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Aplicações do Cultivo Celular no Desenvolvimento de Vacinas
Carlos Eduardo Cunha
Gustavo Moreira
Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico Curso de Graduação em Biotecnologia
Disciplina de Engenharia Tecidual
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Sumário
• Histórico (Vacina da Poliomielite)
• Vacina para Raiva
• Vacina para Influenza
• Vacinas baseadas em Células Dendríticas
• Vacina para Febre Amarela
• Vacinas para Câncer
• Conclusão
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Histórico
• Início do séc. XIX – Primeiros Cultivos
• 1940-1950 – Avanços Importantes
– Vírus da Poliomielite
John Franklin Enders Thomas Huckle Weller Frederick Chapman Robbins
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Histórico
• 1952 – Primeira Vacina em Cultivo Celular
• 1954 – Prêmio Nobel para o grupo de Enders
Jonas Salk
Propagação do Vírus da Poliomielite Humana em células Vero
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Histórico
• 1953-1955 – Teste da Vacina Salk
• Maior experimento da história (2 milhões de crianças)
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Vacinas para raiva
Posição da Organização Mundial da Saúde
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Aspectos Gerais
• Agente etiológico: Vírus de RNA envelopado da família Rhabdoviridae;
• Transmissão: mordidas de carnívoros e morcegos;
• Pode infectar qualquer mamífero, causando
encefalite. Inevitavelmente fatal;
• É a principal doença zoonótica.
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Vacina & Cultivo Celular
• Primeiramente em cultura de tecido nervoso:
– Baixa imunogenicidade e alto nível de reações adversas.
• Vírus produzidas em cultivo celular (Vero, NIL2 ou BHK) e ovos embrionados seguido de inativação por β-propiolactona;
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Vacina & Cultivo Celular
• Vero;
• NIL2;
• BHK.
Cultivo
• β-propiolactona
Inativação • Ultracentrifugação
Concentração
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Influenza
• OMS
– Vacina trivalente anual
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Influenza
• Produção Atual
– Ovos
– 6-12 meses
– 1 ou 2 ovos por dose
– Contra indicações
– Contaminação
– Eficiência duvidosa
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Cultivo Celular
Tempo
Segurança
Eficiência
Custo
Influenza
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Influenza
• Avanços no Cultivo Celular
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Influenza
• Avanços no Cultivo Celular
• 100 pessoas
• Europa, 2009
• Eficiência:
80% 1ª dose
90% 2ª dose
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Influenza
• Avanços no Cultivo Celular
• US$ 1 bilhão
• Produção para 2013
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Influenza
• Avanços no Cultivo Celular
– 2011
IF = 33,633
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Influenza
• Avanços no Cultivo Celular
– 2008-2009
• A/H1N1
• A/H3N2
• B
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Influenza
• Avanços no Cultivo Celular
– Cultivo em células Vero
– 7250 pessoas (3626 vacinadas)
– Eficiência: 78,5% (contra 73% da já utilizada)
– Tempo de produção: 10 semanas menor
Mais tempo para OMS
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Influenza
• Avanços no Cultivo Celular
– 2011
• Produção 3 vezes maior de vírus
IF = 3,572
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Vacinas baseadas em células dendríticas
In vivo trafficking and immunostimulatory
potential of an intranasally-administered primary
dendritic cell-based vaccine
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Aspectos Gerais
Coccidioidomicose Antifúngicos não
surtem efeito
Necessidade de resposta Th1
eficiente
Vacina baseada em células dendríticas
Cultivo celular!
Coccidioides posadasii Coccidioides immitis
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Cultivo Celular
• Isolamento de DCs a partir da medula óssea;
• 37 °C em 5% CO2: coletas aos 2 e 4 dias de cultivo;
• RPMI 1640: – Antibióticos; – 10% SFB; – IL4 e GM-CSF; – Aminoácidos não-essenciais de MEM.
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Cultivo Celular & Transfecção
• Incubação das DCs em DMEM a 37 °C em atmosfera de 5% CO2;
– Lavagem com o mesmo meio previamente.
• Reagente TransIT-TKO;
– 2 μg de cada plasmídeo.
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Co-cultivo
• DCs: – Transfectadas e não-transfectadas;
• Linfócitos (células T) do baço;
• 1:64; 24h;
• Marcação com anticorpos para verificar ativação das células T in vitro por citometria de fluxo.
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Resultados
• DCs transfectadas expressaram o antígeno Ag2/PRA e ativaram células T;
• Produção de células T de memória e IFN-γ;
• DCs administradas de forma intranasal migraram para sangue, pulmão e timo.
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Resultados
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Febre Amarela
IF = 53,484
• 2011
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Febre Amarela
Vacina Atual
Ovos
Cepa 17D
Segurança
1936
Problemas Viscerais → 1:250.000 Problemas Neurais → 1:125.000 Choques Anafiláticos → 1: 55.600
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Febre Amarela
• Avanços no Cultivo Celular
XRX-001
• Cepa 17D em células Vero
• Suspensão com microesferas
• 60 pessoas (24 dose baixa e 24 dose alta)
• Segura
• Eficiência: 13% e 46% 1ª dose
88% e 100% 2ª dose
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Febre Amarela
• Avanços no Cultivo Celular
– Vacina contra JEV → 3 doses
– Estudos para diminuir doses
– Vacina atual protege por toda a vida
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Vacinas para câncer
Specific microtubule-depolymerizing agents
augment efficacy of dendritic cell-based cancer vaccines
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Aspectos Gerais
• Padrões moleculares associados a dano: – Morte celular imunogênica;
– Estimulam fagocitose, maturação e apresentação de antígenos de DCs;
• Agentes despolimerizantes específicos para microtúbulos: – Atividade anti-câncer;
– Ativação da DCs.
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Cultivo Celular
• B16F10 (melanoma de camundongo):
– DMEM + 10% SFB, atbs e 2 mM L-glutamina;
• BMDCs:
– RPMI1640 + 10% SFB, atbs e 2 mM L-glutamina.
• 37 °C, 5% CO2, placas de 96 poços.
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Isolamento de BMDCs – Dia 0
• Fêmur;
• Tibia
Coleta da medula
• RPMI1640;
• Lise de células vermelhas
Lavagem • RPMI1640;
• 37 °C, 5% CO2;
• GM-CSF
Cultivo
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Isolamento de BMDCs
• Troca de meio;
• GM-CSF
Dia 2
• GM-CSF;
• IL-4
Dia 5 • Coleta de
células não aderidas
Dia 7
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Resultados
• Vacinas baseadas em DC:
– Estimularam a ativação de linfócitos T citotóxicos;
– Aumentaram taxas de sobrevivência em camundongos.
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Conclusão
• Cultivo celular é uma boa opção para produção de vacinas contra doenças virais;
• Extrema importância para o desenvolvimento de vacinas baseadas em células homólogas;
• Bom custo-benefício no caso
de pandemia/epidemia.
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Obrigado! 谢谢!