amplifiquem per PCR la regió d'interés. Podem estudiar quins al.lels té un individu fent una digestió mitjançant enzims de restricció. Per fer bé la PCR optimitzem diferents parámetres: T, [ Mg+2 ].....

A l'exemple amplifiquem un fragment de DNA de 281 pb i un polimorfisme a la base 81. Fem análisis de restricció i podem saber quants individus són homozigots, heterozigots... (CC , CT, TT ).

Seminario 8: TERAPIA GÉNICA

La teràpia gènica consisteix en utilitzar DNA o RNA amb finalitats terapèutiques. No pots ficar un DNA a la sang a saco!!! (El cos el degrada). Utilitzem virus o vectors. Virus o vectors del teixit específic que volem atacar. Un cop dins tenim tot un sistema de defensa intracel.lular. El virus ha d'arribar al nucli, transcriure's, traduir-se, madurar i expressar la proteïna d'interés. Només hi ha hagut un únic éxit en la teràpia génica: la Fibrosis quística. És una malaltia pulmunar; correspón a un dèficit de proteïnes.

Hi ha moltes estrategies:

-Produïr proteïna.-Produir proteïnes inhibidores- Introduir fragments de DNA com a bloqueg- Provocar la mort de les cél.lules (mort del tumor).

De vevctors virials trobem:

-Integratius: Entren al genoma i s'expressen-No integratius: No entren al genoma (=Pasen a les cél.lules filles)

De vectors NO virials:- DNA nú- Electrotransferéncia de DNA per múscul (més actual)- Complexos amb mol.lécules catióniques (cápsides)

Adenovirus: Es trenca la regió E1 per evitar que es multipliqui el virus i també es pot pasar el nostre DNA d'interés. (CFTR)

Van veure que donava un bon efecte DOSIS / RESPOSTA.

Seminario 9: MODELIZACIóN POR HOMOLOGíA

Para obtener imformación de forma predictiva. Conocemos una seqüéncia de una proteïna peró NO su estructura. Tenemos la estructura de proteïna de su misma família. A partir de éstos estructuras podemos aventurar su estructura pero teniendo en cuenta las diferencias de seqüèncias. Similitud secuencuas-estructuras: Relación entre similitud estrutural y % de identidad. El límite inferior del modelaje es de 30 %. El porcentaje en diseño de farmacos és de > 70 %. Para hacer el modelado cogeríamos a la proteína que tuviera una seqüéncia más parecida a la que queremos modelan.

Pasos del modelado:- Buscan homòlogos con estructura conocida.- Selección de homólogos de interés (miembros mas cercanos criterios addicionales)- Obtención del alineamiento de la seqüéncia con los homologos. Muy importante porqué si el alineamiento está mal, el modelado está mal.

- Calculo del modelo: A partir del alineamiento traspasamos las cordenadas de la proteïna reconocida a la incògnita. Cálculos de energía.

- Contraste del modelo- Experimentación- "Feed back" con el modelo.

EJEMPLO ESTUDIO: ssAO

. Enzima involucrado en met. Glucosa

. Partimos de la benzilanina

- Objetivo: Diseño dirigido / racional de mejores substratos de la ssad para mejorar la capacidad de unión.- Dos seq se consideran homólogos cuando tienen una función y estructura similar.

Mayor homología <==> mayor similitud entre secueèncias.

* Homología alta: modelos de gran calidad* Homología baja: muchos miss match, delecciones.....Difícil hacer un modelado válido.

La búsqueda de homólogos se hace con bases de datos de sec. Puntuamos las sec y nos quedamos con la de mayor puntuación para hacer la perdicción funcional / estructural por asociación / heréncia.Problemas habituales:

- Sólo hay familiares remotos:

*Baja similitud de sec.*Difícil tener buenos alineamientos.