Apostila Prática de Processos Bioquímicos_versão2
-
Upload
anndreisa-monteiro -
Category
Documents
-
view
19 -
download
0
Transcript of Apostila Prática de Processos Bioquímicos_versão2
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
FACULDADE DE TECNOLOGIA ENGENHARIA DE PRODUÇÃO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E AMBIENTAL PROCESSOS BIOQUÍMICOS
MANUAL DE PRÁTICAS DE
PROCESSOS BIOQUÍMICOS
APOSTILA DAS AULAS PRÁTICAS
Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues
Telma Temóteo dos Santos
Agosto de 2011
Índice 1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRÃO .............................................................2 2. QUANTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS ................................................................6
2.1 Roteiro da Prática 1 – Quantificação de Micro-organismos...................................................8 2.1.1. Preparo da Suspensão de Células..................................................................................8 2.1.2 Determinação do peso seco de células (%p/v)................................................................8 2.1.3. Turbidimetria ...............................................................................................................8 2.1.4. Contagem de células em câmara de NEUBAUER ........................................................9 2.1.5. Determinação do volume do centrifugado (% v/v) ......................................................10 2.1.6. Estudo Dirigido..........................................................................................................10 2.1.7. Relatório da Prática 1 .................................................................................................11
3. DOSAGEM DE AÇÚCARES..................................................................................................12 3.1 Método do DNS (3,5 dinitro salicilato)...............................................................................13 3.2 Roteiro da Prática 2 - Curva Padrão do Método DNS .........................................................14
3.2.1. Preparo da Solução Padrão de Glicose: 5 µmols/mL ..................................................14 3.2.2. Construção da Curva Padrão ......................................................................................14 3.2.3. Estudo Dirigido..........................................................................................................15 3.2.4. Relatório da Prática 2 .................................................................................................16
4. ACÚCARES REDUTORES (AR) E AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS (ART)..................17 4.1 Roteiro da Prática 3 - Determinação de Açúcares Redutores (AR) e Açúcares Redutores Totais (ART) ...........................................................................................................................20
4.1.1. Determinação de Açúcares Redutores (AR)................................................................20 4.1.2. Determinação de Açúcares Redutores Totais (ART)...................................................20 4.1.3. Dosagem de açúcares pelo método do DNS................................................................21 4.1.4 Relatório da Prática 3..................................................................................................22
5. Grau Brix.................................................................................................................................23 5.1 Roteiro da Prática 4 - Determinação do BRIX ....................................................................24
5.1.1. Procedimento.............................................................................................................24 5.1.2. Relatório da Prática 4 .................................................................................................25
5. Cinética do Crescimento Microbiano........................................................................................26 5.1 Roteiro da Prática 5 - Cinética do Crescimento de Células de Leveduras ............................29
5.1.1. Preparo da solução de YED 2% e inoculação das células ............................................29 5.1.2. Determinação da concentração de biomassa (X) .........................................................29 5.1.3. Relatório DA Prática 5 ...............................................................................................30
6. Produção de Etanol ..................................................................................................................31 6.1 Roteiro da Prática 6 - Produção de Etanol em caldo de cana-de-açúcar ...............................32
6.1.1. Fermentação ..............................................................................................................32 6.1.2. Inibição da fermentação por NaF (inibidor da enolase) ...............................................32 6.1.3. Relatório da Prática 6 .................................................................................................33
6.2 Roteiro da Prática 7 - Produção de Etanol em YED a 2% ...................................................34 6.2.1. Preparo da solução de YED 2%..................................................................................34 6.2.2. Produção de células e de etanol e consumo de glicose ................................................34 6.2.3. Determinação do álcool pelo método do dicromato.....................................................35 6.3.4. Relatório da Prática 7 .................................................................................................36
7. Acidez de vinhos......................................................................................................................37 7.1. Roteiro da Prática 8 - Determinação da acidez total de vinhos ...........................................38
7.1.1. Procedimento.............................................................................................................38 7.1.2.Relatório da Prática 8..................................................................................................39
8. Preparo de Soluções e Indicadores............................................................................................40
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 2
1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRÃO
O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton, quando este descobriu que a luz
branca, ao atravessar um prisma, é dividida em várias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro
visível é apenas uma pequena parte do espectro eletromagnético. A luz é, portanto, definida
como uma forma de energia eletromagnética, formada por ondas que apresentam comprimentos
diferentes. O comprimento de onda é medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10-9m. A tabela 1.1
mostra as regiões do espectro em relação ao comprimento de onda.
Tabela 1. 1: Regiões do espectro em função do comprimento de onda Região Comprimento de onda (nm) Raios X 0,1 a 100 Ultravioleta 100 a 400 Visível 400 a 800 Infravermelho 800 a 5.000 Mico-onda 5.000 a 30.000
A capacidade que as diversas substâncias químicas têm de absorverem luz em
determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinação quantitativa e
qualitativa, uma vez que o espectro de absorção é característico para uma determinada substância
e a quantidade de absorção (intensidade) é dependente da concentração do composto.
Os métodos instrumentais estão sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as
mais diversas análises nas inúmeras áreas de atuação na industria química destacando-se os
métodos espectrofotométricos.
A espectrofotometria — medida de absorção ou transmissão de luz — é uma das mais
valiosas técnicas analíticas amplamente utilizadas em laboratórios de área básica, bem como em
análises clínicas e biológicas. Alguns exemplos de aplicação incluem: determinação de atividade
enzimática ou nas dosagens de compostos orgânicos em fluidos biológicos, como glicose, uréia,
proteínas, etc, em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reação química, ou
um produto incolor que absorva na região do UV ou do IV.
A técnica baseia-se no fato de que quando um feixe de luz monocromática atravessa uma
solução com moléculas absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e o restante é
transmitido. A absorção de luz depende basicamente da concentração das moléculas absorventes
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 3
e da espessura da solução – caminho óptico (Figura 1.1). Deve-se utilizar um feixe de luz
monocromática de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado.
Beer em 1852 observou a relação existente entre a transmissão e a concentração do meio
onde passa o feixe de luz. Uma determinada solução absorve a luz proporcionalmente à
concentração molecular do soluto, isto é, " A intensidade de um feixe de luz monocromático
decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta
aritmeticamente ".
