Apostila Biotecnologia de Alimentos

UNIJUI UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RS DBQ DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E QUMICA CURSO - QUMICA INDUSTRIAL DE ALIMENTOS

INDICE

APRESENTAO........................................................................................................................... 1

INTRODUO A TECNOLOGIA DE FERMENTAES........................................................... 2

MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL ....................................................................... 9

ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR..................................... 18

CRESCIMENTO CELULAR ........................................................................................................... 27

CLASSIFICAO DOS PROCESSOS............................................................................................ 37

EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES STARTERS........................................................... 40

SISTEMAS DE FERMENTAO.................................................................................................. 48

INTRODUO AO ESTUDO DA FERMENTAO ALCOLICA........................................... 54

SEPARAO DOS PRODUTOS DE FERMENTAO.............................................................. 66

SEPARAO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM LEVEDURAS....... 73

PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAO COM BACTRIAS.......................................... 77

DIGESTO ANAERBICA (FERMENTAO METANOGNICA)......................................... 79

TECNOLOGIA DE PRODUO E UTILIZAO DE ENZIMAS.............................................. 89

Prof. Raul Vicenzi 1

APRESENTAO

A Biotecnologia um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da

transformao ou tratamento de materiais de origem biolgica. Spinks (1980) define

Biotecnologia como a utilizao de organismos vivos ou sistemas biolgicos para a

produo industrial e seu uso em servios de saneamento.

A tendncia atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto mais

essencial, a Microbiologia Industrial, que trata do aproveitamento dos microrganismos

como agentes de degradao e sntese. Por semelhana dos conceitos fundamentais

que regem o tratamento biolgico de efluentes, o cultivo de clulas animais e vegetais

e a produo de certos medicamentos. Assim, tambm devido ao seu amplo

significado, pode englobar tambm aspecto igualmente importante da Cincia,

Tecnologia e Engenharia de Alimentos.

De certa forma, os processos de fermentao representa uma elo que liga as

antigas artes de elaborao de alimentos (queijo, vinho, ...), mediante o uso de uma

flora microbiana natural com a moderna industria de fermentao de alimentos que

utilizava cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. A

produo em larga escala de protenas de organismos unicelulares, produo de

antibiticos, produo de clulas animais e vegetais e a produo compostos qumicos

a partir de matrias-primas renovveis em substituio aos combustveis fsseis, so

exemplos de outras reas onde os processos fermentativos podem ser utilizados.

O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem como

objetivo principal estudar alguns elementos essenciais e bsicos dos processos

fermentativos: introduo a microbiologia industrial, sistemas de fermentaes,

desenho de fermentadores, cintica de crescimento, metabolismo microbiano,

esterilizao na indstria fementativa, produo de enzimas, cultivos starters.

Objetiva, tambm, abordar de forma mais detalhada alguns tipos de fermentao:

alcolica, lctica, actica, metanognica.

Introduo biotecnologia de alimentos


INTRODUO A TECNOLOGIA DE FERMENTAES

O termo Fermentao deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas

devido a produo de dixido de carbono pela ao das leveduras sobre o extrato de frutas ou gros

de malte;

Significado bioqumico: relata a gerao de energia pelo catabolismo de compostos orgnicos;

Produo de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma poca e as

bebidas alcolicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a.C. na China;

Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egpcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, aps

estrusavam e amassavam os gros lavando-os aps para obter a bebida, ainda, utilizavam as

leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pes;

Leite e derivados lcteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando

retido no estmago de terneiros jovens coagulava-se (ao enzimtica);

Produtos crneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem j sabia que a carne

finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era seca

e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradvel

Este produto foi o precursor da lingia fermentada produzida atualmente.

O nome salame provm da cidade de Salamis, destruda a mais de 2000

anos, situada na costa oeste da ilha Grega de Cypros.

Exame microscpico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440

a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se uma

pureza maior nos sedimentos mais recentes.

A necessidade de preservar a carne da caa e de animais domsticos abatidos durante o

inverno e consumidos no vero (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse solues

para a preservao do produto.

Assim, os produtos crneos fermentados tornaram-se de grande importncia no mercado

alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma caractersticos da tecnologia

usada.

Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscpio, foi o primeiro a examinar em

1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida......

1856-1857: Louis Pasteur, aps investigaes detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do

vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o acar em etanol e CO2 quando em

anaerobiose.

Pateur tambm observou muitas outras fermentaes: Ex.: observou provavelmente um

Penicillium que fermentava D-tartarato de amnio em uma mistura racmica de D e L-tartarato

(tartarato de Na, K);

Observou tambm como uns microrganismos cilndricos produziam cido butrico somente em

condies anaerbias e investigou a produo de cido actico por fermentao;

1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um microrganismo

frente a outros e previram suas aplicaes teraputicas;



1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu tcnicas de cultivo puro assim como outros mtodos

bacteriolgicos clssicos utilizados at hoje;

Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentaes industriais:

Emprego de fungos e leveduras na modificao de alimentos e bebidas e os estudos

microbiolgicos pioneiros de Pasteur e Kock.

Desenvolvimento de fermentaes em superfcie ou semi-slidas surgiu com o desenvolvimento

de alimentos orientais e durante as grandes navegaes;

Capacidade hidroltica de determinados fungos em hidrolisar o amido e protenas na produo

de molho de soja, este foi o inicio das fermentaes industriais.

Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de obteno de protenas alimentcias

microbianas (SCP - protenas de organismos unicelulares) e de inculos de microrganismos

Produo de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a produo de cidos prepararam o caminho

para o desenvolvimento de fermentaes que produzissem cidos orgnicos;

O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de

tcnicas que permitiram estudar as aplicaes industriais de espcies microbianas individuais,

iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esterilizados e condies asspticas nas

fermentaes industriais.

FERMENTAO DE ALIMENTOS

Fermentao de po, queijo e cerveja bem como bebidas alcolicas desenvolveram-se para

satisfazer as exigncias comerciais modernas de produo em grande escala, com qualidade elevada

e constante, custos competitivos e variedade de produtos.

Produo de cultivos Starters para produtos lcteos e o emprego de enzimas industriais

melhoraram a eficincia dos processos, assim como a automao e controle da qualidade na

produo de po e produtos lcteos.

Fermentao de po em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo;

Uso de amilases microbianas na produo de acares fermentescveis a partir de gros de

amido, proporcionando acares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a

massa de po e produzir textura caracterstica).

Tcnicas de Pasteurizao: permitiram a produo de cerveja em escala industrial fazendo com que

industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes complexos

produzindo em grande escala.

Tcnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos)

Controle da velocidade de inoculao;

Viabilidade e condies de armazenamento das leveduras;

Controle das condies de oxignio dissolvido;

Controle da concentrao de Nitrognio solvel e de acares fermentescveis no lcool;

Controle da temperatura do processo;

Fermentao em processos contnuos;



Introduo de inovaes tecnolgicas como:

Obteno de cerveja com elevadas concentraes de mosto;

Emprego de cereais no malteados e enzimas microbianas

Produo de cervejas com baixos nveis de carboidratos

Aplicao de tcnicas genticas convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e

eliminar caractersticas indesejveis.

LEVEDURAS DE PANIFICAO

Sculo XVII os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais;

Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentao variveis, foram gradualmente sendo

substitudas por leveduras procedentes de fbricas de bebidas alcolicas.

1781 obtm-se as primeiras leveduras de panificao prensadas, obtidas atravs do processo

Holands e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado Viena

Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matria-prima e

30% de lcool.

1879-1919 - avanos substanciais nos processos fermentativos com uso de biomassa

permitindo a obteno industrial de leveduras para panificao de forma independente de

bebidas alcolicas;

1879 - Marquardt introduziu a aerao no processo fermentativo de cereais permitindo

aumentar o rendimento e diminuindo a produo de lcool a 20%.

INOVAES TECNOLGICAS:

Adio gradual de acar

Surge o primeiro processo de retro-alimentao

Permite elevar a eficincia do processo ate

prximo do mximo terico sem a formao

conjunta de lcool.

Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produo de leveduras de

panificao usando melao (todo resduo dos processos industriais da poca) como substrato, com a

finalidade de produzir protena para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produo

de SCP.

Durante a Segunda Guerra Mundial, tambm na Alemanha, inicia-se a produo de SCP para

consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melao procedente da produo de

papel e polpa de celulose, obtendo-se os acares (substrato) a partir da hidrlise cida da madeira.

USA, Sua, Taiwan e Rssia passam tambm a utilizar este processo.

CIDOS ORGNICOS

1881 inicia-se a produo comercial de cidos orgnicos sendo que at hoje 50% do cido

lctico utilizado a nvel industrial produzido via fermentao usando Lactobacil1us delbrueckii.



cido Ctrico extrado inicialmente a partir do suco de limo e posteriormente sintetizado a

partir do glicerol.

