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EDICIN: 17.03.03

Walter Ivens H.

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NDICEA B C D E F G H I J K L M Elementos del microscopio.......................................................................... Sistema ptico. Contrate de fases Contrate segn Hoffman . Contraste segn Nomarski . Mtodos combinados Microscopa de polarizacin Mediciones con el microscopio.. Microfotografa tradicional.. Microfotografa digital Fluorescencia.. Microscopa confocal Varios y cuidados del microscopio... Pgina 3-9 9 -27 28 - 30 31 - 32 33 - 36 37 - 38 39 - 44 45 - 46 47 - 54 55 - 56 57 - 75 76 - 79 80 - 83

Estos apuntes de microscoa solo pretenden dar una informacin bsica sobre el tema y es evidente que temas como Contraste de Fases, Nomarski, Polarizacin, Fluorescencia y Microscopa Confocal merecen una explicacin mucho mas detallada, pero ese no es el objetivo de estos ap untes.

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BASES DE LA MICROSCOPA(Walter Ivens H.)

1.1 Los elementos que configuran un microscopio son los siguientes: 1.) 2.) 3.) 4.) 5.) 6.) Estativo y su Base. Fuente de luz. Platina o mesa Porta-Preparado. Revlver porta Lente-Objetivo. Tubo de observaci Sistema ptico compuesto por : - Los Lentes-Objetivos - Los Lentes-Oculares - Condensador - Lente de campo - Lentes colectores y auxiliares

FIGURA N1

Lampara halgena

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1.1.1 EL ESTATIVO Y SU BASE El estativo (base o pedestal) del microscopio es el componente central al que se le agregan todas las dems partes. De su tamao, solidez y peso depende la estabilidad y la ausencia de vibraciones en el microscopio. Incluido en la construccin del estativo se alojan los sistemas de enfoque macromtrico y micromtrico, as como tambin la ampolleta (fuente de luz) o el acople para una lampara externa. Igualmente en la base del estativo se ubican algunos lentes y diafragmas que controlan el haz de luz. Es normal que el fabricante ubique tambin en la base del estativo un transformador de 220V a 6V, 0 a 12V, y un sistema de control de la intensidad de la luz (voltaje variable). El componente ms complejo en el estativo es el sistema de enfoque que acta sobre la platina, salvo en los microscopios del tipo invertido en los cuales acta sobre el revolver portaobjetivos. En el sistema de enfoque el control macromtrico desplaza la platina en forma gruesa y el control micromtrico produce un desplazamiento fino de la platina. Estos sistemas se componen bsicamente de varios engranajes, piones, ruedas, y ejes de bronce, tefln o acero que requieren de cierta mantencin peridica o al menos de limpieza y lubricacin cada 2 aos. El enfoque micromtrico tiene generalmente grabado en su control externo (perilla) una escala micromtrica, la que permite hacer mediciones de profundidad en el preparado. Al usar lentesobjetivos de un alto aumento (por lo tanto de poca profundidad de foco) es posible enfocar un punto superior del objeto observado y luego, actuando sobre el enfoque fino, se procede a enfocar un punto inferior del mismo objeto. La diferencia en la posicin de la escala micromtrica en el tambor indica cuantas micras de distancia hay entre los dos puntos enfocados.

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1.1.2 FUENTE DE LUZ La fuente de luz, tanto en microscopia diascpica como episcpica, es generalmente en base a ampolletas de filamento como las halgenas o tungsteno, pudiendo ser tambin en base a ampolletas de arco elctrico como las de Mercurio o Xenn. La ampolleta ms usada actualmente es la halgena con potencias de 20, 50 y 100 watts. Para microscopa de Fluorescencia se usa la ampolleta de Mercurio de 100 y de 200 watts, para obtener mejores resultados (ver capitulo fluorescencia). Las ampolletas y sus porta-lmparas pueden ser del tipo "pre-centrada", sin embargo, el porta-lmpara puede disponer de un sistema de centraje de la ampolleta. En el primer caso el usuario no puede centrar la ampolleta ya que viene centrado el sistema por fbrica y no se puede modificar. En el segundo caso el usuario debe centrar y controlar el centraie con unos tornillos de centraje disponibles para tal fin en el porta-lmpara. Muchas veces, especialmente en las lmparas del tipo externas, se dispone adems de un lente colector desplazable, el cual permite enfocar el filamento o arco de las lmparas en los oculares, facilitando as el correcto centraje y distribucin de la luz.

1.1.3 LA PLATINA PORTA-PREPARADOS Esta mesa generalmente de forma cuadrada (salvo en los microscopios de polarizacin en los cuales es redonda) lleva y fija el porta-objeto en su posicin para la observacin del preparado. Esta es controlada en sus movimientos verticales por el sistema de enfoque macro-micro-mtrico (salvo en el microscopio invertido) Los desplazamientos horizontales en sus ejes X-Y son controlados por un comando ubicado a un costado de la platina que se encuentra generalmente en una posicin cmoda a la mano del operador. Para volver a reubicar algn punto seleccionado en el preparado observado, la platina dispone de escalas micromtricas para el eje X y para el eje Y. Bajo la platina se ubica el condensador de apertura, el cual se desplaza junto con ella en sus movimientos verticales (salvo en los microscopios invertidos). Muchos microscopios permiten desplazar el condensador en forma independiente a la platina. En los microscopios para estudiantes o los del tipo ms simple para laboratorio, la fbrica puede entregar el porta-condensador sin sistema de desplazamiento vertical propio, para as evitar su mal uso, ya que generalmente el condensador se debe usar solamente en su posicin ms alta (cercana al preparado). En el porta-condensador o en el condensador mismo hay un sistema de centraje (dos tornillos), con los cuales debe alinearse cuidadosamente el sistema ptico para obtener una iluminacin perfecta y aprovechar al mximo las caractersticas de los lentes-objetivos (ms detalles en el captulo sobre el centraje del microscopio) 1.1.4 REVLVER O NUEZ PORTA-OBJETIVO Este disco giratorio, permite tener permanentemente colocados en el microscopio varios lentes-objetivos y seleccionar el necesario girando simplemente dicho disco o revolver. Su construccin debe ser muy precisa, ya que debe mantenerse centrado el sistema ptico al cambiar de un lente a otro. Ciertos revlveres, especialmente los microscopios de polarizacin, tienen un sistema individual de centraje para cada lente-objetivo.

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1.1.5 EL TUBO DE OBSERVACIN: Hay una cierta variedad de tubos de diferente complejidad, dependiendo de su aplicacin y comodidad de uso. Se pueden clasificar como sigue: a)Tubo Monocular b)Tubo Binocular c) Tubo Trinocular - Simple y Elemental -.Normal, no compensado - TipoSEIDENTOPF(no necesita compensacin) -.Compensado -.Tipo SEIDENTOPF (ambos con desvo de luz/imagen "0 o 100% u otra relacin al observador o a la pelcula).

Todos los tubos anteriores se pueden fabricar con inclinacin ergonomtrica para mayor comodidad del observador. ?? El Tubo Monocular es un tubo de observacin para un ojo y actualmente slo se usa en microscopios de precio muy econmico. Fuera de ser incmodo, el observar con un ojo no le permite a algunas personas ver todos los detalles, tanto de definicin como de color, debido a que los ojos pueden tener diferentes capacidades o rendimiento, y el usar slo uno de ellos es una limitante. ?? El Tubo Binocular ms simple divide el rayo de luz/imagen en dos por medio de prismas o espejos, dirigiendo stos un rayo a cada uno de los dos lentes-oculares. Debido a las distancias intrapupilares diferentes de las personas, se debe poder ajustar la distancia entre los dos oculares mediante un desplazamiento lateral de estos (entre 68mm y 80mm). Esto incide a su vez, en un trayecto mas largo o ms corto del haz de luz-imagen. La importancia de lo anterior es crtica en el tubo trinocular fotogrfico/TV, debido a la ventaja de obtener foco simultneo en la pelcula y en los ojos del observador (ver explicacin en "tubos trinoculares"). Posibles diferencias de dioptras entre los dos ojos del observador, hacen necesario que al menos uno de los dos porta-oculares o el ocular mismo, disponga de un sistema que permita compensar dichas diferencias de dioptras. Generalmente el tubo o el ocular dispone de un anillo giratorio de enfoque, permitiendo asi tener foco simultneo en ambos ojos. ?? El Tubo Binocular o Trinocular SEINDENTOPF es un tubo cuya distancia intrapupilar se ajusta colapsando mas o menos este tubo, el cual gira sobre su eje central paralelo en forma similar al sistema de los anteojos larga-vista (o prismticos). En este tipo de construccin no hay variacin en el recorrido del haz de luz/imagen hasta los oculares, por este motivo el sistema es muy usado en los tubos trinoculares fotogrficos. ?? El tubo Binocular o Trinocular compensado es similar al tubo binocular normal, pero corrige la distancia recorrida por el haz de luz /imagen (al separar o juntar los oculares) mediante un sistema mecnico que se desplaza simultneamente y a una distancia idntica a la de los dos portaoculares en su eje paralelo, manteniendo as en forma constante una misma distancia total. (ver figuras 2 y 3) ?? En los Tubos Trinoculares Fotogrficos/TV, es especialmente importante un sistema de largo de haz de luz/imagen constante, ya que solo as el fabricante puede disear un sistema que produzca siempre un foco simultneo en la pelcula como tambin en los ojos del observador y por lo tanto un manejo ms cmodo. Sin embargo, normalmente los sistemas fotogrficos traen adems, un telescopio u ocular de control y enfoque, con el cual se tiene la certeza de que al observar en dicho telescopio/ocular foco, hay efectivamente tambin foco sobre la pelcula. Nikon usa tubos trinoculares con el sistema SEIDENTOPF, por lo cual no hay necesidad de compensacin del largo del haz de luz/imagen. Otros fabricantes usan el tubo compensador el cual tambin subsana el problema.