Figura 1. 1: Esquema de Absorção da Luz
Fonte: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html
A análise quantitativa em espectrofotometria é realizada através da medida da
absorbância, a qual se relaciona linearmente com a concentração dentro de uma faixa de
concentração, seguindo a lei de Lambert- beer. Para medidas de absorção de luz visível e
ultravioleta na pesquisa bioquímica a indústria especializada fabrica vários tipos de aparelhos,
comumente chamados de espectrofotômetros (Figura 1.2).
Nos espectrofotômetros a luz, fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma ou
rede de difração (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes
monocromáticas). O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em um
recipiente transparente (cubeta). Parte da luz é absorvida e parte é transmitida. A redução da
intensidade luminosa é medida pelo detector (célula fotoelétrica) porque o sinal elétrico de saída
do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal elétrico amplificado e
visualizado no galvanômetro em números é lido como uma absorbância e é proporcional à
concentração da substância absorvente existente na cubeta.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 4
Figura 1. 2: Esquema óptico dos principais componentes do espectrofotômetro. As letras representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de
amostras com cubeta contendo solução, (f) célula fotelétrica, (g) amplificador.
Se houver proporcionalidade entre a absorbância e a concentração da substância, pode-se
determinar a concentração da substância em amostras de concentração não conhecida com base
numa curva de calibração, que relaciona absorbância e concentração. Na Figura 1.3 á
apresentada uma curva de calibração, que corresponde à relação gráfica entre os valores de
absorbância e os de concentração.
Figura 1. 3: Curva de Calibração: Absorbância em função da Concentração
Para se plotar uma curva padrão é necessária a leitura de pelo menos quatro pontos, se
esta estiver na faixa de linearidade ou de dez pontos, caso não esteja. Além disso, é preciso
trabalhar, ao menos em triplicata para cada ponto. A curva é obtida a partir da inserção de uma
linha de tendência que passe pelos pontos experimentais. No exemplo da Figura 1.3 observa-se
que o ajuste dos pontos experimentais foi feito com uma reta. A qualidade do ajuste é avaliada
pelo valor do R2, não mostrado neste exemplo.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 5
Com base na análise gráfica da Figura 1.3 é possível verificar a linearidade da reação e
calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração.
FC = Média (Cp/Ap)
C = A.FC Onde:
FC - fator de conversão ou fator da curva
Ap - absorbância do padrão
Cp - concentração do padrão
C - concentração da amostra
A - absorbância da amostra
Observação:
Pode-se trabalhar com a Absorbância (A), como mostrado no texto, ou com a
Transmitância (T).
Na prática, a transmitância, que é medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o
branco na passagem da luz), é pouco utilizada, pois é substituída pelo valor de densidade óptica
(D.O.) ou absorvância, termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso
da transmitância:
A = log 1/T
Referências:
BRACHT, A; ISHII-IWAMOTO, E. L. Métodos de Laboratório em Bioquímica. São
Paulo: Manole, 2003.
http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/curvapadrao.html
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 6
2. QUANTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS
Os micro-organismos possuem a capacidade de ocupar e modificar um determinado
ambiente de forma rápida. A partir da proliferação, os micro-organismos também excretam
enzimas que modificam reagentes para a formação de novos produtos. Diante disso, a
quantificação microbiana é um importante acompanhamento em processos industriais que
envolvam micro-organismos diretamente, exemplo da fermentação alcoólica, ou para se verificar
a minimização dos mesmos quando estes não são desejáveis, como é o caso das salas de preparo
de injetáveis nas indústrias farmacêuticas.
Como exemplo de quantificação microbiana na industria tém-se a Portaria nº 518/04, que
estabelece que a quantidade de bactérias heterotróficas presentes na água não pode ultrapassar
500 UFC/ml senão há a necessidade de reteste,inspeção da fonte ou outras providências cabíveis.
Uma situação oposta, ao se considerar alimentos com atividade próbiótica, a contagem mínima
deve ser de 108 a 109 UFC na dose diária recomendada ou a empresa deve comprovar a eficácia
do produto como probiótico.
O crescimento dos micro-organismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais
como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células, por exemplo. A escolha
do método é função do Micro-organismo e das características do meio de fermentação (cor,
sólidos presentes, etc.).
Não existe um método absoluto para a quantificação microbiana ou determinação da
viabilidade celular de uma população de células. Para estimar a proporção de células viáveis em
uma cultura ou processo fermentativo, métodos baseados no plaqueamento ou observação
microscópica têm sido utilizados. Os métodos de contagem direta são rápidos e simples,
exigindo um mínimo de equipamento, permitindo que seja observada, simultaneamente, a
morfologia celular.
Outros métodos amplamente empregados são densidade ótica (ou absorbância), peso seco
de células, volume de centrifugado, número mais provável, dentre outros. Alguns destes métodos
serão vistos na prática 1.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 7
Referências:
Brasil, Portaria nº 518, de 25 de março de 2004. Estabelece os procedimentos e
responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo
humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências. D.O.U. - Diário Oficial da
União; Poder Executivo, de 26 de março de 2004. Disponível online em: <http://e-
legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=22322&word=>. Acesso em: 31/07/2008.
FDA, Bacteriological Analytical Methods, 2001. Disponível online em:
<http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html>. Ultimo acesso em: 29/07/2008.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 8
2.1 Roteiro da Prática 1 – Quantificação de Micro-organismos Material 1 balão volumétrico de 100 mL 6 balões volumétricos de 250 mL 2 balões volumétricos de 1000 mL 1 Becher de 100 mL 1 Bastão de vidro 1 tubo de centrífuga pipetas volumétricas de 2, 3, 5, 10 e 15 mL 1 pesa-filtro
Equipamentos estufa espectrofotômetro UV-Visível centrífuga balança dessecador câmara de Neubauer microscópio
Reagentes Fermento
Biológico Água
Objetivo: Determinar a concentração de células de levedura em uma suspensão, usando 4
diferentes técnicas de quantificação.