1923 - inicia-se a produo de Citrato via fermentao industrial, atualmente estima-se uma

demanda aproximada de 450.000 toneladas/ms produzidas exclusivamente por fermentao,

inicialmente:

Empregava-se cultivo em superfcie de Aspergilius niger como organismo produtor (citrato).

Aps a 2 Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977

desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente.

Outros cidos orgnicos so produzidos de forma econmica e rentvel por fermentao:

Ex.: produo de Acido Glucnico e Acido Actico, este obtido pela oxidao do etanol

utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o cido Actico em escala industrial produzido somente

por via qumica.

LCOOL E CETONAS

Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizados

na produo de glicerol, componente para produo de explosivos, desenvolve a primeiro processo

fermentativo de produo de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presena de

bissulfito de sdio;

Durante a Primeira Guerra na Inglaterra desenvolvido o processo de fermentao acetona-

butanol por via anaerbia, utilizando Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em

grande escala que necessitava mtodos de cultivos puros para prevenir a contaminao.

Aps a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou a procura por n-butanol,

produzido por fermentao at os anos 50, sendo substitudo pelo n-butanol produzido a partir do

petrleo, cujo preo era mais baixo que o preo do amido e dos substratos a base de acar utilizados

no processo fermentativo.

1941 - Inicia-se a implementao da indstria da fermentao alcolica nos USA, aps revogar-

se a proibio da produo de lcool por bioprocessos, sendo responsvel ento por 77% do lcool

industrial produzido

1973 - A crise do petrleo faz surgir projetos para produo de combustveis alternativos.

Surge o PROLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhes de gales de

etanol/ano, a partir da cana-de-acar.

Nos USA inicia-se o Gasohol Program que destinava-se a produzir lcool a partir do milho,

adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um nmero muito grande de plantas

industriais de pequena e grande escala utilizando processos contnuos e descontnuos.

AMINOCIDOS

Glutamato Monosdico e a Lisina so os que se produzem em maiores quantidades, cerca de

500.000 e 80.000 toneladas/ms, respectivamente.

A produo de aminocidos resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos

bioqumicos que regulam a biosntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se

superprodues a partir de mutaes e do controle do processo de fermentao.



As novas tcnicas passam a:

Estimular as clulas para que usem substratos alternativos;

Preveno ou impedimento de reaes laterais;

Induo e ativao de enzimas biosintticas;

Reduo ou inibio de atividades enzimticas que poderiam degradar o produto e, finalmente

facilitar a excreo do aminocido pelo microrganismo.

As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentao para

produo de cido glutmico foram as responsveis pelo grande avano na produo de aminocidos

por fermentao.

Hoje a maioria dos aminocidos comerciais so produzidos por fermentao. Assim como a

de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor.

BIOPOLIMEROS

Goma Xantana - biopolmero mais importante atualmente em funo do volume de produo,

utilizada como gelificante ou estabilizante de suspenses. Produzido por fermentao utilizando a

bactria Xanthomonas campestris.

Outras gomas:

Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii;

Pululano produzido pelo Aureobasidium pullulans;

Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum;

Gelano produzido pela Pseudomonas elodea

Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando

problemas nos processos de mistura, transferncia de massa e calor em fermentadores. Estes

aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de fermentao.

POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) : polister termoplstico acumulado intracelularmente em

alguns tipos de bactrias (Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus, entre

outras) at um nvel de 80% da massa seca celular, sua produo permite a fabricao de plsticos

biodegradveis.

VITAMINAS

A maioria das vitaminas produzida por mtodos qumicos. Entretanto algumas vitaminas

podem ser produzidas por fermentao. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, cido

flico, cido pantotnico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina.

A sntese qumica da vitamina B12 muito complexa sendo que sua produo comercial s

vivel por via fermentativa utilizando Pseudomonas.

Riboflavina: sua produo por fermentao compete eficazmente com os mtodos de sntese e

semi-sntese, sendo que 30% da demanda mundial produzida por fermentao.



Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de

produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentao, perodo muito inferior aos 5 dias

necessrios quando se utiliza Ascomycetes.

ANTIBITICOS

Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou

que poderiam ter efeito teraputico.

1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum, contaminante dos cultivos de

Staphylococcus aureos, matava as bactrias, identificando o ingrediente ativo, a Penicilina, podia

inibir outras bactrias.

Aps a penicilina ter sido isolada na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain

demonstraram sua destacada atividade antibacteriana desenvolvendo-se ento um processo

fermentativo comercial para sua produo. Este fato marcou o incio da indstria de antibiticos.

Seguiu-se ento a descoberta de

Estreptomicina a partir de espcies de Streptomyces

Cefalosporinas a partir de Cephalosporium acremonium

Com o desenvolvimento a partir de 1940 de tcnicas de gentica microbiana que implicaram

em tcnicas de mutao e seleo de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento da

produo de penicilina de poucas mg/L para at 20g/L de cultivo.

Iniciam-se tambm, nesta poca, os estudos sobre a produo de metablitos secundrios,

pequenas molculas como os antibiticos que no tm papel importante no crescimento e

manuteno das clulas.

TRANSFORMAES DE ESTERIDES

O uso de microrganismo, o domnio das tcnicas microbiolgicas e fermentativas permitiu

fazer transformaes enzimticas altamente seletivas e especificas, representando um grande avano

na produo de frmacos, como os hormnios esterides.

1940 - descobriu-se que a cortisona, esteride secretado pela glndula adrenal, aliviava a dor de

pacientes com artrite reumtica, o que fez desenvolver-se um processo de sntese qumica para

sua produo que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g;

1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona,

produzindo 11-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da sntese de cortisona casse para

11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g.

1980 - Introduziram-se modificaes no processo e os custos foram diminuindo gradativamente

de forma que hoje estes custos esto prximos de U$ 0,46/g.

Tcnicas semelhantes de biotransformao microbiana permitiram a sntese de outros

esterides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros frmacos

importantes na medicina.



ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO

1) Formulao do meio de cultura a ser usado no processo;

2) Esterilizao do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares;

3) Produo de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador;

4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condies timas para a formao do

produto

5) Extrao do produto e sua purificao;

6) Disposio dos efluentes produzidos no processo.

REAS DE APLICAO DA FERMENTACO INDUSTRIAL

A) ALIMENTOS

v Massas fermentadas (po, panetone);

v Carnes fermentadas (salame, lingia);

v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho ...);

v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente ...);

v Leite fermentado (iogurte, queijo ...);

v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase ...);

v Condimentos (vinagre, glutamato...)

v Aminocidos (lisina, cido glutmico);

v Polissacardeos (dextrano)

B) PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS

v lcool (industrial e carburante);

v Antibiticos de uso veterinrio;

v Biogs;

v Hormnios de crescimento vegetal.

C) MEDICAMENTOS

v Antibiticos;

v Vacinas;

v Vitaminas;

v Hormnios de consumo humano (insulina);

v Aminocidos.

D) CIDOS ORGNICOS E SOLVENTES

v cido ctrico;

v cido actico;

v Etanol;

v Propanol;

v Butanol;

v cido lctico.

Microbiologia industrial


INTER-RELAES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMAS

As relaes existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos so muito

importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reaes qumicas

especificas.

As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimtica pode convenientemente

ser manipulada em bio-reatores apropriados.

Por outro lado as clulas microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte

slido, atuam como catalizadores que levam a reaes qumicas concretas, da mesma maneira que as

enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo.

Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentaes se refere ao cultivo de

microrganismos em grande escala.

A seleo e aplicao dos princpios da engenharia gentica aplicada a microrganismos

apropriados permitem manipular o contedo enzimtico destes em determinadas condies. Tambm

o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocar a induo da enzima

necessria para a degradao desse substrato de crescimento dentro da clula.

Ex.: o cultivo de levedura sobre maltose induzir a biossntese da enzima maltase, (uma -

glucosidase) que degrada maltose a glicose, que necessria para a produo de energia qumica em

forma de ATP dentro da levedura.

MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL

Introduo Os produtos comercialmente importantes das fermentaes industriais so de 4

categorias: clulas microbianas, molculas grandes como enzimas e polissacardeos, produtos bsicos

e metablitos secundrios que no so necessrios para o crescimento celular. A produo comercial

dos produtos de fermentao tem utilizado principalmente diversas espcies de bactrias, leveduras e

fungos, ainda que os avanos recentes no desenvolvimento de tcnicas de cultivos tm permitido

utilizar clulas mais complexas nos processos de fermentao.

Microrganismos Industriais Na natureza existem duas classes principais de clulas, ambas

utilizadas nos processo de fermentao industrial:

procariontes - clulas bacterianas;

eucariontes -leveduras, fungos, clulas animais e vegetais.

Os microrganismos tambm se diferenciam em funo de suas exigncias de oxignio,

podendo dividir-se em estritamente aerbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos

filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presena de O2 e os estritamente

anaerbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausncia de O2 e os

microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situao de

aerobiose e anaerobiose.