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FIGURA N2 FIGURA No. 3

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Todos los Tubos Trinoculares deben tener un sistema que permita enviar la luz, ya sea a los oculares del observador o a la cmara fotogrfica o TV. Igualmente hay sistemas que desvan cierto porcentaje de la luz al observador y otro porcentaje simultneamente a la pelcula. Es importante que Ud. elija el tipo de tubo que mejor se adapte a su trabajo ya que cada uno de ellos tiene ciertas ventajas o desventajas. l acople ptico entre el Tubo Trinocular y el sistema fotogrfico es logrado generalmente mediante un ocular de proyeccin o lente "Relay", ubicado en la salida del Tubo Monocular. Ultimamente Nikon opta por no usar lente de acople alguno y obtiene el foco con una distancia fsica precisa desde el lente-objetivo hasta la pelcula. Si se usa un ocular de proyeccin o lente "Relay", se tiene la posibilidad de modificar el aumento final sobre la pelcula o pantalla de televisin, de acuerdo al aumento propio de dicho lente ocular. ?? El tubo Binocular (Trinocular) Ergonomtrico es una construccin que permite ajustar el ngulo de observacin para el usuario, y as proporcionar una mayor comodidad (ngulo generalmente o o variable entre unos 35 a 45 de inclinacin). NOTA: Hay que tener en cuenta, que algunas fbricas tratan de intercalar la menor cantidad de ptica entre el lente-objetivo y la pelcula o cmara de TV, a fin de evitar demasiadas superficies de vidrio y/o espejos, sobre las cuales podra depositarse pelusas o polvo lo que afectara la limpieza (calidad) de la imagen fotografiada. 1.2 SISTEMA PTICO DEL MICROSCOPIO Los Lentes-Objetivos Son el principal elemento de todo microscopio, de su calidad depende un gran porcentaje de la calidad final del sistema. La calidad de un lente-objetivo se determina principalmente por su poder de resolucin, contraste, correccin cromtica, curvatura de campo, amplitud de campo y reproducibilidad de colores. Adicionalmente hay que considerar en su eleccin la distancia de trabajo y elementos de construccin como la proteccin retrctil en los objetivos de 40x o ms, correccin para cubre-objeto, diafragma ajustable (especialmente para campo oscuro) y tambin el medio de inmersin que necesita usar como por ejemplo: aceite de inmersin, glicerina, agua, aire u otro. Consideraciones adicionales para microscopa especializada como Fase Contrastada, Fluorescencia, Nomarski, DIC, polarizacin y otras, se trataran en captulos dedicados especialmente a dichos temas. 1.2.1 PODER DE DEFINICIN (RESOLUCIN) Es la capacidad del lente/objetivo de definir o resolver dos puntos como tales, a una mnima distancia entre ellos este poder de resolucin lo determina la llamada "apertura numrica" del objetivo y la longitud de onda de la luz involucrada.

La frmula N1 es la siguiente: Resolucin : 0,61 x Longitud de Onda Apertura Numrica

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Para saber la apertura numrica la frmula N2 es: "A.N.": = I.R. x Angulo sin 0 A.N. I.R. Sin 0 = Apertura Numrica = ndice de Refraccin = 50% del ngulo entre preparado y objetivo

En otras palabras mientras ms luz indirecta, refractada y difractada puede captar el objetivo, mayor es su A.N. o su poder de resolucin. Tambin podemos decir que para una misma distancia focal (distancia de trabajo objetivo/preparado), mientras mayor el dimetro del lente frontal mayor es la A.N. del objetivo o su poder de resolucin.(Ver figura N5) FIGURA N4

En Fig. No. 4 se observa que con un ndice de refraccin igual al del vidrio, el haz de luz sigue una trayectoria recta, contrariamente a lo que sucede por ejemplo con el aire, en el cual el haz de luz se refracta al pasar del vidrio al aire. El vidrio tiene un ndice de refraccin aproximado 1,525 y el aire tiene un ndice de refraccin de 1,00, por lo tanto se trata de igualar el ndice de refraccin del vidrio con el de un medio de inmersin.

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FIGURA N5

Menor Apertura Numrica = Menor Resolucin

Mayor Apertura Numrica = Mayor Resolucin

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1.2.2 ABERRACIN CROMTICA Debido a que el microscopio trabaja con el espectro visible de luz (luz blanca), cada longitud de onda o color que la compone es refractada en ngulos diferentes por la ptica del sistema, esto conlleva a que los puntos de foco para los diferentes colores caigan en planos diferentes, salvo que el fabricante logre corregir su sistema ptico de tal forma, que evite esta Aberracin Cromtica.

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1.2.3 ABERRACIN ESFRICA Los rayos de luz recorren distancias diferentes dentro de los lentes, y debido a la forma de estos se hace difcil una adecuada correccin en la parte perifrica o en los bordes. Este problema se conoce con el nombre Aberracin Esfrica.

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FIGURAS N6 - 7 - 8

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1.2.4 CURVATURA DE CAMPO Este problema se aprecia frecuentemente en los lentes/objetivos de un aumento de 40x y ms. Al observar el preparado podemos enfocar solamente el centro de este o solamente su periferia. No es posible enfocar todo el campo visual en un mismo punto de enfoque. Lo anterior tambin se debe a problemas de comportamiento ptico de la luz dentro del sistema. Hay objetivos especialmente corregidos para subsanar este problema, estos objetivos, llamados "planos" (pl), son de compleja construccin y de alto costo. El nombre plano proviene de que su punto de foco se logra en un solo plano, lo permite observar todo el campo en un punto focal simultneo (ver figura N10) 1.3 DENOMINACIN DE LOS LENTES/OBJETIVOS Objetivos Acromticos. Son aquellos en los cuales el fabricante ha corregido la aberracin cromtica axial (o parte central de lente), especialmente para los colores rojo y azul. La resolucin y contraste son excelentes en su parte central, por lo que esta ptica es apta para observaciones en general. Objetivos Apocromticos. Son aquellos en los cuales el fabricante ha corregido la aberracin cromtica para todo el espectro visible, rojo, azul, violeta usando vidrio fluorita de muy baja dispersin. En estos lentes se ha corregido al mximo todas las aberraciones, logrando una resolucin y reproducibilidad de color excelente. Objetivos Plan-Acromticos y Plan-Apocromticos. En ellos el fabricante ha corregido adems la curvatura de campo. Otros Lentes/Objetivos. De fase contrastada, de polarizacin, para fluorescencia, se describen en los captulos especializados

1.3.1 LOS LENTES OCULARES Los lentes objetivos crean una imagen real en el plano focal del ocular (a1-b1), el ocular a su vez crea una imagen virtual (a2-b2) a una distancia de aproximadamente unos 25 cm del ojo del observador (ver figura 9). Los oculares tienen un aumento propio que puede ser de 5x, l0x, l5x, 20x, 25x u otro, dependiendo esto del fabricante. El aumento ms usado es el de 10x debido a que un aumento mayor del ocular no contribuye a ver ms detalles en el preparado, solamente produce una imagen ms aumentada pero no mas definida. Esto se debe a que el mejor poder de resolucin slo puede llegar a distinguir hasta un mximo de 200 nm (0,0002mm), ya que la longitud de onda de los rayos luminosos no permite sobrepasar ese mnimo. Por ese motivo, en la frmula de definicin (ver frmula 1 antes) se observa la importancia que tiene la longitud de onda en el poder de resolucin del sistema al plantear "Long.onda / por Apert. Numer." Los oculares (en el caso de Nikon), tambin cumplen una importante funcin de correccin final compensatoria de la imagen entregada por los lentes/objetivos, obteniendo as una mxima calidad en la imagen final.

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FIGURA N9

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FIGURA N10

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Los oculares se clasifican segn el dimetro del campo visual que logran captar y son: de campo normal, de campo ampliado, de gran campo y de ultra gran campo. Adems hay oculares especiales como los de acople al sistema fotogrfico o de TV, llamados oculares de proyeccin o lentes Relay. Hay oculares de enfoque fotogrfico tambin llamados telescopios de enfoque, los oculares de centraje para fase contrastada, y otros.

1.3.2 CONDENSADOR Los condensadores son necesarios para obtener una adecuada iluminacin del preparado, lograr que se concentre la mayor cantidad de luz disponible y que sta sea uniforme. El condensador tiene gran ingerencia en la resolucin, contraste, profundidad de foco y en el brillo de la imagen. Su construccin incluye un diafragma ajustable llamado "diafragma de apertura", con su uso se controla precisamente la resolucin, el contraste y la profundidad de foco en la imagen. Sin embargo, esto se produce en forma dependiente, es decir, querer mejorar la resolucin afecta el contraste y viceversa, como vemos en el siguiente esquema: Resolucin Diafragma Abierto Diafragma Cerrado Alta Baja Contraste Bajo Alto Prof. de Foco Menor Mayor Brillo Alto Bajo

Como recomendacin estndar, se sugiere usar el diafragma de apertura del condensador a un 70% de la apertura del lente/objetivo en uso. Si bien esto reduce el poder de resolucin del objetivo, mejora notablemente el contraste y la profundidad de foco. El condensador tiene una escala de apertura marcada que sirve de gua. Depender tambin del preparado mismo, la mejor posicin del diafragma de apertura, segn como se observe la imagen al variar lentamente el dimetro del diafragma. En caso de usar un objetivo de 100x con alta A.N. (1,30 a 1,40), deber usarse tambin un condensador de alta apertura. En observaciones crticas debe aplicarse aceite de inmersin entre el lente frontal del condensador y el porta-preparado. Adems de la inmersin usual a aplicar entre el preparado (o cubre-objeto) y el objetivo, hay que hacer doble inmersin para obtener un mximo rendimiento del sistema. Campo Claro A continuacin se muestran tres condensadores tpicos de la fabrica Nikon para campo claro:

Tipo ABBE con A.N. 1,25 para trabajos generales en inmersin de aceite al usar con objetivo 100x

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Tipo de lente frontal abatible con A.N. 0,90 para microfotografa y trabajos generales. Uso en seco al usar objetivo 100x.

Tipo Acromtico con A.N. 1,35 para observaciones crticas con alta resolucin en inmersin de aceite al usar con objetivo de 100x.

NOTA: Al usar aceite entre condensador y porta-preparado, se debe asegurar que el aceite no contenga burbujas de aire.

1.3.3-

CONDENSADOR DE TRANSMITIDA "DA")

CAMPO

OSCURO

(CAMPO

OSCURO

CON

ILUMINACIN

En la tcnica de campo oscuro se procura que la luz de iluminacin no llegue directamente al observador, es decir que se usa nicamente la luz que se refracta en el preparado, por tal razn, cambia su trayectoria. Este cambio de trayectoria hace que los rayos puedan penetrar por el objetivo del microscopio, formar imagen y ser observada. Al observar un preparado con la tcnica de campo oscuro, ste se observa en total oscuridad o penumbra. Dentro de dicho campo destacan con luz propia, todos aquellos objetos que difractaron la luz. Para la tcnica de Campo Oscuro se construyen dos condensadores diferentes, uno a usar con bajos aumentos y otro con alto aumentos con objetivo de inmersin de 100x. Para eliminar posibles rayos no difractados que puedan haber penetrado al objetivo, no permitiendo as un campo realmente oscuro, se les incorpora a los objetivos de 100x un diafragma, el cual al ser cerrado parcialmente detiene esos rayos no difractados mejorando la calidad del campo oscuro. En las tcnicas de Epifluorescencia (iluminacin con luz incidente), tambin se trabaja en campo oscuro, pero su obtencin es algo diferente al mtodo descrito aqu (ver microscopa de fluorescencia captulo K. En la figura N11 se muestran los rayos de un condensador especial (condensador de campo oscuro), los que son enviados en forma oblicua o diagonal hacia el preparado, de tal forma que si siguen su trayectoria recta no penetran al objetivo del microscopio, pero aquellos rayos que tocan el preparado se quiebran, siempre que el objeto tenga una refraccin diferente al medio en el cual se encuentra. Parte de ellos entran al objetivo y forman luego la imagen.

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FIGURA N11

Los medios de inmersin ms usados, segn aplicacin, facilidad de limpieza y manejo son: Aceite de inmersin estndar, Aceite de Cedro libre de fluorescencia propia, Glicerina y Agua. El ndice de refraccin del medio de inmersin es determinante ya que incide en la refraccin del haz de luz.