2.1.1. Preparo da Suspensão de Células
Pesar cerca de 1 g de fermento biológico em um becher de 100 mL
Dissolver em água destilada e diluir em balão volumétrico de 100 mL
2.1.2 Determinação do peso seco de células (%p/v)
Pipetar 10 mL da suspensão de células recém preparada, previamente agitada e
transferir para pesa-filtro de tara conhecida.
Secar em estufa entre 100 e 120ºC até peso constante.
Determinar, por diferença de massa, o peso seco de células e expressar o resultado em
termos de massa seca de células (g) / 100 mL de suspensão.
2.1.3. Turbidimetria
Diluir alíquotas de 2, 3 e 5 mL da suspensão de células em balões volumétricos de 250
mL e alíquota de 15 mL em balão volumétrico de 1.000 mL (fazer em duplicata).
Ler a absorbância das suspensões diluídas em espectrofotômetro (=570 nm), usando
água destilada como branco.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 9
2.1.4. Contagem de células em câmara de NEUBAUER
Diluir a suspensão 50 vezes.
Gotejar a suspensão diluída em câmara de NEUBAUER e cobrir com a lamínula.
Efetuar a contagem de 5 dos 25 quadrados da câmara (Figura 2.1). Expressar o
resultado em termos do número de células / mL da suspensão original, com base no
seguinte cálculo:
( 5 quadrados) x (5x104) x diluição
Figura 2. 1: Câmara de Neubauer. A. O círculo indica a área aproximada coberta pelo aumento de 100 vezes ao microscópio (10X ocular e 10X objetiva) de uma câmara de contagem padrão. B. Aspecto de um quadrado
integrante do quadrado médio, mostrando que devem ser contadas as células que tocam as linhas do topo e da esquerda do quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da direita do quadrado.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 10
2.1.5. Determinação do volume do centrifugado (% v/v)
Pipetar 10 mL da suspensão de células recém preparada, previamente agitada e
transferir para tubo de centrífuga graduado.
Centrifugar por 15 minutos. Anotar o volume de células.
Expressar o resultado em termos de volume de células / 100 mL da suspensão.
2.1.6. Estudo Dirigido
1) Pesquisar outras metodologias para quantificação de micro-organismos e para controle de
qualidade.
2) Quais as possíveis fontes de erro das técnicas utilizadas nesta prática?
3) Discutir a aplicabilidade de cada técnica utilizada nesta prática.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 11
2.1.7. Relatório da Prática 1 Componentes do Grupo: 1) Preencher os espaços abaixo, efetuando os cálculos necessários: - Determinação do volume do
centrifugado (% v/v)
volume da suspensão: __________
volume de células: __________
% v/v: __________
- Determinação do peso seco de células (%p/v)
volume da suspensão: __________
tara do pesa-filtro: __________
pesa-filtro + células secas: __________
peso das células secas: __________
Peso seco (g/100 mL): __________
- Contagem de células em câmara de NEUBAUER Contagem quadrados: A = _____ , B = _____, C = _____, D = _____, E = _____
5 quadrados (A+B+C+D+E) = _______
[células] da suspensão diluída 50 vezes = ( 5 quadrados) x (5x104) x (diluição)
[células] da suspensão original = _______ (nº células / mL)
- Turbidimetria Diluição Vol. Susp.
(mL) Vol. balão
(mL) ABS
570nm ABS média Nº células
células/mL Peso seco
(g/100 mL)
2) Construir os seguintes gráficos, determinando a reta de calibração e o fator da curva: Absorbância 570 nm x peso seco das suspensões diluídas Absorbância 570 nm x nº células/mL das suspensões diluídas
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 12
3. DOSAGEM DE AÇÚCARES
Os carboidratos, ou açúcares, com fórmula empírica (CH2O)n são um dos maiores grupos
de compostos orgânicos conhecidos na natureza, e juntamente com as proteínas formam os
principais constituintes dos organismos vivos. Os carboidratos simples mais abundantes são as
pentoses e hexoses. Os açúcares possuem um ou mais átomos assimétricos de carbono, portanto
podem existir na forma de estereoisômeros.
Os carboidratos têm diversas classificações, de acordo com seu tamanho, com o grupo
funcional que é derivado, entre outras. As classificações podem ser: monossacarídeos,
oligossacarídeos e polissacarídeos.
Os monossacarídios são carboidratos simples que não podem ser hidrolisados a açúcares
de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdeídos) e cetoses
(poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o
número de carbonos na cadeia.
Os oligossacarídios são polímeros compostos de resíduos de monossacrídios unidos por
ligações hemiacetálicas, neste caso denominadas ligações glicosídicas, em número que variam de
duas, até, aproximadamente, dez unidades. São compostos importantes na determinação de
estruturas de polissacarídios.
Na indústria existem diversas reações tanto de degradação como de formação de açucares
que são determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos.
Um açúcar redutor é um açúcar no qual o carbono da carbonila não está envolvido em
uma ligação glicosídica e, portanto, pode sofrer oxidação.
Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais
como os íons férrico e cúprico. O carbono do grupo carbonila é oxidado a ácido carboxílico.
Todos os monossacarídeos são potencialmente redutores, devido a presença da carbonila. Outros
carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 13
3.1 Método do DNS (3,5 dinitro salicilato)
Um dos métodos empregados na quantificação de açúcares redutores é o método do DNS.
É um método rápido e prático na determinação de açúcares redutores, e tem grande
aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicação temos: controle de qualidade na
caracterização das matérias primas para fins de processamento, e verificação se determinado
produto está dentro dos parâmetros e padrões exigidos pela legislação; indústria açucareira, no
acompanhamento do processo de fermentação, que permite verificar as taxas de consumo de
açúcar pelo micro-organismo.
A determinação de açúcares redutores pelo método do DNS baseia-se na redução, em
meio alcalino, do 3.5-dinitrosalicilato (coloração amarela). O produto formado é estável, com
coloração laranja-avermelhado (3-amino 5-nitro salicilato) na proporção estequiométrica e
máxima absorção da luz visível no comprimento de onda de 535 nm. Neste método ocorre a
seguinte reação de oxidação (Figura 3.1):
Figura 3. 1: Reação de oxidação da carbonila pelo reagente DNS.
Para se aplicar o método é necessário se fazer inicialmente uma curva-padrão do açúcar
que se deseja quantificar, como será realizado na prática 2 deste manual.