As bactrias utilizadas nos processos fermentativos so principalmente quimiorganotrficos,

isto , podem obter sua energia e seu carbono por oxidao dos compostos orgnicos. As bactrias

podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em funo de suas resposta a colorao de

Gram. A reproduo se d por diviso assexuada. Os esporos so produzidos usualmente em resposta



as condies adversas do meio, porque so mais resistentes ao calor e aos compostos txicos que as

clulas vegetativas e posteriormente germinam em condies apropriadas. As bactrias so

desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintticos

Os fungos (bolores) tambm so quimiorganotrficos e os mais importantes utilizados nas

fermentaes se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos

gneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gneros Thicotherma, Aspergillus,

Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos so desprovidos de clorofila ou outros pigmentos

fotossintticos. Sua reproduo pode ser assexuada (esporulao) ou sexuada.

As leveduras so fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada

(por gemao ou diviso binria) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativos

industriais a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produo de lcool e nas panificaes.

Esta levedura no degrada a lactose, por isso para produzir lcool e biomassa a partir de soro de leite

utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessrias para degradar lactose. Outras

leveduras importantes so: Candida utilis e Endomycopsis fibuliger

Os vrus no tm estrutura celular alguma, possui o material gentico (DNA ou RNA) contido

por uma camada de protena. No possuem atividade metablica e, portanto, no sintetizam

protoplasma nem crescem. Em conseqncia disto sua multiplicao no pode ser feita por um

processo de diviso, como nos microrganismos celulares. Novos vrus so produzidos pelas clulas

nas quais penetram, de acordo com as informaes contidas no seu cido nuclico. So agentes

submicroscpicos que infecta as plantas, animais e bactrias. Os vrus bacterianos (bacterifagos)

infectam os processos de fermentao de cepas microbianas e causa srios problemas,

particularmente nos cultivos starter utilizados no processamento de alimentos.

Clulas animais e clulas vegetais tambm podem ser utilizadas nos processos fermentativos

industriais, principalmente para a produo de antibiticos e hormnios vegetais. Necessitam de um

meio muito nutritivo e so sensveis a flutuaes de fatores externos como temperatura, pH, O2 e CO2

dissolvidos.

FONTES NUTRICIONAIS PARA OS MICRORGANISMOS

Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos so as mesmas de todos os

seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de

energia e fonte de material plstico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos:

a) os vegetais so fotossintticos (obtm energia da luz solar) e autotrficos, se nutrem

exclusivamente de substncias inorgnicas;

b) os animais so quimiotrficos, pois obtm energia as custas de reaes qumicas e heterotrficos,

por exigirem fontes orgnicas de carbono.

Entre os microrganismos h uma grande variedade de tipos intermedirios.

FONTES DE ENERGIA

a) Algumas bactrias realizam fotossntese, porm no produzem oxignio. Podem utilizar fontes

inorgnicas (liotrficas) ou compostos orgnicos (organotrficas) como doadores de eltrons.

b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactrias so quimiossintticas, obtendo energia as



custas de reaes qumicas, nas quais substratos adequados so oxidados com desprendimento de

energia. Estes substratos podem ser inorgnicos (litotrficos) ou orgnicos (organotrficos). No

primeiro grupo encontramos apenas bactrias, como por exemplo, Thiobacillus, capazes de

oxidar enxofre, produzindo cido sulfrico, podem ser utilizados na lixiviao de metais, como

cobre e urnio. A grande maioria das bactrias e a totalidade de fungos, leveduras e, tambm, os

protozorios so quimiorganotrficos.

FONTES DE MATERIAL PLSTICO

MATRIASPRIMAS COMO FONTE DE CARBONO

Para os autotrficos a nica fonte de carbono necessria o CO2. Para os heterotrficos, h

necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintticas:

Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), leos, Metanol, Etanol;

Melao de cana-de-acar Composio varivel (rico em aminocidos, vitaminas, minerais,

vrios acares); corrigir deficincias (N, P, S);

Extrato de Malte cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminocidos.

MATRIASPRIMAS COMO FONTE DE NITROGNIO

Quanto s necessidades de nitrognio h trs categorias principais de microrganismos:

Alguns microrganismos, especialmente bactrias, retiram o nitrognio diretamente da atmosfera e o

converte em nitrognio orgnico. Muitos fungos e quase totalidade das bactrias utilizam compostos

inorgnicos de nitrognio, como amnio e nitratos. Algumas bactrias exigem fontes orgnicas de

nitrognio. De um modo geral, adicionar aminocidos ou hidrolisados de protenas favorece o

crescimento da maioria dos heterotrficos.

o Sais de Amnio, Sais (nitratos); Uria

o Lquido da macerao do milho ( 4% N);

o Extrato de levedura e Peptonas (laboratrio)

o Ar atmosfrico

ONS INORGNICOS ESSENCIAIS

Alm de nitrognio, os microrganismos exigem uma srie de outros elementos, sob a forma de

compostos inorgnicos, alguns em quantidade bem maiores que outros.

o Macronutrientes P, S, K, Mg, Ca, Fe

o Micronutrientes Cu, Zn, Co, B, ...

FATORES DE CRESCIMENTO

So os compostos orgnicos indispensveis a um determinado microorganismo, que ele no

consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa

crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminocidos, nucleotdios,

cidos graxos, entre outros.

Aspecto importante dessa exigncia resulta do fato que, quando um microrganismo exige um

determinado fator, seu crescimento ser limitado pela quantidade desse fator presente no meio.



Dentro de certos limites, o crescimento ser proporcional ao teor do composto limitante. Isso

permite a elaborao de um mtodo de dosagem de certos compostos, baseados na medida do

crescimento microbiano. Essa a base da dosagem microbiana de uma srie de substncias,

principalmente aminocidos e vitaminas.

AGUA

A gua no constitui um nutriente, mas absolutamente indispensvel para o crescimento dos

microrganismos. Seu papel mltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substncias

em soluo atravs da membrana citoplasmtica. Exerce funo na regulao da presso osmtica e

regulao trmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecao, a no ser

quando esta precedida pelo congelamento brusco (liofilizao)

OXIGNIO ATMOSFRICO

Como a gua o oxignio no um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrognio

nos processos de respirao aerbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presena

de O2 livre:

Aerbios exigem oxignio livre; alguns, porm, em pequenas quantidades no tolerando as

presses normais de O2 atmosfrico;

Anaerbios no toleram a presena de O2 livre;

Facultativos crescem na presena ou ausncia de O2.

Entre as bactrias encontra-se os trs tipos de comportamento. Os fungos (bolores) so estritamente

aerbios, enquanto as leveduras so aerbias ou facultativas.

CLASSIFICAO DOS MOSTOS

SINTTICO: composio conhecida quantitativamente e qualitativamente usado em pesquisas

quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentao. O objetivo saber a rota de

fermentao, saber quanto e quando e quais os substratos que esto sendo utilizados pelos

Microorganismos. Tem um alto custo.

COMPLEXO: composio no bem definida, esto enquadrados os meios naturais tais como:

caldo de cana, melao, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais.

CARACTERISTICAS DO MOSTO

Requerimentos bsicos:

1) Proporcionar o mximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado;

2) Produzir a mxima concentrao de biomassa ou produto;

3) Permitir o mximo rendimento na formao do produto;

4) Produzir o mnimo de subprodutos indesejveis;

5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponvel durante o ano todo

6) No sofrer degradao durante a esterilizao

7) No dever causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente:

aerao, agitao, extrao, purificao e tratamentos dos efluentes.



SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAO ALCOLICA

a) Aucaradas: neste grupo temos as diretamente fermentescveis (contm monossacardeos: Ex.:

glicose, frutose, suco de uva, ma, pra, etc.).

Principal substrato um monossacardeo (glicose) e este metabolizado diretamente at

piruvato.

As matrias-primas indiretamente fermentescveis so aquelas que contm dissacardeos,

predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-acar e melao.

A composio do melao de cana-de-acar varia em funo de fatores como:

qualidade da matria-prima (variedade, idade, sanidade, maturao, queimada ou no, etc);

mtodos de extrao do acar (moagem, clarificao, cozimento, etc);

condies tcnicas das regies aucareiras;

condies e tempo de armazenamento.

b) Amilceas: contm em sua composio polissacardeos (amido) utilizada para produo de

vodka, rum, whisky (tem que sofrer sacarificao).

PREPARO DA MATRIA-PRIMA

a) Melao: deve sofrer uma preparao prvia (de 82 Brix 18 -20 Brix)

CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluio do

melao.