Lentes Auxiliares y Filtros Finalmente mencionamos que en el paso ptico de la luz desde la ampolleta hasta el condensador, los fabricantes intercalan lentes colectores o lentillas para controlar la adecuada conduccin del haz de luz, para enfocar la lmpara y as poder centrarla fcilmente. Tambin se suministra normalmente uno o ms filtros para efectos especiales, ya sea en la observacin o en la fotografa. La aplicacin y uso se describe en captulos posteriores.

1.4 ILUMINACIN SEGN KEHLER Actualmente las principales fbricas de microscopios han adoptado como sistema de iluminacin el mtodo llamado "Iluminacin segn Kehler". en la figura N12 est esquematizado y debe considerarse que: ?? La imagen del diafragma de campo debe formarse en el preparado, es decir, ajustar condensador. ?? La imagen del filamento (o arco) de la ampolleta debe formarse en el diafragma de apertura del condensador, es decir, ajustar lmpara correctamente. ?? El diafragma de apertura y el diafragma de campo trabajan en forma independiente. Su funcin fue descrita en pginas anteriores. ?? Puede ser que el diafragma de campo y el diafragma de apertura deban ser levemente re centrados y ajustados cada vez que se cambia el lente/objetivo.

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1.4.1 Centraje del Condensador a) Enfoque un preparado usando el objetivo de 10x.

b) Cierre algo el diafragma de campo, luego enfoque su imagen desplazando el condensador hacia arriba o abajo. c) Centre ahora dicha imagen usando los tornillos de centraje del condensador. d) Abra el diafragma de campo hasta que la totalidad de este sea iluminada (el diafragma debe desaparecer del campo visual).

1.4.2 Centraje de la Lmpara a) Coloque un filtro neutro o un papel blanco sobre el lente de campo, luego observe y centre la lmpara. Si dispone de un filtro especial de centraje, enfoque en l el filamento o arco de la lmpara, desplazndola hacia delante y atrs, enfocando con el lente colector de la lmpara. b) Controle observando a travs del microscopio. 1.4.3 Ajuste la distancia intrapupilar y compense posibles diferencias de dioptras de su vista a) Junte o separe los oculares en el tubo hasta que vea un solo campo visual. c) Posicione el objetivo de 40X, enfoque el preparado slo con su ojo izquierdo, usando el enfoque macro/micromtrico. Luego usando su ojo derecho, reenfoque el preparado pero ahora solamente girando el anillo de ajuste de dioptras del ocular derecho (no se debe mover el sistema de enfoque micromtrico). De este modo se debe obtener foco simultaneo para ambos ojos. En caso de duda, repita la operacin. Este ajuste (compensacin) de posibles diferencias de dioptras entre los ojos, es desde luego una operacin individual diferente para cada observador.

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Fotografa de diatomea. Este preparado es muy til para comprobar la resolucin de un objetivo (lente)

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FIGURA N12

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OPTICA INFINITA : En un sistema de la llamada ptica infinita la fbrica disea el paso ptico desde el objetivo hasta la entrada al tubo de observacin (binocular o trinocular) de tal forma que los rayos recorran un camino paralelo el cual facilita la intercalacin de elementos pticos como ser analizadores, mdulos itermedios, divisores de rayos,etc. La imagen siguiente ilustra dicho paso ptico paralelo y su recorrido mas largo .

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1.5 SISTEMA DE CONTRASTE DE FASES(O Modificacin de Amplitud por Desplazamiento de Fases).

Antes de explicar de como se logra hacer visible un objeto mediante la tcnica de contraste de fases, se debe tener en cuenta que el ojo percibe solamente diferencias de intensidad (brillo) de la luz, es decir, una mayor o menor amplitud de la onda provocada por una mayor o menor absorcin de la luz al atravesar el preparado. Tambin el ojo percibe las diferencias de longitud de onda dentro de cierto rango de luz visible, es decir, de los colores. El ojo no percibe diferencias de fases en las ondas de luz. La tcnica de fase contrastada se usa precisamente para observar los objetos que prcticamente no tienen coloracin ni presentan mayores contrastes, situacin que se da muchas veces en preparados vivos e imposibles de teir. Con sta tcnica se logra modificar la amplitud de las ondas que atraviesan el objeto, con relacin a las ondas que atraviesan el medio dentro del cual este se encuentra, logrando as producir una imagen visible. En un preparado teido la onda que lo atraviesa a l y al medio que rodea al preparado, afecta la amplitud de la onda (de acuerdo a la teora de Abb), dando origen a ondas de diferente amplitud, lo que hace visible la imagen por diferencia de amplitud (brillo o intensidad) encontrado en el objeto. En las siguientes figuras se ilustra y describe las diversas situaciones. La figura "A" corresponde a una imagen normal de microscopa en campo claro, visible por diferencias de amplitud. Normalmente el rayo (onda), al cruzar un objeto lo suficientemente denso, es absorbido parcialmente y pierde energa. Contrariamente, el rayo que no pas por el objeto no fue afectado y mantiene su intensidad. El ojo percibe sta diferencia de amplitud entre las ondas y as puede ver la imagen. En la figura "B" se muestra lo que pasa con un preparado el cual no presenta diferencias significativas de absorcin ni diferencias de color, en ste caso es posible que la tcnica de contraste de fase s permita ver una imagen. Mediante un condensador con iluminacin anular se logran separar los rayos que no son difractados por el objeto en el preparado, de aquellos que s son difractados al cruzar un objeto del preparado. Luego el anillo de fase, ubicado en el lente de salida del objetivo, desplaza la onda de la luz no difractada (directa) en un cuarto de onda con respecto a los rayos difractados producindose ahora una diferencia de amplitud entre la luz directa y la difractada, hacindose, por tal motivo, visible al ojo. El anillo de fase es diseado de tal forma que tambin rebaje la intensidad de la luz directa para asemejarla a la intensidad de la luz difractada y as obtener una mejor imagen. En la pgina 30 se observa como se logra la iluminacin anular y como es el recorrido de la luz hasta formar la imagen intermedia. Una iluminacin circular del condensador, atraviesa el preparado y cae sobre el anillo de fase, ubicado en la parte posterior del objetivo. Este anillo de fase desplaza en de onda (lambda) la luz, atenuando al mismo tiempo su intensidad (rayo amarillo en la ilustracin). La luz difractada (rayo naranja en la ilustracin), tambin llega al plano de la imagen intermedia y prcticamente no es afectado por el anillo de fases. Como se explica en el prrafo anterior, as se produce en ste plano una imagen visible.

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Fig. B Esquema del desplazamiento de onda en lambda

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1.6 SISTEMA DE MODULACIN DE CONTRASTE SEGN HOFFMAN El sistema de modulacin de contraste segn Hoffman, da una imagen de relieve estable que bien se puede comparar con la microscopa de fase interferencial (DIC), descrita mas adelante pero a diferencia de sta se puede observar el preparado dentro de un recipiente plstico, debido a que el sistema no requiere que su iluminacin sea polarizada. El sistema de modulacin Hoffman lo conforman tres componentes: un modulador (ubicado en la parte focal trasera del objetivo "HMC"), un diafragma de ranura (ubicado dentro del mdulo "HMC") y un polarizador opcional (el cual puede ser colocado en la unidad de iluminacin diascpica). Note que en caso de usar el polarizador se hace solamente para modificar el contraste de la imagen. Principios de la Modulacin de Contraste Debido a que ojos, cmaras y pelculas, perciben slo diferencias en la intensidad de la luz o diferencias de color, ellos no pueden ver o percibir clulas o bacterias incoloras o transparentes. Estos objetos incoloros/transparentes son llamados "objetos de fase" debido a que ellos solamente afectan y desplazan la fase de la luz cuando sta los traspasa. Los objetos de fase podran hacerse visibles si los teimos, pero habra que privarlos de vida. Para poder observarlos en su estado viviente se ha desarrollado:

1.) La fase contrastada ( ya descrita) 2.) El sistema de modulacin de contraste segn Hoffman. 3.) El contraste de interferencia diferencial. En la microscopa de modulacin de contraste Hoffman se usa el mismo sistema ptico que en microscopa normal, pero se le adicionan partes o piezas que convierten la luz, que atraviesa los especmenes transparentes, en luz que presentar una variacin de intensidad. Estas partes adicionales modulan la amplitud de aquella luz que pas por el espcimen, cambiando as la intensidad de la luz y por lo tanto hacindola visible.

Pensemos ahora que la luz pasa por un preparado de fase y debido a que este objeto de fase tiene un ndice de refraccin diferente al del material que lo rodea la luz va ser refractada en sus bordes, (ver figura N13 donde se muestra la luz refractada en un objeto ). trapezoidal).

En la Fig. 13 vemos el principio general de la modulacin de contraste. Se observa ah un diafragma de ranura en la apertura del condensador, y un modulador dentro del objetivo "HMC". Este modulador es un filtro de densidad ubicado en la pupila de salida del objetivo "HMC". Este divide la pupila de salida en tres regiones: oscura, semi-oscura y transparente. Si no hay nada sobre la superficie del objeto, la luz atraviesa la regin "semi-oscura" del modulador y aparece semi-oscura (gris). Pero si la luz es difractada por un objeto de fase, ella pasa, ya sea por la parte "oscura" o por la parte "transparente" del modulador dependiendo de la diferencia en su ngulo de refraccin, as la luz aparece oscura o brillante, de acuerdo a la regin del preparado que atraves, y el objeto de fase se hace visible.

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En la microscopa de modulacin de contraste la imagen aparece en relieve como en la microscopa "DIC" pero la resolucin puede ser algo inferior. Lo notable es que no hay influencia de doble refraccin, lo cual permite observar un espcimen con doble refraccin Algunas ventajas del sistema "Hoffman" son: ?? ?? ?? ?? ?? Figura 13 Imgenes tridimensionales son posibles. No tiene "efecto - halo". El contraste se puede variar. Ideal cuando se deben usar recipientes plsticos (cultivos). Aplicaciones en: Biologa Celular, Botnica, Histologa, Hematologa, Neurologa, Gentica.

(tipo ranura)

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1.7 CONTRASTE DIFERENCIAL DE INERFERENCIA "NOMARSKI" El contraste diferencial de interferencia (=DIC), se obtiene con un montaje ptico especial en el microscopio, que permite observar "objetos de fase", es decir, preparados incoloros los que no afectan la amplitud de las ondas que los atraviesan, por lo que no son visibles. Las caractersticas principales se resumen como sigue: ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? Permite observar desde estructuras muy finas hasta estructuras gruesas. No presenta halos (como es el caso de fase contrastada). Diferencias de fases hasta varios Lambda son observables. Permite un grosor ptico favorable: 2 Lambda o menos. Son posibles observaciones de incluso de 0,5 mm (seccin del preparado). La profundidad de foco es de 2 a 3 veces mayor que en contraste de fase convencional. Se pueden observar tambin preparados teidos. Se puede variar el contraste desplazando el prisma Birefringente Nomarski. Permite detectar gradientes en el preparado hasta 15.

