Apresentação do PowerPoint - Sistema de...
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TENSOATIVOS E MICELAS
IÔNICOS:
brometo de dodeciltrimetilamônio CH3
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-N-CH3+
Br-
CH3
dodecil sulfato de sódio
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OSO3- Na+
cauda apolar
cabeça polar
Catiônicos
Aniônicos
Moléculas anfifílicas: grupo liofóbico grupo liofílico
TENSOATIVOS E MICELAS
NÃO-IÔNICOS: CH3-(CH2)9-OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OH
óxido de n-deciltetraetileno (C10E4)
ZWITERIÔNICOS: CH-CH2-PO4
--(CH2)2-N(CH3)3+
dioctanoil fosfatidil colina (C8-lecitina)
QUANTO À CAUDA:
CH3-(CH2)6-COOCHCH3-(CH2)6-COOCH
Saturada/insaturada Cadeias duplas Cadeia ramificada
halogenadas (fluorcarbonetos) cadeia de polióxido de propileno
TENSOATIVOS E MICELAS
NÃO-IÔNICOS: CH3-(CH2)9-OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OH
óxido de n-deciltetraetileno (C10E4)
ZWITERIÔNICOS: CH-CH2-PO4
--(CH2)2-N(CH3)3+
dioctanoil fosfatidil colina (C8-lecitina)
QUANTO À CAUDA:
CH3-(CH2)6-COOCHCH3-(CH2)6-COOCH
Saturada/insaturada Cadeias duplas Cadeia ramificada
halogenadas (fluorcarbonetos) cadeia de polióxido de propileno
SURFACTANT = Surface Active Agent
Líquidos contração da superfície (< energia livre)
força de atração para dentro exercida pelas moléculas presentes na solução sobre as moléculas na superfície
TENSÃO SUPERFICIAL - (mN/m)
Moléculas anfifílicas – procuram orientar-se na superfície (< energia livre)
Interação H2O-Tens. < interação H2O-H2O
tensão superficial
Formação de micelas balanço complexo de forças intermoleculares:
van der Waals
eletrostáticas
hidrofóbicas estéricas
ligações de hidrogênio
MICELAS = agregados de tensoativos
Micelização = mecanismo alternativo à adsorção na superfície/interface para a remoção do grupo hidrofóbico do contato com a água.
Razão principal para a formação de micelas = obtenção de estado mínimo de energia livre
tensão superficial
CMC Concentração de tensoativo
condutividade
detergência
pressão osmótica
Tempo de reação: milissegundos a minutos
As micelas são colóides de associação
Dinâmicas, reversíveis, distribuição estatística de tamanhos (polidispersão)
micela esférica
bicamada
micela cilíndrica
TIPOS DE AGREGADOS FORMADOS (MICELAS)
vesícula (lipossoma)
temperatura
SEPARAÇÃO DE FASES
“Solução” micelar homogênea
Fase rica em micelas
Fase pobre em micelas
- turvação “cloud point” - “ponto de névoa”
- aumento da temperatura redução na solubilidade da micela
Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas
PROCESSO DE SEPARAÇÃO DE FASES
Sistema Monofásico Sistema Bifásico
Fase Rica em
micelas
Fase Pobre
em micelas>> TºC tempo
Tem
pera
tura
T´
Região Bifásica
Região Monofásica Ponto Crítico
Linha de amarração “Tie-Line”
Ci CB CT
V’B V’T
Concentração de tensoativo
Cd Cc
V´c V´d
CURVA BINODAL (C10E4)
Cc e Vc
Cd e Vd
T (oC)
(ou vice-versa)
Yagui, C. O. R., Pessoa A., Blankschtein, d. Two- phase aqueous micellar systems - an alternative method for protein purification. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 21(4):531- 544, 2004
DIAGRAMA DE FASES
Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases Aquosas - SMDFA
T (oC)
19,00
13,05C10E4 + 0,5 M Li2SO4
C10E4 + 0,5 M NaCl
C10E4
C10E4 + 0,1 M KI
23,60
4,75
Influência de alguns sais sobre o ponto crítico
SMDFA – aplicações: Purificar e concentrar compostos como: BSA, bacteriófagos, antibióticos,
colesterol oxidase, lisozima e outras enzimas, vitaminas lipossolúveis e compostos orgânicos.
Separar contaminantes com características hidrofóbicas presentes em soluções biológicas.
Primeiro trabalho - BORDIER (1981) - agente tensoativo não-iônico Triton X-114 - proteínas hidrofílicas X proteínas hidrofóbicas.
Pode ser aplicado a sistemas envolvendo células intactas.
Alternativa na purificação de proteínas de plantas - compostos presentes em plantas que interferem nas técnicas convencionais de extração, como fenóis e clorofila, podem ser facilmente removidos por SMDFA.
Pode separar: íons metálicos, estriol, progesterona, -estradiol, estrona, clorofila, bacteriófagos, células, fenóis e outras moléculas orgânicas de baixa massa molar.
SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS (SMDFA) APLICADO À PURIFICAÇÃO DE
PROTEÍNAS
Ambiente ameno para materiais biológicos;
Método seguro, não utiliza compostos inflamáveis ou explosivos;
Fácil ampliação de escala;
Baixo custo (em princípio requer somente um tensoativo e em baixas concentrações);
Gera resíduos de fácil manuseio (baixa toxicidade, fácil acondicionamento, etc.);
Micelas fornecem ambientes hidrofílicos e hidrofóbicos;
Controle e otimização da partição pelo ajuste das características micelares (tamanho e forma);
Fácil separação do material desejado das moléculas de tensoativo após a purificação;
A seletividade da partição pode ser melhorada com a utilização de micelas contendo ligantes de afinidade ou misturas de tensoativos;
Técnica não interfere em metodologias como cromatografia líquida, eletroforese, ELISA, etc.