B M - b = Quantidade de melao em peso d = volume litros)

M

b B - M = Quantidade de gua em peso d = volume (litros)

B = Brix do melao

b = Brix da gua (zero)

M = Brix desejado (18 20)

d = densidade

Ex.: melao: 80 Brix

gua; 0 Brix

M = 20 Brix

dmelao = 1,6284

dgua = 1,0000

80 20 0 = 20 Kg melao = 12,31 Litros

1,6284

20

0 80 20 = 60 kg de gua = 60 litros

1,0000



No tanque de diluio controla-se:

pH: entre 4,5 5,5

Nutrientes: Sulfato de amnio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimtico}

b) Caldo de cana-de-acar: no necessita diluio pois a cana sofre adio de gua por asperso na

moenda para extrao do acar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20

D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2O a ser adicionada

Brix desejado

Ex.: Brix do caldo = 20

Volume = 50.000 L

Brix desejado = 16

D = 20 x 50.000 50.000 = 12.500 L de H2O a ser adicionada para ter 16 Brix

16

Aps fazer a diluio corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando cido sulfrico, ctrico ou ainda suco de

limo (caseiro) e colocam-se os nutrientes.

DETERMINAO DE SLIDOS SOLVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA

1) Preparo do mosto:

a) Determinao de slidos solveis por refratometria

- Para cada grau acima de 20 C subtrai-se 0,06 por grau;

- Para cada grau abaixo de 20 C soma-se 0,06 por grau:

Ex.: 20 Brix a 25C 5 x 0,06 = 0,3 20 Brix 0,3 = 19,7 Brix

20 Brix a 15C 5 x 0,06 = 0,3 20 Brix + 0,3 = 20,3 Brix

Um mosto inicialmente com 76 Brix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST.

100 g melao -------- 76 g SST

X g --------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mL

Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de gua

RELACO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA.

1 Brix corresponde a 0,54 Baum

1 Baum corresponde a 1,8 Brix

1 Brix corresponde a 0,85 Babo

BRIX = % de slidos solveis existentes em uma soluo de sacarose quimicamente pura.

Fermentadores


ELEMENTOS DE UM FERMENTDOR (BIOREATOR)

O corao de qualquer processo fermentativo sem dvida o fermentador. Uma definio

funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantm um

ambiente favorvel para que se desenvolva um determinado processo biolgico.

A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de ao inoxidvel

brilhante e com uma instrumentao muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores industriais

so assim, outros importantes processos biolgicos industriais, desenvolvidos em grande escala, so

conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados.

Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto,

embora para processos cujas condies so muito sensveis ser necessrio um sistema fechado e

muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorvel.

MEIO AMBIENTE

As condies ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob trs

aspectos diferentes: condies biolgicas, qumicas e fsicas.

MEIO BIOLGICO

Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questo encontram-se

presentes, enquanto que os no produtivos, destrutivos ou no desejveis estejam excludos do

processo. Do ponto de vista de produo importante tambm que os microrganismos desejados

estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a um ritmo rentvel.

Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema assptico.

A assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos

vivos, diz-se ento esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir

o microrganismo desejado denomina-se inoculao.

MEIO QUMICO

Implica na composio do meio de crescimento microbiano, que dever conter as

concentraes adequadas de substratos ou nutrientes microbiolgicos, assim como dos precursores

sintticos, livres de substncias inibidoras e mantidas a um pH adequado.

MEIO FSICO

Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle muito importante

quando se projeta um fermentador.

Este parmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condies ao longo da

fermentao, exigem um bom sistema de agitao, o que pode provocar por sua vez a ruptura dos

organismos e de seus agregados.

Quando se mantm um ambiente favorvel os parmetros ambientais no tm que

necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo.

Fermentadores


Fermentao por batelada - caractersticas:

v Diferentes fases de crescimento;

v Diferentes condies timas;

v Fermentao parece estar programada de acordo com a disponibilidade de nutrientes;

v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apaream de acordo com estas trocas as

sucessivas fases de crescimento

PRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORES

Os fermentadores classificam-se em dois grandes grupos:

v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos esto imersos no meio

de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes lquidos. O fermentador mais simples consiste em

um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio lquido.

Estes fermentadores forma utilizados de gerao em gerao com muito xito na indstria

cervejeira j que ao formar-se na fase anaerbica da fermentao, uma capa de espuma que contm

CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperatura

durante a fermentao se pode colocar tubos refrigerantes. So muito utilizados no tratamento

biolgico de guas residuais em fluxo lento, onde a superfcie do lquido permite que se dissolva o

O2 do ar e libere o CO2. Estes efeitos podem ser acelerados com a agitao do lquido que aumenta a

transferncia de gases e mantm a homogeneidade. Nos sistemas anaerbios os prprios gases da

fermentao podem proporcionar a agitao, atravs do desenho do fermentador (cnico/cerveja) ou

por meio mecnico (bombas de recirculao).

v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se

desenvolve sob forma de uma lmina ou capa disposta sobre uma superfcie que est em contato com

o meio nutritivo. Em laboratrios se utiliza o cultivo em superfcie (placas). Inicialmente a

produo de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmente

se utilizada o cultivo em superfcie na fermentao do cido ctrico (Aspergillus niger), que se

cultiva em uma superfcie com um meio adequado contendo melao em bandejas de pouca

profundidade, colocadas em estantes temperatura constante e com circulao de ar freqente.

Tambm e pode desenvolver pelculas microbianas sobre uma superfcie de meio slida adequada.

Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plstico particulado, lminas de plstico onduladas,

atravs dos quais se faz passar o meio lquido sobre a capa de microbiana da superfcie.

v Na prtica, porm, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso tambm aparece uma capa sobre

a superfcie do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de microrganismos

dispersos no meio de cultivo.

Fermentadores


Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de recuperao do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo:

Esterilizador Refrigerao Com ou sem ruptura celular

Formulao

Armazena,mento de Matrias-primas

Inculo Volume: 1 a 2 litros

Preparao de Meios

Fermentador de produo

Tanque de Semeadura

(p-de-cuba)

Separao de clulas

Etapas de Recuperao do

Produto

Envasamento e Armazenamento

PRODUTO

Tratamento de Efluentes

Utilizao de Subprodutos

- gua - ar - vapor

gua do Processo

Ar Estril Vapor Energia Inculo Preparado 1:10

Esterilizao na indstria fermentativa


ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR

Introduo

A esterilizao implica a destruio, inativao ou remoo de toda forma de vida

microbiana. Isso quer dizer que a esterilizao provoca nos microrganismos uma perda irreversivel

da capacidade de reproduo no ambiente considerado. No implica, entretanto, a inativao total

das enzimas celulares, toxinas, etc.

Antes de entrarmos na discusso dos mtodos, conveniente fazermos algumas

consideraes em torno dos mecanismos de esterilizao e das caractersticas das populaes

microbianas.

O mecanismo letal varia conforme o processo de esterilizao empregado. O efeito final,

entretanto, o mesmo. Deve ocorrer a destruio e/ou inativao da(s) enzimaas) envolvida(s) em

processos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizante bloqueie uma

reao enzimtica essencial ou destrua uma molcula vital. Na prtica, entretanto, agentes com ao

to especifica no encontram aplicao como esterilizantes, por vrios motivos: A heterogeneidade

da populao microbiana; a possibilidade da existncia de microrganismos com capacidade de

utilizar outras rotas metablicas para vencer o bloqueio estabelecido; a dificuldade do agente em

atingir um alvo muito especfico; etc., podem ser mencionados como fatores que justificam a

utilizao de agentes capazes de atingir o microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecfico.

Principalmente no caso da esterilizao de equipamentos industriais, procura-se utilizar processos

capazes de danificar generalizadamente a clula, em vez de se procurar um ponto especfico de sua

estrutura metablica.

Outra considerao importante, no caso da esterilizao de equipamentos, a cessao do

efeito esterilizante no final do processo de esterilizao. Em outras palavras, o agente ou condio

esterilizante deve atuar eficientemente durante o processo de esterilizao. Terminada a

esterilizao, no deve haver ao residual. No caso de fermentao industrial, por exemplo, uma

possvel ao residual pode ser to ou mais prejudicial que a presena de certos contaminantes.

Essas consideraes ajudam a apontar os processos fsicos como os mtodos de escolha na

esterilizao de equipamentos.

MTODOS DE ESTERILIZAO

Fsicos Qumicos

Calor:

- Seco: Flambagem ; ar quente

- mido: vapor fluente, vapor sob presso;

tindalizao.

Radiao:

- Ultravioleta

- Ionizantes (RX e )

Filtrao : Membranas

Lquidos, Gases e vapores

Esterilizantes gasosos: xido de etileno (mais

eficiente que os demais; utilizado em cmaras

de esterilizao)

Formaldedo mais comum

-propiolactona- carcinogncia

cido peractico



A escolha do mtodo depende das caractersticas dos produtos a serem esterilizado e do custo

do processo.

Quando se usa agentes qumicos: tempo de contato

Quando se usa calor: tempo e a temperatura de contato

OBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mosto

MECANISMOS DE ESTERILIZACO

Se bem que os mtodos usuais de esterilizao tenham uma ao generalizada sobre a clula,

o mecanismo pelo qual isso conseguido varia conforme o agente empregado. No caso do calor,

sabe-se, desde os tempos de Koch, que o mecanismo de destruio dos microrganismos pelo calor

seco no o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor.