El equipamiento ptico especial que debe poseer el microscopio para la tcnica "DIC" es: ?? ?? ?? ?? ?? Fuente de luz poderosa, 100 o 200 watts luz mercurio o luz halgena de 100 watt o ms. Filtro polarizador y Filtro analizador Los prismas Nomarski (wollastone) Set de objetivos especiales DIC para luz polarizada (libres de tensiones) Platina giratoria (opcional recomendado).

Principio del Microscopio "DIC" El microscopio genera un contraste de imagen, usando dos haces de luz polarizada, levemente separadas entre s, que oscilan en forma perpendicular el uno con respecto del otro. La configuracin ptica es tal, que stos haces atraviesan el preparado, separados slo por una distancia que es inferior al poder de resolucin del sistema ptico. El contraste se produce en las regiones donde el objeto (preparado) presenta una gradiente en su ndice de refraccin, debido a que una gradiente en el ndice de refraccin produce una diferencia de fase entre los dos haces de luz polarizada. Los dos haces de luz son recombinados por el objetivo, el segundo prisma birefringente Nomarski (wollastone) formando un solo haz. La diferencia de fases entre stos dos haces genera cambios en la intensidad de la luz. Paso ptico de un sistema "DIC" de luz transmitida (ver figura N14). El haz de luz que emerge a travs del diafragma de campo desde la base del microscopio, pasa por un filtro polarizador, luego pasa por el primer prisma Nomarski, dentro del cual es dividido en dos haces de luz polarizada que vibran uno con respecto al otro en un plano de 90 (ver figura N16). Luego un condensador dirige estos dos haces en forma paralela separados slo por una mnima distancia a travs del preparado. Dentro de ste las dos ondas son afectadas por, la gradiente propia del mismo y/o por la gradiente entre el preparado y su medio.

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El objetivo del microscopio capta los dos haces y los dirige al segundo prisma Nomarski, de tal forma que los haces son recombinados dentro del prisma y emergen de l como un solo rayo con una diferencia de fases. Luego atraviesa un filtro pol-analizador y forma la imagen intermedia. El filtro analizador est orientado en 90 con respecto al filtro de polarizacin, de manera que produce la extincin de la luz de iluminacin. Esto significa que est orientado en 45 respecto del plano de oscilacin de cada una de las ondas entrantes, lo que asegura igual intensidad de ambos rayos o haces de luz (ver figura N15). La separacin de los dos rayos polarizados "O" y "E" es de las siguientes magnitudes: ?? Para un objetivo de 16x/0,32 Es de 1,30 ? m ?? Para un objetivo de 100x/1.25 Es de 1,25 ? m La imagen intermedia se forma por una doble imagen producida por los dos rayos. Sin embargo, sta doble imagen no se aprecia como tal, debido a que su separacin no sobrepasa el poder de resolucin del objetivo. En la figura N17 se puede observar el desplazamiento. La imagen "DIC" es notablemente diferente a una imagen de fase contrastada, en el sentido que posee un fuerte relieve o una apariencia pseudo-tridimensional. Esta imagen tambin da la impresin que se estn viendo detalles en la superficie del preparado, pero sta impresin es falsa en la mayora de los preparados biolgicos. La manera de variar la distancia del paso ptico es desplazando el prisma Nomarski y manteniendo su posicin en 90 con relacin al eje ptico. En otro sistema similar (Smith), se intercala un compensador "Desenarmont", el que es usado para controlar y variar el retardo de fases entre una onda (haz) con respecto a la otra, en vez de desplazar el prisma Nomarski, como se describi anteriormente. Nota: El prisma birefringente Wollastone modificado (el eje ptico de su cristal est inclinado) se llama Nomarski. Tiene la ventaja de sacar la figura de interferencia del prisma y as usar objetivos de mayor poder.

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FIGURA N14

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FIGURA N15

FIGURA No16

FIGURA N17

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1.8 MTODOS COMBINADOS DE OBSERVACIN: Combinacin de Epi-Fluorescencia (ver ese captulo) con DIC o fase contrastada Preparados de rpido desvanecimiento durante la observacin son a veces problemas insalvables en la fluorescencia. En estos casos un mtodo de observacin muy efectivo es usar una combinacin con DIC/Nomarski, o con fase contrastada. De este modo se puede primero buscar, mirar y luego posicionar el objeto usando ya sea DIC o fase, para luego pasar a la excitacin con la fluorescencia episcpica, esto permite observar y microfotografiar con ms calma, sin estar preocupado por un desvanecimiento rpido. Ms an, observaciones con "DIC" o fase, le dan la oportunidad de una revisin morfolgica en todo el espcimen, pudiendo as confirmar la ubicacin de la parte iluminada del espcimen (ver figura N18). Observacin Simultnea de Epi-Fluorescencia y DIC En ste caso se usan la epi-fluorescencia y la iluminacin con DIC/Diascpica al mismo tiempo, para as observar una imagen combinada con ambas tcnicas. Al observar slo con fluorescencia es dificultoso detectar donde est el rea que emite la fluorescencia, o saber como es la estructura fina del rea donde se esta produciendo la emisin. La observacin combinada es una efectiva ayuda para llevar a cabo la observacin morfolgica de todo el preparado y al mismo tiempo ver la existencia de fluorescencia (ver figura N19). Observaciones simultneas de epi-fluorescencia y fase contrastada son igualmente posibles y tiles. FIGURA N18

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FIGURA N19

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1.9 MICROSCOPA DE POLARIZACIN

Se puede obtener luz polarizada a partir de luz no polarizada, filtrndola por transmisin o logrndola por reflexin, esto sucede cuando la luz se refleja sobre una superficie plana y lisa. Por transmisin, que es el caso que nos interesa, en una fuente de luz como lo es la ampolleta del microscopio, en el haz de luz que ella emite sus ondas luminosas son transversales a la direccin (eje) de propagacin de dicho haz. Es decir, estas ondas oscilan en todos los planos perpendiculares a la direccin de propagacin de la luz, por lo tanto esta luz no esta polarizada. Con un "Prisma de Nicol" (o filtro Nicol), se pueden eliminar o absorber todas las vibraciones, dejando pasar slo las vibraciones de uno de los planos de oscilacin (plano de polarizacin). Un elemento de polarizacin "Nicol" deja pasar como luz polarizada alrededor de un 32% de la luz incidente. La luz que emerge del prisma o filtro Nicol es luz polarizada, es decir vibra en un solo plano. Al intercalar en el haz de luz un segundo filtro polarizador, ste recibe en microscopa el nombre de analizador, su giro permite orientarlo de tal forma que la luz polarizada del primer filtro, puede pasar casi totalmente, solo parcialmente o no puede pasar, segn la orientacin del analizador con respecto al polarizador (ver figura N21). En un microscopio de polarizacin se intercala generalmente el filtro de polarizacin entre la fuente de luz y el condensador (siempre antes del preparado), el segundo filtro (analizador) se intercala entre el objetivo y los oculares de observacin, generalmente en el tubo bino- o trinocular. Al girar el filtro analizador o el polarizador se controla y vara el plano de polarizacin y por lo tanto tambin la relacin entre el polarizador y el analizador. Otros elementos que pueden intercalarse en el haz de un microscopio de polarizacin son: platina giratoria con divisiones en 360, cua de cuarzo, analizador Sernamont, placa de yeso de Lambda, lente de Bertrand, y tambin para ciertos trabajos cristalogrficos se usa una platina universal "de Fedro". Ms adelante se detalla la funcin de cada uno de stos elementos. Un microscopio de polarizacin debe usar ptica libre de tensiones especialmente en sus objetivos. El fabricante identifica dichos objetivos con la palabra "POL" o "DIC". El revlver, en el cual se montan los objetivo, debe permitir centrar exactamente cada objetivo en su eje ptico. Normalmente se usa el analizador con respecto al polarizador, en posicin cruzada, as sus direcciones de vibracin son perpendiculares entre s, por lo tanto si en el campo de observacin no hay algn espcimen, ste permanece oscuro (negro), pero en las partes donde si hay un elemento que interfiere con el haz de luz polarizada, ste aparecer luminoso y generalmente coloreado sobre el fondo oscuro. Los elementos o materiales que permanecen oscuros no interactan con la luz polarizada y son llamados "isotrpicos", stos tienen un solo ndice de refraccin. Son substancias isotrpicas por ejemplo los lquidos (excepto los cristales lquidos), las fusiones, polmeros no orientados, vidrio sin tensiones, minerales y productos qumicos del sistema cbico de cristales como por ejemplo la sal de mesa. Las substancias que interactan y aparecen luminosas y coloreadas en alguna orientacin entre los polarizadores cruzados son llamados "anisotrpicos". Estas substancias desvan la luz generalmente en dos ndices de refraccin principales, por ejemplo, polmeros orientados, fusiones orgnicas enfriadas, vidrio con tensiones, todos los minerales y qumicos en el sistema de cristales hexagonales, tetragonales, orthombicos, monoclnico, trigonal.

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En el campo biomdico los elementos que presentan anisotropa son por ejemplo, el pelo, dientes, esmalte, huesos, uas, fibras musculares en contraccin. El beneficio de la polarizacin es por lo tanto el de poder diferenciar entre especmenes transparentes isotpicos y anisotrpicos. Otro efecto producido con el mtodo de polarizacin, es el de los colores de interferencia, estos colores son intrnsecos al material anisotrpico y son determinados tanto por el grosor del material como por su grado de anisotropa o birrefringencia. La birrefringencia est relacionada a la diferencia numrica entre los ndices principales de refraccin. La birrefringencia de una substancia, no puede cambiarse sin cambiar la substancia, pero s se puede modificar generalmente el grosor y la substancia anisotrpica puede variar su color (controlando su grosor), el color mismo proviene del retardo de uno de los componentes de la luz polarizada a travs de la substancia cristalina. La formacin de colores no es como la de un espectro continuo, ms bien son colores de interferencia que se forman en una secuencia definida, de acuerdo a la diferencia del paso del haz de luz a travs del material birrefringente (podemos observar efectos similares al descrito al mirar una burbuja de jabn o una mancha de aceite sobre el agua). Los colores estn en una secuencia caracterstica llamada serie "Newton", estos estn formados en "ordenes" los cuales, en caso de materiales birrefringentes, deben ser interpretados de acuerdo al grosor del material y a su birrefringencia (n2-n1). Los llamados compensadores y las placas de tinte, son placas delgadas de material birrefringente, como el cuarzo, la mica, y el yeso, las que estn cortadas en una direccin cristalogrfica determinada, de tal manera que la direccin de sus componentes de vibracin, rpida y lenta, sean conocidos. Estas placas son insertadas en el paso ptico del microscopio y as se retarda la luz en una longitud de onda fija, o en una longitud de onda variable pero conocida. Los colores exhibidos por las substancias anisotrpicas pueden variarse de dos formas con el uso de stos compensadores, dependiendo si el cristal est en posicin aditiva o sustractiva con respecto al compensador. Estos compensadores tambin son tiles en la deteccin de substancias con una birrefringencia pobre (el color de fondo puede cambiar de negro (oscuro) a gris o a rojomagenta al usar un compensador). Lente Bertrand Lente auxiliar que se inserta por sobre el objetivo, para llevar la imagen del plano focal posterior del objetivo al plano focal frontal del ocular, posibilitando as observar la pupila de salida sin tener que remover el ocular al estar usando la iluminacin segn Koehler (ver figura N20 Se usa como ayuda cuando se necesita observar figuras de interferencia permitiendo la observacin conoscpica. La imagen (figura N22) conoscpica, es la imagen de interferencia del preparado, la cual difiere dependiendo de si son cristales uniaxiales o biaxiales, como tambin de la direccin del corte de dichos cristales con relacin a ejes cristalogrficos u pticos. En las figuras de la pgina 43 se pueden observar una variedad de posibles imgenes de interferencia las cuales dependen del grado de birrefringencia, de si son cristales uniaxiales o biaxiales, de la direccin del corte, etc. Placa de tinte de ? (yeso): Compensador Snarmont : Produce retardo de onda en de Lambda. Permite medir el retardo de onda con una precisin de 1 Lambda (?). Permite medir en forma burda el retardo de onda en un rango entre 1? a 6?.

