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DEPARTAMENTO DE POSGRADOS
“DETERMINACIÓN DE CLEMBUTEROL EN MÚSCULO E
HÍGADO BOVINO EN LA PROVINCIA DE MANABÍ Y SU
EVALUACIÓN RESPECTO A LOS LÍMITES MÁXIMOS
PERMITIDOS.”
MAGÍSTER EN GESTIÓN DE LA CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
Autora:
Wania Fernanda Espinoza Molina
Director:
Luis Alejandro Ramos Guerrero
Co-Director:
Paul Ernesto Vargas Jentzsch
Cuenca, Ecuador
2015
Espinoza Molina II
DEDICATORIA
Esta investigación va dedicada a mi hijo Marcelo Israel Barrera Espinoza, quien ha sido mi
inspiración, apoyo y razón principal, quien con su existencia llena de amor, alegría, ternura,
comprensión y compromiso con su mami, fue mi pilar fundamental de entendimiento ante la
misión que me había planteado de desarrollar esta investigación como aporte importante para
mi país y de esta manera su luz me sirvió para seguir avanzando en mi desarrollo personal,
profesional y como ser humano con visión y energía encaminada por ti hijo mío para velar por
su seguridad alimentaria con este breve aporte.
Dedico así también esta investigación con todo mi corazón a mi madre María Teresa Molina
Cruz, quien con sus sabios consejos y escucha, nunca dejó de dudar de las capacidades de
su hija y me apoyó en todo momento entendiéndome, escuchándome, incentivándome a
surgir y salir adelante firme y con convicción.
Padre mío en tu ausencia física te dedico mi pequeño aporte de investigación, sé que desde
nuestro cielo estarás orgulloso de cada pasito que doy,
La excelencia, el trabajo, el don de gente, la perseverancia, la visión y convicción la herede
de ustedes padres míos.
A mis hermanas Vilma, Paola, Erika, por sus consejos, preocupación, energía y oraciones.
A mis sobrinos Carito, Dome, Karla, Juan Daniel, Emilia, Rafaela, Nicolás, Daniel, Josué, por
su cariño y acompañamiento a mi hijo en mi ausencia.
A mi gente linda de AGROCALIDAD, de manera especial a mis amigos profesionales de la
vida: Dr. Luis Ramos, Paul Vargas, Rommel Betancourt, Diego Vizcaíno, quienes me
apoyaron en primera instancia con los recursos necesarios para poder desarrollar mi proyecto.
Dedicado de manera total a mi país que merece mucho compromiso de todos quienes somos
actores de esta sociedad con derechos a una seguridad, calidad y por ende una soberanía
alimentaria.
Espinoza Molina III
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a mi hijo, mi vida entera, mi razón de ser, por su comprensión todo este tiempo de
haberme compartido parte de su tiempo familiar para poder realizar mi investigación.
Gracias infinitas a mi madre Tere, por su ejemplo de lucha por nuestros ideales, por el ejemplo
de emprendimiento, valentía y amor incondicional.
A mis hermanas y familia por su apoyo ilimitado todo este tiempo distante de ustedes.
A mi padre Marcelo (+), quien es mi motivación como ser humano con convicción, valores,
perseverancia y responsabilidad, gracias papi por tu gran ejemplo.
A mi familia Espinoza Prado, por su apoyo y compañía, de manera especial a mi tío Leonardo
y primo Santiago
A mis grandes amigos Álvaro L, Jenny C, Nahir D, Jenny B, Carolina C, César S (+), JCI
Cuenca, quienes con su cariño y energía positiva ayudaron a que mantuviera mi ritmo en base
a las distintas circunstancias vividas.
A mi gran escuela de trabajo AGROCALIDAD, gracias por su apoyo total. Gracias Ing. Diego
Vizcaíno por su apertura y confianza en mi proyecto y mi persona.
De manera especial a la COORDINACIÓN GENERAL DE LABORATORIOS DE
AGROCALIDAD, donde se desarrolló mi trabajo de investigación, por el aporte de recursos
humano, económico e intelectual, para que este proyecto sea posible.
A mi gran amigo y hermano Luis Ramos Guerrero, “Doc”, gracias infinitas por confiar en mí,
por apoyarme, por ser el gestor para que todo esto se dé hasta el final y por ser mi Director
de tesis, por su preocupación, dedicación y sabios consejos y enseñanzas.
A mi gran amigo hermano Paul Vargas J, por tu excelente labor como mi codirector del
proyecto de investigación de maestría, por tu apoyo técnico, moral todo este tiempo ha sido
valioso, me has enseñado mucho, infinitas gracias.
Amigo Rommel Betancourt, gracias por su compromiso total, por su escucha a mi propuesta
y creer en que esta idea inicial aportaría mucho en la inocuidad de un país, de nuestro país.
A mi compañera y amiga, Margoth Barrionuevo, por su entregada labor con la enseñanza de
la técnica de ELISA.
A mi gran equipo de trabajo: Rommel Betancourt, Diego Andino, Paulette Andrade, Paul
Vargas, Coordinación de Manabí, Coordinación de Inocuidad de Alimentos, Coordinación de
Sanidad Animal, Coordinación de Registros, Laboratorio de Contaminantes Pecuarios,
Laboratorio de Diagnóstico Animal, Laboratorio de Contaminantes Agrícolas, Laboratorio de
Biología Molecular, Departamento Administrativo Financiero, Comunicación.
Espinoza Molina IV
A mis compañeros de trabajo y amigos quienes se convirtieron en mi familia, mi compañía en
todo este tiempo. A mis amigas(os) Rosita, Evelyn, Lore, Patricia, Ana, Erika, Gaby, Paulette,
Silvana, Jacqueline, Carla, Liz, Margoth, Catalina, Daniela, Jessica, Jessandra, Alicia, Diego
Andino, Juan Pablo, Euclides, Wladimir, Marlon, Lenin, Alexander, Juan Carlos, Alexander T,
Jorge I, Ernesto, Kathy P, Janeth, Mónica, Cristina, gracias por todo su apoyo y cariño todo
este tiempo, por llegar a ser mi compañía, apoyo, familia.
A Pablo Jaramillo – Gerente Comercial de la empresa Inventagri, proveedores de Kits de
ELISA, por el apoyo en la adquisición y donación de Kits ELISA Clembuterol, a Mark
MacBeath – Gerente Comercial de Biooscientific y a Kyle Smith – Desarrollo Químico
II/Consultor Técnico Biooscientific, por su apoyo capacitación y desarrollo en la técnica de
ELISA para músculo e hígado, por la donación de un lector de ELISA para el desarrollo de
esta investigación.
A Fernando Gualpa, Gerente de investigación y desarrollo para la Corporación World Survey
Service, por su apoyo en la enseñanza del manejo, acondicionamiento del equipo
UPLC/MS/MS.
Espinoza Molina V
RESUMEN
El presente trabajo evalúa la presencia del β-adrenérgico clembuterol, en productos pecuarios
bovinos, como una medida encaminada a la prevención de riesgos en la salud humana por su
consumo. Se aplicaron técnicas analíticas inmunológicas como el ensayo por
inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y cromatográficas-espectrométricas
(UPLC/MS/MS), en matrices de hígado y músculo bovino. La investigación se desarrolló con
un muestreo aleatorio en 10 mataderos de la provincia con el mayor hato ganadero del país,
Manabí. Se evaluaron un total de 48 submuestras de hígado y 48 de músculo. Para el análisis
de los resultados se consideran los límites máximos de residuos veterinarios LMRV,
establecidos en el Codex Alimentarius y en la normativa de la Unión Europea. Como resultado
se determinó un alto porcentaje de muestras con presencia de clembuterol superior a los
LMRV. También, se evaluó el desempeño de los dos métodos implementados. Los resultados
sugieren la implementación de un plan de control del uso fraudulento del compuesto para la
engorda animales bovinos en el Ecuador.
PALABRAS CLAVE
Clembuterol, hígado bovino, músculo bovino, ELISA, UPLC/MS/MS, LMRV.
ABSTRACT
The present study evaluates the presence of β-adrenergic clenbuterol in bovine cattle
products, as a measure aimed at the prevention of risks to human health due to its
consumption. Analytical techniques were applied like the Linked ImmunoSorbent Assay
(ELISA) and cromatographic- spectroscopic (UPLC/MS/MS), in matrices of liver and bovine
muscle. The research was carried out with a random sampling in 10 slaughterhouses of the
province with the largest cattle herd of the country, Manabí. A total of 48 liver and 48 muscle
subsamples were evaluated. For the analysis of the results, the maximum residue limits, VMRL
established in the Codex Alimentarius and in the European Union regulations are considered.
As a result, a high percentage of samples with a higher clenbuterol presence than VMRLV
were determined. Also, the performance of the two methods implemented has been evaluated.
The results suggest the implementation of a control plan for the fraudulent use of the
compound for fattening bovine animals in Ecuador.
KEYWORDS
Clenbuterol, bovine liver, bovine muscle, ELISA, UPLC/MS/MS, VRML.
Espinoza Molina VI
Espinoza Molina VII
ÍNDICE DE CONTENIDOS
DEDICATORIA .................................................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................... iii
RESUMEN ........................................................................................................................... v
PALABRAS CLAVE .......................................................................................................... v
ABSTRACT ......................................................................................................................... vi
KEYWORDS .................................................................................................................... vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS .................................................................................................. vii
ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................................... ix
ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................... xi
ÍNDICE DE ANEXOS .........................................................................................................xiii
CAPÍTULO 1. INTRODUCCION ...................................................................................... 1
1.1. Objetivo General ..................................................................................... ..............4
1.2. Objetivos Específicos .............................................................................. ..............4
CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................... 5
2.1. Tipo de investigación .............................................................................. ..............5
2.2. Localización y descripción del sitio de investigación...............................................5
2.3. Población bovina y delimitación del muestreo .......................................... ..............5
2.4. Consentimiento Institucional.................................................................... ..............8
2.5. Descripción del trabajo de campo............................................................ ..............8
2.5.1. Fase I: Recopilación de Información bibliográfica ...........................................9
2.5.2. Fase II: Muestreo y diagnóstico preliminar .....................................................9
2.5.3. Fase III: Plan de Muestreo .............................................................................9
2.5.3.1. Procedimiento de muestreo ..................................................................... 10
2.5.3.2. Toma de muestras y distribución del muestreo......................................... 11
2.5.4. Fase IV: Métodos de Análisis en Laboratorio. ............................ ..................13
2.5.4.1. Procedimiento para el análisis de clembuterol en tejido (músculo e hígado
bovino): Método de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) ................ 14
Principio .................................................................................................................. 14
Sensibilidad del Método (Límite de Detección) ......................................................... 15
Equipos y Materiales ................................................................................................ 15
Herramientas ........................................................................................................... 15
Espinoza Molina VIII
Reactivos y Estándares ........................................................................................... 15
Preparación de soluciones y/o reactivos ................................................................... 15
Consideraciones para el ensayo .............................................................................. 16
Preparación de la muestra ....................................................................................... 16
Procedimiento de extracción .................................................................................... 16
Procedimiento del ensayo ELISA ............................................................................. 17
Cálculo de las concentraciones ................................................................................ 18
2.5.4.2. Procedimiento para el análisis de clembuterol en tejido (músculo e hígado
bovino): Método de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en
tándem UPLC/MS/MS ................................................................................................. 18
Principio .................................................................................................................. 19
Sensibilidad del Método (Límite de Detección y Cuantificación) ............................... 20
Equipos y Materiales ................................................................................................ 20
Reactivos y Estándares ........................................................................................... 21
Preparación de soluciones y/o reactivos ................................................................... 21
Condiciones del Cromatógrafo líquido ...................................................................... 22
Condiciones del espectrómetro de masas ................................................................ 22
Preparación de la muestra ....................................................................................... 22
Procedimiento del ensayo UPLC/MS/MS ................................................................. 22
Seteo de masas en el equipo UPLC/MS/MS............................................................. 23
CAPÍTULO 3. RESULTADOS ........................................................................................ 26
3.1. Resultados obtenidos con el Método ELISA ........................................................ 26
3.1.1. Resultados de submuestras de músculo bovino con Método ELISA ............. 26
3.1.2. Resultados de submuestras de higado bovino con Método ELISA ............... 29
3.2. Resultados Cuantitativos obtenidos con el Método UPLC/MS/MS ........................ 34
3.3. Comportamiento estadístico de los resultados ..................................................... 37
3.3.1. Distribución de los datos ............................................................ 37
3.3.2. Comparación mediante t de student para muestras emparejadas................. 40
3.3.2.1. Prueba t student para muestras emparejadas en Microsoft Excel,
resultados de análisis de hígado .............................................................................. 40
3.3.2.2. Prueba t student para muestras emparejadas en Minitab, resultados de
análisis de Hígado ................................................................................................... 41
3.3.2.3. Prueba t student para muestras emparejadas en Microsoft Excel,
Espinoza Molina IX
resultados de análisis de Músculo ............................................................................ 43
3.3.2.4. Prueba t student para muestras emparejadas en Minitab, resultados de
análisis de Músculo .................................................................................................. 45
3.4. Análisis cualitativos de los Métodos ELISA y UPLC/MS/MS en relación a la
normativa vigente. .......................................................................................................... 46
3.4.1. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Codex
Alimentarius ................................................................................................................ 54
3.4.2. Resultados obtenidos con el método UPLC/MS/MS en relación al Codex
Alimentarius ................................................................................................................ 55
3.4.3. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Council
Regulation (EEC) N°2377/90 ....................................................................................... 57
3.4.4. Resultados obtenidos con el método de UPLC/MS/MS en relación al Council
Regulation (EEC) N°2377/90 ....................................................................................... 58
3.4.5. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Council
Directive 96/23/EC (29 Abril 1996) ............................................................................... 60
3.4.6. Resultados obtenidos con el método de UPLC/MS/MS en relación al Council