Exceto em casos em que haja uma destruio fsica do microrganismo, como o caso da

flambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilizao no est bem elucidado.

Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolizao da clula so aparentes e poderiam ser

interpretadas como oriundas da atuao de foras osmticas.

A adsoro de corantes pelas clulas, a incapacidade de reproduo e, no caso de

microrganismos mveis e a perda da motilidade, so caractersticas que auxiliam na constatao da

perda de viabilidade de clulas individuais.

Enquanto que a inativao pelo calor seco , essencialmente, um processo oxidativo, o uso de

vapor causa uma coagulao das protenas celulares com prejuzo para a organizao estrutural do

microrganismo, afetando a sua competncia fisiolgica.

TABELA 1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessrio para destruir esporos bacterianos de

fermentao simples em meio com concentrao inicial de 1,6 x 105 esporos/mL

TEMPERATURA (C) TEMPO (minutos)

100 1200

105 600

110 190

115 7

120 19

125 7

130 3

135 1

Tempo de esterilizao corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquela

temperatura especfica e no ao tempo total do processo, que deve incluir o tempo de aquecimento e

resfriamento.

DESNATURAO DE PROTENAS

Alm das estruturas primria, secundria e terciria, as molculas de protena podem ser

constitudas por mais de uma cadeia de polipeptdios. A conformao estrutural da molcula protica



estabilizada por ligaes covalentes e no-covalentes. Essas ligaes reduzem a flexibilidade das

cadeias polipeptdicas, garantindo sua disposio de uma forma ordenada, compacta e,

conseqentemente, de baixa entropia, em vez de uma associao ao acaso. Entre as ligaes

covalentes, o tipo de ocorrncia mais geral a ligao dissulfeto As ligaes no-covalentes podem

ser pontes de hidrognio, ligaes hidrofbicas e inicas. As ligaes hidrofbicas so as que mais

contribuem para a estabilizao da estrutura protica, pois de um modo geral, 40% dos resduos de

aminocidos de uma protena possuem ramificaes no-polares.

Uma alterao estrutural da molcula de protena , normalmente, acompanhada de uma

perda de atividade biolgica, pois a ao de enzimas pode ser explicada por uma perturbao

conformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima.

Considerando-se que as clulas de microrganismos podem conter, normalmente, de 40 a 60%

de seu peso seco em protenas, e considerando-se, ainda, as funes metablicas e/ou estruturais

desempenhadas por essas protenas na clula microbiana, pode-se perceber, com facilidade, o efeito

que agentes ou condies capazes de desorganizar estruturalmente as protenas podero exercer

sobre a clula.

ALTERAO DNA

Se, de um lado, agentes que atuam sobre as protenas so capazes de comprometer

diretamente a competncia fisiolgica, agentes capazes de causar alteraes no material gentico do

microrganismo podem provocar o aparecimento de mutaes letais. Donde a possibilidade de se

utilizarem, na esterilizao, substncias ou condies que apresentem maior afinidade pelo cido

desoxirribonuclico (DNA).

- Agentes qumicos como propionolactona, cido nitroso, etc., agem sobre o material gentico das

clulas, causando alteraes que tero conseqncias sobre as caractersticas fisiolgicas do

microrganismo.

- Radiaes Fazendo-se incidir uma radiao sobre microrganismos, os componentes celulares

podero absorver energia radiante. O efeito letal das radiaes uma demonstrao da presena, na

clula viva, de molculas capazes de absorvera energia radiante. Protenas e cidos nuclicos,

constituintes essenciais da matria viva possuem estruturas que absorvem principalmente luz

ultravioleta. As alteraes fotoqumicas que ocorrem, em virtude da absoro de luz ultravioleta, so

muito prejudiciais s clulas.

POPULAO MICROBIANA

Ao tratar de esterilizao, temos de levar em conta, tambm, as caractersticas dos

microrganismos contaminantes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no equipamento

apenas formas vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram for um meio que

no as abrigue e proteja da ao do agente esterilizante, e mais ainda, se pudermos estar certos de

que o agente esterilizante ser capaz de atuar sobre as clulas microbianas em condies favorveis e

por tempo suficiente, ento o problema de esterilizao ser relativamente simples.



FIGURA 1 - Esterilizao de um meio de cultura em autoclave a 121 C por 20 minutos. O tempo total de esterilizao 100 minutos.

ESTERILIZAO POR AGENTES FSICOS

CALOR SECO

calor seco mata os microrganismos por oxidao dos componentes celulares. O ar seco no um

bom condutor de calor e sua ao no to enrgica quanto a do vapor. Por esse motivo necessrio

uma temperatura e tempo maiores de esterilizao.

o emprego do calor seco ou ar quente, recomendado quando o contato direto ou completo do

vapor sobre presso com o material indesejvel ou improvvel, que o caso de vidraria, leos, ps

e substncias similares.

A esterilizao pelo calor seco consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a uma

temperatura tal que, durante o perodo de aquecimento, haja inativao dos microrganismos

presentes.

A maior resistncia demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de um

endurecimento da camada mais externa da clula por meio de coagulao das protemas, dificultando

a penetrao do calor no interior da clula propriamente dita e ulterior coagulao das protenas

plasmticas. Devido muito menor capacidade de penetrao do calor seco, necessrio aquecer o

equipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por tempo mais prolongado, o que torna

esse mtodo inadequado quando materiais como papel, algodo, plsticos, etc., esto presentes.

Populaes homogneas de esporos apresentam uma relao linear de inativao com relao

ao tempo de exposio a 125 C. A no-linearidade que ocorre com populaes naturais, pode ser

atribuda a uma heterogeneidade da populao. As relaes no-lineares obtidas com populaes

naturais podem ser reproduzidas por misturas adequadas de esporos com resistncias trmicas

diferentes, isolados daquelas mesmas populaes. Alis, essa heterogeneidade das populaes



naturais pode ser devida no s presena de esporos de espcies diferentes como tambm a

diferentes graus de resistncia trmica entre esporos de uma mesma espcie.

A temperatura empregada tem sido 125 C e comum cotar-se a resistncia trmica de um

microrganismo em relao ao D125. A desorganizao molecular que ocorre nas clulas, devido

exposio a temperaturas elevadas, pode se dar dos seguintes modos:

a) ativao direta das molculas pela energia trmica, com alterao conformacional por quebra de

ligaes intramoleculares e interveno subseqente de outras molculas;

b) reao de molculas complexas com oxignio, gua ou vapor de gua (no caso de esterilizao

pelo calor mido).

A exigncia bsica da esterilizao pelo calor seco que todo o material seja sujeito

temperatura esterilizante. As nicas causas possveis de fracasso na esterilizao so o controle

defeituoso da temperatura; a no penetrao do calor; e a presena de microrganismos com

resistncia trmica superior esperada.

CALOR MIDO

calor mido mata os microrganismos por desnaturao protica, ou seja: pela coagulao das

protenas e enzimas celulares, e tambm a fuso dos lipdeos da membrana celular;

quanto maior a temperatura menor o tempo necessrio;

Para destruir esporos temos que submeter este vapor de gua a uma presso positiva para

alcanarmos as temperaturas de trabalho;

Sempre que possvel usa-se vapor para a esterilizao, pelo seu alto contedo de calor por

unidade de peso ou de volume; porque cede facilmente calor a uma temperatura constante e

controlvel; por ser de fcil produo e distribuio; e porque, mesmo sendo de aquecimento rpido,

a velocidade de aquecimento e a temperatura final do equipamento podem ser controladas.

TABELA 2 - Relao entre a presso de vapor de gua em diferentes presses

Presso de vapor da gua (atm) Temperatura

0 100,0

0,34 109,0

0,68 115,0

1,00 121,0

1,36 126,5

Obs.:

- Para assegurar a temperatura pela presso de trabalho precisamos ter certeza de que todo o ar foi

expulso, primeiro porque o ar no bom condutor de calor, logo o calor no penetra no material a

ser esterilizado. Segundo a temperatura do ar aquecido a uma presso inferior a temperatura do

vapor aquecido a mesma presso.

Causas da inativao trmica de bactrias pelo calor mido

Os mecanismos propostos para explicar a influncia letal do calor mido sobre as bactrias

so: (a) coagulao de protenas; (b) inativao de enzimas; (c) desorganizao dos lipdeos

celulares; (d) desorganizao do aparelho gentico; (e) ruptura do RNA.



A morte das clulas expostas ao calor exponencial. A base bioqumica desse fenmeno

difcil de ser explicada em termos de acontecimentos especficos na clula. O calor mido age sobre

vrios componentes celulares e, na clula, pode-se observar uma srie de efeitos.

Inativao trmica dos esporos

Os esporos so dotados de uma camada interna de mucopeptdeo recoberta por uma capa

protica rica em cistena. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistncia dos esporos:

impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas; desidratao do material

protico, com estabilizao conseqente da maior interaproximao dos radicais hidrofbicos e

imobilizao inica.