Referências:
MILLER, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., n. 31, p.426, 1959.
WANG, Nam Sun. Glucose assay by dinitrosalicylic colorimetric method. Disponível em: http://terpconnect.umd.edu/~nsw/ench485/lab4a.htm. Acesso em: 10 ago 2011.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 14
3.2 Roteiro da Prática 2 - Curva Padrão do Método DNS
Material 1 balão volumétrico de 100 mL 1 Becher de 50 e de 100 mL 1 Bastão de vidro Buretas de 10 e 50 mL 7 tubos de ensaio com tampa de rosca Pipeta volumétrica de 1 mL
Equipamentos espectrofotômetro UV-Vis balança termômetro banho-maria
Reagentes Glicose Reagente DNS
Objetivo: Construir uma curva padrão para determinação de açúcares redutores pelo método do
DNS, empregando a glicose como padrão.
Sensibilidade do método: 1-20 µmols glicose
3.2.1. Preparo da Solução Padrão de Glicose: 5 µmols/mL
Pesar, em um becher de 100 mL, 90 mg glicose. Anotar a massa para realizar os
cálculos.
Solubilizar com água destilada e transferir para balão volumétrico de 100 mL.
Avolumar o balão.
3.2.2. Construção da Curva Padrão
Em tubos de ensaio com tampa, e com auxílio da bureta de 10 mL, preparar os
seguintes pontos da curva, em duplicata com exceção do branco:
Água destilada (mL)
Solução Padrão (mL)
branco 1,0 - 1 0,8 0,2 mL 2 0,6 0,4 mL 3 0,4 0,6 mL 4 0,2 0,8 mL 5 - 1,0 mL
Adicionar 1 mL de DNS em cada tubo. Agitar e aquecer à 100°C em banho-Maria
durante 5 min.
Resfriar e acrescentar 13 mL de água destilada em cada tubo, com auxílio da bureta de
50 mL. Tampar os tubos e homogeneizar (volume final = 15 mL).
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 15
Proceder a leitura da absorbância em espectrofotômetro em: = 540 nm.
3.2.3. Estudo Dirigido 1) Pesquisar outras metodologias para quantificação de açúcares. 2) Ler o artigo Comparação de Métodos para Determinação de Açúcares Redutores e
Totais em Mel, disponível na pasta da Disciplina de Processos Bioquímicos ou no link http://www.scielo.br/pdf/cta/v23n3/18834.pdf
3) Quais as possíveis fontes de erro na prática em questão?
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 16
3.2.4. Relatório da Prática 2 Componentes do Grupo: 1) Preencher os espaços abaixo, efetuando os cálculos necessários:
Tubo ABS (540 nm) ABS média [glicose] (µg/mL) 1
2
3
4
5
2) Construir a curva padrão de glicose: Abs x [glicose] µg/mL, determinando o coeficiente
angular e o fator da reta obtida.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 17
4. ACÚCARES REDUTORES (AR) E AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS (ART)
A qualidade da cana-de-açúcar era determinada exclusivamente pela sacarose aparente
(POL). Atualmente, englobam-se características físico-químicas e microbiológicas dessa
matéria-prima, que podem afetar, significativamente, a recuperação deste açúcar na fábrica e a
qualidade do produto final.
Dois tipos de fatores afetam a qualidade da matéria-prima destinada à indústria:
fatores intrínsecos: relacionados à composição da cana (teores de sacarose, açúcares
redutores, fibras, compostos fenólicos, amido, ácido aconítico e minerais), sendo estes
afetados de acordo com a variedade da cana, variações de clima (temperatura, umidade
relativa do ar, chuva), solo e tratos culturais;
fatores extrínsecos: relacionados a materiais estranhos ao colmo (terra, pedra, restos de
cultura, plantas invasoras) ou compostos produzidos por microrganismos devido à sua
ação sobre os açúcares do colmo.
‘ Desta forma, existem indicadores que permitem avaliar tanto a riqueza da cana como a
qualidade da mesma para a recuperação dos açúcares. A Figura 4.1 ilustra a coleta de amostras
de cana para avaliação da sua qualidade. A Tabela 4.1 apresenta os principais indicadores da
qualidade da cana.
Figura 4. 1: Coleta de amostras de cana no caminhão na entrada da empresa. Fonte: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-cucar/arvore/
CONTAG01_138_22122006154842.html
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 18
Tabela 4. 1: Indicadores da qualidade e valores recomendados para a cana-de-açúcar.
Fonte: Ripoli e Ripoli (2004).
Abaixo, seguem as definições de alguns destes indicadores:
POL: teor de sacarose aparente na cana. Para a indústria canavieira, quanto mais elevados os
teores de sacarose, melhor.
Pureza: é determinada pela relação POL/Brix x 100. Quanto maior a pureza da cana, melhor a
qualidade da matéria-prima para se recuperar açúcar. Todas as substâncias que apresentam
atividade óptica podem interferir na POL, como açúcares redutores (glicose e frutose),
polissacarídeos e algumas proteínas.
ATR ou ART (Açúcares Redutores Totais): indicador que representa a quantidade total de
açúcares da cana (sacarose, glicose e frutose). O ART é determinado pela relação POL/0,95 mais
o teor de açúcares redutores. A concentração de açúcares na cana varia, em geral, dentro da faixa
de 13 a 17,5%. Entretanto, é importante lembrar que canas muito ricas e com baixa percentagem
de fibras estão mais sujeitas a danos físicos e ataque de pragas e microrganismos. Os estudos
mostram que nas primeiras 14 horas de deterioração da cana, 93% das perdas de sacarose foram
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 19
devidas à ação de microrganismos, 5,7% por reações enzimáticas e 1,3% por reações químicas,
resultantes da acidez.
Açúcares redutores: é a quantidade de glicose e de frutose presentes na cana, que afetam
diretamente a sua pureza, já que refletem em uma menor eficiência na recuperação da sacarose
pela fábrica.
A determinação de açúcares redutores pode ser realizada pelo método de DNS,
utilizando-se como padrão a glicose. Na determinação de açúcares redutores totais, promove-se
preliminarmente a hidrólise da sacarose com ácido clorídrico à quente, como será realizado na
prática 3.