SISTEMA MICELAR NÃO-IÔNICO DE DUAS FASES AQUOSAS PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
proteína hidrofílica
proteína hidrofóbica
BORDIER (1981) apresentou a possibilidade de separação de proteínas em SMDFA – tensoativo Triton X-114.
Purificação de proteínas hidrofóbicas: colesterol oxidase, lipase, proteínas de membrana.
Altos valores de Kp
EXPERIMENTO [C10E4] (% p/p)
T (oC)
R (Vt/Vb)
KG6PD BMG6PD (%)
1 2,50 19,5 0,76 0,53 0,04 97 9
2 3,60 20,0 1,00 0,36 0,00 104 4
3 3,25 20,4 0,60 0,33 0,01 108 7
4 3,00 21,5 0,35 0,20 0,04 101 6
5 5,00 22,0 0,60 0,10 0,01 101 2
PARTIÇÃO DA ENZIMA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE (G6PD) EM SISTEMA
C10E4/TAMPÃO
SISTEMA MICELAR MISTO (NÃO-IÔNICO/IÔNICO) DE DUAS FASES AQUOSAS
- G6PD negativamente carregada
- C10E4
- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+
- G6PD negativamente carregada
- C10E4
- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+
- G6PD negativamente carregada
- C10E4
- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+
- G6PD negativamente carregada
- C10E4
- CnTAB (n = 8, 10, or 12) – carga positiva+ ou
Micelas mistas são formadas in situ, sem necessidade de síntese
Condições da solução (pH, FI) podem ser variadas
melhorar a partição alterando as interações eletrostáticas Reverter as interações e separar as
proteínas das micelas
TENSOATIVOS CATIÔNICOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400
Time (min)
Rec
over
y G
6PD
(%)
C8TABC10TABC12TAB
2.5 mM CnTAB + 0.068 mg/mL G6PD
Rec
uper
ação
Tempo
TENSOATIVOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA
Tensoativos não-iônicos – apresentam apenas interações hidrofóbicas não-específicas em concentrações ~ CMC (exceção: BSA e Tritons)
Tensoativos iônicos: 1- interações eletrostáticas com resíduos de aminoácidos de carga oposta
na superfície da proteína (ligação sítio-específica)
2- interações hidrofóbicas das caudas apolares com o interior apolar da proteína (ligação cooperativa, não-específica).
maior a tendência a formar micelas - maior a afinidade pelas proteínas
em geral, tensoativos aniônicos interagem mais fortemente que os catiônicos
cadeias laterais da arginina e lisina (ligação com aniônico) são mais “projetadas” que as do ác. glutâmico e aspartato (ligação com catiônicos)
PURIFICAÇÃO DE G6PD EM HOMOGENEIZADO DE S. Cerevisiae
FONTE DE G6PD PROCESSO UTILIZADO KG6PD YG6PD (%)
Enzima pura sistema C10E4/C10TAB/tampão 7,7 71
Homogeneizado de S.cerevisiae
sistema C10E4/C10TAB/tampão 1,91 48
Homogeneizado de S.cerevisiae
purificação em dois estágios: I - C10E4/tampão
II -C10E4/C10TAB/tampão
I – 0,35 II – 3,82
59
SISTEMA IC10E4/Tampão
separação de fases
coleta da fase Inferior
SISTEMA IIC10E4/C10TAB/Tampão
separação de fases
GFP CBM9
liga à celulose, di- e monossacarídeos
CBM9GFP
C10G1
Surfactant - C10G1
(Decyl -D-glucopyranoside)
+
EXTRAÇÃO DA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTEGFPuv
UTILIZANDO LIGANTE DE AFINIDADE
C10G1 (5%) Lisado Celular + CBM9-GFP Tampão pH 7,2
29oC, após 6h Fase Pobre em Micelas
Fase Rica em Micelas (GFPuv)
Micela +
ligante + GFP
Procion red Cibacron blue
Inibidores de G6PD - Mimetizam a coenzima NAD(P)+
H
N
O
NH2
H H
O
OHOH
OP
OO
PO
-O O CH2
-O
N
N
N
N
NH2
H
CH2
HH
OROH
H
O
+
NADP+
UTILIZAÇÃO DE INIBIDORES ENZIMÁTICOS COMO LIGANTES DE AFINIDADE
PARTIÇÃO DOS LIGANTES CIBACRON BLUE E PROCION RED EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO
0
5
10
15
20
25
30
35
Procion red Cibacron blue
K lig
ante
PARTIÇÃO DA G6PD EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO CONTENDO CIBACRON BLUE E PROCION RED
0,20
0,30
0,40
sem ligante cibacron blue procion red
K G6P
D
Interações de afinidade não são suficientemente fortes para influenciar significantemente o perfil de partição da G6PD.
Ocorrência de interação do ligante com as micelas, diminuindo a probabilidade de formação de complexo enzima inibidor.
Estrutura da Endotoxina: LipoPoliSsacarídeo (LPS)
porç
ão
hidr
ofób
ica
por
ção
hidr
ofíli
ca
4-(C
8H17
)-C 6
H4-
(OCH
2CH
2)n-
OH
,n~
8
TRITON X-114 polioxietileno p-t-octil fenol
Remoção de Endotoxina (pirogênio) por Extração Líquido-LíquidoRemoção de Endotoxina (pirogênio) por Extração Líquido-Líquido