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Aplicación de la Genética Mendeliana utilizando a Drosophila

melanogaster

Aguilar-Navarro, Alicia1. Ávila-Grave Dalia1. Linares-Holguín, Orlando1

1Universidad Autónoma de Sinaloa. Escuela de Biología.

Introducción

La transmisión de información biológica de progenitores a progenie, ha sido

un factor esencial en el desarrollo de los organismos, esta transmisión ha requerido

de la evolución de mecanismos genéticos, que garanticen la fidelidad de este

proceso. Debido a su fundamental importancia estos mecanismos, fueron

establecidos desde muy temprano en la historia de la vida, de manera que en la

actualidad son compartidos por muchos grupos taxonómicos. Para comprender los

principios genéticos, es posible entonces estudiar organismos muy diferentes y

llegar a conclusiones generales. La selección de un organismo específico, para

realizar estudios genéticos, depende de las ventajas que éste presente para la

realización de estos estudios.

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster, ofrece grandes ventajas para

la realización de diversos estudios en genética. Ha sido utilizada ampliamente como

material experimental desde que fue utilizada por W.E.Castle, en 1906, y sentó las

bases para las cruzas llevadas a cabo por T.H. Morgan y sus colaboradores en

1909. Las principales ventajas como organismo modelo se centran

fundamentalmente en un tiempo de generación corto, una abundante descendencia

y un fácil mantenimiento debido a sus reducidas dimensiones.

Debido al exhaustivo estudio de Drosophila durante el último siglo, ha sido

posible la acumulación de gran cantidad de información. Uno de los avances más

importantes se produjo en el año 2000 cuando la secuencia completa del genoma

de Drosophila fue publicada. Este hecho, junto con la disponibilidad de multitud de

técnicas y herramientas moleculares para su análisis, ha permitido consolidar a

Drosophila como organismo modelo en los estudios de la Genética del Desarrollo.

Otra de las grandes ventajas de Drosophila se basa en la facilidad para

introducir y combinar mutaciones en su genoma. De esta forma, el fenotipo

mutante nos permite inferir la posible función del gen durante el desarrollo. El

genoma de Drosophila contiene poco ADN repetitivo y la mayoría de los genes son

de copiaúnica, evitándose así los inconvenientes de la redundancia funcional. Esta

particularidad, junto con la posibilidad de insertar nuevo material genético en el

genoma de Drosophila ha permitido la generación de diversas colecciones de

mutantes, que constituyen un poderoso medio para analizar procesos biológicos

complejos.

Drosophila es un insecto holometábolo (que lleva a cabo una metamorfosis

completa), cuyo ciclo de vida es de alrededor de 10 a 15 días a 25°C. Su duración

puede variar en moscas mutantes y con los cambios de temperaturas (por ejemplo,

a 18°C su duración se duplica). Una hembra puede dejar entre 100-400 embriones

que eclosionan a las 24hs. El ciclo de vida de Drosophila melanogaster incluye

cuatro fases, huevo, larva, pupa y adulto.

Huevo: Las hembras adultas son capaces de poner huevos dos días después

de emerger del estado de pupa, la puesta aumenta por día durante una semana

hasta 50 o 75 huevecillos por día. Los ponen sobre la superficie del alimento. El

huevo es ovoide, con dos pequeñas proyecciones que emergen de un extremo,

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estas son aplanadas y le sirven al huevecillo para que no se hundan en el medio de

cultivo. Los huevos se pueden ver a simple vista sobre la superficie del alimento.

El desarrollo embrionario del huevo tarda aproximadamente 1 día a 25°C. La larva

emerge del huevo.

Larva: Es blanca, segmentada y vermiforme. Tiene partes bucales de

coloración negra en una región cefálica estrecha, que penetran en el alimento

comiendo vorazmente. No tiene ojos por lo que este animal es completamente

ciego. Las larvas tampoco tienen apéndices y deben empujarse comiendo para

desplazarse por su ambiente. Respiran por traqueas y poseen un par de espiráculos

visibles en los extremos anteriores y posteriores del cuerpo. La fase larvaria en el

ciclo de Drosophila, consiste de tres subdivisiones llamadas estadios. El primero y

segundo estadio terminan en mudas cada muda implica una eliminación completa

de la piel y partes orales de la larva y es el mecanismo por medio del cual esta

crece.