Referências: RIPOLI, T. C. C.; RIPOLI, M. L. C. Biomassa de cana-de-açúcar: colheita, energia e
ambiente. Piracicaba: Barros & Marques Ed. Eletrônica, 2004. 302 p. VIAN, Carlos Eduardo Freitas. Qualidade de matéria-prima. Disponível em: http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/gestor/cana-de-acucar/arvore/CONTAG01_138_22122006154842.html. Acesso em: 10 Jul 2011.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 20
4.1 Roteiro da Prática 3 - Determinação de Açúcares Redutores (AR) e Açúcares Redutores Totais (ART) Material balão volumétrico de 500 mL 6 balões volumétricos de 100 mL pipetas volumétricas de 1, 2, 5, 10, 25 e
50 mL provetas de 25 e 100 mL 8 tubos de ensaio com tampa de rosca Buretas de 10 e 50 mL Becher de 100 mL
Equipamentos espectrofotômetro UV-
Vis banho-maria termômetro
Reagentes 100 mL de Caldo de cana HCl 1:1 NaOH 0,1 mol/L Reagente DNS Padrão de glicose (aula
anterior)
Objetivo: Determinar a concentração de sacarose, glicose e frutose presentes no caldo de cana.
4.1.1. Determinação de Açúcares Redutores (AR)
Diluir 1, 5 e 10 mL de caldo de cana in natura, ou melaço, em balões volumétricos de
100 mL.
Pipetar 1 mL do caldo de cana, ou melaço, diluído e transferir para tubo de ensaio com
tampa, devidamente identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.
4.1.2. Determinação de Açúcares Redutores Totais (ART)
Diluir 50,00 mL de caldo de cana in natura, ou melaço, em balão volumétrico de 500
mL.
Adicionar a seguir 70 mL de água destilada. Inserir um termômetro no balão e levar o
conjunto para banho-maria (~70°C)
Quando a temperatura da solução atingir 65°C, retirar o balão do banho-maria e
adicionar imediatamente 25 mL de HCl 1:1. Homogenizar e deixar em repouso, à
temperatura ambiente, por 30 minutos.
Após este tempo, avolumar o balão até volume final.
Transferir 2, 10 e 25 mL do hidrolisado diluído para balões volumétricos de 100 mL.
Adicionar NaOH 0,1 mol/L até completar o volume do balão.
Pipetar 1 mL de cada solução acima para tubo de ensaio com tampa, devidamente
identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 21
4.1.3. Dosagem de açúcares pelo método do DNS
Preparar um padrão de glicose, como na prática anterior, para ler a absorbância junto
com as amostras.
Proceder a dosagem de açúcares redutores (amostras do item 4.1) e redutores totais
(amostras do item 4.2) pelo método do DNS: adicionar 1 mL de DNS às amostras já
colocadas nos tubos e levar ao banho-maria por 5 min. Deixar esfriar e completar com
13 mL de água destilada.
Preparar amostra em branco (1 mL de água + 1 mL de DNS).
Proceder a leitura da absorbância em espectrofotômetro em: = 540 nm.
Se a absorbância da amostra estiver fora da curva de calibração, repetir o procedimento
variando a diluição do hidrolisado.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 22
4.1.4 Relatório da Prática 3 Componentes do Grupo: 1) Dados obtidos na Prática:
Diluição (AR) ABS (AR) Diliução (ART) ABS (ART)
Concentração do Padrão de Glicose (µg/mL) = _____
ABS do padrão de glicose = _____
2) Calcular o teor de sacarose e de açúcares redutores no caldo de cana (g/100mL) usando
as seguintes equações:
% AR = (C x B x F x 10-4) / P ________ (g/100 mL)
% ART = (A x B x F x 10-4) / P ________ (g/100 mL)
% sacarose = [%ART - %AR] x 0,95 ________ (g/100 mL)
onde: A = absorbância da amostra processada conforme item 2. B = concentração do padrão de glicose em µg/mL (ponto da curva de calibração) C = absorbância da amostra processada conforme item 1. P = absorbância do padrão de glicose (ponto da curva de calibração) F = fator de diluição
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 23
5. Grau Brix
Uma das variáveis agroindustriais mais facilmente determinadas em laboratório ou
mesmo em campo, é o Brix. Quando se trata de cana madura existe estreita relação entre essa
porcentagem e o conteúdo de sacarose na solução. A cana é considerada madura com Brix mínimo
de 18° entre outros fatores. Por consenso, admite-se o Brix como sendo a porcentagem de sólidos
solúveis contidos em uma solução açucarada, ou seja:
1° BRIX corresponde a 1 g de sólidos dissolvidos em 100 g de solução à 20°C
Sendo a sacarose um dos sólidos do caldo (80-90%), o aumento do seu conteúdo acaba
por resultar em aumento do Brix do caldo. Portanto, em soluções com alto teor de açúcares,
como por exemplo o melaço, o valor do °Brix é uma medida aproximada do teor de açúcares
presentes no meio.
A medida do Brix pode ser feita através de refratômetro ou pelo Sacarímetro de Brix, que
que será utilizado na prática 4. A escala do Sacarímetro de Brix varia de 0 a 90º Brix com
divisões de 0,1 / 0,2 / 0,5 e 1º Brix.
Referências:
DOUMER, M. E.; MARTINS, G. A.; MOREIRA, A. da S.; SILVA, S. D. dos A..
Avaliação de graus brix de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) da parte inferior e
superior de colmos. Disponível em:
http://www.ucpel.tche.br/cic/cdcic2009/pdfs/1464.pdf Acessado em: mai 2011.
INCOTERM. Instruções de Uso do sacarímetro de Brix. Disponível em:
http://www.incoterm.com.br/download_anexo/5733_MANUAL.pdf. Acesso em mai
2011.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 24
5.1 Roteiro da Prática 4 - Determinação do BRIX Material proveta de 500 mL
Equipamentos sacarímetro de Brix termômetro
Reagentes 500 mL de Caldo de cana
Objetivo: Determinar o teor de sólidos dissolvidos em uma solução, através da medida da
densidade utilizando o sacarímetro de BRIX.