A inativao dos esporos em presena de vapor de gua deve-se atividade da gua e no

propriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mostra que os altos coeficientes de temperatura,

caractersticos da inativao trmica de esporos. s podem ser devidos a processos de coagulao de

protenas

ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS POR RADIAES UV E IONIZANTES

Os princpios bsicos da utilizao da radiao UV so a reduo de microrganismos

presentes no ar e a destruio de clulas depositadas na superfcie do equipamento e expostas

radiao. A radiao UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os nveis de

contaminao.

A ao de radiaes ionizantes (raios gama) sobre os microrganismos se manifesta como um

uma inibio do poder de multiplicao dos mesmos.

ESTERILIZAO DE EQUIPAMENTOS POR AGENTES QUMICOS

Apresenta a vantagem de ser feita a temperatura inferior a 50C. Os fatores que influenciam

na eficincia da esterilizao so: tempo de contato, temperatura, pH, matria orgnica, estabilidade

ao oxignio umidade, etc. detergentes, lquidos (cidos e lcalis, glutaraldedo, formaldedo, iodfors,

cido peractico) Gases e vapores (oznio, brometo de metila, formaldedo, -propionolactona, xido

de etileno, cido peractico)

ESTERILIZAO DO MEIO DE CULTURA

De acordo com um conceito bem amplo, a esterilizao de um meio a operao que tem por

finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou microscpicas,

saprfita ou no, existentes no meio considerado.

O grau de esterilizao dos meios de fermentao varia conforme o processo a que se destina.

Algumas vezes totalmente dispensvel (fermentao lctica de hortalias e polvilho; tratamento

biolgicos de resduos); realizada de forma incipiente (fermentao alcolica; produo de leveduras

para panificao; fermentao actica do vinagre); realizada com alto grau de exigncia (produo de

antibiticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios laboratoriais sempre necessrio

(devido ao uso de culturas puras)

Em plantas industriais o calor mido a principal forma de se efetuar a esterilizao. Pode



ser feita nos prprios recipientes destinados a fermentao (processo descontnuo) ou em separado

(processo contnuo)

ESTERILIZAO EM BATELADA:

Vrios meios de cultura so esterilizados no fermentador a 121 C (para destruir esporos), o

tempo calculado em funo dos constituintes do mosto(pH, material em suspenso, etc) e do

tamanho do fermentador.

Esterilizar s vlvulas e eletrodos e outros equipamentos que entram em contato direto com o

fermentador

Mtodo indireto - injetar vapor no fermentador atravs de camisa ou da serpentina;

Mtodo direto - injetar vapor direto na soluo nutriente, assim o vapor deve estar livre de aditivos

qumicos

OBS.: O vapor gerado pela indstria normalmente contm substncias potencialmente txicas aos

microrganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo de gerao de vapor. Com

injeo direta de vapor no meio de cultura o volume deste aumentar, pois uma parte do vapor se

condensa aumentando o volume do lquido dentro do fermentados.

Vantagem

a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente, evitando perigos de

contaminaes;

Desvantagem

a) Manuteno de temperaturas altas por perodos longos, favorecendo possveis alteraes no meio;

b) Consumo elevado de vapor e gua de resfriamento;

c) Problemas de corroso pelo contato do equipamento com o meio aquecido.

d) Elevado tempo ocioso do equipamento;

e) interaes qumicas com nutrientes

ESTERILIZAO CONTINUA

As principais desvantagens apresentas podem ser evitadas pela esterilizao contnua; melhor

controle de temperatura; temperaturas mais elevadas diminui o tempo da operao; Fornece meio

esterilizados para fermentadores de vrios tamanhos

Etapa preliminar obrigatria nos processos fermentativos contnuos, tambm tem valor nos

processos em batelada, pois diminui o tempo de esterilizao e a rea fsica necessria para o

processo, devido a relao exponencial entre taxa de morte e temperatura tomando bem menor o

tempo necessrio para a destruio de todos os microrganismos quando temperaturas maiores so

utilizadas;

Na esterilizao em batelada so necessrios 30 a 60 minutos a 121 C, a esterilizao contnua

normalmente realizada em 30 a 120 segundos a 140 C;

Meio de cultura torna-se diludo pois a condensao do vapor aumenta o volume do lquido,

para resolver este problema o meio aquecido bombeado atravs de uma vlvula de expanso e o

condensado removido por uma bomba de vcuo at que o meio de cultura fique com a mesma

concentrao de antes da esterilizao.



Pode se feita pela injeo direta de vapor ou por meio de trocadores de calor.

Em certos casos a pasteurizao j p suficiente para eliminar grande parte do flora microbiana.

uma operao rpida utilizando temperaturas prximas de 100 C seguida de resfriamento. Em

meio cidos equivale a uma esterilizao

Para pequenas quantidade de meio pode-se lanar mo da tindalizao.

FIGURA 2 - Esquema de esterilizao contnua do meio de cultura em trocadores de calor

DESTRUIO DE NUTRIENTES

A esterilizao do meio pelo calor acarreta alteraes na sua composio qumica. A

experincia mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilizao de um dado meio,

menor ser a destruio de nutrientes e, conseqentemente, melhores sero os resultados da

fermentao posterior. Esta menor destruio de nutrientes uma conseqncia de fato observada

experimentalmente de ser a energia de ativao de destruio trmica dos microrganismos maior

do que a de destruio trmica dos nutrientes. Essa afirmativa de importncia prtica, tanto na

esterilizao de meios de fermentao como na esterilizao de alimentos.

ESTERILIZAO DO AR

As fermentaes aerbias, com o microrganismo em suspenso, constituem os processos

fermentativos de maior importncia industrial atualmente. Em tais fermentaes a quantidade de ar

introduzida no sistema grande e perfeitamente aceitvel, que haja grande preocupao quanto a

esterilizao do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser tomados

principalmente nas horas iniciais da fermentao.

- A maior parte dos processos fermentativos conduzido com agitao vigorosa, e o ar fornecido

ao fermentador deve ser estril.

- O nmero de partculas e microrganismos depende da localizao da indstria, do movimento do

ar e do tratamento prvio que o ar foi submetido.



MTODOS PARA ESTERILIZAO DO AR

Calor seco - normalmente antieconmica ou de difcil realizao;

Radiaes Apenas as radiaes UV poderiam ter aplicao prtica, porm pouco usada devido ao

grande tempo de exposio. Pode ser usada em pequenas instalaes (laboratrios, pesquisa). Atua

mais como desinfetante.

Filtrao sem dvida o processo mais importante por ser o de maior aplicao na industria.

Filtros feitos de l de vidro, acetato de celulose, etc

Os filtros pode ser de dois tipos principais:

Filtros que apresentam poros - reteno mecnica dos microrganismos (cartuchos de membranas de

steres de celulose, nylon);

Filtros de camadas de material fibroso (l-de-vidro, ) - Atua na combinao de vrios efeitos

fsicos: inrcia, bloqueio, difuso, separao por gravidade e atrao eletrosttica.

Metabolismo e cintica de crescimento microbiano


CRESCIMENTO CELULAR

O crescimento dos microrganismos uma parte integral de quase todos os processos de

fermentao. Sabe-se que as bactrias se reproduzem por diviso binria, produzindo duas clulas de

mesmo tamanho, entretanto a reproduo de muitas leveduras se d por gemao;os mofos crescem

por extenso das hifas e a morfologia de seu miclio pode variar em funo do meio ambiente.

quando um fungo cresce na superfcie de um meio slido produz uma rede miceliana , cuja natureza

reflete a natureza do meio. Nos cultivos submersos, as clulas fngicas podem crescer unidas a

partculas de nutrientes suspensas na forma de miclio filamentoso difuso ou como massa densa. A

morfologia e crescimento influem na velocidade de crescimento e na formao de produtos

Quando um microrganismo inoculado em um meio de volume e composio conhecidos, o

cultivo passa por uma srie de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da inoculao,

existe uma fase de latncia, em que o microrganismo se adapta as condies do meio. Aps um certo

perodo de tempo em que a velocidade de crescimento das clulas aumenta gradualmente, as clulas

crescem a uma velocidade constante mxima ; esta fase se denomina exponencial ou logartmica.

medida que o crescimento continua, os nutrientes se vo esgotando e os produtos vo sendo

excretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminui e finalmente o crescimento cessa,

devido freqentemente ao esgotamento de um nutriente ou pelo acumulo de algum produto txico;

esta fase se denomina estacionria.

FIGURA 3 Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontnuo

FATORES QUE INFLUEM NA VELOCIDADE DE CRESCIMENTO

A velocidade de crescimento varia com o tipo de clula microbiana e tambm em funo das

condies fsico-qumicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se duplique a biomassa

aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os tempos de duplicao mdio para

as clulas animais e vegetal so substancialmente maiores que os de mofos e leveduras, que por sua

vez so maiores que das bactrias.