Directive 96/23/EC (29 Abril 1996) ............................................................................... 61
3.4.7. Relación de los métodos aplicados para la detección de clembuterol en
bovinos................................................................................................ 63
CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN ............................................................................................ 68
4.1. Resultados cuantitativos del análisis de músculo e hígado mediante el método
ELISA y UPLC/MS/MS .................................................................................................... 68
4.2. Resultados cualitativos del Análisis de Músculo e Hígado mediante el método
ELISA y UPLC/MS/MS .................................................................................................... 70
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES .................................................................................... 73
CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES ........................................................................... 76
BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 77
ANEXOS ............................................................................................................................ 80
Espinoza Molina IX
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Imagen Optimizada de Clembuterol ......................................................................1
Figura 2. Población bovina del Ecuador por provincia, periodo 2014. ...................................7
Figura 3. ELISA competitivo............................................................................................... 14
Figura 4. Ejemplo de curva de calibración para la determinación de clembuterol ................ 18
Figura 5. Fuente de ionización de electrospray .................................................................. 19
Figura 6. Monitorización de reacción múltiple .................................................................... 20
Figura 7. Curva de calibración Método ELISA submuestras de músculo bovino.................. 27
Figura 8. Resultados de submuestras de músculo bovino con Método ELISA ..................... 29
Figura 9. Curva de calibración Método ELISA submuestras de higado bovino .................... 30
Figura 10. Resultado de submuestras de higado bovino con Método ELISA ....................... 32
Figura 11. Resultado de la lectura de submuestras de músculo con Método ELISA ............ 33
Figura 12. Cromatograma TIC de la solución estándar de clembuterol de 2.0 ug/L ............. 34
Figura 13. Curva de Calibración determinación de Clembuterol en el rango de 0,125 a 8.0
ug/L por UPLC-MS-MS ....................................................................................................... 35
Figura 14. Resultado de la lectura de submuestra de músculo en espectrómetro de masas
método UPLC/MS/MS ........................................................................................................ 37
Figura 15. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de hígado con Método
ELISA ................................................................................................................................ 38
Figura 16. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de hígado con Método
UPLC/MS/MS ..................................................................................................................... 38
Figura 17. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de músculo con Método
ELISA ................................................................................................................................ 39
Figura 18. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de músculo con Método
UPLC/MS/MS ..................................................................................................................... 40
Figura 19. Diagnóstico de resultados y valores atípicos en el análisis de hígado con Método
ELISA y UPLC/MS/MS ....................................................................................................... 42
Figura 20. Prueba t de dos muestras relacionadas para resultados de análisis de hígado
con Método ELISA y UPLC/MS/MS .................................................................................... 43
Figura 21. Diagnóstico de resultados y valores atípicos en el análisis de Músculo con
Método ELISA y UPLC/MS/MS ........................................................................................... 45
Figura 22. Prueba t de dos muestras relacionadas para resultados de análisis de hígado
con Método ELISA y UPLC/MS/MS .................................................................................... 46
Figura 23. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,
Método ELISA. Normativa Codex CAC - 2014 .................................................................... 54
Figura 24. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método ELISA. Normativa Codex CAC - 2014 .................................................................... 55
Figura 25. Resultado del análisis de clembuterol en tejido de músculo, Método
UPLC/MS/MS. Normativa Codex CAC - 2014 ..................................................................... 56
Espinoza Molina X
Figura 27. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,
Método ELISA. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90 ........................................57
Figura 28. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en hígado, Método
ELISA. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90.....................................................58
Figura 29. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90 .............................59
Figura 30. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90 .............................59
Figura 31. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,
Método ELISA. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 Abril 1996) ................................60
Figura 32. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método ELISA. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 Abril 1996) ................................61
Figura 33. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 Abril 1996).....................62
Figura 34. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 Abril 1996).....................62
Figura 35. Resultados comparativos entre tejido analizado por Método ELISA en función de
la norma de referencia. .......................................................................................................66
Figura 36. Resultados comparativos por tejido analizado con Método UPLC/MS/MS en
función de la norma de referencia. ......................................................................................67
Espinoza Molina XI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Población bovina y ponderación de la muestra por provincia en base a datos
correspondientes al periodo 2014 .........................................................................................6
Tabla 2. Ubicación de mataderos de faenamiento bovino a muestrear en la Provincia de
Manabí .................................................................................................................................7
Tabla 3. Matrices de tejido bovino y métodos a implementar para la determinación de
clembuterol ..........................................................................................................................8
Tabla 4. Mínimo de muestras necesarias para detectar residuos no conformes en un lote. 12
Tabla 5. Distribución de la muestra en la provincia de Manabí en base al periodo 2014 ...... 12
Tabla 6. Planificación del muestreo en los mataderos de la provincia de Manabí según
horario de faena bovina ...................................................................................................... 13
Tabla 7. Seteo de las masas de clembuterol ...................................................................... 24
Tabla 8. Gradiente de solventes aplicado en el método cromatográfico. ............................. 24
Tabla 9. Resultados de soluciones estándar de clembuterol para análisis de muestras de
Músculo - Método ELISA .................................................................................................... 26
Tabla 10. Resultados de clembuterol en submuestras de músculo Método ELISA .............. 27
Tabla 11. Resultados de clembuterol en submuestras de hígado Método ELISA ................ 29
Tabla 12. Resultados de clembuterol en submuestras de hígado_Método ELISA ............... 30
Tabla 13. Resultados clembuterol en submuestras de hígado y músculo bovinos_Método
UPLC/MS/MS ..................................................................................................................... 35
Tabla 14. Prueba t para medias de dos muestras emparejadas, resultados de análisis de
hígado ................................................................................................................................ 41
Tabla 15. Prueba t para medias de dos muestras emparejadas, resultados de análisis de
Músculo. ............................................................................................................................ 44
Tabla 16. Límites Máximos de Residuos Veterinarios en matriz músculo e hígado bovino
establecido en normativas internacionales .......................................................................... 46
Tabla 17. Tabulación de resultados de análisis en muestras de músculo, según método
ELISA y UPLC/MS/MS ....................................................................................................... 48
Tabla 18. Resumen análisis en muestras de músculo, según método ELISA y
UPLC/MS/MS, con relación a la normativa legal ................................................................. 50
Tabla 19. Tabulación de resultados de análisis en muestras de hígado, según método
ELISA y UPLC/MS/MS ....................................................................................................... 51
Tabla 20. Resumen análisis en muestras de hígado, según método ELISA y UPLC/MS/MS,
con relación a la normativa legal ......................................................................................... 53
Tabla 21. Resultados de presencia de clembuterol mediante los métodos de ELISA y
UPLC/MS/MS en muestras de músculo, en relación a la normativa legal vigente. ............... 63
Tabla 22. Resultados de presencia de clembuterol mediante los métodos de ELISA y
UPLC/MS/MS en muestras de hígado, en relación a la normativa legal vigente................... 64
Tabla 23. Resultados comparativos por tejido analizado con Método ELISA en función de la
norma de referencia. .......................................................................................................... 65
Espinoza Molina XII
Tabla 24. Resultados comparativos por tejido analizado con Método UPLC/MS/MS en
función de la norma de referencia. ......................................................................................66
Espinoza Molina
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Plan de muestreo para el estudio de residuos de medicamentos veterinarios
(anabólicos) a Nivel Nacional.............................................................................................. 80
Anexo 2. Autorización desarrollo de tesis maestría “Evaluación de clembuterol en productos
pecuarios bovinos .............................................................................................................. 93
Anexo 3. Reunión coordinación proyecto de análisis residuos veterinarios ......................... 94
Anexo 4. Planificación muestreo en mataderos de Manabí................................................. 95
Anexo 5. Oficio dirección de tesis de maestría de Wania Fernanda Espinoza Molina .......... 95
Anexo 6. Oficio co-dirección como investigador del Proyecto Prometeo y Agrocalidad de la
tesis de maestría de Wania Fernanda Espinoza Molina ...................................................... 96
Anexo 7. Formato Orden de trabajo de las muestras del proyecto “Evaluación de
clembuterol en productos pecuarios bovinos de la provincia de Manabí .............................. 97
Anexo 8. Formato Registro de toma de muestras ............................................................... 98
Anexo 9. Formato registro de análisis de ELISA ................................................................. 99
Anexo 10. Informe de cumplimiento de comisión para la toma de muestras en la provincia
de Manabí. ....................................................................................................................... 100
Anexo 11. Informe de comisión de servicios institucionales para la toma de muestras de
productos pecuarios bovinos en la provincia de Manabí .................................................... 103
Anexo 12. Capacitación Método de ELISA para clembuterol y demostración .................... 103
Anexo 13. Certificado de formación completa sobre el Método de ELISA para clembuterol.
............................................................................................................................................. 106
Anexo 14.. Seteo de masas clembuterol en el equipo UPLC/MS/MS ................................ 106
Anexo 15. Laboratorio de contaminantes productos pecuarios, análisis de clembuterol por el
método de ELISA. (Recepción de muestras, codificación, extracción de la porción analítica)
............................................................................................................................................. 108
Anexo 16. Figuras de participación en formación y desarrollo del método ELISA
clembuterol, impartida por la empresa Biooscientific – Inventagri. ..................................... 109
Anexo 17. Figuras del proceso de análisis por el método cromatográfico UPLC/MS/MS
(Preparación de estándares, recepción, codificación, preparación, extracción de las muestras
de hígado y músculo, previo a la inyección en el equipo) .................................................. 110
Anexo 18. Figuras Acondicionamiento del equipo (gradiente) ........................................... 111
Espinoza Molina 1
Wania Fernanda Espinoza Molina
Trabajo de Graduación
Luis Alejandro Ramos Guerrero
Mayo, 2018
“Determinación de clembuterol en músculo e hígado bovino en la provincia de
Manabí y su evaluación respecto a los límites máximos permitidos.”
CAPÍTULO 1. INTRODUCCION
Uno de los principales retos a nivel mundial es satisfacer la creciente demanda de alimentos.
Asimismo, el crecimiento demográfico obliga a buscar métodos y alternativas que permitan
obtener mayores rendimientos en la producción de alimentos. Los productos bovinos no
escapan a esta tendencia y la industria ganadera ha implementado métodos para cubrir la
demanda, tanto en cantidad como en calidad, a través de manejos genéticos, adelantos
tecnológicos y farmacológicos, mismos que permitieron mejoras y una producción más
eficiente. Sin embargo, se ha determinado que existen productos veterinarios de riesgo como
es el caso del clembuterol, sustancia que está catalogada como un anabolizante del grupo de
los β-agonistas adrenérgicos (López Hernández, y otros, 2011), y cuyo uso está autorizado
en varios países como medicamento para problemas respiratorios en humanos, así como
también para uso veterinario en equinos.
Figura 1. Imagen Optimizada de Clembuterol
Fuente: Wania Espinoza
Espinoza Molina 2
El clembuterol, cuya estructura química se muestra en la Figura 1, causa efectos en la salud
humana al ser utilizado en dosis no terapéuticas. Dependiendo de la cantidad ingerida de este
fármaco, diversos efectos pueden manifestarse en los pacientes incluyendo taquicardias,
tembladera, vómitos, cefalea, rubor facial, ansiedad, hipertensión, dolor muscular y, en casos
extremos, se pueden presentar intoxicaciones severas y hasta la muerte. (López Hernández,
y otros, 2011).
Se ha determinado que el clembuterol aplicado a bovinos permite la ganancia de masa
muscular y esto genera beneficios económicos para los productores. Esta ganancia de masa
muscular sucede en virtud de la acción lipolítica de disminución de la grasa e incremento de
la carne magra (Smith & Paulson, 1997) y, por ende, se tendría el incremento de peso de los
animales. Hay reportes que dan cuenta de que el clembuterol se ha utilizado en Europa y
América de manera ilegal por parte de ciertos productores de ganado, y esto ha significado
un peligro para la salud pública. En este sentido varios casos de intoxicación se han
relacionado con productos cárnicos contaminados con residuos de clembuterol (Smith &
Paulson, 1997).