5.1.1. Procedimento
Transferir o caldo de cana ou melaço para a proveta de 500 mL
Mergulhar o sacarímetro de BRIX cuidadosamente, de modo a não umedecer a haste
acima do líquido. Deixar o instrumento flutuar livremente e não deixar tocar nas
paredes ou no fundo da proveta. Aguardar 5 minutos.
Proceder a leitura olhando em nível com a superfície da solução, anotando o valor do
BRIX.
Verificar a temperatura da solução.
Efetuar as correções, utilizando a tabela 5.1. A correção é aditiva quando a temperatura
da solução for maior do que a temperatura padrão (20°C) e subtrativa quando a
temperatura da solução for menor do que a temperatura padrão.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 25
5.1.2. Relatório da Prática 4 Componentes do Grupo: Leitura no sacarímetro (°BRIX): _____ ° B – temperatura padrão 20°C Temperatura da solução: _____°C Fator de correção: ______ ° BRIX = leitura no sacarímetro +/- fator de correção: ______ ° B Tabela 5. 1: Tabela de Correção para Grau Brix
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 26
5. Cinética do Crescimento Microbiano
Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e
não ao aumento das dimensões celulares. Quando se estuda a cinética de crescimento a escolha
da técnica de quantificação microbiana é um parâmetro importante, pois dela depende os
cálculos que serão realizados. É importante também se determinar a taxa de crescimento
microbiano e o tempo de geração do micro-organismo em estudo, nas condições de processo
utilizadas.
A Taxa de crescimento (velocidade específica de crescimento) é a variação no número
ou massa de microrganismos por unidade de tempo.
Define-se Tempo de geração como o intervalo de tempo necessário para que uma célula
se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a
20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas.
O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de
fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura.
O conhecimento da cinética de um processo ou da cinética de crescimento microbiano é
importante industrialmente, pois permite a análise de perigos e pontos críticos do processo
(APPCC); previsão de eventos fora do processo; determinação de vida-de-prateleira; análise de
Risco.
Na Figura 5.1 é mostrada uma curva típica de crescimento microbiano. O crescimento
microbiano pode apresentar quatro fases distintas, a saber:
Fase Lag ou de Adaptação - fase de adaptação metabólica ao novo ambiente, onde
ocorre rearranjo do sistema enzimático (síntese de enzimas), traumas físicos (choque
térmico, radiação, entre outros) e traumas químicos (produtos tóxicos, meio de cultura).
O número de indivíduos não aumenta nesta fase, podendo até mesmo decrescer. A
duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam
anteriormente.
Fase Log ou Exponencial - Nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas,
absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Fase
na qual o número de células da população dobra a cada geração. A taxa de
crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 27
questão. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Esta taxa de
crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Após um
determinado período de crescimento exponencial, as condições ambientais tornam-se
desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais, acúmulo de metabólitos tóxicos e
limitação de espaço. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase
estacionária.
Fase Estacionária - Fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente
devido às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se
dividindo, mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito
próxima da taxa de morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis
na população. A curva de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária
depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se
tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições
ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. É na fase estacionária que são
sintetizados vários metabólitos secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas.
Nesta etapa ocorre também a esporulação das bactérias.
Fase de Declínio ou de Morte - Fase de declínio exponencial do número de células
viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. O número de células
viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população.
Figura 5. 1: Curva característica do crescimento celular de um micro-organismo
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 28
Leitura Complementar: STREMEL, D. S., VIDAURRE, T.C., SILVA, F.S., KELLER, L.E. Estudo da cinética
de crescimento microbiano do Bacillus subtilis em meio alternativo na produção de Biocontrolador de fungos fitopatogênicos. XVIII Congresso Regional De Iniciação Científica e Tecnológica.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 29
5.1 Roteiro da Prática 5 - Cinética do Crescimento de Células de Leveduras Material pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 5 mL pipetas graduadas de 5, 10 e 25 mL proveta de 100 mL 5 Becher de 50 ou 100 mL 8 tubos com tampa de rosca 1 Erlenmeyer de 250 mL Bastão de vidro
Equipamentos espectrofotômetro UV-Vis agitador tipo shaker balança
Reagentes fermento biológico extrato de lêvedo glicose KH2PO4 (NH2)2SO4
Objetivo: Determinar a taxa específica de crescimento de células de levedura em meio sintético
(YED 2%).
5.1.1. Preparo da solução de YED 2% e inoculação das células
Preparar a solução de YED em erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lêvedo, 2 g de
glicose, 0,2 g de KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de água destilada
e solubilizar todos os reagentes.
Pesar entre 90 e 100 mg de fermento biológico. Anotar a massa.
Inocular o meio sintético transferindo o fermento para a solução de YED 2%, com o
auxílio da própria solução.
Colocar o erlenmeyer em agitador tipo shaker e iniciar agitação contínua.
5.1.2. Determinação da concentração de biomassa (X)
Após inocular as células, retirar uma alíquota de 3 mL.
Transferir um pouco da amostra para a cubeta e proceder a determinação de biomassa
em 570 nm, utilizando a curva de “quantificação de micro-organismos”.
Se a absorbância for maior do que o último ponto da curva, proceder à diluição da
mesma.
Repetir o procedimento, retirando alíquotas a intervalos de 30 min, aumentando a
diluição, se necessário.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 30
5.1.3. Relatório DA Prática 5 Componentes do Grupo: 1) Determinação da concentração de biomassa (X)
Tempo (h)
Absorbância (570 nm)
diluição [biomassa] (g/ mL)
0 1 2 3 4
2) Construir a curva de crescimento: (i) [biomassa] x tempo, (ii) Ln [biomassa] x tempo. 3) Determinar a taxa específica de crescimento (µX) das células de levedura em meio YED.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 31
6. Produção de Etanol
O álcool (etanol) pode ser obtido de diversas formas de biomassa, sendo a canade-açúcar
a realidade econômica atual. Investimentos portentosos estão sendo efetuados para viabilizar a
produção de álcool a partir de celulose, sendo estimado que, em 2020, cerca de 30 bilhões de
litros de álcool poderiam ser obtidos desta fonte, apenas nos EUA. O benefício ambiental
associado ao uso de álcool é enorme, pois cerca de 2,3 t de CO2 deixam de ser emitidas para cada
tonelada de álcool combustível utilizado, sem considerar outras emissões, como o SO2.