El tercer estadio termina en la pupación. Inmediatamente antes de la

pupación la larva deja de comer, se arrastra hacia una superficie relativamente

seca, y se revierten sus espiráculos anteriores. La fase larvaria dura alrededor de 4

días a 25°C, es ese momento el tercer estadio y mide aproximadamente 4. mm de

largo.

Pupa: Es considerada la fase reorganizativa del ciclo de la mosca, durante el

cual la mayoría de las estructuras larvarias son destruidas y las estructuras adultas

se desarrollan a partir de tejidos embrionarios llamados anlagen. Estos tejidos

embrionarios han permanecido latentes en el animal desde su diferenciación en el

huevo. El animal empupa dentro de la última piel larvaria, la cual es en un inicio

suave y balnca pero gradualmente se endurece y adquiere un color más oscuro. Los

cambios anteriores resultan en el desarrollo de un individuo con la forma corporal y

las estructuras del adulto (imago). Esta fase dura alrededor de 4 días a 25°C, el

adulto emerge del pupario.

Adulto: El adulto es considerado la fase reproductiva del ciclo. La mosca

emerge o eclosiona del pupario forzando su salida por el extremo anterior del

pupario. En un inicio, la mosca adulta es de forma elongada con las alas no

expandidas. En una hora las alas se expanden y el cuerpo gradualmente adquiere

una forma de adulta. En un inicio los adultos son de un color relativamente claro,

dentro de las primeras pocas horas se obscurecen y adquieren el color

característico (1).

Fig. 1. Ciclo biologico de D. melanogaster. Se observan tambien una mosca macho y una

hembra.

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En el adulto las diferencias sexuales son las siguientes:

Tamaño: la hembra es ligeramente más grande que el macho.

Forma: el abdomen de la hembra es más ancho que el del macho y

terminado en punta, mientras que el del macho termina redondeado

Color: la hembra posee sobre la parte dorsal del abdomen una serie de

bandas de pigmentación oscuras alternando con bandas claras, mientras que

el macho tiene un manchón negro en el extremo del abdomen por la fusión

de varias bandas.

Número de segmentos abdominales: la hembra posee 7 mientras que el

macho sólo tiene 5.

Aparato genital: las hembras tienen el abdomen de color claro y solo una

placa vaginal de la misma coloración que el resto; los machos tienen un arco

genital de color pardo.

Peine sexual: sólo lo poseen los machos en el primer segmento tarsal de su

primer par de patas, y lo utilizan para sujetarse a las hembras durante la

cópula.

Mutaciones

De cada pareja se origina un gran número de descendientes. Debido al corto

periodo de gestación de la especie, aspecto que hace que las variedades y

mutaciones entre ellas sean infinitas. Las mutaciones son cambios químicos

estructurales que afectan a los genes o cromosomas que se producen

ocasionalmente (no comunes) en forma irreversible y que al heredarse se

transmiten de generación en generación, haciendo que aparezca una nueva

característica hereditaria. Pocas mutaciones son letales, pero si existen algunas que

puedan causar la muerte del individuo (mutación letal). Tal es el caso de la

mutación de las alas vestigiales en la Drosophila melanogaster.

De acuerdo a la(s) mutación(es) que presente una mosca, recibirá un nombre

específico, entre los que se destacan:

Dumpy: con alas truncadas oblicuamente y reducidas a las 2/3 partes de su

longitud normal, su vena marginal esta intacta. Vértices de cerdas y pelos

toráxicos presentes en casi todos los casos.

Ebony: cuerpo de color ébano, negro brillante adulto; las ventas de las alas

y de las patas son mucho más oscuras que en las moscas silvestres.

White: el color de sus ojos es casi blanco. Ocelos, túbulos de Malpigi y

cubierta testicular (en los machos) incoloros.

Vestigial: sus alas son apenas más largas que el abdomen y

proporcionalmente mas angostas que en las moscas silvestres. La superficie

de las alas son grises debido a la alta concentración de pelos en esta.

Sepia: el color de los ojos del imago al salir es marrón rojizo transparente,

oscureciendo a sepia con la edad hasta de alcanzar la tonalidad negra en la

fase adulta. Ocelos de color silvestres (2).