La administración vía oral del clembuterol en bovinos, en una dosis de 3 mg/kg, tiende a
causar efecto en el animal a partir de las 48 horas, y los residuos del anabólico se observan
principalmente en la orina en un 41,5%, el 3% se elimina a través de las heces y el resto se
manifiesta en los tejidos y esqueleto (Smith & Paulson, 1997). El tiempo de efecto residual del
clembuterol estimada en bovinos es de 18 horas a partir de la excreción urinaria. (Smith, 1998)
A nivel internacional, se tienen varios reportes sobre problemas en la salud de la población,
asociados a la aplicación ilegal de adrenérgicos agonistas en el ganado. En México, en el
período 2002 a 2006, se registraron 192 reportes de intoxicaciones por clembuterol con un
total de 1300 casos que ventajosamente no han resultado en defunciones, sin embargo,
fueron motivo de enorme preocupación en aquel país (Domínguez, y otros, 2009-2010). El
alimento consumido en la mayoría de aquellos casos fue el hígado de res y las reacciones
fueron observadas dentro de un período de 30 minutos a 6 horas posteriores a la ingesta.
Entre los síntomas que presentaron los pacientes afectados se destacaron palpitaciones,
náuseas, ansiedad, angustia y malestar general, con una duración promedio de 40 horas
(Domínguez, y otros, 2009-2010).
Considerando que Ecuador fue declarado país libre de fiebre aftosa en el año 2015, ésta
temática adquiere aún más relevancia, pues importantes mercados internacionales se abren
a la exportación de carne bovina producida en el país. Es previsible que países que muestren
interés en importar carne ecuatoriana, impongan estrictos y exigentes estándares de calidad
e inocuidad alimentaria, en los que se incluirían límites muy bajos de residuos de fármacos
y/o productos de uso veterinario.
Espinoza Molina 3
Actualmente, Ecuador está comprometido con el levantamiento de información sobre el uso
de medicamentos veterinarios y otros fármacos, y no se puede descartar el posible uso en la
ganadería de ciertos fármacos que en otros países están prohibidos y han causado problemas
graves. En caso de no llegar a cumplir con esos criterios de calidad e inocuidad, la carne
bovina ecuatoriana tendría una nueva barrera que impediría su exportación, por lo que, es
indispensable desarrollar estudios como los que se presentan en este trabajo.
En este contexto, se hace necesario contar con información sobre la presencia (o ausencia)
de residuos de fármacos en productos cárnicos bovinos para que de esta manera las
instituciones nacionales de control y los productores puedan encarar estrategias para corregir
posibles malas prácticas en la producción y asegurar la calidad e inocuidad de los productos
tanto para consumo interno como para exportación.
Por lo antes mencionado es que esta investigación pretende direccionar al levantamiento de
información sobre la presencia de clembuterol en músculo e hígado de res. Se sospecha que
este anabólico estaría siendo aplicado en bovinos, pero la falta de datos de análisis de
residuos de este anabólico en productos cárnicos no permite establecer si esta problemática
existe. Esta investigación incluye el análisis de clembuterol en muestras de carne e hígado de
bovinos en la provincia con el hato más grande del país, es decir Manabí. Los valores de
concentración de clembuterol son comparados con Límites Máximos de Residuos Veterinarios
(LMRV) establecidos en el Codex Alimentarius. Se espera que los datos generados permitan
hacer un diagnóstico del sistema de producción de carne bovina y que sirvan de base para
encarar acciones que permitan la mejora de la inocuidad de los productos cárnicos que se
producen en el país.
En el Capítulo 2, se describe los materiales y métodos utilizados en la investigación, así como
las unidades y cantidades de muestras. También se describen los métodos analíticos
considerados para la determinación de residuos de clembuterol en los tejidos objetos de
estudio: músculos e hígado. Los métodos analíticos usados en esta investigación son el
método de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas, ELISA (del inglés “Enzyme- Linked
Immunosorbent Assay”) y cromatografía líquida UPLC/MS/MS (del inglés “Ultra Performance
Liquid Chromatography) acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Los
métodos analíticos mencionados fueron usados para la detección y cuantificación de
clembuterol en muestras colectadas en la provincia de Manabí, considerando que esta
provincia representa el 18,13% del hato bovino nacional.
En el Capítulo 3 se describen los resultados de los análisis de muestras de músculo e hígado
obtenidos usando los métodos de ELISA y UPLC/MS//MS. Debido a que las muestras fueron
analizadas con dos métodos, es posible realizar una comparación entre métodos.
En el Capítulo 4 se presenta la discusión de los resultados obtenidos. Se realiza la evaluación
del contenido de clembuterol en las muestras. Asimismo, se realiza un contraste
Espinoza Molina 4
de estos resultados con aspectos establecidos por organismos internacionales sobre el uso
de anabólicos en la ganadería. Adicionalmente se incluye un análisis legal asociado a las
garantías de la salud humana en la República del Ecuador.
1.1. Objetivo General
Determinar clembuterol en músculo e hígado bovino en la provincia de Manabí y su evaluación
respecto a los límites máximos permitidos
1.2. Objetivos Específicos
- Desarrollar métodos apropiados para la detección del anabólico clembuterol en productos
pecuarios bovinos.
- Proporcionar las herramientas para asegurar la calidad e inocuidad de los productos
pecuarios bovinos desde el inicio de la cadena de producción primaria, mediante la valoración
de la presencia de residuos de clembuterol.
- Disponer de información estadística sobre la presencia de clembuterol en el país para la
toma de acciones pertinentes
Espinoza Molina 5
CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Tipo de investigación.
La presente investigación es de tipo analítica en la que se realiza la generación de resultados
(concentración de clembuterol) y una comparación de variables tanto en los tipos de muestra
(músculo e hígado) y los métodos aplicados (ELISA y UPLC/MS/MS).
2.2. Localización y descripción del sitio de investigación.
La provincia de Manabí fue seleccionada para efectos de esta investigación, debido a que
tiene el mayor hato bovino en la República del Ecuador (Ver Tabla 1 y Figura 2). Las muestras
de carne e hígado para el análisis de clembuterol en productos pecuarios bovinos fueron
obtenidas de diez mataderos en la provincia de Manabí (Ver Tabla 2). Esta investigación fue
realizada en colaboración con la Coordinación General de Inocuidad de Alimentos, la
Coordinación General de Laboratorios, la Coordinación de Registros Agropecuarios y la
Coordinación General de Sanidad Animal, de la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la
Calidad del Agro (AGROCALIDAD), la misma que tiene presencia en las diferentes provincias
del país. Las muestras se analizaron en los laboratorios de AGROCALIDAD, ubicados en
Tumbaco – Cantón Quito, Provincia de Pichincha.
2.3. Población bovina y delimitación del muestreo
La población bovina considerada dentro de la investigación son toretes, toros y vacas, las
mismas que para su análisis se definen como UM (unidades de muestreo). El número de
muestras se determinó en base a la información suministrada por las Coordinaciones de
Sanidad Animal y de Inocuidad de Alimentos y que constan en el “Plan de Muestreo para el
Estudio de Residuos de Medicamentos Veterinarios (Anabólicos) a Nivel Nacional”,
documento paralelo desarrollado para fines de esta investigación (ANEXO 1). Aspectos
relacionados al muestreo en la provincia considerada en este estudio (Manabí) fueron
recabados de dicho documento.
Espinoza Molina 6
Tabla 1. Población bovina y ponderación de la muestra por provincia en base a datos correspondientes al periodo 2014
POBLACIÓN BOVINA DEL ECUADOR EN EL PERIODO 2014
PROVINCIA TORETES TOROS VACAS POBLACIÓN BOVINA TOTAL
PONDERACIÓN POR
PROVINCIA
MATADEROS ACTIVOS
MANABI 124022 26364 327411 477797 18,13% 28
ESMERALDAS 87212 10534 112219 209965 7,97% 8
PICHINCHA 40476 25019 144115 209610 7,95% 14
GUAYAS 38933 10804 117140 166877 6,33% 20
COTOPAXI 38159 27860 78081 144100 5,47% 9
STO. DOMINGO 49004 11974 77452 138430 5,25% 4
CHIMBORAZO 23312 23324 85790 132426 5,02% 4
LOJA 32676 15590 73564 121830 4,62% 16
MORONA SANTIAGO
22787 23800 69186 115773 4,39% 6
AZUAY 18010 18247 75764 112021 4,25% 8
EL ORO 29839 8985 63259 102083 3,87% 19
BOLIVAR 24502 14868 52758 92128 3,50% 4
ZAMORA CHINCHIPE
25263 19619 46414 91296 3,46% 6
CAÑAR 10520 11005 68843 90368 3,43% 3
CARCHI 9569 8995 57943 76507 2,90% 4
TUNGURAHUA 12733 14831 48277 75841 2,88% 7
IMBABURA 19840 15852 28508 64200 2,44% 10
LOS RIOS 16941 3983 40141 61065 2,32% 9
SUCUMBIOS 19436 5253 28730 53419 2,03% 5
NAPO 11003 6666 16547 34216 1,30% 3
ORELLANA 13064 3547 16983 33594 1,27% 2
PASTAZA 6652 5145 11322 23119 0,88% 8
STA. ELENA 1557 634 7134 9325 0,35% 1
TOTAL 675510 312899 164758 1
2635990 100,00% 198
Fuente: Wania Espinoza Adaptado de la Base Sifae y movilización 2014. Coordinación General de Sanidad Animal AGROCALIDAD.
Espinoza Molina 7
Figura 2. Población bovina del Ecuador por provincia, periodo 2014.
Fuente: Wania Espinoza M, Adaptado de la Base Sifae y movilización 2014. Coordinación General de Sanidad Animal AGROCALIDAD
Tabla 2. Ubicación de mataderos de faenamiento bovino a muestrear en la Provincia de Manabí
No. DE
MATADERO
CANTÓN
ESPECIE ANIMAL
CLASE DE BOVINO A
MUESTREAR
% CORRESPONDIENTE AL HATO BOVINO
NACIONAL
1 PORTOVIEJO
BOVINO
TORETES, TOROS Y VACAS
18,13
2 CALCETA
3 MANTA
4 CHONE
5 SANTA ANA
6 TOSAGUA
7 JPIJAPA
8 EL CARMEN
9 CAMPOZANO
10 ROCAFUERTE
Fuente: Wania Espinoza M. Adaptado de la Coordinación General de Inocuidad
AGROCALIDAD.
ESMERALDAS, 8%
Manabí, 18%
PICHINCHA, 8%
NAPO, 1%
ORELLANA, 1%
PASTAZA, 1%
STA. ELENA, 0%
GUAYAS, 6%
LOS RIOS, 2%
SUCUMBIOS, 2%
Otros, 16%
IMBABURA, 2% COTOPAXI, 5%
CARCHI, 3%
TUNGURAHUA, 3%
STO. DOMINGO, 5%
CAÑAR, 3%
CHIMBORAZO, 5%
EL ORO, 4%
BOLIVAR, 3%
ZAMORA CHINCHIPE, 3%
LOJA, 5%
AZUAY, 4% MORONA SANTIAGO, 4%
POBLACIÓN BOVINA DEL ECUADOR PERIODO 2014
Espinoza Molina 8
Las muestras correspondieron a tejido bovino (músculo e hígado). Para la etapa analítica se
aplicaron métodos basados en cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en
tándem (UPLC/MS/MS) y ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) (ver Tabla
3). La última es una técnica de tipo “screening” que permite la detección y la estimación de
concentraciones del clembuterol en muestras de músculo y/o hígado de una manera rápida y
con un menor costo.
Tabla 3. Matrices de tejido bovino y métodos a implementar para la determinación de
clembuterol.
MATRIZ BOVINA
(SUBMUESTRA)
MÉTODO POR APLICAR Cantidad por
muestrear en
campo
(aprox.)
Porción analítica
según el método
(laboratorio)*
SCREENING CONFIRMATORIO
Músculo (pecho) ELISA Ensayo
colorimétrico
competitivo
UPLC/MSMS 500g 1g ELISA
5g UPLC/MS/MS
Hígado ELISA Ensayo
colorimétrico
competitivo
UPLC/MSMS 400g 1g ELISA
5g UPLC-MSMS
Fuente: Wania Espinoza M. Adaptado de CODEX GL 33, Cuadro 3. Carne de res y aves;
descripción de las muestras primarias y tamaño mínimo de las muestras de laboratorio.
Nota: Las cantidades de muestra indicadas para los diferentes métodos se especifican en el
Manual MaxSignal® ELISA clembuterol y CLG-AGON1.01. United States Department of
Agriculture. Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science.
2.4. Consentimiento Institucional.
El Director Ejecutivo de AGROCALIDAD y sus Coordinaciones participantes, una vez
informados sobre la propuesta de la investigación planteada mostraron su consentimiento
para la puesta en marcha de esta como componente importante del Plan de Contaminantes
Pecuarios del proceso de Inocuidad de Alimentos de la institución. (Memorando MAGAP-DSL-
AGROCALIDAD-2014-001919-M, del 03 de octubre de 2014, Memorando MAGAP-DSL-
AGROCALIDAD-2014-001920-M, del 03 de octubre de 2014, (Ver Anexos 2, 3)
2.5. Descripción del trabajo de campo.
Esta investigación se realizó en cuatro fases:
Fase I: Recopilación de información bibliográfica
Fase II: Muestreo y diagnóstico preliminar
Fase III: Plan de muestreo
Fase IV: Implementación metodologías y análisis de muestras
Espinoza Molina 9
2.5.1. Fase I: Recopilación de Información bibliográfica
Para esta fase se recopiló información bibliográfica y bases de datos de la autoridad Sanitaria
Nacional (AGROCALIDAD), donde se consideraron variables de población animal bovino
(toretes, toros y vacas), existente en el país para poder establecer el tamaño de la muestra.