Cua de Cuarzo

:

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Nota: Para observaciones biolgicas muchas veces es suficiente disponer solamente de un filtro polarizador y otro analizador, sin ms accesorios o complementos.

FIGURA N20

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FIGURA N21

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FIGURA N

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ROCA LUNAR

Acido Sulfosalicilico

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1.10 MICROMETRO DE OCULAR (MEDICIONES CON EL MICROSCOPIO)

Para poder medir un espcimen con el microscopio es necesario conocer el aumento exacto con el cual se est observando el preparado. La frmula de multiplicar el aumento del objetivo por el aumento del ocular y posiblemente tambin por algn aumento intermedio alojado en el tubo del microscopio, no da suficiente exactitud para realizar una medicin precisa. Bsicamente esto sucede debido a que el aumento indicado tanto en los objetivos como en los oculares y posibles lentillas intermedias es solo aproximado. Mtodo de calibracin o determinacin exacta del aumento: Hay que disponer de un ocular micromtrico o ocluar con disco micromtrico. Este disco es insertado en un ocular el cual debe ser enfocable, es decir, que permita enfocar ntidamente al disco que se ha insertado en l. Adems hay que disponer de una reglilla micromtrica de mesa (preparado) la cual debe ser de precisin y generalmente se suministra una reglilla de 2mm. divididos en 200 partes o de 1mm. dividido en 100 partes. Esta reglilla se coloca en el microscopio como si fuese un preparado y luego se observa con el objetivo a usar y con el ocular micromtrico. Ambas imgenes se sobreponen y deben ser alineadas girando el ocular (ver figura N23) De la observacin podemos desprender a cuantas centsimas de milmetros (o micras) corresponde cada divisin de la reglilla ocular. Desde luego esto va a variar segn el aumento del microscopio usado en sta observacin. La ilustracin muestra, como ejemplo, que en ste caso 45,8 divisiones de la reglilla de mesa corresponden a 100 divisiones de la reglilla ocular. Como sabemos que cada divisin de la reglilla de mesa es, en ste caso, de 0,01mm (reglilla de 1mm dividida en 100 partes) resulta que cada divisin de la reglilla ocular corresponde a: 0,00458mm (4,58) 45,8 x 100 mm 0,01

Finalmente se reemplaza la reglilla de la mesa por el preparado (objeto) a medir. Sabiendo ahora a cuanto corresponde cada divisin de la reglilla ocular, podemos efectuar la medicin exacta. Esta determinacin basta hacerla una vez con su microscopio y anotarse la calibracin para cada lente-objetivo. Obviamente usando siempre el mismo ocular con su retculo.

Mediciones en profundidad dentro del preparado: Estas se realizan generalmente solo con altos aumentos usando el tambor micromtrico que tiene el sistema de enfoque fino de su microscopio al enfocar puntos en el preparado que estn a diferentes profundidades o distancias del objetivo (ver figura N23).

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FIGURA N 23

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BASES DE LA MICROFOTOGRAFA (con pelcula)Walter Ivens H.

Los componentes bsicos en la microfotografa (sobre pelcula) son:

1.) La pelcula fotogrfica:

(color negativa o color diapositiva) (blanco y negro negativa) 2.) La cmara fotogrfica (diferentes tipos) 3.) El fotmetro o exposmetro (generalmente es parte integrante del sistema) 4.) El microscopio bsico con tubo trinocular y fuente de luz. 5.) La ptica (condensador, lente objetivo, ocular acople, filtros. 6.) El revelado fotogrfico y el laboratorio fotogrfico.

2.1 LA PELCULA FOTOGRFICA Generalmente se usa pelcula en color para micro-fotografa y se recurre a pelcula blanco y negro slo para casos especiales. En la pelcula de color se debe distinguir la pelcula color negativa y la color diapositiva. El color negativo presenta un negativo en colores irreales o inversos es decir los colores no corresponden a los colores de la muestra y solo al ser copiados o ampliados a papel fotogrfico color, este ltimo muestra los colores reales o aproximadamente reales que presentaba el preparado (por nueva inversin de colores). La pelcula color-negativa se usa si se desea obtener una copia o ampliacin en papel color y la pelcula color diapositiva se usa si se quiere obtener una diapositiva para ser proyectada sobre una pantalla o teln. Las pelculas difieren entre s por su sensibilidad a la luz y por su respuesta al color de la luz usada para iluminar el preparado. En relacin con su sensibilidad a la luz, las pelculas se clasifican por valores, los cuales se expresan en ISO, ASA o DIN. Siendo ISO actualmente la denominacin internacional. Asa es la clasificacin norteamericana y DIN es la clasificacin alemana. Una pelcula puede tener por ejemplo: 50, 100, 200, 400 ISO u otras sensibilidades a la luz. Si el valor ISO es el doble de otro, significa que la sensibilidad de la pelcula es tambin el doble, o sea, necesita la mitad de la luz (exposicin) que la otra pelcula. Hay que tener en cuenta que a menor sensibilidad de la pelcula, mayor es su resolucin o nitidez (menor grano) y a mayor sensibilidad mayor es el tamao de grano por lo tanto tiene menor nitidez. Igualmente que a mayor sensibilidad de la pelcula esta presenta menor contraste de colores y viceversa, a menor sensibilidad, presenta un mayor contraste de colores. Con relacin a su respuesta de color a la luz, las pelculas pueden ser fabricadas para luz da, luz artificial o luz infrarroja. La pelcula luz da esta balanceada en su respuesta de color para la luz de sol en un da levemente nublado. Dicha luz es luz blanca la cual contiene todo el espectro de colores en ciertas proporciones lo cual hace ver los colores de las cosas tal como estamos acostumbrados desde siempre. Esa composicin de color se llama temperatura de color de aproximadamente 5.400K (Kelvin) en el caso luz da.

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La luz emitida por una ampolleta de casa, por una ampolleta de tungsteno o wolfragmio de un microscopio antiguo, es nominada luz artificial y su composicin de colores contiene una mayor cantidad de rojo lo cual significa una luz ms rojiza a la vista. La temperatura de color de esta luz es de aproximadamente de 3.600K. S se toma una fotografa con pelcula de luz da iluminando el preparado con luz artificial, la fotografa presentar una coloracin amarilla/rojiza. A su vez, s se toma una fotografa con pelcula para luz artificial, iluminando con luz de sol, la fotografa presentar colores azulinos. La pelcula infrarroja es para objetos que emiten radiacin infrarroja (generalmente calor).

2.2 LA CMARA FOTOGRFICA O SISTEMA MICROFOTOGRFICO Una cmara fotogrfica tradicional consta siempre de un lente-objetivo y de una caja (cmara) porta-pelcula. En toda cmara fotogrfica se regula la cantidad de luz necesaria para la sensibilidad de la pelcula elegida, mediante el control del tiempo o lapso durante el cual la luz llega a la pelcula (obturador) y mediante el control del dimetro del haz de luz que llega a la pelcula (diafragma). El obturador es una puerta que permanecer mas o menos tiempo abierta al paso de la luz y el diafragma es un control anular que puede ser abierto o cerrado para dejar pasar un haz de luz de mayor o menor dimetro, generalmente el tiempo de exposicin y el valor del diafragma a usar es indicado por un fotmetro o exposmetro. Dicho fotmetro mide la luz disponible y, sabiendo la sensibilidad de la pelcula, indica que valores de diafragma y obturador son convenientes de usar en cada caso. Ahora bien, una cmara o sistema microfotogrfico es en su concepto bsico muy similar al de una cmara fotogrfica normal siendo en el microscopio reemplazado el lente de la cmara por el objetivo y ocular del microscopio y el diafragma es determinado por el sistema ptico del microscopio, especialmente por el objetivo y el ocular en uso como por la configuracin ptica y fsica interna del microscopio entre el objetivo y la pelcula. 2.3 FOTMETRO (EXPOSMETRO) La cantidad de luz en el microscopio es dada por su fuente de luz y su regulacin en intensidad lumnica es controlada por el voltaje aplicado a ella. La luz emitida por la lmpara es controlada por uno o dos diafragmas del microscopio (el diafragma de campo y el diafragma de apertura) y por posibles filtros que se puedan intercalar. Una vez que la luz ha cruzado por los diafragmas, filtros, lentes condensador, objetivo y ocular, es medida por el fotmetro antes de llegar a la pelcula. De esta manera cualquier variacin en la cantidad de luz en su trayecto hasta la pelcula es correctamente cuantificada por el fotmetro, dando as el tiempo de exposicin correcto en cada caso. 2.4 LA CALIDAD Y CUALIDAD DE LUZ Usada en el microscopio se refiere a su temperatura de color, es decir a su composicin espectral. Como disponemos de una fuente de "luz artificial" y se trabaja generalmente con pelcula "luz da" debemos lograr que la luz artificial del microscopio sea lo ms semejante a la "luz da". Esto se obtiene igualando su temperatura de color en los 5.600K.