Objetivos

Preparación del medio de cultivo para Drosophila melanogaster

Identificación de caracteres (ojos, alas, cuerpo, sexo)

Separación de sexo

Hacer cruzas de los individuos por características determinados; se, Vg,

Bw,e,w,dpse.

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Materiales y métodos

Medio de cultivo. El medio consiste en una fuente de carbohidratos, aminoácidos, y

vitaminas. El cual esta hecho a base de harina de maíz (Cuadro 1). Se disolvieron

en agua destilada estéril por separado el agar y la harina de maíz, una ves

realizado esto, se depositaron en un vaso de precipitado de 600 ml, después se

vierten los demás reactivos a (Excepto tegosept y el acido propionico) agitando

constantemente, se lleva a punto de ebullición durante 15 min. Posteriormente se

vierten el tegosept y el acido propionico los cuales funcionan como antibiótico y

antifungico respectivamente. Ya preparado se vertió en frascos de vidrio de 500 ml,

previamente lavados y esterilizados con alcohol etílico, con tapones de algodón con

gasa. Una vez depositado el medio se dejaron reposar un día para posteriormente

realizar los cruces.

Cuadro 1. Reactivos del medio

Reactivo Cantidades para 500 ml.

Agar-agar 5 gr.

Harina de maíz 30 gr.

Sacarosa 17.5 gr.

Dextrosa 12.5 gr.

Levadura 15 gr.

Tegosept (alcohol etílico) 5 ml

Acido propionico 2.5 ml

Manejo del Material vivo. Se utilizaron 6 razas puras de D. melanogaster (Cuadro 2

y Fig. 1) para realizar los cruces especificados en el cuadro 3.

Cuadro 2. Razas puras de D. melanogaster

Símbolo Característica

w (white) Ojos blancos

e (ebony) Cuerpo color ebony, ojos rojos (negro)

Se (sepia) Ojos color sepia

Vg (vestigiales) Alas vestigiales

bw (tipo silvestre) Ojos rojos, cuerpo claro

dpSe Alas dumpy, ojos sepia

Fig.1. Cuatro de las seis razas puras de D. melanogaster utilizadas: a) Fenotipo silvestre (bw); b) Ojos color blanco (w); c) Ebony (e); y d) Alas vestigiales (vg).

a) b) c) d)

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Cuadro 3. Cruces realizados.

Cruce Parentales

Se x dpSe 2 Se 2 dpse

Se x e 2 Se 2 e

Se x w 2 Se 2 w

Se x bw 2 Se 2 bw

Vg x bw 2 vg 2 bw

e x dpSe 2 e 2 dpse

Para obtener la primera generación (F1) las moscas se anestesiaron con cloroformo

al 90 %, y se observaron sus características sexuales y fenotipicas al estereoscopio

para separar las deseadas y ser depositados en los frascos con medio. Se dejo que

se llevara a cabo el ciclo de vida normal de D. melanogaster y cuando hubo

huevesillos los parentales fueron eliminados. Una vez obtenida F1 se procedió a

anestesiarlas y separarlas por sexo, posteriormente se realizo un conteo y por

ultimo el fenotipo fue observado al estereoscopio para cada F1 correspondiente.

Para obtener F2 se tomaron 2 hembras y 2 machos de F1 y se colocaron en un

frasco con medio, con el proceso restante igual que en F1.

Resultados y Conclusiones.

Los resultados serán presentados de la siguiente manera: se presentan desglosados

los cálculos de probabilidad de fenotipos, realizados por medio del método de

bifurcación en línea, seguido, se presentan los resultados obtenidos en el

laboratorio, para cada cruce realizado. Además, se especificaran, para cada cruce,

cual fue la característica que se comportó como dominante y cual característica

como recesiva, y al final la posible explicación o conclusión de cada cruce.

1) Cruce Se x w. Característica: Color de ojos.

P1 SeSe x ww

Gametos Se w

F1 Se w -- 100 % Moscas con ojos color sepia.

F1 x F1 Se w x Se w

F2 Se Se Se w w Se ww -- ¾ Ojos Sepia; ¼ Ojos blancos

Cuadro 4. Generaciones F1 y F2 del cruce Se x w.