Asimismo, se recopiló información bibliográfica sobre los métodos analíticos para la
determinación del analito en estudio y la normativa legal vigente. Se seleccionaron los
métodos analíticos más apropiados considerando criterios de equipamiento e insumos
disponibles, los límites de cuantificación y detección, y la menor complejidad de los ensayos.
2.5.2. Fase II: Muestreo y diagnóstico preliminar
Se realizó un muestreo preliminar completamente al azar en los mataderos de las provincias
de Tungurahua, Pichincha y Santo Domingo de los Tsáchilas, con la finalidad de determinar
la presencia o ausencia de clembuterol en hígado y músculo bovino y de esta manera
determinar preliminarmente la frecuencia, la misma que permitirá preparar el plan de muestro
final acorde a la problemática local. Para esto se implementó y utilizó el método de ELISA
semicuantitativo.
La cantidad de muestras y de lugares a muestrear estuvieron basados en la cercanía al
laboratorio y a criterios técnicos establecidos en el método de muestreo recomendado por el
CODEX en CAC/GL 33, 1999. Así como en la información de los sistemas de Fiebre Aftosa
de Ecuador (SIFAE), Sistema de Información Geográfica y Agropecuaria (SIGAGRO), matriz
estado de mataderos, matriz frecuencia y días de faena, correspondientes al periodo 2014 de
AGROCALIDAD. Con esta información se desarrolló un plan de muestreo para el estudio de
residuos de medicamentos veterinarios (anabólicos) a nivel nacional.
2.5.3. Fase III: Plan de Muestreo
En la investigación se consideró inicialmente un alcance nacional y se desarrolló un plan de
muestreo para el estudio de residuos de medicamentos veterinarios (en este caso anabólicos)
a nivel país. Se tomó como referencia el método de muestreo recomendado del Codex
Alimentarius CAC/GL 33 (1999), así como también la información de los sistemas SIFAE y
SIGAGRO. Adicionalmente, se consideró la información disponible en AGROCALIDAD sobre
el estado de los mataderos en el país y aspectos relacionados a su funcionamiento (por
ejemplo, frecuencia y días de faena), correspondientes al periodo 2014. Asimismo, se
consideraron los resultados del muestreo y diagnóstico realizado preliminarmente.
Espinoza Molina 10
En este plan de muestreo resultó que Manabí es la provincia con el mayor número de
muestras y, por lo tanto, la más representativa en cantidad del país. De igual manera se realizó
un estudio de costos del estudio y se decidió finalmente establecer el alcance del estudio a
Manabí. Para cumplir con los criterios de representatividad del estudio se realizó el muestreo
en 10 mataderos de la mencionada provincia (Ver Tabla 2).
2.5.3.1. Procedimiento de muestreo
Para fines del muestreo y actividades que se le relacionen se presentan a continuación
algunas definiciones aplicadas en el muestreo.
Población:
La población bovina que fue considerada en la investigación incluyó toretes, toros y vacas,
las mismas que para su tratamiento vienen a ser las unidades o muestras, esto basándonos
en el documento “Plan de Muestreo para el Estudio de Residuos de Medicamentos
Veterinarios (Anabólicos) a Nivel Nacional” desarrollado para fines de esta investigación
(ANEXO 1)
Muestra:
Una o más unidades seleccionadas (animales bovinos) entre una población de unidades, o
una porción de material seleccionada entre una cantidad mayor de material. (Códex
Alimentarius, 1999)
Muestreo:
Procedimiento empleado para extraer y constituir una muestra. Se realizará basada en el
protocolo de toma y envío de muestras del manual de AGROCALIDAD. Este protocolo
especificará la metodología, los instrumentos y demás necesidades para la toma,
conservación y envío de muestras, así también el técnico encargado de realizar el muestreo.
Tamaño de la muestra:
Número de unidades, o cantidad de material, que constituyen la muestra.
Unidad:
La parte discreta más pequeña de un lote que deberá extraerse para formar la totalidad o
parte de una muestra. También se la puede considerar para fines de esta investigación como
submuestra.
Animales grandes o partes u órganos de estos. Una unidad estará formada por una porción,
o la totalidad, de una parte, u órgano determinado. Las partes u órganos podrán cortarse para
formar unidades.
Espinoza Molina 11
En el estudio hace referencia a la porción de un tejido de hígado y músculo a ser extraído.
Unidad de muestreo (UM):
Conjuntos no solapados de la población que cubren la población completa. (Sheaffer,
Mendenhall, & Lyman R., 2007)
En el caso de la investigación haría referencia a los mataderos.
Procedimiento en las UM (matadero):
En cada unidad de muestreo, se debe seleccionar unidades al azar, con una frecuencia de
muestreo según la cantidad de animales existentes en el matadero al momento de la visita.
Las unidades deben marcarse de manera que permitan realizar el seguimiento durante el
proceso de faena hasta la toma de la muestra.
Unidad de Producción Agropecuaria (UPA):
Es una extensión de tierra dedicada total o parcialmente a la producción agropecuaria, la cual
reúne las siguientes características:
Una unidad económica, en el sentido de que desarrolla una actividad económica agropecuaria
bajo una dirección o gerencia única, independientemente de su forma de tenencia y de su
ubicación geográfica; compartiendo los mismos medios de producción en toda su extensión.
Para el caso de estudio aplicado a la presente investigación se definirá a la UPA como el
predio.
2.5.3.2. Toma de muestras y distribución del muestreo:
Se calculó el tamaño de la muestra a analizar a nivel nacional aplicando principalmente los
criterios recomendado por el Codex Alimentarius en CAC/GL 33 (1999). Fue considerado el
total de la población bovina adulta (vacas, toros y toretes) existentes a nivel nacional en el
periodo 2014, esto de acuerdo con los datos de AGROCALIDAD.
El muestreo se contempló en la provincia de Manabí, la misma que con el 18,13% es la
provincia con mayor hato bovino del país y que corresponde a una población total de 477.797
bovinos, considerada para efectos de la investigación.
Se aplicó a la metodología una probabilidad del 99% de detección y un 10% de incidencia de
los residuos no conformes en la UM (derivados del estudio preliminar). Estos parámetros
preestablecidos fueron usados para hacer el cálculo de número total de bovinos a
muestrearse en la provincia de Manabí, aplicando la ecuación 1.
𝑛 = 𝑛0
1+(𝑛0−1)/𝑁 (Ec.1)
Espinoza Molina 12
10 22 29 44
Donde, n es el número mínimo de muestras primarias a tomarse, no es el número de muestras
indicado en la Tabla 4, y N es el número de unidades en el UM que puede constituir una
muestra. Considerando valores de 44 y 477797 para no y N, respectivamente, se obtiene un
número de 44 bovinos a muestrearse. Por supuesto, este número de bovinos debe ser
repartido entre los mataderos más importantes de Manabí con la finalidad de dar un mayor
peso específico a los mataderos con mayor número de sacrificios. Se consideró, además,
colectar un 10% adicional de muestras en previsión a posibles fallos en la logística o análisis;
es decir un total de 48 muestras.
Tabla 4. Mínimo de muestras necesarias para detectar residuos no conformes en un lote.
Número de muestras primarias seleccionadas al azar necesario para una probabilidad determinada de detectar una muestra no conforme por lo menos en un lote de carne de reses y aves, para una incidencia dada de residuos no conformes en el lote.
Incidencia de los residuos no conformes en el lote %
Número mínimo de muestras (no) necesarias para detectar residuos
no conformes con una probabilidad del:
90% 95% 99% 90 1 - 2 80 - 2 3 70 2 3 4 60 3 4 5 50 4 5 7 40 5 6 9 35 6 7 11 30 7 9 13 25 9 11 17 20 11 14 21
15 15 19 29
5 45 59 90 1 231 299 459
0,5 460 598 919
0,1 2302 2995 4603
Fuente: Cuadro N°2. Códex Alimentarius, CAC/GL 33 Métodos de muestreo recomendados para la determinación de residuos de plaguicidas a efectos del cumplimiento de los LMR (1999)
La distribución del muestreo se ha considerado en base a la población total de bovinos adultos
(vacas, toros y toretes) correspondientes al periodo 2014 (ver Tabla 5). Como se mencionó
antes, al total de muestras calculadas a ser recolectadas (44) se adicionó 10% en previsión a
posibles fallos en la logística o análisis.
Tabla 5. Distribución de la muestra en la provincia de Manabí en base al periodo 2014
POBLACION BOVINA
Total unidades
a considerar
Tamaño de la
muestra
10% adicional
por error
posible en
procesamiento
de muestras
Mataderos
activos
Mataderos
para
considerar
en el
muestreo
TORETES TOROS VACAS
124022 26364 327411 477797 44 4 28 10
Fuente: Anexo 1
Espinoza Molina 13
Se escogieron 10 de los 28 mataderos, considerando su representatividad y mayor flujo de
sacrificios mensuales. Asimismo, se consideró su localización geográfica
Para la toma de muestras en varios cantones de la provincia de Manabí, se coordinó con el
personal técnico de AGROCALIDAD, considerando los horarios de faena bovina de los
mataderos. (Ver Tabla 6 y Anexo 4)
Tabla 6. Planificación del muestreo en los mataderos de la provincia de Manabí según horario
de faena bovina.
CANTÓN
PARROQUIA
LUGAR
NÚMERO DE
ANIMALES/ MES
PONDERACIÓN
POR MATADERO
MANABÍ
No. MUESTRAS
POR TOMAR/ CAMAL
HORARIOS DE FAENA
A LA FECHA
BOLIVAR
CALCETA
Camal
Municipal – Calceta
200
4,6%
2
Junín Lunes y Martes 23:00 (3 bovinos)
CHONE
CHONE
Chone - Camal
Municipal de Chone
300
6,9%
3
Lunes a
viernes 22:00
EL CARMEN
EL CARMEN
Camal
Municipal El Carmen
524
12,1%
5
Lunes,
martes, jueves, viernes 14:00
JIPIJAPA
JIPIJAPA
Jipijapa - Camal
Municipal de Jipijapa
250
5,8%
3
Lunes a jueves 2:00
MANTA
SAN JUAN DE
MANTA
San Juan de
Manta - COGAMANTA S.A.
1327
30,6%
13
Lunes a viernes 15:00
PAJAN
CAMPOZANO
Canal
Parroquial de Campozano
130
3,0%
1
Lunes a viernes 2:00 a 5:00
PORTOVIEJO
PORTOVIEJO
Camal Municipal de Portoviejo
1100
25,4%
11
Lunes a sábado 17:00 (30 diarios)
ROCAFUERTE
ROCAFUERTE
Camal Municipal de Rocafuerte
180
4,2%
2
Viernes 8:00 / sábado
16:30
SANTA ANA
SANTA ANA
Camal
Municipal de Santa Ana
135
3,1%
1
Lunes a
Viernes 17:00 (1 res)
TOSAGUA
TOSAGUA
Camal Municipal de Tosagua
190
4,4%
2
Martes a sábado 1:00
TOTAL: 4336 100% 44
2.5.4. Fase IV: Métodos de Análisis en Laboratorio.
Los métodos aplicados para el análisis de clembuterol en las matrices de músculo e hígado
fueron los de ELISA y UPLC/MS/MS
Espinoza Molina 14
2.5.4.1. Procedimiento para el análisis de clembuterol en tejido (músculo e
hígado bovino): Método de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas
(ELISA).
Principio
El método ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima,
de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima
e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno- anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un
substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro (lector de ELISA) Ver
Figura 3.
Figura 3. ELISA competitivo
Fuente: Imagen modificada. Adaptado de DocSlide.documents.tips/Down
load/link/monografia-de-elisa.html
Espinoza Molina 15
Sensibilidad del Método (Límite de Detección)
Para músculo e hígado bovino, el límite de detección reportado en el kit es de 0,10 µg/kg (o
ppb).
Equipos y Materiales
Lector de ELISA Bioo Scientific (filtro primario 450 nm; filtro diferencial 630 nm)
Incubadora
Homogeneizador de tejido
Evaporador de N2 Thermo Scientific TS-18822
Mezclador (vortex) - velocidad variable
Tubos cónicos de 15 ml
Micropipetas de 10, 20, 100 y 1000 µl
Micropipetas multicanal
Placas de micro titulación
Herramientas
Tijeras para cortar carne
Overoles impermeables
Guantes
Pinzas
Reactivos y Estándares
Control negativo 1,8 ml
Soluciones clembuterol HRP Conjugad 7 ml
20X Sample Buffer 10 ml
Solución de lavado 20X 28 ml
Stop Buffer 20 ml
Sustrato TMB 12 ml
10X PBS 25 ml
Equilibrio Buffer I 10 ml
Equilibrio Buffer II (polvo) 62 g
Acetonitrilo
Estándares de clembuterol* 1,8ml
* (0,05 ng/ml, 0,15 ng/ml, 0,50 ng/ml, 1.5 ng/ml, 4,5 ng/ml, 10 ng/ml)
Preparación de soluciones y/o reactivos
Preparación del buffer de extracción de muestra 1X: Combinar 1 volumen del buffer de
extracción de muestra 20X con 19 volúmenes de agua destilada y mezclar bien.