O crescimento celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre

25 e 35 C. Dentro deste espao o crescimento aumenta com o aumento da temperatura at um valor

mximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de morte

microbiana.

O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimtica. A maioria dos

microrganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4.

A velocidade de crescimento da clula microbiana depende da atividade de gua (Aw) e da

umidade relativa. As bactrias necessitam uma Aw 0,95 enquanto os mofos podem crescer em

valores de atividade de gua menores, de at 0,7 como mnimas.

Como em qualquer reao qumica, a velocidade de crescimento depende da concentrao de

nutrientes qumicos, e pode ser descrita pela equao de Monod. Os valores tpicos de Ks para as

diversas fontes de carbono esto compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3 . As clulas podem crescer a

velocidades prxima as max quando a fonte de carbono limitante maior que 10 Ks ou 10 a 100

mg/dm3. As concentraes de carboidratos elevadas podem inibir o crescimento devido ao efeito

osmtico que tem uma influencia maior sobre as bactrias do que sobre os mofos

Foi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada durante o crescimento

celular, freqentemente proporcional a quantidade de substrato utilizado.

Biomassa produzida (g) x/s = ------------------------------ x/s =coeficiente de rendimento de biomassa Substrato consumido (g)

METABOLISMO MICROBIANO

O crescimento microbiano depende da capacidade da clula para utilizar os nutrientes de

meio ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e tambm os

principais compostos de baixo peso molecular, necessrio para a atividade celular. O metabolismo

intermedirio inclui as reaes que transformam os compostos de carbono e nitrognio que entram

na clula em novo material celular ou em produtos que so excretados. A sntese desses compostos

necessita energia e a maioria das clulas utilizada nas fermentaes, so heterotrficas e obtm sua

energia a partir da quebra de compostos orgnicos. Nos processos respiratrios ou aerbios, os

microrganismos so capazes de oxidar completamente alguns dos substratos a CO2 e H2O, obtendo o

mximo de energia para a converso dos substratos remanescentes em nova massa celular. No

metabolismo fermentativo ou anaerbio, as clulas so menos eficazes para converter os substratos

orgnicos em material celular e usualmente excretam intermedirios degradados parcialmente.

O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estgios. Aps a

inoculao de uma cultura em um meio nutriente existe um perodo durante o qual o crescimento

parece no ocorrer; este perodo refere-se fase lag e pode ser considerado como uma fase de

adaptao. Seguindo um perodo durante o qual a taxa de crescimento das clulas aumenta

gradualmente, as clulas crescem a uma taxa constante, este perodo conhecido como fase

exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as clulas entram fase estacionria. Aps um



longo perodo de tempo o nmero de clulas viveis decresce e a cultura entra na fase de morte ou

declnio. Tanto quanto esta cintica de crescimento, o comportamento de uma cultura pode ser

descrito de acordo com os produtos, os quais so gerados durante os estgios da curva de

crescimento.

Quando um microrganismo inoculado em um meio rico em nutrientes, a velocidade da

diviso celular, e portanto a produo de biomassa, varia de acordo com uma seqncia

caracterstica. A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inculo e

otimizando as condies fsicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a durao da

fermentao contribui pra o custo do produto, logo uma fase lag mnima aconselhvel.

FIGURA 4. Curva de crescimento de biomassa e consumo de glicose em um cultivo em batelada.

Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes

essenciais esto em excesso, esses nutrientes se transformam em produtos finais do metabolismo

energtico, em calor, ou em compostos requeridos para a reproduo de novas clulas. Durante a

fase exponencial de crescimento a diviso celular ou velocidade de aumento da biomassa chega a ser

mxima e os produtos gerados so essencialmente para o crescimento das clulas e incluem:

aminocidos, nucleotdeos, protenas, cidos nuclicos, lipdios, carboidratos, etc. Estes produtos so

conhecidos como os primeiros produtos do metabolismo ou METABOLITOS PRIMRIOS e a

fase a qual eles so produzidos (fase log ou exponencial) como trofofase. Tambm se inclui nesta

categoria a biomassa celular que pode ser considerada como o metablito mais primrio.

Muitos produtos do metabolismo primrio so considerados economicamente importantes e

so produzidos por fermentao.

Durante a desacelerao e na fase estacionria, algumas culturas microbianas sintetizam

compostos os quais no so produzidos durante a trofofase e os quais parecem no ter nenhuma

funo bvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos como METABLITOS

SECUNDRIOS e a fase na qual eles so produzidos (equivalente fase estacionria) como

idiofase. importante salientar que os metablitos secundrios ocorrem em cultivos contnuos a



baixas taxas de crescimento sendo uma propriedade destas, baixas taxas de crescimento, e tambm,

da fase onde no tem crescimento celular.

TABELA 3. Produtos do metabolismo primrio microbiano e sua significncia comercial.

Metabolismo Primrio Significncia Comercial

Etanol Ingrediente ativo em bebidas alcolicas, usado como combustvel em

motores quando misturado ao petrleo

cido Ctrico Vrios usos na indstria alimentar

cido glutmico Intensificador de Flavor

Lisina Suplemento alimentar

Nucleotdeos Intensificador de Flavor

Fenilalanina Precursor do Aspartame - Adoante

Polissacardeos Aplicao na indstria alimentar

Vitaminas Suplementa Alimentar

Fonte: Stanbury, Whitaker & Hall in Principles of Fermentation Technology. 1995.

Os metablitos secundrios so compostos que no so necessrios para a biossntese celular,

no tendo um papel direto no metabolismo energtico. A biossntese destes compostos est

intimamente ligada com o metabolismo primrio das clulas que os produzem, j que normalmente

seus precursores so metablitos primrios ou modificados, como cidos orgnicos, aminocidos,

derivados de acares e bases nitrogenadas. Um conceito apropriado para os metablitos secundrios

so os compostos no essenciais para o crescimento exponencial (Wiseman, A.)

Os metablitos secundrios mais importantes do ponto de vista comercial so os antibiticos,

entre eles a Penicilina, cuja produo anual chega a 10.000 ton/ano. As toxinas e os alcalides

representam o resto dos metablitos secundrios de importncia industrial.

Quando se observa que microrganismos crescem a taxas relativamente baixas de crescimento

no seu meio ambiente natural, isto sugere indicio de que a idiofase que prevalece sobre a trofofase,

a qual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos.

METABOLISMO ENERGTICO

A energia necessria aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismos

fototrficos), ou pela oxidao de substncias qumicas (organismos quimiorganotrficos). Nos dois

casos a energia vai ser estocada pela forma de energia de ligao qumica, biologicamente utilizvel.

Trata-se essencialmente da ligao anidridofosfrica do trifosfato de adenosina (ATP), formada pela

fosforilao do difosfato de adenosina (ADP).

ORGANISMOS QUIMIORGANOTRFICOS

A maioria das bactrias, leveduras e mofos so incapazes de efetuar a fotossntese, utilizam a

energia liberada no decorrer das reaes qumicas de oxidao. So chamadas quimiorganotrficas.

As reaes de oxidao podem ser efetuadas de vrios modos:



- Perda de eltron:

Fe++ Fe+++ + e- + energia

- Desidrogenao:

R-CH2OH R-CHO + 2H+ + 2e- + energia

- Hidratao-desidrogenao:

R-CHO + H2O R-COOH + 2H+ 2e- + Energia

- Descarboxilao-desidrogenao:

R-CO-COOH + H20 R-COOH + CO2 + 2H+ + 2e- + Energia

Em todos os casos h perda de eltrons freqentemente acoplada a uma perda de prtons.

Estes eltrons e prtons, aps transferncia mais ou menos longa, feita por intermdio de uma cadeia

de oxireduo, vo reduzir um aceptor final. Os microrganismos quimiorganotrficos tiram sua

energia da oxidao de substncias orgnicas elaboradas, as quais devem obrigatoriamente

encontrar-se no meio, logo, trata-se de microrganismos heterotrficos. A grande maioria dos

microrganismos que intervm na biotecnologia faz parte deste grupo.

ACEPTOR FINAL DE ELTRONS

O sistema de transporte de eltrons mais ou menos complexo e recorre as enzimas

(desidrogenases, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos, etc.) que

so intermedirios aceptores de eltrons (e de prtons); trata-se de um seguimento de reaes

acopladas com oxireduo. No final desta cadeia, eltrons (e prtons) servem para reduzir um

aceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxignio molecular, composto mineral oxidado ou

composto intermedirio do metabolismo. Existe, tambm, um mecanismo de eliminao de eltrons

e prtons prprio de numerosas bactrias anaerbias, sob a forma de hidrognio, devido a

hidrogenase.

Se o substrato for completamente oxidado, diz-se que h respirao (fala-se s vezes, de via

oxidativa). Se o substrato for parcialmente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o que

acarreta a formao de metablitos, diz-se que h fermentao. A fermentao traz geralmente o

nome da(s) substncia(s) produzida(s) ou da mais abundante se a produo for complexa.