En este caso, la característica color de ojos sepia fue dominante. En la generación

F1 se puede observar que el experimento arrojo los resultados esperados, los cuales

se obtuvieron del calculo de probabilidad de fenotipo para un cruce monohibrido de

Mendel, pero en la generación F2 no se presento ningún individuo con ojos blancos,

Fenotipo Generación F1 Generación F2

Total Total

Ojos color sepia (Se) 32 39 71 52 54 106

Ojos color blanco (w) 0 0 0 0 0 0

Total 32 39 71 52 54 106

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al contrario del 25% previsto. La posible explicación es el mal rescate de los

especimenes muertos con ojos blancos, pues recordemos que todas las moscas

contadas estaban previamente vivas, no contamos los especimenes muertos en el

frasco.

2) Cruce Se x bw. Característica: Color de ojos.

P1 bwse x bwse

F1 bwbw, bwse, bwse, sese--- ¾ Color de ojos rojos (se); ¼Color de

Ojos sepia.

* Nota: Existen tres tipos de genotipos que probablemente fueron tomados y

depositados para producir F2 (bwse x bwse; Sebw x bwbw; bwbw x bwbw), por lo

tanto, se desglosara el que, de acuerdo con los resultados obtenidos, es el genotipo

seleccionado.

F1 x F1 bwse x bwse

F2 bwbw bwse bwse sese --3/4 ojos rojos; ¼ ojos sepia

Cuadro 5. Generaciones F1 y F2 del cruce Se x bw.

Los resultados de la F1 fueron los anteriores, debido a que al momento de comenzar

la cruza no se utilizaron líneas puras sino el producto de una F1, por lo tanto

estaríamos hablando de que se obtuvo hasta la F3. En la F1, se obtuvo la proporción

3:1 calculada, por lo tanto aquí si aplica la proporción esperada, pero si se analizan

el numero total por característica obtenemos 99 color rojo y 19 color sepia,

parecería una proporción 4:1, sin embargo sigue siendo 3:1 pues el cruce del cruce

F1 x F1 obtuvimos una F2, con una proporción 3:1.

3) Cruce vg x bw. Característica: alas.

P1 bw bw x vg vg

Gametos bw vg

F1 bw vg - 100 % Alas normales

F1 x F1 bw vg x bwvg

F2 bw bw bw vg vg bw vg vg - ¾ Alas normales y ¼ alas vestigiales.

Fenotipo Generación F1 Generación F2

Total Total

Ojos color sepia (Se) 10 9 19 11 20 31

Ojos color rojo (bw) 51 48 99 41 39 80

Total 61 57 118 52 59 111

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Cuadro 6. Generaciones F1 y F2 del cruce vg. x bw.

La característica que se comporto como dominante fueron las alas normales y alas

vestigiales como recesiva. Para F1, los resultados corroboraron las probabilidades

fenotipicas anteriormente calculadas, pero para F2 al parecer no, puesto que los

resultados están muy desproporcionados, debido tal vez al conteo posterior al

tiempo correcto o la mala recuperación de los especimenes muertos.

4) Cruce Se x dpSe. Características: Color de ojos y forma de las alas.

L= Alas normales

P1 SeSe LL x dpdp SeSe

Gametos SeL dpSe

F1 SeSe Ldp --- Alas normales y color de ojos sepia.

Las proporciones de la generacion F2 se calcularon con el metodo de bifurcación

lineal.

SeSe Ldp x SeSe Ldp

Se Se x Se Se Ldp x Ldp

Se - 100% LL

Ldp ¾ Alas normales

dpL

Dpdp ¼ Alas dumpy.

¾ alas normales -- ¾ Alas normales y ojos color sepia.

4/4 Sepia

¼ alas dumpy --- ¼ Alas dumpy y ojos color sepia.

Cuadro 7. Generaciones del cruce Se x dpSe.

La característica dominante fueron las alas normales y los ojos color sepia. Para F1

y F2, los resultados corroboraron las proporciones fenotipicas anteriormente

calculadas una proporcion 3:1.

Fenotipo Generación F1 Generación F2

Total Total

Alas normales (bw) 87 74 161 174 165 339

Alas vestigiales (vg) 0 0 0 2 1 3

Total 87 74 161 176 166 342

Fenotipo Generación F1 Generación F2

Total Total

Ojos sepia, alas normales 21 12 33 162 111 273

Ojos sepia, alas dumpy 0 0 0 67 35 102

Total 21 12 33 212 163 375

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5) Cruce Se x e. Características: Color de ojos y color de cuerpo.