Preparación de la solución PBS 1X: Combinar 1 volumen de la solución PBS 10X con 9
volúmenes de agua destilada y mezclar bien
Espinoza Molina 16
Preparación del Buffer de balanceo de muestra 1X: Agregar 10 ml del Buffer de balanceo de
muestra I y 62 g del Buffer de balanceo de muestra II (polvo) a una botella plástica de 250 ml.
Adicionar 190 ml de agua destilada a la botella, mezclar bien y obtener una solución
homogénea.
Consideraciones para el ensayo
Todos los reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente antes de su uso (1-2 horas a
20-25°C). Las soluciones deben ser preparadas en el momento del ensayo ELISA.
Todos los reactantes deben ser mezclados mediante una suave inversión o movimiento en
remolino antes del uso.
Preparar los volúmenes que serán necesarios para el número de pocillos que serán usados.
No retornar los reactantes a los recipientes originales.
Preparación de la solución de lavado 1X: Combinar 1 volumen de solución de lavado 20X con
19 volúmenes de agua destilada y mezclar bien. Preparar el volumen total de solución de
lavado 1X, pues este buffer es estable por todo el tiempo de vida del kit. Siempre se debe
evitar contaminar el buffer con otros reactivos o puntas de pipeta.
Preparación de la muestra
Asegúrese que las muestras sean almacenadas apropiadamente. En general, las muestras
deben ser refrigeradas entre 2 y -4°C por no más de 1-2 días. El congelamiento a una
temperatura mínima de -20°C es necesario cuando el almacenamiento es por mayores
tiempos. Antes de su uso, las muestras pueden ser descongeladas a temperatura ambiente
(20-25°C) o en el refrigerador.
Procedimiento de extracción
Remover la grasa y las venas del músculo o el hígado. Homogeneizar el músculo o el hígado
hasta lograr una consistencia de puré, esto usando un homogeneizador de tejido.
Pesar 1 g (± 0.05 g) de la muestra homogeneizada en un tubo cónico de 15 ml.
Adicionar 2.0 ml del Buffer de extracción de muestra 1X al tubo. Colocar la tapa al tubo y
agitar manualmente para asegurar que toda la muestra esté sumergida en el buffer.
Incubar la muestra por 20 minutos a 40°C.
Adicionar al tubo cuidadosamente 3.0 ml de acetonitrilo y 2.5 ml del Buffer de balanceo de
muestra 1X. Sólo para muestra de hígado, se adiciona 100 µl del Buffer de extracción de
hígado. Mezclar vigorosamente con ayuda del vortex a máxima velocidad por 3 minutos o
realizar el mezclado con vortex "multitubos" por 10 minutos.
Centrifugar la muestra por 10 minutos a 4000 RCF.
Cuidadosa y lentamente, transferir 1.2 ml (2 porciones de 600 µl) de la capa superior de
acetonitrilo a un nuevo tubo de 15 ml. Si la capa superior de acetonitrilo no es
Espinoza Molina 17
suficientemente clara, se debe asegurar de utilizar la fuerza centrífuga apropiada. Re
centrifugar la muestra por 10 minutos a máxima velocidad.
Usando un evaporador de N2, secar la muestra completamente hasta lograr que solo un
residuo blanco quede en el fondo del tubo. Para facilitar el proceso, colocar el tubo con la
muestra en contacto con calor (50°C) durante el secado. Tener cuidado de evaporar muy
rápido y evitar pérdidas en la aguja o hacia la atmósfera. Iniciar el proceso de evaporación
usando nitrógeno con baja presión.
Adicionar al residuo seco 1.6 ml (± 0,1 ml) de hexano. Tapar el tubo y dar suaves golpes
contra una superficie dura. Agitar con el vortex por 30 segundos.
Adicionar 800 µl de PBS 1X. Agitar con el vortex por 3 minutos.
Centrifugar la muestra por 5 minutos a 4000 RCF.
Descartar la fase superior de hexano o transferir 500 µl o menos de la fase acuosa inferior a
un tubo de 1.5 ml. Evitar transferir cualquier residuo de hexano al nuevo tubo, pues esto puede
resultar en imprecisiones en el ensayo ELISA.
Usar 100 µl de la capa acuosa inferior para el ensayo. El factor de dilución es 2.
Procedimiento del ensayo ELISA
Adicionar 100 µl de cada estándar de clembuterol, por duplicado, en diferentes pocillos.
Adicionar los estándares a la placa solo en el orden de menor concentración a mayor
concentración.
Adicional 100 µl de cada muestra en diferentes pocillos. Realizar un duplicado por lo menos
cada 10 muestras.
Adicionar 50 µl del conjugado clembuterol-HRP a cada pocillo. Mezclar el contenido de la
placa por 1 minuto.
Incubar la placa por 45 minutos a temperatura ambiente (20-25°C).
Eliminar exhaustivamente la solución de los pocillos y descartar el líquido. Lavar la placa 3
veces con 250 µl de solución de lavado 1X. Después del último lavado, invertir la placa y secar
mediante golpecitos sobre pedazos de papel absorbente. El siguiente paso debe realizarse
inmediatamente después del lavado.
Adicionar 100 µl del substrato TMB. Incubar la placa por 15 minutos a temperatura ambiente
(20-25°C). Controlar el tiempo de reacción inmediatamente después de adicionar el substrato.
Mezclar la placa por 1 minuto. No devolver substrato al recipiente original para evitar cualquier
posible contaminación. Si el substrato muestra coloración, es un indicativo de deterioro y debe
ser descartado. Es recomendable cubrir la placa durante la incubación.
Espinoza Molina 18
Después de la incubación, adicionar 100 µl de buffer de parado de reacción para detener la
reacción enzimática.
Leer la placa lo antes posible después de la adición del buffer de parado de reacción. La
lectura se debe realizar con un filtro primario de 450 nm y un filtro diferencial de 630 nm. Antes
de medir, limpiar la parte baja de la placa con un paño libre de pelusa, para asegurar que no
se tengan interferencias de humedad o huellas digitales en las lecturas.
Cálculo de las concentraciones
Se prepara una curva de calibración graficando la absorbancia relativa media (%) de cada
estándar respecto de su concentración en ng/ml en una curva logarítmica, tal como se muestra
en la Figura 4. La absorbancia relativa es el cociente entre la absorbancia del estándar (o la
muestra) y la absorbancia del estándar cero. Para expresar este valor en porcentaje, se
multiplica por 100.
Figura 4. Ejemplo de curva de calibración para la determinación de clembuterol
Fuente: Manual MaxSignal® ELISA Clembuterol
Se usan los valores de absorbancia relativa media de cada muestra para calcular su
correspondiente concentración de Clembuterol expresado en ng/ml, así como también un
complemento en Excel (MaxSignal® ESA AnalysisProgram) para obtener los resultados en
µg/kg.
2.5.4.2. Procedimiento para el análisis de clembuterol en tejido (músculo e
hígado bovino): Método de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de
masas en tándem UPLC/MS/MS
Espinoza Molina 19
Principio
El método cromatográfico UPLC-MS-MS combina las ventajas de la separación de los
compuestos mediante cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC, por sus siglas en
inglés) y la capacidad de detección selectiva y confirmación de la identidad molecular del
espectrómetro de masas.
El método cromatográfico consiste en la separación de los componentes de la solución que
se inyecta al cromatógrafo, mediante diferencias entre las propiedades fisicoquímicas de las
sustancias y la interacción entre la fase móvil (solventes) y la fase estacionaria (materiales
especiales).
El método de detección debe ser capaz de detectar selectivamente la salida de los diferentes
compuestos separados en la columna cromatográfica. Para esto existen diferentes tipos de
detectores, pero uno de los más confiables es el detector en base a espectrometría de masas.
La espectrometría de masas es una técnica analítica que identifica a los compuestos en base
a su relación masa/carga y a la abundancia de los iones generados en el proceso. Para que
se pueda desarrollar esta técnica es necesario que los compuestos constituyentes de una
muestra formen iones (se ionicen) y para eso existen diferentes métodos tales como la
ionización electrónica (EI), química (CI), de electrospray (ESI), química a presión atmosférica
(APCI), fotoionización a presión atmosférica (APPI), ionización multimodo (MMI), por láser
(MALDI), por plasma acoplado inductivamente (ICP).
El modo de ionización utilizado en este trabajo corresponde al de electrospray (ESI), el mismo
que tiene una buena cobertura de polaridad y de pesos moleculares de los analitos, además
de corresponder a una técnica de ionización suave, lo que permite disponer de información
de los iones moleculares, lo que es básico para la identificación y cuantificación.
En ESI el eluyente (solvente y muestra separada) que sale de la columna cromatográfica es
nebulizado a presión atmosférica en presencia de un campo electrostático fuerte y un gas de
secado calentado. Las gotas de eluyente formadas en la nebulización son reducidas de
tamaño por el gas caliente hasta que se genera una explosión de tipo Coulombica. (Ver Figura
5).
Figura 5. Fuente de ionización de electrospray.
Fuente: Guía Agylent: Espectrometría de masas, fundamentos y teoría
Espinoza Molina 20
En una etapa posterior los iones ingresan al analizador de iones, que existen de distintos
tipos, y que en el presente trabajo correspondió a un triple cuadrupolo. En esta configuración
realmente existen dos cuadrupolos en donde se separan los iones por sus diferentes
relaciones masa/carga y entre los dos el tercero corresponde a una celda de colisión en donde
se realiza una segunda generación de iones. (Ver Figura 6).
Figura 6. Monitorización de reacción múltiple.
Fuente: Guía Agylent: Espectrometría de masas, fundamentos y teoría
Finalmente, los iones que han paso por este proceso llegan al detector para ser identificados
por sistemas capaces de detectar partículas cargadas como los multiplicadores de electrones.
Tomando en consideración que los sistemas de espectrometría de masas son complejos, los
mismo vienen asociados a softwares que permiten el completo manejo de estos y el
procesamiento de los datos.
Sensibilidad del Método (Límite de Detección y Cuantificación)
La cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) y la cromatografía gaseosa (GC) son
tradicionalmente los sistemas de elección de los analistas cuando se requieren resultados
sensibles, confiables y con una variabilidad mínima. Los valores del método para el límite de
detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) son 0,125 µg/Kg y 0,25 µg/Kg respectivamente.
Equipos y Materiales
Cromatógrafo líquido de ultra desempeño acoplado a espectrómetro de masas en
tándem. UPLC/MS/MS Waters, modelo Xevo TQ-S.
Equipo de concentración por paso de nitrógeno
Centrífuga Eppendorf 5804R
Mezclador (vortex) - velocidad variable
Balanza - sensibilidad 0.01 g
Balanza analítica - sensibilidad 0.0001 g
Espinoza Molina 21
Agitador horizontal
Molino de cuchillas GRINDOMIX GM200 marca Retsch
Licuadora
Tubos de centrífuga - 50 ml, con tapa
Micropipetas - ajustables, 10 - 5000 µl
Varillas de vidrio - 10 mm de diámetro por 10 cm de largo, redondeadas a ambos
lados
Matraces volumétricos - 1000, 100, 10 y 5 ml, ámbar
Filtro de nylon 0.45 µm
Cajas Petri - desechables de poliestireno
Escalpelos
Guantes resistentes a cortes
Reactivos y Estándares
Metanol - grado HPLC/MS
Acetonitrilo - grado HPLC/MS
Isopropanol - grado HPLC/MS
Cloruro de sodio, NaCl - grado reactivo
Sulfato de sodio, Na2SO4 - anhidro, grado reactivo
Sulfato de magnesio, MgSO4 - anhidro, mínimo 99.5% de pureza
Agua - desionizada, grado HPLC
Ácido fórmico - pureza 98 - 100%.
Carne e hígado libre de drogas.
Estándar clembuterol-HCl 98% pureza, marca Dr. Ehrenstorfer, lote N°41002
Estándar Metoprolol tartrate 99,5% pureza, marca Dr. Ehrenstorfer, lote N°20120
Preparación de soluciones y/o reactivos
Solución "stock" de clembuterol ~25 µg/ml (en metanol):
Pesar ~2.5 mg de clembuterol en un matraz volumétrico ámbar de 100 ml, diluir y enrazar
con metanol. Registrar la masa con 0,1 mg y calcular la concentración exacta. Este
estándar es estable por 2 meses bajo refrigeración a 2 - 8°C.