RESPIRAO AERBIA

Existem vrios mecanismos de respirao aerbia. O fato comum entre eles que o aceptor

final de prtons o oxignio do ar e no podem intervir seno quando os microrganismos so

cultivados em condies de aerobiose. Para cada par de prtons transformados em gua, h formao

de 3 molculas de ATP, podendo s vezes haver uma oxidao direta. Esta via leva a formao de

perxido de hidrognio (H202) que txico para clula; exceto se esta possuir catalase, enzima capaz

de decompor o H2O2. Quando um microrganismo possui esta via, e no tem catalase, morto pelo

oxignio do ar, sendo portanto, um anaerbio estrito.



FERMENTAO / RESPIRAO

Na fermentao propriamente dita, uma substncia orgnica originria da degradao do

substrato serve como aceptor de eltrons (e de prtons). De fato, pode-se considerar que a mesma

substncia que serve, ao mesmo tempo, de doador e aceptor. Numerosas fermentaes podem ser

efetuadas em anaerobiose, pois todos os prtons liberados servem para reduzir um substrato

orgnico; outras devem ser efetuadas em aerobiose, pois pelo menos uma parte dos prtons liberados

servem para reduzir o oxignio. CINTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Na fase logartmica podemos dizer que dobram por intervalo de tempo:

O nmero de clulas (bactrias e leveduras):

A biomassa (actomicetos e fungos).

A velocidade de crescimento se mantm constante durante a fase logartmica, ainda que o meio

se altere pelo consumo de substrato e excreo de metablitos.

A velocidade de crescimento independe da concentrao do substrato, pois um excesso de

substrato est presente.

O substrato limitante a substncia que pela mudana de sua concentraao promove:

mudanas na velocidade de crescimento do microrganismo

mudanas na velocidade de consumo do substrato

mudana na velocidade de formao do produto.

Na pratica podemos dizer que todo o substrato limitante.

O processo industrial interrompido ao final da fase logartmica ou antes da fase de

declnio, depende se o processo associado ou no associado.

A taxa de aumento da biomassa est relacionada com a velocidade especfica de crescimento

() e a concentrao da biomassa (X) expressa em g/L. dx ------- = X , onde dt = velocidade mxima da biomassa X = concentrao de biomassa A taxa do aumento do nmero de clulas est relacionada com a velocidade especfica de

crescimento e com a densidade celuIar (N) expressa em clulas/L.

dN ------- = N , onde N = densidade celular dt

O tempo de gerao (G) uma constante da cepa da clula e depende das condies de cultivo.

o espao de tempo necessrio para que uma clula se duplique. Quando o microrganismo est na fase

exponencial o tempo de gerao constante e dado por:



t t G = --- = --------------------

z 3,322 log Nf/Ni

METABOLISMO MICROBIANO

A sntese do produto se d no interior da clula, para que o substrato seja convertido em

produto, ele deve entrar na clula e ser biotransformado por uma seqncia especfica de enzimas.

Quanto mais complexo o produto, maior ser o nmero de enzimas envolvidas no metabolismo.

Esquema simplificado do metabolismo celular. S [ X P ] P

ENTRADA DO PROCESSO: transporte do substrato para dentro da clula

METABOLISMO - TRANSFORMACO: o que diferencia o processo qumico do fermentativo.

s vezes X =P.

SAIDA DO PROCESSO: liberao do produto da enzima, podendo ficar intra ou extracelular.

S = concentrao do substrato em g/L

X = concentrao de clulas em g/L

P = concentrao do produto em g/L ou mg/L

VELOCIDADE DE FORMAO DE CLULAS

A velocidade de formao de clulas e dada pela variao da concentrao de clulas em

funo do tempo, na fase exponencial de crescimento (fase log), a velocidade constante e pode ser

calculada pelo numero de clulas (N) por contagem direta dos microrganismos ou por contagem em

placas e ainda pela massa seca de clulas (X). Ela chamada velocidade especifica de crescimento,

calculada por:

ln Nf ln Ni ln Xf ln Xi ln DOf ln DOi = ------------------- ou -------------------- ou ---------------------

tf ti tf - ti tf - ti para [ ] de clulas para Biomassa para densidade tica

FIGURA 5- Variao da Concentrao Celular em Funo do Tempo

OBS.: Para microrganismos no filamentosos prefervel utilizar nmero de clulas e para

microrganismos filamentosos, a massa seca de clulas.



VELOCIDADE DE CONSUMO DE SUBSTRATO

A medida que a clula est se reproduzindo os substratos esto sendo consumidos, a

velocidade de consumo do substrato ser teoricamente constante, enquanto for constante o

crescimento celular, isto quase nunca acontece, uma vez que o substrato no s utilizado para o

crescimento celular, mas tambm para formao de metablitos, em alguns processos o substrato

pode ter uma velocidade de consumo quase linear por um perodo de tempo, e a velocidade

chamada de velocidade especfica de consumo do substrato e calculada por:

ln Sf ln Si = ------------------- Sf = concentrao de substrato

tf ti

FIGURA 6 - Variao da Concentrao de Substrato em Funo do Tempo

VELOCIDADE DE FORMAO DO PRODUTO

A velocidade de formao do produto tende a ser constante durante um perodo de tempo.

chamada de velocidade especifica de formao do produto e calculada por:

ln Pf ln Pi

= ------------------- Pf = Produto final tf ti



FIGURA 7 - Variao da Concentrao de Produto em Funo do Tempo

VELOCIDADE ESPECFICA DE CRESCIMENTO

funo de trs parmetros:

- Concentrao de substrato limitante (S)

- Velocidade mxima de crescimento ( max)

- Constante especifica do substrato (ks), equivale a concentrao em = 0,5 max

a concentrao de substrato que d a metade da velocidade mxima de crescimento. E dada

pela equao de MONOD, que equivale a equao de Henri-Michaelis-Menten para cintica

enzimtica. S

= max --------------- Ks = corresponde a metade do max Ks + S

FIGURA 8 - Relao entre a Velocidade de crescimento e Concentrao de Substrato



Existindo vrios substratos limitantes, podemos estender a equao de Monod para: K1.S1 K2.S2 Kn.Sn

= max . --------- + --------- + + .......+ ----------- K1 + S1 K2 + S2 Kn + Sn

- Se existir um excesso de todos os substrato, ento = max e a cultura est na fase log, na sua

velocidade mxima de crescimento.

Se o primeiro substrato for exaurido e outro substrato estiver presente, teremos uma segunda

fase lag e log com outro tempo de gerao que caracteriza a metabolizao deste segundo substrato,

este fenmeno chamado de DIAUXIA. Isto ocorre porque um dos substratos, geralmente a glicose,

catabolizada preferencialmente e inibe a quebra de outros substratos. As enzimas que catabolizam

os outros substratos so induzidas (durante a segunda fase lag) aps a metabolizao completa do

primeiro substrato. TABELA 4 - Efeito do comprimento da cadeia de glicose na velocidade mxima de crescimento de Fusarium graminearum a 30C

ACAR N de UNIDADE de

GLICOSE

max (h-1) G (h)

Glicose 1 0,28 2,48

Maltose 2 0,22 3,15

Maltotriose 3 0,18 3,85

FIGURA 9 Crescimento triuxico de Fusarium graminearum

Com isto chegamos a concluso que o mximo depende do:

microrganismo;

condies de cultivo;

composio do meio de cultura;

temperatura de incubao;

outros fatores (pH, oxignio, etc.)



CLASSIFICAO DOS PROCESSOS

TIPO 1 - ASSOCIADO

No processo associado o produto derivado diretamente do metabolismo primrio, usado

para a produo de energia. O crescimento, o catabolismo de carboidratos e a formao do produto

ocorrem ao mesmo tempo. A TROFOFASE (fase de crescimento) e a IDIOFASE (fase de formao

do produto) no so separadas.

Ex. produo de biomassa, etanol e cido glucnico. Sendo A, B, e C, produtos

intermedirios do metabolismo primrio, a formao do produto pode ser considerada:

A B C PRODUTO

FIGURA 10 - Relao entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um Processo

Associado

TIPO 2- SEMI-ASSOCIADO

O Produto derivado de um substrato usado no metabolismo primrio, mas segue uma rota

colateral. A tropofase e a idiofase so separadas. Em fermentao em batelada este tipo de cintica

possui dois pontos importantes:

1) crescimento celular acompanhado de alto consumo de substrato e pouca ou nenhuma formao

de produto;

2) O crescimento diminui e a formao do produto comea acompanhada de um alto consumo de

substrato.

Ex.: produo de cido ctrico e de alguns aminocidos. A reao de formao do produto pode ser

exemplificada como: A B C Metabolismo Primrio

D E Produto



FIGURA 11 - Relao entre Crescimento Celular e Formao de Produto em um

Processo Semi-Associado

TIPO 3 - NO ASSOCIADO

O metabolismo primrio e a formao do

Apostila Biotecnologia de Alimentos

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