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FIGURA N24

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La correcta eleccin de la fuente de luz, la aplicacin del voltaje que indica la fbrica para que la ampolleta emita una temperatura de color ms cercana a la de luz da y con una correccin final mediante un filtro, generalmente azul plido o de interferencia producen el resultado deseado. En los manuales de uso para microfotografa los fabricantes indican que para un determinado microscopio y pelcula, se utilice un cierto voltaje y un filtro de caractersticas indicadas . Si se respetan dichas indicaciones y s el posterior revelado de la pelcula es bien realizado, los colores obtenidos son muy reales. Los tiempos de exposicin en microfotografa pueden variar normalmente entre 1/100 de segundo a varios minutos de exposicin (10 o ms minutos). Tiempos muy comunes en preparados histolgicos observados en campo claro pueden ubicarse alrededor de 1/4, 1/2, 1 o 2 segundos. En preparados de fluorescencia y campo oscuro (ultramicroscopa) los tiempos pueden ser de varios minutos. Los sistemas automticos de microfotografa facilitan bastante el trabajo ya que miden y controlan el tiempo de exposicin automticamente y luego de tomar la fotografa hacen avanzar la pelcula en forma motorizada, dejando inmediatamente preparado el sistema para la prxima fotografa. Algunos sistemas permiten adems medir la luz en dos reas diferentes: en un caso se mide la luz de toda el rea a fotografiar y en el otro caso se mide la luz de solo una reducida parte del preparado, la que realmente ms pueda interesar (medicin spot). Los sistemas microfotogrficos automticos son pequeos microprocesadores, los que indican en su "display" el tiempo que durar la toma o el tiempo que permanece abierto el obturador. Esto incluso se puede observar en forma previa a la toma misma. Adems indican si se produce alguna falla en el proceso o cuando se han completado todas las tomas y desde luego permiten usar pelculas de diferentes sensibilidades. 2.5 EL MICROSCOPIO PARA MICROFOTOGRAFA El microscopio a usar en microfotografa debe tener una base slida y un sistema de iluminacin adecuado (generalmente Koehler), la ampolleta en lo posible debe ser del tipo halgeno (iodo) o de mercurio o xenn en caso de fluorescencia. Adems es necesario equipar el microscopio con un tubo de observacin/fotogrfico trinocular, el cual permita la fcil y segura instalacin de un sistema microfotogrfico. Para obtener el mximo rendimiento ptico del microscopio en la observacin y en microfotografa es esencial, el correcto y total centraje de su sistema ptico. 2.6 LA PTICA La calidad de la microfotografa depende escencialmente de la calidad ptica de todos los componentes del microscopio, pero especialmente de la calidad de sus lentes/objetivos, los cuales deben tener una buena resolucin (alta apertura numrica) una buena correccin cromtica y proporcionar un campo lo ms plano posible. El acople ptico entre microscopio y cmara fotogrfica debe ser el indicado por fbrica, generalmente mediante un ocular (telescopio) de acople el cual proporciona el foco preciso sobre la pelcula y participa en la determinacin del aumento final sobre ella. Los filtros de color a usar en microfotografa color deben ser solamente los recomendados por fbrica para compensar la temperatura de color.

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Los filtros llamados neutros o grises no afectan el color de la luz e influyen exclusivamente sobre la cantidad de luz. Es decir los filtros neutros permiten bajar la intensidad de la luz sin afectar su temperatura de color.

2.7 EL REVELADO FOTOGRFICO: Este es realizado generalmente en los laboratorios especializados. Se recomienda elegir bien y/o probar con cual laboratorio se obtienen los mejores resultados y el menor maltrato a los negativos y ampliaciones en papel . Es conveniente tratar de trabajar siempre con la misma pelcula (marca, tipo, sensibilidad) y con un mismo laboratorio, si este trabaja satisfactoriamente.

2.8 MANEJO DE LA MICROFOTOGRAFA: Desde luego el usuario debe dominar el centraje del sistema ptico, lmpara y condensador tal como se necesita para la observacin a travs del microscopio. Una vez realizado dicho centraje (ver "bases de la microscopa") deber enfocar correctamente en el sistema microfotogrfico. Observando a travs del telescopio de enfoque se ven en el centro una cruz de doble raya y un circulo. Sin importar el enfoque del preparado mismo, se debe proceder a mirar con un ojo, luego girar el ocular del telescopio hasta distinguir ntidamente las rayas de la cruz y el crculo. Luego, observando siempre con el mismo ojo se enfoca el preparado, pero usando el sistema de enfoque macro y micromtrico del microscopio. Procediendo as se tiene la seguridad que su preparado esta en foco sobre la pelcula. Es posible que al observar luego a travs del tubo binocular este no muestre un enfoque exacto de la imagen pero no se deber retocar el control del foco ya que en microfotografa es la imagen observada en el telescopio de enfoque la que prevalece y debe respetarse. Para obtener coincidencia de foco en el tubo binocular/trinocular podr girarse el sistema de enfoque de los oculares (siempre que sean de tal tipo) hasta que se vea ntido el preparado con ambos ojos en el mismo punto de enfoque que observbamos en el sistema microfotogrfico. El campo que se fotografa es desde luego rectangular de acuerdo a la forma y tamao del negativo usado y por lo tanto su rea es menor a la observada en los oculares (que proporcionan un campo circular) por tal motivo el telescopio de enfoque muestra unas demarcaciones que delimitan el campo que ser fotografiado ya sea para pelcula de 35mm o para Polaroid. Tambin se puede disponer de un ocular normal para el tubo binocular al cual se le inserta una placa que muestra el encuadre de la fotografa.

En la siguiente ilustracin se observa una cmara fotogrfica montada en un microscopio en el cual se usa la luz transmitida e incidente a la vez.

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2.9 RESUMEN Y SECUENCIA PARA MICROFOTOGRAFIAR 1) Ubicar su microscopio sobre una mesa firme y slida para evitar vibraciones que pueden afectar la nitidez de la imagen. 2) Revisar que todas las piezas del microscopio estn firmemente acopladas entre s y que el sistema ptico este totalmente limpio. 3) Encender la fuente de luz, a intensidad cmoda para el observador. 4) Centrar todo el sistema ptico del microscopio, lmpara, ajustar el diafragma de campo, ajuste del condensador y apertura del diafragma. (Ver "bases de la microscopa"). 5) Ajustar el telescopio de enfoque del sistema microfotogrfico con uno de los ojos del observador (Ver ntido cruz y circulo). 6) Seleccionar y colocar el filtro de color (o interferencia) recomendado por fabrica. 7) Colocacin y enfoque del preparado respetando lo descrito ms arriba. (Ver nota al pie) 8) Ubicar la parte del preparado de tal forma que se encuentre dentro de las demarcaciones indicadas en el telescopio de enfoque. 9) Llevar la intensidad de la luz al valor indicado por la fabrica para microfotografa. 10) En caso de que la luz sea demasiado intensa, se recomienda usar filtros neutros grises (en caso dado sirve tambin un trozo de papel blanco que se coloca sobre el haz de luz que emerge de la base del microscopio). 11) Disparar el sistema fotogrfico.

Desde luego previamente se debi cargar la cmara con la pelcula adecuada, generalmente color de 100 ISO (ASA) e indicarle al sistema microfotogrfico el tipo de pelcula que se est usando.

Nota: En bajos aumentos (objetivos 2x y 4x) pueden presentarse problemas de foco en la foto debido a la acomodacin del ojo del observador (especialmente en gente joven). Con cierta prctica y tratando de enfocar en forma rpida, se puede evitar dicha acomodacin del ojo. Tambin es posible usar una lupa de enfoque adicional que evita el problema.

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INFORMACIN PTICA PARA CMARA DE 35mm. (MICROSCOPIOS BIOLGICOS Nikon aos 80/98)Objetivos Apertura numrica NA Resolucin e(um) Lente de proyeccin o acople (X) 2.5 4 5 2.5 4 5 2.5 4 5 2.5 4 5 2.5 4 5 2.5 4 5 2.5 4 5 2.5 4 5 2.5 4 5 2.5 4 5 Aumento total Profundidad de foco PFT* (X) 10 16 20 25 40 50 50 80 100 100 160 200 250 400 500 10 16 20 25 40 50 50 80 100 100 160 200 250 400 500 Campo de observacin F (mm) 4.3 2.7 2.2 1.7 1.1 0.9 0.87 0.54 0.43 0.43 0.27 0.22 0.17 0.11 0.09 4.3 2.7 2.2 1.7 1.1 0.9 0.87 0.54 0.43 0.43 0.27 0.22 0.17 0.11 0.09

4x Objetivo Plan acromtico

0.13

2.10

16.3

10x 20x

0.30 0.50

0.90 0.55

3.1 1.1

40x 100x (Oil)

0.70

0.40

0.6

1.25

0.22

0.3

4x Objetivo Plan apocromtico 10x

0.20 0.45

1.40 0.60

6.9 1.4

20x

0.75

0.40

0.5

40x 100x (Oil)

0.95

0.30

0.3

1.40

0.20

0.2

*PFP: Profundidad de foco en el plano de la pelcula

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FOTOGRAFA DIGITALWalter Ivens H.

La fotografa digital o electrnica tiene ahora en la microscopa una gran importancia al incrementarse su calidad en la imagen en comparacin con los inicios de sta tcnica digital, por lo cual es necesarios conocer hoy bien sus caractersticas, ventajas y desventajas. Una fotografa digital es una imagen que se obtiene en forma electrnica y ya no por medio de pelculas a base de granos de plata sobre celuloide las que una vez tomadas deben ser reveladas. Una cmara digital capta una imagen transformndola en seales elctricas y almacenado stas en tarjetas o chips de memoria . Estas seales elctricas se descargan luego ya sea a una computadora, un monitor o un televisor para poder ser observadas. Un tratamiento con programas de computacin especiales (como Photoshop) permite posteriormente modificar, mejorar o insertar datos adicionales en la imagen original obtenida. La calidad de la imagen digital puede alcanzar hoy ya prcticamente la misma calidad a la que se obtiene con una pelcula fotogrfica tradicional, siempre que se conozcan los principios bsicos que determinan dicha calidad en una imagen digital y como manejarlas en la computadora. La nitidez de una imagen digital depende por una parte de la cantidad de puntos que forman dicha imagen (los as llamados pixeles), mientras mas pixeles forman una imagen digital de un tamao determinado, mas ntida ser dicha imagen. Si una cantidad determinada de pixeles forma cierta imagen esta aparecer mas ntida mientras menor sea el rea sobre la cual se distribuyen esa cantidad de pixeles y viceversa la imagen aparecer menos ntida mientras mayor sea el rea sobre la cual se distribuy esa cantidad determinada de pixeles. La nitidez de la imagen tambin depender del tamao de cada pixel, mientras mas chico cada pixel mejor es la nitidez de la imagen ya que sta se formar con puntos mas pequeos. Sin embargo hay que considerar que mientras mas chicos los pixeles menor es la sensibilidad a la luz y viceversa mientras mas grande los pixeles mayor es la sensibilidad a la luz de la cmara fotogrfica digital. Hay una similitud con la pelcula tradicional la cual, a mayor sensibilidad, tiene una menor nitidez debido a que sus granos de plata que forman la imagen son de mayor tamao. Adems un pixel mas grande, si bien da una mayor sensibilidad a la luz, desmejora la imagen, ya que se produce un mayor "ruido electrnico" en la cmara. La informacin sobre el color depende de la profundidad" en los planos de los pixeles, los llamados Bit, es decir si representamos los pixeles como un punto los bit son los puntos que estn debajo" de los pixeles o los que forman un pixel , mostrados aqu en cubitos: (8 Bits son 1 Byte) Mientras mas bits tenga cada pixel mejor es la informacin de color de la que va disponer la imagen pero el peso de la imagen ser tambin afectada por la cantidad de informacion registrada ya sea en blanco y negro (grises) o en color . Desde luego tiene una importancia muy significativa en la resolucin o nitidz de la fotografa digital la resolucin que proporciona el sistema ptico del microscopio. Especialmente el objetivo es determinannte ya que mientras mayor sea su apertura numrica (A.N.) mejor ser su poder de definicin. As podemos decir que una alta calidad del objetivo con un muy buen sistema ptico del microscopio mas la mayor cantidad de pixeles de la cmara digital y el menor tamao de stos pixeles mejor ser la nitidz obtenida en la fotografa. Una buena cmara digital debe tener una gran cantidad de pixeles, stos deben ser del menor tamao la cmara debe tener una alta sensibilidad a la luz y no debe producir mucho ruido de fondo. (electrones excitados por otros factores que no son la luz recibida).