Solución "stock" de metoprolol 10 µg/ml (en metanol):
Solución intermedia A de clembuterol 250 ng/ml
Solución intermedia B de clembuterol 50 ng/ml (en metanol)
Espinoza Molina 22
Condiciones del Cromatógrafo líquido
Sistema del cromatógrafo líquido: ACUITY UPLC
Tiempo de corrida: 7,0 min
Columna: Acquity UPLC HSS T3, 1,8µm, 2,1 x 100 mm
Temperatura de la columna: 30°C
Temperatura del inyector: 10°C
Volumen del inyector: 5 µl
Tasa de flujo: 0,4 mL / min
Fase móvil:
A1: 0,1% (v/v) Solución acuosa de ácido fórmico
B1: 0,1% (v/v) Acetonitrilo
Condiciones del espectrómetro de masas
Sistema Masas: Xevo TQ-S MS
Modo de ionización: ESI+
Voltaje de la capilaridad: 3.5 kv
Voltaje del cono: 30 V
Temperatura de la fuente: 150 °C
Temperatura de Desolvatación : 550 °C
Gas de desolvatación: 900 L/H
Flujo del gas de colisión: 0,19 mL/min
Preparación de la muestra
Los residuos de clembuterol se extraen de las muestras de músculo e hígado con una mezcla
de acetonitrilo e isopropanol. Las sales cloruro de sodio, sulfato de sodio y sulfato de
magnesio son usados para precipitar las proteínas y deshidratar la solución. Este extracto es
evaporado, reconstituido en agua, filtrado y analizado por UPLC/MS/MS.
Procedimiento del ensayo UPLC/MS/MS
Extracción de muestras de hígado y músculo:
Pesar 5 +/- 0,1 mg de hígado o músculo en un tubo de centrífuga desechable de 50ml.
Incluido el control positivo y negativo.
Espinoza Molina 23
Adicionar 4ml de acetonitrilo y 1ml de isopropanol. Para el hígado y músculo congelado
tapar y agitar en el vortex por 2 minutos. Para músculo homogenizado sin congelar, agitar
en el vortex por 30 segundos.
Añadir 1,2 g de NaCl y agitar por 2 minutos
Añadir 4g Na2SO4 y 0,5g de MgSO4. Agitar por 2 minutos.
Nota: este es un punto de parada adecuado. La muestra puede ser almacenada durante la
noche a 2-8 °C
Centrifugar las muestras alrededor de 5 minutos
Filtrar el extracto:
usando una jeringa de 3ml y un filtro de nylon de 0,45 µm
Pipetear 1ml de extracto en un tubo de 12x75 mm
Evaporar a sequedad con nitrógeno
Añadir 0,8 ml de agua destilada tipo I, en el tubo y vortex por 30 segundos y filtrar
usando la jeringa de 3ml y el filtro de nylon.
Proceder con el seteo de masas y lectura en el equipo.
Fuente: Método United States Department of Agriculture. (07 de 02 de 2012).
Seteo de masas en el equipo UPLC/MS/MS
Para el seteo de masas (identificación de Ion molecular y productos iónicos que caracterizan
el analito); se hace uso del software Intelligent Star del equipo, el mismo que permite la
identificación del compuesto de interés (ion molecular) y al menos dos productos iónicos
(iones provenientes del fraccionamiento de la masa del compuesto) mediante un proceso de
infusión directa al detector de una solución estándar de clembuterol, de manera que el sistema
realiza una aplicación automática de parámetros electrónicos para caracterizar el analito. El
detalle de los parámetros se expone en la Tabla 7.
Espinoza Molina 24
Tabla 7. Seteo de las masas de clembuterol
Nombre del
Compuesto
Fórmula
Ion
precursor
(m/z)
Hijos
(m/z)
Dwell (s)
Cono
Voltaje
Energía
Colisión
(Ev)
Clembuterol
C12H18N2Cl2O
277,11
131,96 0,025 24 28
167,88 0,025 24 28
Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD.
Una vez seteada la masa del clembuterol el equipo está listo para analizar las muestras de
hígado y músculo. Las condiciones aplicadas para la separación cromatográfica del
Clembuterol (temperatura, tiempo, gradiente de solventes, flujo, curva), se realiza en modo
de gradiente de acuerdo con lo indicado en la Tabla 8.
Tabla 8. Gradiente de solventes aplicado en el método cromatográfico.
Tiempo (min) Flujo (mL/min) A1% B1% Curva
Inicial 0,4 95 5 Inicial
1,2 0,4 95 5 1
2,5 0,4 59 41 6
3,5 0,4 59 41 1
3,7 0,4 0 100 6
4,8 0,4 0 100 1
5 0,4 95 5 6
Fase móvil A. 0,1% (v/v) Solución acuosa de ácido fórmico
Fase móvil B. 0,1% (v/v) Ácido fórmico en acetonitrilo
Fuente: Yiping Re & Jinchuan Yang; Waters Corporation.
Curva de Calibración y Cálculos
La cuantificación de una sustancia mediante un método cromatográfico involucra el desarrollo
de una curva de calibración, la misma que es construida relacionando la concentración de
diferentes soluciones estándares de clembuterol, con la respuesta que genera el
espectrómetro de masas al detector al ion molecular y iones hijos de la molécula de
clembuterol.
En este método se utilizaron soluciones estándar de clembuterol de 0,125; 0,25; 0,50; 1,0;
2,0; 4,0; y 8, 0 ug/L de clembuterol. Para la generación de la respuesta instrumental se
monitorearon los iones 277,11 m/z, 131,96 m/z y 167,88 m/z.
Espinoza Molina 25
Los cálculos se realizan utilizando la curva que mejor relaciona a los valores de concentración
con la respuesta instrumental (ver Figura X). El coeficiente de correlación obtenido en la curva
de calibración de 0,9944 indica una correlación adecuada en el rango en el que se evaluaron
las muestras (0,125 a 8,0 ug/L).
Espinoza Molina 26
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
El muestreo realizado en los mataderos de la provincia de Manabí permitió la recolección de
muestras de 48 animales (unidades), es decir, 48 submuestras de hígado y 48 submuestras
de músculo (96 en total). El análisis de las submuestras de hígado y músculo mediante el
método de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y el método basado en
cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC/MS/MS)
permitió la detección y la estimación de concentraciones del clembuterol en dichas muestras
de manera semicuantitativo para el método de barrido ELISA y de manera cuantitativa para
la determinación con el método UPLC/MS/MS.
Las submuestras de hígado y músculo fueron obtenidas en 10 mataderos en la provincia de
Manabí. Estos mataderos, de acuerdo con los datos proporcionados por AGROCALIDAD para
el año 2014, tienen el mayor número animales faenados en la provincia. Es importante
recordar que la provincia de Manabí representa el 18,13% de la producción bovina de la
República del Ecuador.
3.1. Resultados obtenidos con el Método ELISA
A continuación, se resumen los resultados obtenidos tras la aplicación del protocolo de
análisis con el método ELISA.
3.1.1. Resultados de submuestras de músculo bovino con Método ELISA
El análisis de los estándares de clembuterol aplicando el protocolo del método ELISA arrojó
los resultados presentados en la Tabla 9:
Tabla 9. Resultados de soluciones estándar de clembuterol para análisis de muestras de
Músculo - Método ELISA
STD. NO.
STD CLEMBUTEROL (ppb)
LN Conc.
OD 450-1
(Absorbancia)
B/B0*
(Absorbanci
a Relativa)
Std1 0,000 2,736 1,000
Std2 0,050 -2,996 2,379 0,870
Std3 0,150 -1,897 1,746 0,638
Std4 0,500 -0,693 1,328 0,485
Std5 1,500 0,405 0,644 0,235
Std6 4,500 1,504 0,293 0,107
Nota: *B/B0 = absorbancia del estándar (o de la muestra) / absorbancia del estándar cero.
Fuente: Step 5: STANDARDS CONCENTRATION VALUES, BIOO MaxSignal® ELISA
Analysis Program in Excel (with BIOO Specified Standards)
Espinoza Molina 27
En función de los resultados obtenidos, se procedió a realizar la regresión logarítmica de los
datos obtenidos (Ver Figura 7):
Figura 7. Curva de calibración Método ELISA submuestras de músculo bovino
Fuente: Wania Espinoza
La Tabla 10 resume los resultados de la lectura de las submuestras de músculo bovino a
través del Método ELISA.
Tabla 10. Resultados de clembuterol en submuestras de músculo Método ELISA
No.
Individuo
No.
MUESTRA
OD-1
(Absorbancia)
B/B0
(Absorbancia
Relativa)
Resultados Muestras
(ppb Clembuterol ug/kg)
1 151865 1,418 0,578 0,422
2 151871 1,477 0,540 0,626
3 151877 1,363 0,498 0,799
4 151880 1,419 0,519 0,709
5 151883 1,248 0,456 1,022
6 151892 1,413 0,516 0,718
7 151895 1,423 0,520 0,703
8 151904 1,558 0,569 0,526
9 151907 1,409 0,515 0,724
10 151910 2,096 0,766 0,166
11 151913 1,514 0,553 0,578
12 151916 1,358 0,496 0,808
Concentración Clembuterol (ppb)
10,000 1,000 0,100
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0,010
y = -0,17ln(x) + 0,3418 R² = 0,9906
90%
80%
CURVA DE CALIBRACION DETERMINACION CLEMBUTEROL EN MUSCULO- METODO ELISA
100% A
bsorb
ancia
Rela
tiva *100
Espinoza Molina 28
No.
Individuo
No.
MUESTRA
OD-1
(Absorbancia)
B/B0
(Absorbancia
Relativa)
Resultados Muestras
(ppb Clembuterol ug/kg)
13 151919 1,627 0,595 0,454
14 151922 1,437 0,525 0,682
15 151925 1,446 0,529 0,669
16 151928 1,530 0,559 0,559
17 151931 1,490 0,545 0,609
18 151934 1,467 0,536 0,639
19 151937 1,603 0,586 0,478
20 151940 1,560 0,570 0,524
21 151943 1,568 0,573 0,515
22 151946 1,338 0,489 0,843
23 151949 1,998 0,730 0,205
24 151952 1,635 0,598 0,446
25 151955 1,639 0,599 0,442
26 151958 1,464 0,535 0,643
27 151967 0,862 0,315 2,339
28 151970 1,727 0,631 0,366
29 151973 1,332 0,487 0,854
30 151976 1,590 0,581 0,491
31 151979 1,155 0,422 1,248
32 151982 2,087 0,763 0,169
33 151985 1,603 0,586 0,478
34 151988 1,489 0,544 0,610
35 151991 1,449 0,530 0,664
36 151994 1,526 0,558 0,563
37 151997 1,657 0,606 0,425
38 152000 1,49 0,545 0,609
39 152003 1,56 0,570 0,524
40 152006 1,578 0,577 0,504
41 152009 1,222 0,447 1,081
42 152012 1,544 0,564 0,542
43 152015 1,725 0,630 0,368
44 152024 1,695 0,620 0,392
45 152027 1,769 0,647 0,335
46 152030 0,947 0,472 0,000
47 152033 1,013 0,505 0,000
48 152036 1,000 0,498 0,000
En la Figura 8 se muestran los resultados de las submuestras de músculo bovino en
relación con la curva de calibración calculada para los estándares de clembuterol.
Espinoza Molina 29
Figura 8. Resultados de submuestras de músculo bovino con Método ELISA
Fuente: Wania Espinoza
3.1.2. Resultados de submuestras de hígado bovino con método ELISA
El análisis de los estándares de clembuterol para las submuestras de hígado, aplicando el
protocolo del método ELISA arrojó los resultados presentados en la Tabla 11.
Tabla 11. Resultados de clembuterol en submuestras de hígado Método ELISA
STD. NO.
STD
CLEMBUTEROL
(ppb)
LN Conc.
OD 450-1
(Absorbancia)
B/B0*
(Absorbancia
Relativa)
Std1 0,000 2,007 1,000
Std2 0,050 -2,996 0,503 0,251
Std3 0,150 -1,897 -0,298 -0,148
Std4 0,500 -0,690 -0,793 -0,395
Std5 1,500 0,410 -1,336 -0,666
Std6 4,500 1,500 -1,738 -0,866
Nota: *B/B0 = absorbancia del estándar (o de la muestra) / absorbancia del estándar cero.
Logarítmica (STD. NO.) ELISA MUSCULO STD. NO.
Concentración clembuterol (ppb)
10,00 1,00 0,10
0%
0,01
4,50
10%
1,50
50%
40% 0,50
30%
20%
0,15
70%
60%
y = -0,17ln(x) + 0,3418 R² = 0,9906 0,05
100%
90%
80%
RESULTADOS CLEMBUTEROL EN MUSCULO- METODO ELISA
Absorb
ancia
Rela
tiva *
100
Espinoza Molina 30
En función de los resultados obtenidos, se procedió a realizar la regresión logarítmica de los
datos obtenidos para los estándares (Ver Figura 9):
Figura 9. Curva de calibración Método ELISA submuestras de hígado bovino
Fuente: Wania Espinoza
La Tabla 12 resume los resultados de la lectura de las submuestras de hígado bovino a
través del Método ELISA.
Tabla 12. Resultados de clembuterol en submuestras de hígado Método ELISA
No.
Individuo
No.