A cana-de-açúcar é a segunda maior fonte de energia renovável do Brasil com 12,6% de
participação na matriz energética atual, considerando-se o álcool combustível e a co-geração de
eletricidade, a partir do bagaço. Dos 6 milhões de hectares, cerca de 85% da cana-de-açúcar
produzida no Brasil está na Região Centro-Sul (concentrada em São Paulo, com 60% da
produção) e os 15% restantes na região Norte-Nordeste.
Na safra 2004, das cerca de 380 milhões de toneladas moídas, aproximadamente 48%
foram destinadas à produção de etanol. O bagaço remanescente da moagem é queimado nas
caldeiras das usinas, tornando-as auto-suficientes em energia e, em muitos casos, superavitárias
em energia elétrica que pode ser comercializada. No total foram produzidos 15,2 bilhões de litros
de etanol e uma geração de energia elétrica superior a 4 GWh durante a safra, o que representa
aproximadamente 3% da nossa geração anual.
O etanol é um produto da fermentação do açúcar, mais freqüente entre os micro-
organismos. As principais produtoras de álcool são as leveduras principalmente linhagens de
Saccharomyces cerevisae. As leveduras são, como na maioria dos fungos, organismos aeróbicos.
No entanto, sob condições de anaerobiose fermentam carboidratos à etano e gás carbônico.
C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2
A fermentação da glicose à etanol e gás carbônico pela levedura Saccharomyces
cerevisae segue o caminho da frutose bifosfato. A transformação de piruvato à etanol resume-se
em duas etapas. Primeiro, o piruvato é descarboxilado a acetaldeído sob ação da piruvato-
descarboxilase (e cooperação da tiaminopirofosfato). O acetaldeído é, em seguida, reduzido a
etanol pela álcool-desidrogenase com NADH2.
Referências:
http://www.biodieselbr.com/energia/alcool/etanol.htm
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 32
6.1 Roteiro da Prática 6 - Produção de Etanol em caldo de cana-de-açúcar Material 2 Erlenmeyer de 500 mL Proveta de 200 mL 2 Becher de 50 mL Becher de 100 mL Bastão de vidro Fermentômetro
Equipamentos balança
Reagentes 350 mL de Caldo de cana 60 g de fermento biológico NaF
Objetivo: Produzir etanol utilizando caldo de cana como matéria prima e observar as fases da
fermentação alcoólica.
6.1.1. Fermentação
Pesar cerca de 25 g de fermento biológico em becher.
Transferir 150 mL de caldo de cana para o erlenmeyer de 500 mL.
Acrescentar o fermento biológico previamente pesado e adaptar o fermentômetro.
Anotar a massa total do conjunto (m).
Deixar que a fermentação se processe, pesando e anotando a massa do conjunto a cada
30 min.
6.1.2. Inibição da fermentação por NaF (inibidor da enolase)
Repetir o procedimento do item 6.1, acrescentando-se ao caldo de cana 0,315 g de NaF.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 33
6.1.3. Relatório da Prática 6 Componentes do Grupo: 1) Para os procedimentos 6.1 e 6.2, responda:
a) Qual a quantidade de gás carbônico produzido?
b) Qual a quantidade de etanol produzido?
c) Qual a quantidade de glicose consumida?
2) Calcule o grau de inibição provocado pelo NaF.
3) Calcule o rendimento e a eficiência da fermentação. Dado: rendimento teórico = 0,511
4) Construa o gráfico SCO2 x t, Setanol x t.
5) Pesquise a função da enzima enolase.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 34
6.2 Roteiro da Prática 7 - Produção de Etanol em YED a 2% Material Parte 1: Erlenmeyer de 250 mL Provetas de 50 e 100 mL Pipeta volumétrica de 1 mL 2 Becher de 50 e 100 mL 10 tubos com tampa de rosca 3 tubos de centrífuga 4 balões volumétricos de 250 mL 2 balões volumétricos de 100 mL Bastão de vidro Pipeta graduada de 5 mL Bureta de 25 mL Parte 2: Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 mL 3 Erlenmeyer com tampa de borracha Proveta de 200 ou 250 mL Proveta de 25 mL ou pipeta graduada de
20 mL Bureta de 25 mL
Equipamentos Parte 1: Balança Espectrofotômetro Destilador centrífuga
Reagentes Parte 1: 60 g de fermento
biológico Glicose Padrão de glicose de
10 mol/mL DNS Extrato de lêvedo KH2PO4 (NH4)2SO4 NaOH 0,1 N
Parte 2: Padrão de dicromato de
potássio H2SO4 concentrado H3PO4 85 % Indicador Sulfato ferroso amoniacal
Objetivo: Calcular a eficiência de uma fermentação de glicose por células de leveduras através
da medida da produção de etanol e do consumo de glicose.
6.2.1. Preparo da solução de YED 2%
Colocar em um erlenmeyer de 250 mL: 1 g de extrato de lêvedo, 2 g de glicose, 0,2 g de
KH2PO4 e 0,2 g de (NH4)2SO4. Acrescentar 100 mL de água destilada e solubilizar todos
os reagentes.
Retirar uma alíquota de 3 mL para a dosagem de açúcar pelo método do DNS.
6.2.2. Produção de células e de etanol e consumo de glicose
Inocular o erlenmeyer de 250 ml, contendo YED com 20 % (pu/v) de células. Agitar e
imediatamente retirar uma alíquota de 1,0 ml (tempo 0) e verter para balão volumétrico
de 250 mL, completando com água destilada. Fazer a leitura da ABS a 570 nm (dosagem
de células).
Manter o mosto inoculado agitando periodicamente por 1 h.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 35
Após 1 h de fermentação, retirar alíquota de 3 ml para determinação da concentração
celular. Diluir a amostra 1:250 e ler a ABS a 570 nm.
Centrifugar cerca de 30 ml do meio fermentado. Recolher o sobrenadante (tempo 1 h).
Do sobrenadante, guardar 5 ml para determinação do teor de açúcar e colocar 10 ml no
compartimento do destilador.