N= Cuerpo color normal

R= Ojos color rojo

P1 SeSe NN x RR ee

Gametos SeN Re

F1 RSe Ne -- 100% Ojos color rojo y cuerpo de color normal.

F1 x F1 RSe Ne x RSe Ne

Rse x Rse Ne x Ne

RR NN

Rse ¾ ojos rojos Ne ¾ cuerpo color

SeR eN normal. sese ¼ ojos sepia ee ¼ cuerpo ebony

¾ cuerpo color normal 9/16 Ojos rojos y cuerpo color normal.

¾ ojos rojos ¼ cuerpo color ebony 3/16 Ojos rojos y cuerpo color ebony.

3/4 cuerpo color normal 3/16 Ojos sepia y cuerpo color normal.

¼ ojos sepia ¼ cuerpo color ebony 1/16 ojos sepia y cuerpo color ebony.

Cuadro 8. Generaciones del cruce Se x e

Las características dominantes en este cruce fueron: ojos color rojo y cuerpo color

normal. Sin embargo, en F1, aparecieron 5 individuos con ojos color sepia y cuerpo

color normal, debido a que el conteo se realizo días después de que debió hacerse,

para entonces ya había ocurrido el cruce F2, es por esto que en el primer conteo

aparecieron organismos de F2.

Fenotipo Generación F1 Generación F2

Total Total

Ojos rojos y cuerpo color

normal

91 52 143 81 68 149

Ojos sepia y cuerpo color

normal

2 3 5 25 19 44

Ojos rojos y cuerpo ebony 0 0 0 40 24 64

Ojos sepia y cuerpo ebony 0 0 0 3 2 5

Total 93 55 148 149 113 262

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6) Cruce e x dpSe. Caracteristicas: Color del cuerpo, color de ojos y

forma de las alas.

Cuadro 9. Genotipos esperados para el cruce e x dpSe por el Metodo de Bifurcación.

Cuadro 10. Generaciones F1 y F2 del cruce e x dpSe.

Las características dominantes fueron: cuerpo color normal, alas normales y ojos

color rojo. En la F1 se obtuvo el fenotipo esperado, en F2 el fenotipo esperado era

con una proporción 27:9:9:3:9:3:3:1 de un cruce trihibrido, a simple vista se

observa que se cumplió parcialmente a excepción de los últimos dos fenotipos, se

podría explicar por la interacción de genes letales recesivos.

Cruces de los alelos de la F2 de eSedp x eSedp Fenotipos

esperados

¾ normales

¾ Rojo

¾ normal 27/64 NRL

¼ dumpy 9/64 NRdp

¼ Sepia

¾ normal 9/64 NseL

¼ dumpy 3/64 Nsedp

¼ ebony

¾ Rojo

¾ normal 9/64 eRL

¼ dumpy 3/64 eRdp

¼ Sepia

¾ normal 3/64 eseL

¼ dumpy 1/64 esedp

Fenotipo Generación F1 Generación F2

Total Total

Cuerpo color normal, alas

normales, ojos rojos.

158 114 272 76 87 163

Cuerpo color normal, alas

normales y ojos sepia.

0 0 0 35 33 68

Cuerpo color normal, alas

dumpy, ojos rojos.

0 0 0 26 28 54

Cuerpo color normal, alas

dumpy, ojos sepia.

0 0 0 20 16 36

Cuerpo color ebony, alas

normales, ojos rojos.

0 0 0 40 32 72

Cuerpo color ebony, alas

dumpy, ojos rojos.

0 0 0 19 13 32

Cuerpo color ebony, alas

normales, ojos sepia.

0 0 0 0 0 0

Cuerpo color ebony, alas

dumpy, ojos sepia.

0 0 0 0 0 0

Total 158 114 272 216 209 425

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Bibliografía

1.- Características y ciclo de vida de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster.

Dr. Luis mejia. Laboratorio de genetica general FAUSAC

2.- Ciencias Biologicas, Claude A. Welch

3.- Klug,W. Cummings, M. 1999. Conceptos de Genetica. 5ta ed. Editorial prentice

Hall. P.814.

4.- Curtis, M. 2000. Biología.6ta ED. Editorial Médica Panamericana. P.1496