MUESTRA
OD-1
(Absorbancia)
B/B0
(Absorbancia
Relativa)
Resultados Muestras
(ppb Clembuterol)
1 151864 0,205 0,102 0,141
2 151870 0,622 0,310 0,000
3 151876 0,625 0,311 0,000
4 151879 0,718 0,358 0,000
5 151882 0,905 0,451 0,000
6 151891 0,355 0,177 0,103
7 151894 0,636 0,317 0,000
8 151903 0,750 0,374 0,000
9 151906 0,836 0,417 0,000
10 151909 0,625 0,311 0,000
11 151912 0,720 0,359 0,000
Concentración de Clembuterol (ppb)
10,000 1,000 0,100 0,010
y = -0,243ln(x) - 0,5438 R² = 0,985
80%
60%
40%
20%
0%
-20%
-40%
-60%
-80%
-100%
CURVA DE CALIBRACION DETERMINACION CLEMBUTEROL EN HIGADO- METODO ELISA
100%
Absorb
ancia
Rela
tiva *
100
Espinoza Molina 31
12 151915 0,713 0,355 0,000
13 151918 1,017 0,507 0,000
14 151921 0,629 0,313 0,000
15 151924 0,694 0,346 0,000
16 151927 0,800 0,399 0,000
17 151930 -1,459 -0,727 4,248
18 151933 0,510 0,254 0,000
19 151936 0,726 0,362 0,000
20 151939 0,727 0,362 0,000
21 151942 0,154 0,077 0,156
22 151945 0,730 0,364 0,000
23 151948 0,747 0,372 0,000
24 151951 0,971 0,484 0,000
25 151954 0,922 0,459 0,000
26 151957 1,039 0,518 0,000
27 151966 0,770 0,384 0,000
28 151969 0,938 0,467 0,000
29 151972 1,034 0,515 0,000
30 151975 0,931 0,464 0,000
31 151978 0,567 0,283 0,000
32 151981 0,938 0,467 0,000
33 151984 0,487 0,243 0,079
34 151987 0,908 0,452 0,000
35 151990 0,940 0,468 0,000
36 151993 0,339 0,169 0,107
37 151996 0,155 0,077 0,156
38 151999 0,214 0,107 0,138
39 152002 0,710 0,354 0,000
40 152005 0,501 0,250 0,077
41 152008 0,988 0,492 0,000
42 152011 0,981 0,489 0,000
43 152014 0,583 0,290 0,000
44 152023 0,875 0,436 0,000
45 152026 -1,589 -0,792 5,544
46 152029 0,753 0,375 0,000
47 152032 0,672 0,335 0,000
48 152035 0,454 0,226 0,085
Fuente: Coordinación General de Laboratorios - AGROCALIDAD
En la Figura 10 se muestran los resultados de las submuestras de hígado bovino en relación
con la curva de calibración calculada para los estándares de clembuterol.
Espinoza Molina 32
Figura 10. Resultado de submuestras de hígado bovino con Método ELISA
Fuente: Wania Espinoza.
En la Figura 11, podemos observar los resultados de las submuestras de músculo con el
Método de ELISA, en base al programa MaxSignal® ELISA Clembuterol Analysis Program
in Excel.
Logarítmica (STD) ELISA HIGADO STD
Concentración de Clembuterol (ppb) -100%
1,500
-60%
-80%
0,500
-40%
0,150
100,000 10,000 1,000 0,100
0%
0,010
-20%
0,050
60%
40%
20%
y = -0,243ln(x) - 0,5438 R² = 0,985
100%
80%
Resultados Submuestras Higado Método ELISA
Absorb
ancia
Rela
tiva *
100
Espinoza Molina 33
Figura 11. Resultado de la lectura de submuestras de músculo con Método ELISA
Fuente: MaxSignal® ELISA Clembuterol Analysis Program in Excel
Espinoza Molina 34
3.2. Resultados Cuantitativos obtenidos con el Método UPLC/MS/MS
El protocolo del Método UPLC/MS/MS fue aplicado para la lectura de 48 submuestras de
hígado y 48 submuestras de músculo bovino, para la cuantificación se obtuvieron los
cromatogramas TIC para las soluciones estándar (ver Figura 12) y se generó la curva de
calibración mostrado en las Figura 13. Los resultados de la cuantificación de clembuterol en
las muestras se resumen en la Tabla 13. Los Resultados de las submuestras de músculo en
el espectrómetro de masas se puede observar en la Figura 14.
Figura 12. Cromatograma TIC de la solución estándar de clembuterol de 2.0 ug/L
Agonistas 004 2015 009 Smooth(SG,2x1)
Std 2.00 ug/L Std 2.00 ug/L
100
Clenbuterol
F2:MRM of 2 channels,ES+
277.11 > 131.96
3.274e+005
%
0 min
Agonistas 004 2015 009 Smooth(SG,2x1)
Std 2.00 ug/L Std 2.00 ug/L
100
Clenbuterol
F2: MRM of 2 channels, ES+
277.11 > 167.88
1.772e+005
%
0
0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70
min
Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD
Similares gráficos se obtuvieron para las soluciones estándar de las demás concentraciones
Espinoza Molina 35
Figura 13. Curva de Calibración determinación de Clembuterol en el rango de 0,125 a 8.0
ug/L por UPLC-MS-MS
Compound name: Clenbuterol
Correlation coefficient: r = 0.999432, r^2 = 0.998865
Calibration curve: 3416.52 * x + 3980.48
Response type: External Std, Area
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans : None
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD
Tabla 13. Resultados clembuterol en submuestras de hígado y músculo bovinos_Método
UPLC/MS/MS.
Conc
No.
Individuo
CÓDIGO
SUBMUESTRA
HÍGADO
RESULTADO
SUBMUESTRA
HÍGADO
clembuterol (μg/kg)
LOD: 0,125 ug/Kg
LOQ: 0,250 ug/Kg
CÓDIGO
SUBMUESTRA
MÚSCULO
RESULTADO
SUBMUESTRA
MÚSCULO
clembuterol (μg/kg)
LOD: 0,125 ug/Kg
LOQ: 0,250 ug/Kg
1 151864 0,680 151865 0,310
2 151870 0,650 151871 0,440
3 151876 < LOQ 151877 0,810
4 151879 < LOQ 151880 0,690
5 151882 < LOQ 151883 0,640
6 151891 0,270 151892 0,370
7 151894 0,400 151895 0,790
8 151903 < LOD 151904 0,530
9 151906 < LOD 151907 0,530
10 151909 0,560 151910 0,370
Res
pons
e
Espinoza Molina 36
No.
Individuo
CÓDIGO
SUBMUESTRA
HÍGADO
RESULTADO
SUBMUESTRA
HÍGADO
clembuterol (μg/kg)
LOD: 0,125 ug/Kg
LOQ: 0,250 ug/Kg
CÓDIGO
SUBMUESTRA
MÚSCULO
RESULTADO
SUBMUESTRA
MÚSCULO
clembuterol (μg/kg)
LOD: 0,125 ug/Kg
LOQ: 0,250 ug/Kg
11 151912 0,420 151913 0,670
12 151915 < LOD 151916 0,550
13 151918 < LOD 151919 0,760
14 151921 0,290 151922 0,680
15 151924 < LOD 151925 0,670
16 151927 0,260 151928 0,350
17 151930 < LOQ 151931 0,640
18 151933 < LOD 151934 0,680
19 151936 < LOD 151937 0,840
20 151939 < LOD 151940 0,600
21 151942 < LOD 151943 0,580
22 151945 < LOD 151946 0,660
23 151948 < LOD 151949 0,610
24 151951 0,330 151952 0,640
25 151954 < LOQ 151955 0,640
26 151957 < LOD 151958 0,400
27 151966 < LOQ 151967 < LOD
28 151969 < LOD 151970 < LOD
29 151972 < LOD 151973 < LOD
30 151975 < LOD 151976 < LOD
31 151978 < LOD 151979 0,570
32 151981 < LOD 151982 0,290
33 151984 < LOD 151985 < LOD
34 151987 < LOD 151988 < LOD
35 151990 < LOD 151991 0,250
36 151993 < LOD 151994 0,600
37 151996 < LOD 151997 < LOD
38 151999 < LOD 152000 < LOD
39 152002 < LOD 152003 < LOD
40 152005 < LOD 152006 0,820
41 152008 < LOD 152009 < LOD
42 152011 < LOD 152012 0,570
43 152014 < LOD 152015 0,590
44 152023 < LOD 152024 0,600
45 152026 < LOD 152027 0,700
46 152029 < LOD 152030 0,250
47 152032 < LOD 152033 0,500
48 152035 < LOD 152036 0,450
Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD.
Espinoza Molina 37
Figura 14. Resultado de la lectura de submuestra de músculo en espectrómetro de masas
método UPLC/MS/MS
Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD
3.3. Comportamiento estadístico de los resultados
3.3.1. Distribución de los datos
Los datos cuantitativos descritos en las Tablas 12 y 13 han sido analizados de manera que
se pueda observar su distribución mediante Histograma de Frecuencias. Para el análisis se
ha utilizado el programa Minitab ® 17.1.0.
La Figura 15 presenta los resultados obtenidos del análisis de hígado con el Método ELISA.
La distribución observada presenta dos individuos con resultados aislados en relación con el
universo de muestras.
En la Figura 16 se observa la distribución de la frecuencia de resultados analizados en hígado
mediante el Método UPLC/MS/MS. Se han graficado 9 de los 48 individuos debido a que los
resultados del método han presentado dentro de la zona gris generada por la sensibilidad del
mismo, es decir por debajo del límite de cuantificación (<LOQ; 0,250
µg/Kg) o por debajo del límite de detección (<LOD; 0,125 µg/Kg). Estos datos, mismos que
son propios de las condiciones trabajadas en el equipo, no pueden ser asumidos de manera
cuantitativa por lo que el programa los descarta en el análisis estadístico.
Espinoza Molina 38
Figura 15. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de hígado con Método
ELISA
Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.
Figura 16. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de hígado con Método
UPLC/MS/MS
Media 0,2582
Desv.Est.
0,9857
Histograma de Frecuencia de Resultados Hígado-Método
ELISA Nor
mal
Histograma de Frecuencia de Resultados Hígado-Método
UPLC/MS/MS
Normal Media 0,4289
H-UPLC Fre
cue
nci
a
Fre
cue
nci
a
Espinoza Molina 39
Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.
La Figura 17 presenta los resultados obtenidos del análisis de músculo con el Método ELISA.
La distribución observada presenta un individuo con resultado aislado en relación con el
universo de muestras.
En la Figura 18 se observa la distribución de la frecuencia de resultados analizados en
músculo mediante el Método UPLC/MS/MS. Se presentan 38 de los 48 individuos, debido a
que los resultados del método presentaron resultados dentro de la zona gris generada por la
sensibilidad del mismo, correspondientes a valores menores que el LOD y LOQ de 0,125
µg/Kg y 0,250 µg/Kg, respectivamente. Estos datos, mismos que son propios de las
condiciones del método instrumental, no pueden ser asumidos de manera cuantitativa por lo
que se los descarta en el análisis estadístico.
Figura 17. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de músculo con Método
ELISA
Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.
Histograma de Frecuencia de Resultados en Músculo - Método ELISA Normal
Media
Desv.Est. 0,3637
N 48
M-ELISA
Fre
cue
nci
a
Espinoza Molina 40
Figura 18. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de músculo con Método UPLC/MS/MS
Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.
3.3.2. Comparación mediante t de student para muestras emparejadas
Para el análisis de la prueba t de student para muestras relacionadas se ha aplicado el análisis
a través de Microsoft Excel y a través de Minitab ® 17.1.0
3.3.2.1. Prueba t student para muestras emparejadas en Microsoft Excel,
resultados de análisis de hígado
La Tabla 14 muestra los resultados obtenidos en Microsoft Excel mediante el complemento
herramientas para análisis de datos, aplicado a los resultados del análisis de muestras de
hígado bovino con el método ELISA y UPLC/MS/MS.
M-UPLC
38
Histograma de Frecuencia de Resultados en Músculo - Método UPLC/MS/MS
Normal
Media 0,5695
Fre
cue
nci
a
Espinoza Molina 41
Tabla 14. Prueba t para medias de dos muestras emparejadas, resultados de análisis de hígado
ELISA UPLC/MS/MS
Media 0,0669 0,4289
Varianza 0,0012 0,0266
Observaciones 9 9
Coeficiente de correlación de Pearson 0,4403
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 8
Estadístico t -7,1815
P(T<=t) una cola 4,7071E-05
Valor crítico de t (una cola) 1,8595
P(T<=t) dos colas 9,4142E-05
Valor crítico de t (dos colas) 2,3060
3.3.2.2. Prueba t student para muestras emparejadas en Minitab, resultados
de análisis de Hígado
El Asistente de Minitab utiliza el método de Welch, que no presupone ni requiere que las dos
muestras tengan varianzas iguales. Según indica el programa, existen estudios de que la
prueba se desarrolla adecuadamente con varianzas desiguales, incluso cuando los tamaños
de las muestras no son iguales.
Las Figuras 19 y 20 presentan el diagnóstico preliminar del programa y el análisis de t respecto
a la distribución de los datos. Se resaltan los datos atípicos que se presentan fuera de los
rangos de la media de las muestras. Así también presenta la probabilidad de detectar una
diferencia de los resultados de una misma muestra analizada con los diferentes métodos.