No destilador, adicionar em seguida 10 ml de H2O e 0,5 ml de NaOH 0,1 N. Fechar o
sistema e recolher os 8 ml iniciais do destilado. Completar este volume a 10 ml com
exatidão. Congelar a amostra para posterior determinação do teor de etanol pelo método
do dicromato.
Diluir 100 vezes uma alíquota dos sobrenadantes (tempos 0 e 1 h) e determinar a
quantidade de glicose pelo método do DNS.
6.2.3. Determinação do álcool pelo método do dicromato
Colocar 10 ml de solução de dicromato em 3 frascos cônicos e adicionar, em seguida,
5 ml de H2SO4 concentrado, resfriando-se em água da torneira.
Colocar em cada frasco 5,0, 2,5 e 1,0 ml do destilado e completar o volume a 5,0 ml de
água, quando for o caso.
Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 min para o etanol ser quantitativamente levado
a ácido acético.
Após 15 min, adicionar 165 ml de água destilada, 18 ml de ácido fosfórico e 0,5 ml de
indicador.
Titular com sulfato ferroso amoniacal até a cor da solução mudar de púrpura para verde e
anotar o volume consumido (n).
Para o ensaio em branco adicionar 5 ml de água destilada no lugar da amostra e repetir o
procedimento. Anotar o volume consumido (N).
Cálculos: Alíquota de 5 ml do destilado A = 2 (1 – n/N) Alíquota de 2,5 ml do destilado A = 4 (1 – n/N) Alíquota de 5 ml do destilado A = 10 (1 – n/N) Onde A = concentração de etanol na amostra original (%)
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 36
6.3.4. Relatório da Prática 7 Componentes do Grupo: 1) Calcular as concentrações de glicose e de células para os tempos 0 e 1 h. 2) Calcular a massa de etanol formado. 3) Calcular o rendimento e a eficiência da fermentação a partir dos resultados.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 37
7. Acidez de vinhos
Sabe-se que a acidez dos vinhos se deve a presença de ácidos como o tartárico, málico e
cítrico, entre os mais importantes. Estes ácidos garantem a conservação do vinho bem como
outras características de suma importância. O grau de acidez está também relacionado com a
acidez total titulável, o pH, a quantidade de ácidos dissociados e não dissociados, e a quantidade
relativa de cada um dos ácidos presentes.
Dentro dos padrões comerciais, a acidez do sumo fica no intervalo de 0,6 a 0,9 %
(expresso como a quantidade de ácido tartárico por 100ml de sumo ou vinho). Os vinhos doces
têm acidez no intervalo de 0,4 a 0,65%. Na fabricação do vinho é importante saber a acidez
titulável do mostro para poder determinar a quantidade correta de dióxido de enxofre que será
adicionada e também decidir se é ou não necessária uma correção da acidez.
A acidez titulável do vinho é normalmente expressa em ácido tartárico % (m/v); massa
molar do C2H4O2(COOH)2 = 150,09g/mol. Lembrar que o ácido tartárico tem dois hidrogênios
tituláveis ate a viragem da fenolftaleína.
Ácido tartárico ( g/100mL) = (Vb).(C NaOH).( 150,09).(100)
(1000).2.(Vam) onde: Vb é o volume, em mL, da solução de NaOH usada na titulação. C NaOH é a concentração da solução de NaOH, em mol/L. Vam é o volume, em mL, da amostra titulada.
Esta determinação está sujeita à interferência do CO2 dissolvido. Este erro pode ser
minimizado diluindo o vinho com água quente, próximo da fervura, e depois deixando esfriar até
a temperatura ambiente antes de titular. Geralmente esse erro é pequeno.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 38
7.1. Roteiro da Prática 8 - Determinação da acidez total de vinhos Material
2 Erlenmeyers de 250 mL 1 Becher de 100 mL Pipeta volumétrica de 25 mL
Reagentes
Vinhos branco e tinto secos Água destilada Solução alcoólica de fenolftaleína a 1% NaOH 0,1 M
Objetivo: determinar a acidez titulável do vinho branco e tinto. O ácido tartárico expressa a acidez titulável do vinho. Esta expressão pode ser obtida por meio de uma equação que determina a concentração do ácido tartárico em g/mL. 7.1.1. Procedimento
Transferir 25 mL de vinho branco seco para um erlenmeyer de 250 mL. Adicionar 100 mL de água deionizada e 5 gotas de solução alcoólica de fenolftaleína a
1%. Titular com uma solução padrão de NaOH 0,1M. O ponto final é indicado pela permanência de uma leve cor rósea por mais de 30
segundos. Repetir o procedimento acima para o vinho tinto, com o cuidado de que o ponto final é
evidenciado pelo aparecimento de uma cor cinza-esverdeada.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 39
7.1.2.Relatório da Prática 8 Componentes do Grupo:
1) Calcule a acidez do vinho analisado.
2) Determine o erro da análise, comparando o valor obtido com o contido no rótulo.
3) Compare com os valores comerciais.
Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos
Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 40
8. Preparo de Soluções e Indicadores
Reagente DNS
Preparar separadamente, por dissolução à quente e a agitação, as soluções abaixo:
- 10g ácido 3,5-dinitro salicílico em 200 mL NaOH 2 mol/L (fica uma massa pastosa)
- 300 g tartarato duplo de sódio e potássio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL água destilada
Misturar as duas soluções e completar o volume a 1000 mL com água destilada aquecida.
Meio sintético YED 2%
Solubilizar em água destilada o extrato de lêvedo (1%), glicose (2%), KH2PO4 (0,2%) e
(NH4)2SO4 (0,2%)
Indicador: 0,25 g de sal de bário do ácido 4-difenilalanina-sulfônico dissolvido, com
leve aquecimento, em 50 ml de água. Filtrar em papel de filtro faixa azul. Líquido
sobrenadante é usado.
Solução padrão de dicromato de potássio: 8,454 g K2Cr2O7 dissolvidos em água,
completado a 250 mL.
Solução de sulfato ferroso amoniacal: 67,55 de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, dissolvido em
300 mL de água e 10 mL de H2SO4 concentrado. Filtrar em papel faixa azul para balão de
500 mL e completar o volume com água destilada.