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Hay diferentes programas computacionales que permiten capturar y manejar las imgenes digitales, en un sentido de modificacin, color, recorte, tamao, etc. , uno de esos programas es el llamado Photoshop . Hay tambin otro tipo de programas, los cuales si tienen una finalidad totalmente diferente, son los programas tcnicos de ANLISIS DE IMAGEN los cuales partiendo de una imagen digital en la computadora, permiten un sinnmero de clculos, conteos, promedios y anlisis etc. etc. de la imagen. Programas muy conocidos de este tipo son los programas de MEDIA CYBERNETICS. Es muy importante saber elegir la resolucin con la cual va a trabajar una imagen en su computadora ya que mientras mas resolucin Ud. demanda mas grande es el archivo y mas lento es el manejar y procesar la imagen. Por ejemplo una imagen de 200 pixeles por pulgada es 4 veces mas grande que una imagen similar de 100 pixeles por pulgada. El saber cuanta resolucin es necesaria va depender del objetivo y destino final que desea a darle a la imagen obtenida, es decir de la resolucin requerida en la pantalla, o en la impresora. Para obtener una aceptable resolucin la cmara que Ud. elija debe tener en lo posible mas de 1.300.000. pixeles, es decir debe tener por ejemplo no menos de 1300 x 1.000 pixeles (ancho x alto de la imagen original) En relacin a los bits ojal su computadora permita 8 , 18 o 24 bits por pixel. (24bits=16 millones de posibles valores de color.) Otro punto importante en una cmara digital es su sensibilidad a la luz, especialmente si se trabaja en fluorescencia, (poca luz disponible) ya que en ste ltimo caso la cmara debe tener una sensibilidad equivalente a 200 hasta 400 ISO o ms y debe tener un bajo ruido de fondo y muchas veces son necesarias camaras especializadas de alto costo. Las camaras digitales se adaptan al tubo trinocular o incluso binocular del microscopio, haciendo falta para eso el acople ptico y/o mecnico respectivo. (en forma similar a la fotografa tradicional con pelcula) Nikon, por ejemplo, dispone de una cmara digital semi-profesional la cual cumple con los requerimientos normales de resolucin, color, velocidad de exposicin (sensibilidad) conexin a computadora y conexin a monitor o TV disponiendo desde luego tambin de la adaptacin para los microscopios Nikon y posiblemente para otras marcas.

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MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA.Walter Ivens H.

3.0 QU ES FLUORESCENCIA? Es la emisin de luz de una substancia sometida a la estimulacin de: Luz, calor o actividad qumica. Este fenmeno ocurre cuando la aplicacin de un estmulo, provoca que los electrones de una substancia puedan pasar a un nivel de mayor energa (estado de excitacin) el cual es seguido por la entrega de la energa sobrante en forma de luz cuando los electrones vuelven a su estado original (o bsico). Adems de lo mencionado anteriormente, hay otros estmulos que pueden dar pie a una luminiscencia , esto estmulos pueden ser : Emisiones radioactivas, rayos-x, friccin, sonido y varios otros mediadores, originando termoluminicencia, luminicencia de rayos-x y triboluminicencia.) La luminiscencia estimulada por luz es conocida con el nombre de fotoluminiscencia y este fenmeno a su vez se divide en dos tipos: Fluorescencia y fosforescencia de acuerdo a su mecanismo de emisin de luz.

Fotoluminiscencia:

- Fluorescencia - Fosforescencia

La diferencia entre fluorescencia y fosforescencia se define usualmente diciendo que la fluorescencia se caracteriza por la cesacin instantnea de emisin de luz cuando se interrumpe la luz de excitacin, mientras que la fosforescencia persiste por un periodo limitado de tiempo, despus que se interrumpi la luz de excitacin. En trminos prcticos podemos decir: Fluorescencia es un fenmeno en el cual una substancia absorbe luz Ultravioleta o visible (de longitud de onda corta) y emite a su vez luz visible de una longitud de onda ms larga que la de la luz de excitacin. Como este fenmeno de emisin no es acompaado de una radiacin trmica, esta luminiscencia se conoce como de luz fra.

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3.1 CARACTERSTICAS DE LA FLUORESCENCIA La fluorescencia posee varias caractersticas especiales de las cuales las siguientes son particularmente interesantes en la microscopa de fluorescencia. 1.) La substancia tiene que absorber luz para emitir fluorescencia. 2.) El largo de onda de la fluorescencia (Yem) es generalmente ms largo que el largo de onda de la luz excitadora (Yex) ley de Stoke yem > yex (yem: Emisin) (yex : Excitacin) Mientras ms larga sea la longitud de onda, ms baja es la energa de la luz. Por lo tanto la energa de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida. 3.) La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho ms baja que la de la luz de excitacin. (la relacin k es del orden de 10-3 a 10-5 4.) La fluorescencia se irradia en forma esfrica desde la substancia emisora, independientemente de la direccin de la luz excitadora. 5.) La fluorescencia se desvanece. 6.) La intensidad "F" de la fluorescencia es proporcional a la intensidad I0 de la luz excitadora, a la densidad "C" del espcimen y a la eficiencia de la fluorescencia (producto cuntico) k. F I0Ck

7.) Cada substancia posee un espectro de fluorescencia caracterstico.

Luz de excitacin no absorbida Luz de excitacin Substancia Fluorescencia

8.) El espectro de absorcin y el espectro de fluorescencia estn relacionados como imgenes reflejadas.

9.) La luz de fluorescencia est polarizada en grado variable.

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3.2 APLICACIONES: Las aplicaciones especiales y ventajas que proporciona la fluorescencia pueden ser resumidas como sigue: 1) 2) 3) 4) Aplicacin en preparados autofluorescentes. Observacin selectiva de substancias especificas en partes o porciones del preparado. Aplicacin en objetos no visibles debido al poder de resolucin de los microscopios pticos pero que pueden ser detectados mediante la fluorescencia. En varios tipos de informacin que estn contenidos en la fluorescencia y por lo tanto adicionalmente a los exmenes convencionales se pueden realizar otro tipo exmenes detectando esta informacin.

1. El preparado o muestra autofluorescente: Un microscopio de flourescencia detecta la fluorescencia emitida por la muestra misma o por una muestra marcada con un fluorocromo. La luz de iluminacin (excitacin) no est involucrada en la formacin de la imagen. En este sentido la microscopa de fluorescencia difiere de la microscopa normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminacin. 2. Las substancias especficas como organelos celulares, protenas, anticuerpos, DNA, RNA, etc. y partes especficas de la muestra pueden ser observadas selectivamente. Los mtodos de tincin permiten la marcacin selectiva de las substancias establecidas en la muestra y por tal razn la deteccin u observacin puede ser circunscrita a substancias elegidas. En general las tcnicas de fluorescencia en anticuerpos son altamente especficas lo cual aumentan las ventajas de la microscopa de fluorescencia. 3. Los objetos no visibles debido al poder de resolucin de un microscopio ptico pueden ser detectados con fluorescencia. El dimetro de una sola molcula de DNA est en orden de 2nm, lo cual es 1/100 del detalle ms fino que puede ser apenas distinguido por el poder de resolucin de un lente-objetivo (el lente distingue alrededor de 200nm) sin embargo s una molcula de DNA es marcada con un fluorocromo, entonces puede ser observada con el microscopio de fluoresencia. Mas an, tambin un virus cuyas dimensiones son bastante ms pequeas que la resolucin de un microscopio ptico, pueden ser detectadas con un microscopio de fluorescencia si es que las diferentes molculas de fluorescencia estn enlazadas con el virus. Resumiendo, objetos bastante ms pequeos que la limitacin del poder de resolucin de los lentes pticos pueden ser distinguidos siempre que su emisin de luz sea lo suficientemente intensa. 4. Varios tipos de informacin estn contenidos en la luz fluorescente por lo cual se pueden practicar diferentes tipos de anlisis. Se obtiene la siguiente informacin: ?? ?? ?? ?? Intensidad de la fluorescencia. Espectro de excitacin Espectro de fluorescencia y polarizacin Mediciones para anlisis cuantitativo y cualitativo

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3.3 PRINCIPIOS Y COMPONENTES BSICOS DEL MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

El microscopio de fluorescencia se basa en dos principios esenciales: ?? Solamente la porcin del espectro de onda que induce a emisin de luz en forma ms eficiente, es extrada (filtrada) y dirigida a la muestra. ?? Solamente la porcin de la fluorescencia que es necesaria observar es extrada (filtrada) con el propsito de formar la imagen para la observacin y fotografa.

Desde luego la correcta seleccin de la longitud de onda es esencial en un microscopio de fluorescencia y basado en estos principios, el sistema de luz y filtros juega un rol principal. A. La fuente de luz emite en varias longitudes de onda desde el ultravioleta hasta el infrarrojo. B. El filtro de excitacin transmite selectivamente solo aquella luz (longitud de onda) que es necesaria para inducir a la fluorescencia del preparado, principalmente en el rango de longitud de onda corta (UV) y detiene la luz que no se desea usar para la excitacin. C. Un preparado (espcimen) que flourece como respuesta a una luz incidente generalmente es un preparado marcado con fluorocromos. D. El filtro barrera corta la luz de excitacin que no fue absorbida por la muestra dejando pasar solo y selectivamente la luz de la fluorescencia. De esta luz de fluorescencia se puede filtrar una longitud de onda ms especfica si as fuese necesario. Los 4 principios mencionados son indispensables en un microscopio de fluorescencia y deben ser considerados al seleccionar un microscopio.

3.4 REQUERIMIENTOS PARA UN MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA: ?? El campo oscuro: Como generalmente la fluorescencia es extraordinariamente dbil en comparacin con la luz de excitacin, el contraste de la imagen se deteriora si no se separa completamente la luz de excitacin de la luz fluorescente y luego se descarta la luz de excitacin (tcnica de campo oscuro). ?? Luz de alta intensidad y de onda corta (UV): En general es necesario una luz de excitacin cercana al UV y/o visible para poder inducir la fluorescencia y adems que sea de alta intensidad para poder obtener una fluorescencia aceptable.

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?? Sistema de filtros: Cada una de las substancias fluorescentes tiene sus caractersticas especiales de absorcin y emisin por lo cual debe disponerse de un sistema de filtros adecuados dependiendo esto de los objetos que van a ser observados. ?? Medidas de proteccin: Debido a que los rayos UV son dainos al ojo humano deben tomarse medidas apropiadas de proteccin. Tambin hay que cuidar que el sistema ptico usado sea lo suficientemente permeable a los rayos ultravioletas (permita su paso) y que este sistema u ptica no emita fluorescencia propia (fluorescensia en la misma ptica).

?? Desvanecimiento de la fluorescencia: El desvanecimiento de la fluorescencia en el preparado causa dificultades al observar y/o fotografiar por lo cual hay que evitar una irradiacin innecesaria del preparado cuando no se est observando. Esto se logra con un obturador o con un filtro ND que se interpone entre la fuente de luz y el preparado.

3.5 FUENTE DE LUZ Como ya hemos mencionado antes, la fuente de luz en un microscopio de fluorescencia debe emitir una alta cantidad de luz en el rango cercano ultravioleta. Generalmente se usan lmparas de mercurio porque cumplen con estas condiciones. En casos especiales se pueden usar lmparas de xenn o halgenas. 1.) Lmparas de mercurio de alta presin: Una lmpara de mercurio de alta presin es un tipo de lmpara de descarga elctrica la cual contiene una pequea cantidad de gas inerte y mercurio, sellado, dentro de un bulbo de vidrio de cuarzo. Como se muestra en la figura N25, este tipo de lmpara irradia una lnea intensa en el espectro proveniente del mercurio como tambin un espectro continuo de una intensidad bastante pareja que se extiende desde el ultravioleta por el visible hasta el infrarrojo. En fluorescencia, la luz usada para la excitacin de la muestra, es principalmente la ms intensa del rango de 365 a 546nm lo que implica lgicamente una utilizacin eficiente de la energa irradiada por este tipo de lmpara (vase capitulo referente a mtodos de excitacin). La potencia de salida de las lmparas de mercurio de alta presin usada generalmente en los microscopios de fluorescencia es de 50, 100 o 200 watts. Los componentes emisores de luz en estas lamparas difieren en tamao y luminosidad (ver tabla 2) y se debe elegir la lampara adecuada de acuerdo a las condiciones del sistema de iluminacin. En general se usa la lampara de 100 watt en los microscopios de epi-fluorescencia.

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Lmpara de xenn: La lmpara de xenn es una lmpara de descarga, que a diferencia a la lmpara de mercurio de alta presin, posee un espectro continuo que se extiende desde el ultravioleta hasta el cercano infrarrojo y el cual muestra caractersticas particulares parecidas a la luz natural en el rango visible. Consecuentemente las lmparas de xenn son usadas bsicamente como fuentes de luz para mediciones del espectro de excitacin. Las lmparas de xenn tambin son consideradas como fuente de luz para microfluorometra debido a su virtud de alta estabilidad lumnica, comparada con la lmpara de mercurio de alta presin como tambin al factor que su distribucin de energa emitida en el rango UV es continua. Debido a que ambas lmparas, la de mercurio y la de xenn funcionan por descarga elctrica, deben ser encendidas con alto voltaje y requieren por lo tanto una fuente de poder especial.

2.) Lmparas halgenas: Son lmparas incandescentes que emplean filamentos de tungsteno similares a los de las lmparas usadas en los microscopios convencionales. Las lmparas de halgeno pueden ser usadas para microscopa de fluorescencia siempre y cuando la luz de excitacin no tenga que ser UV (excitacin B o G) y que adems no se requiera una luminosidad especialmente alta comparada con las lmparas de descarga. La lmpara de halgeno es de fcil manejo y relativamente econmica.

3.6 FILTROS Como mencionamos anteriormente, en la microscopa de fluorescencia solamente la parte necesaria de luz para excitar es usada en la iluminacin y adems solamente la fluorescencia emitida por la muestra es usada para la observacin. Por esta razn los filtros que transmiten ciertos rangos de longitud de onda y cortan otros tienen una funcin muy importante. Los filtros usados en los microscopios de fluorescencia son los filtros de vidrio coloreado y los filtros de interferencia. Las caractersticas necesarias son obtenidas mediante una apropiada combinacin de estos dos tipos de filtros. Filtros de vidrio coloreados: Estos tipos de filtro son fabricados aadiendo pigmentos al vidrio que transmiten la longitud de onda especfica por absorcin selectiva. La variedad de los filtros de vidrio coloreado, incluye filtros de paso de banda y filtros de corte. Los filtros de vidrio coloreado son relativamente econmicos pero su curva de transmisin es bastante pobre y la base de la curva es tambin ancha por lo cual estos filtros no permiten la seleccin de una banda estrecha.

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FIGURA N25

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Filtros de interferencia: Estos filtros son necesarios para obtener bandas de transmisin y reflexin de una longitud de onda especfica debido a la interferencia que se produce al hacer uso de las mltiples reflexiones entre delgadas y transparentes capas de "Coating" (recubrimiento) que tienen diferentes ndices de refraccin. Estos filtros se fabrican usando las tcnicas de evaporacin al vaco. Los filtros de interferencia son relativamente caros pero tienen caractersticas pticas que no se pueden obtener con filtros de vidrio coloreado y as han contribuido a una notable mejora en la seleccin de la longitud de onda lo cual es una caracterstica necesaria en la microscopa de fluorescencia.

El espejo dicroico usado en la fluorescencia episcpica tambin es similar a un de filtro de interferencia. Este elemento cumple una funcin fundamental en la epi-fluorescencia y debido a sus caractersticas es posible la iluminacin episcopica y la observacin de la fluorescencia en los sistemas actuales los cuales en la prctica reemplazaron a la dia-fluorescencia. En efecto, el espejo dicroico refleja (desva) la luz que proviene de la fuente de iluminacin, en 90 y la enva hacia el preparado, pero la luz fluorescente del preparado al incidir a su vez sobre el espejo dicroico no es desviada y lo traspasa (ver figura N25)

Filtros de interferencia:

- Filtros de excitacin y algunos filtros de barrera (particularmente para excitacin "B") los cuales requieran una curva de transmisin estrecha. - Filtros de barrera (filtros de cort

Filtros coloreados de vidrio

El esquema ptico de un microscopio de epifluorescencia:

La luz emitida por la lmpara de mercurio pasa a travs del filtro de excitacin para seleccionar la longitud de onda requerida para la excitacin de la substancia fluorescente. Luego la luz es reflejada en 90 grados para pasar por el objetivo (lente) el cual trabaja en este caso tambin como condensador finalmente esta luz cae sobre el espcimen (muestra) como luz excitadora. Ahora parte de la fluorescencia emitida, en forma esfrica por el espcimen, pasa a travs del mismo objetivo (lente) el espejo dicroico no refleja la luz con una longitud de onda mayor a la de la luz excitadora. El filtro barrera corta luego toda luz excitadora no absorbida por el espcimen (preparado). As la luz de fondo de excitacin es bloqueada y solo se observa la luz fluorescente. (Ver figuras 26 y 27).

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FIGURA N26

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SISTEMA DE FILTROS Una de las mayores ventajas de la fluorescencia episcopica es la posibilidad de poder seleccionar la longitud de onda con las caractersticas necesarias mediante tres tipos de filtros. 1.) Separacin de la luz de excitacin y la fluorescencia mediante el espejo dicroico. Un espejo dicroico es una especie de filtro de interferencia y cuando es posicionado en 45 al eje ptico la longitud de onda ms corta, es reflejada y la longitud de onda ms larga lo atraviesa. En otras palabras este filtro muestra una alta reflexin con las longitudes de onda para excitacin y muestra una alta transmisin a la longitud de onda de la fluorescencia por lo tanto separa la luz de excitacin de la luz de fluorescencia. Esta es la mayor ventaja del sistema de epifluorescencia. Una gran ventaja del espejo dicroico es tambin que permite una alta eficiencia en la seleccin de la fluorescencia ya que la luz de excitacin alcanza al preparado casi sin atenuacin y la luz fluorescente tambin es transmitida sin una apreciable perdida de intensidad de manera que la eficiencia resultante es mayor al 80% permitiendo as utilizar una fluorescencia dbil con una perdida mnima de luz.

2.) Funcin del filtro de barrera: A pesar que la separacin de la luz de excitacin y la fluorescencia es buena con la combinacin del filtro de excitacin y del espejo dicroico, en realidad no es tan as y se requiere adicionalmente un filtro de barrera cerca de los oculares. La razn es que una parte de la luz de excitacin es reflejada en el lente (objetivo) y en la superficie del preparado. Gran parte de la luz de excitacin es reflejada hacia el espcimen por el espejo dicroico pero una parte de la longitud de onda de la luz de excitacin cae en el rango de transmisin del espejo dicroico. El filtro de barrera es necesario para cortar completamente la luz de excitacin no deseada y es tambin posible de seleccionar un rango de longitud de onda especfica de la fluorescencia si fuese necesario. El grado al cual se pueda llegar en oscurecer el campo circundante a lo fluorescente es determinado en el microscopio por las caractersticas de su sistema de filtros. Eso significa que si el sistema de filtros no es completo y adecuado entonces la luz de excitacin se escurre y el campo oscuro se aclara y consecuentemente la fluorescencia especfica del preparado no puede ser observada adecuadamente. El sistema y conjunto de filtros deben ser considerados en forma muy estricta y exacta en la epifluorescencia.

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3.7 LENTES/OBJETIVOS En la epifluorescencia los objetivos (lentes) trabajan tambin como condensador, la luz de excitacin ilumina al espcimen pasando a travs del lente objetivo. Como consecuencia hay que tener consideraciones especiales para la luz ultravioleta:

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Debe haber una alta transmisin de luz UV y visible. Los lentes objetivos no deben emitir fluorescencia propia (autofluorescencia) Los lentes objetivos no deben causar solarizacin.**

Las condiciones mencionadas son satisfechas por la serie de lentes "flor (secos o aceite), los lentes UV-F (glicerina) y los lentes flor-DL (flor/fase, secos/aceite). Los lentes flor "DL" son esencialmente lentes flor con un anillo de fase agregado permitiendo as ambas cosas, fluorescencia episcpica y observaciones en contraste de fase con el mismo lente objetivo. Debido a que la intensidad de la luz de fluorescencia es muy dbil, los lentes objetivos deben ser preferentemente tan brillantes como sea posible, es decir deben tener una apertura numrica alta. Para fluorescencia excitada por radiacin visible, por ejemplo los mtodos V, B y G, bastan lentes objetivos normales como plan acromtico y plan apocromtico aumentando la brillantez de la imagen de fluorescencia con una apertura numrica alta (NA) tambin los lentes acromticos ofrecen un resultado suficiente.

** (Solarizacin: es un trmino aplicado a cambios qumicos como coloracin o cambios de color en el vidrio los cuales son inducidos por la irradiacin de luz u otras. La solarizacin conduce a efectos indeseados como una menor transmisin de luz.

La brillantez de la imagen en los microscopios de epifluorescencia:

1) La brillantez del campo de iluminacin (Ic) es proporcional al cuadrado de la A.N. (NA) del lente objetivo: Ic = (A.N.) 2

2) La brillantez de la imagen fluorescente Ic es directamente proporcional a la cuarta potencia de la A.N. (NA) e inversamente proporcional al cuadrado del aumento. (A.N.) 4 /A2

Ic

=

(A = Aumento)

As para un mismo aumento de un lente objetivo, la brillantez del campo de il