Espinoza Molina 42
Figura 19. Diagnóstico de resultados y valores atípicos en el análisis de hígado con Método
ELISA y UPLC/MS/MS
Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.
En el caso del método ELISA se observan picos en los resultados del individuo 17 y 45
respectivamente. Se estableció por este método que las medias de los métodos no son
significativamente diferentes. Esto podría deberse a que el tamaño de la muestra
UPLC/MS/MS es demasiado pequeño (9 individuos) debido a los resultados no cuantitativos
que recaen en la zona gris del método
Espinoza Molina 43
Figura 20. Prueba t de dos muestras relacionadas para resultados de análisis de hígado
con Método ELISA y UPLC/MS/MS
Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.
De acuerdo con los tamaños de las muestras, las desviaciones estándares y α, existe una
probabilidad de 90% de detectar una diferencia de 0,50258. Debido a que el tamaño de la
muestra de hígado UPLC/MS/MS es menor que 15, la normalidad puede ser un problema. Si
los datos no están distribuidos normalmente, el valor p puede ser inexacto con muestras
pequeñas. Dado que la normalidad no se puede verificar de forma confiable con muestras
pequeñas, esta prueba comparativa se descarta.
3.3.2.3. Prueba t student para muestras emparejadas en Microsoft Excel,
resultados de análisis de Músculo
La Tabla 15 muestra los resultados obtenidos en Microsoft Excel mediante el complemento
herramientas para análisis de datos, aplicado a los resultados del análisis de muestras de
músculo bovino con el método ELISA y UPLC/MS/MS.
Espinoza Molina 44
Tabla 15. Prueba t para medias de dos muestras emparejadas, resultados de análisis de Músculo.
ELISA UPLC/MS/MS
Media 0,5765 0,584
Varianza 0,0498 0,0236
Observaciones 35 35
Coeficiente de correlación de Pearson 0,19156
Diferencia hipotética de las medias 0
Grados de libertad 34
Estadístico t -0,1798
P(T<=t) una cola 0,4292
Valor crítico de t (una cola) 1,6909
P(T<=t) dos colas 0,8584
Valor crítico de t (dos colas) 2,0322
Espinoza Molina 45
3.3.2.4. Prueba t student para muestras emparejadas en Minitab, resultados
de análisis de Músculo
El Asistente de Minitab utiliza el método de Welch, que no presupone ni requiere que las dos
muestras tengan varianzas iguales. Según indica el programa, existen estudios de que la
prueba se desarrolla adecuadamente con varianzas desiguales, incluso cuando los tamaños
de las muestras no son iguales.
Las Figuras 21 y 22 presentan el diagnóstico preliminar del programa y el análisis de t respecto
a la distribución de los datos. Se resaltan los datos atípicos que se presentan fuera de los
rangos de la media de las muestras. Así también presenta la probabilidad de detectar una
diferencia de los resultados de una misma muestra analizada con los dos métodos.
El análisis con la prueba t determinó que las medias obtenidas en los métodos no son
diferentes. Se determinó que existe un 90% de probabilidad de encontrar una diferencia de
hasta 0,1923 entre los métodos. Se observa que el método UPLC/MS/MS presenta diez casos
dentro de la zona gris en la que no se puede determinar su valor cuantitativo.
Figura 21. Diagnóstico de resultados y valores atípicos en el análisis de Músculo con Método ELISA y UPLC/MS/MS
Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.
Espinoza Molina 46
Figura 22. Prueba t de dos muestras relacionadas para resultados de análisis de hígado
con Método ELISA y UPLC/MS/MS
Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.
3.4. Análisis cualitativos de los Métodos ELISA y UPLC/MS/MS en relación a la
normativa vigente.
En función de los resultados cuantitativos se procedió a comparar con los límites máximos de
residuos veterinarios (LMRV) permitidos en tejidos de músculo e hígado bovinos, establecidos
en normativas internacionales (Ver Tabla 16).
Tabla 16. Límites Máximos de Residuos Veterinarios en matriz músculo e hígado bovino establecido en normativas internacionales.
NORMA DE REFERENCIA LMRV
MATRIZ MÚSCULO
LMRV
MATRIZ HÍGADO
CODEX CAC – 2014 0,2 µg/kg 0,6 µg/kg
COUNCIL REGULATION
(EEC) N°2377/90 0,1 µg/kg 0,5 µg/kg
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (29 Abril 1996) Ausencia Ausencia
Espinoza Molina 47
Acorde a la sensibilidad de los métodos aplicados se determinó el cumplimiento e
incumplimiento de las muestras en relación a dichas normativas, en función de los LMRV y
los límites de detección y cuantificación (LOD y LOQ respectivamente).
Las Tablas 17, 18, 19 y 20, presentan los resultados cualitativos obtenidos por cada individuo
y el criterio de rechazo por presencia de clembuterol en la muestra analizada, conforme la
aplicación y sensibilidad de los métodos de ELISA y UPLC/MS/MS, comparados con los
límites máximos de residuos veterinarios LMRV permitidos en tejidos de músculo e hígado
bovinos.
En la Tablas 21 y 22 se resume la correlación entre los resultados obtenidos mediante los
métodos de ELISA y UPLC/MS/MS, comparados con los límites máximos de residuos
veterinarios LMRV.
Espinoza Molina 48
Tabla 17. Tabulación de resultados de análisis en muestras de músculo, según método ELISA y UPLC/MS/MS
No.
Individuo
CODIGO
SUBMUESTRA
MÚSCULO
CODEX CAC -
2014 (MÚSCULO)
LMRV=0,2 µg/kg
– ELISA
COUNCIL
REGULATION
(EEC) N°2377/90,
(MÚSCULO)
LMRV=0,1 μg/kg -
ELISA
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (1996)
PROHIBIDO PRESENCIA
de β- AGONISTAS μg/kg
(MÚSCULO) - ELISA
CODEX CAC -
2014
(MÚSCULO)
LMRV=0,2 µg/kg
UPLC/MS/MS
COUNCIL
REGULATION
(EEC) N°2377/90,
(MUSCULO)
LMRV=0,1 μg/kg -
UPLC/MS/MS
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (1996)
PROHIBIDO PRESENCIA
de β- AGONISTAS μg/kg
(MÚSCULO) -
UPLC/MS/MS
1 151865 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
2 151871 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
3 151877 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
4 151880 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
5 151883 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
6 151892 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
7 151895 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
8 151904 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
9 151907 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
10 151910 NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
11 151913 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
12 151916 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
13 151919 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
14 151922 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
15 151925 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
16 151928 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
17 151931 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
18 151934 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
19 151937 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
20 151940 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
21 151943 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
22 151946 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
Espinoza Molina 49
No.
Individuo
CODIGO
SUBMUESTRA
MÚSCULO
CODEX CAC -
2014 (MÚSCULO)
LMRV=0,2 µg/kg
– ELISA
COUNCIL
REGULATION
(EEC) N°2377/90,
(MÚSCULO)
LMRV=0,1 μg/kg -
ELISA
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (1996)
PROHIBIDO PRESENCIA
de β- AGONISTAS μg/kg
(MÚSCULO) - ELISA
CODEX CAC -
2014
(MÚSCULO)
LMRV=0,2 µg/kg
UPLC/MS/MS
COUNCIL
REGULATION
(EEC) N°2377/90,
(MUSCULO)
LMRV=0,1 μg/kg -
UPLC/MS/MS
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (1996)
PROHIBIDO PRESENCIA
de β- AGONISTAS μg/kg
(MÚSCULO) -
UPLC/MS/MS
23 151949 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
24 151952 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
25 151955 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
26 151958 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
27 151967 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
28 151970 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
29 151973 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
30 151976 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
31 151979 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
32 151982 NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
33 151985 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
34 151988 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
35 151991 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
36 151994 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
37 151997 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
38 152000 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
39 152003 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
40 152006 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
41 152009 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND
42 152012 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
43 152015 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
44 152024 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
45 152027 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
46 152030 NEGATIVO NEGATIVO ND POSITIVO POSITIVO POSITIVO
47 152033 NEGATIVO NEGATIVO ND POSITIVO POSITIVO POSITIVO
48 152036 NEGATIVO NEGATIVO ND POSITIVO POSITIVO POSITIVO
Espinoza Molina 50
Tabla 18. Resumen del análisis en muestras de músculo, según método ELISA y UPLC/MS/MS, con relación a la normativa legal
RESULTADOS
CODEX CAC -
2014
(MÚSCULO)
LMRV=0,2
µg/kg –
ELISA
COUNCIL
REGULATION
(EEC)
N°2377/90,
(MÚSCULO)
LMRV=0,1
μg/kg - ELISA
COUNCIL
DIRECTIVE
96/23/EC
(1996)
PROHIBIDO
PRESENCIA
de β-
AGONISTAS
μg/kg
(MÚSCULO) -
ELISA
CODEX CAC -
2014
(MÚSCULO)
LMRV=0,2
µg/kg -
UPLC/MS/MS
COUNCIL
REGULATION
(EEC)
N°2377/90,
(MUSCULO)
LMRV=0,1
μg/kg -
UPLC/MS/MS
COUNCIL
DIRECTIVE
96/23/EC
(1996)
PROHIBIDO
PRESENCIA
de β-
AGONISTAS
μg/kg
(MÚSCULO) -
UPLC/MS/MS
TOTAL ANALIZADAS 48 48 48 48 48 48
NEGATIVAS 5 3 - 10 - -
POSITIVAS 43 45 45 38 38 38
NO DETERMINADAS - - 3 - 10 10
Fuente: Wania Espinoza
Espinoza Molina 51
Tabla 19. Tabulación de resultados de análisis en muestras de hígado, según método ELISA y UPLC/MS/MS.
No.
Individuo
CODIGO
SUBMUESTRA
HÍGADO
CODEX CAC -
2014 (HÍGADO)
LMRV=0,6 µg/kg
– ELISA
COUNCIL
REGULATION (EEC)
N°2377/90, (HÍGADO)
LMRV=0,5 μg/kg -
ELISA
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (1996)
PROHIBIDO PRESENCIA
de β- AGONISTAS μg/kg
(HÍGADO) - ELISA
CODEX CAC -
2014 (HÍGADO)
LMRV=0,6 µg/kg
- UPLC/MS/MS
COUNCIL
REGULATION
(EEC) N°2377/90,
(HÍGADO)
LMRV=0,5 μg/kg -
UPLC/MS/MS
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (1996)
PROHIBIDO PRESENCIA
de β- AGONISTAS μg/kg
(HÍGADO) - UPLC/MS/MS
1 151864 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
2 151870 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
3 151876 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
4 151879 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
5 151882 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
6 151891 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
7 151894 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
8 151903 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
9 151906 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
10 151909 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO
11 151912 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
12 151915 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
13 151918 NEGATIVO NEGATIVO ND NEGATIVO NEGATIVO ND
14 151921 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
15 151924 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
16 151927 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
17 151930 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
18 151933 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
19 151936 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
20 151939 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
21 151942 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
22 151945 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
23 151948 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
24 151951 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
25 151954 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
Espinoza Molina 52
No.
Individuo
CODIGO
SUBMUESTRA
HÍGADO
CODEX CAC -
2014 (HÍGADO)
LMRV=0,6 µg/kg
– ELISA
COUNCIL
REGULATION (EEC)
N°2377/90, (HÍGADO)
LMRV=0,5 μg/kg -
ELISA
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (1996)
PROHIBIDO PRESENCIA
de β- AGONISTAS μg/kg
(HÍGADO) - ELISA
CODEX CAC -
2014 (HÍGADO)
LMRV=0,6 µg/kg
- UPLC/MS/MS
COUNCIL
REGULATION
(EEC) N°2377/90,
(HÍGADO)
LMRV=0,5 μg/kg -
UPLC/MS/MS
COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (1996)
PROHIBIDO PRESENCIA
de β- AGONISTAS μg/kg
(HÍGADO) - UPLC/MS/MS
26 151957 NEGATIVO NEGATIVO ND NEGATIVO NEGATIVO ND
27 151966 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
28 151969 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
29 151972 NEGATIVO NEGATIVO ND NEGATIVO NEGATIVO ND
30 151975 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
31 151978 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
32 151981 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
33 151984 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
34 151987 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
35 151990 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
36 151993 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
37 151996 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
38 151999 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
39 152002 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
40 152005 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
41 152008 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
42 152011 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
43 152014 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
44 152023 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
45 152026 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
46 152029 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
47 152032 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
48 152035 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND
Espinoza Molina 53
Tabla 20. Resumen análisis en muestras de hígado, según método ELISA y UPLC/MS/MS, con relación a la normativa legal.
RESULTADOS
CODEX CAC -
2014
(HÍGADO)
LMRV=0,6
µg/kg –
ELISA
COUNCIL
REGULATION
(EEC)
N°2377/90,
(HÍGADO)
LMRV=0,5
μg/kg - ELISA
COUNCIL
DIRECTIVE
96/23/EC
(1996)
PROHIBIDO
PRESENCIA
de β-
AGONISTAS
μg/kg
(HÍGADO) -
ELISA
CODEX CAC -
2014
(HÍGADO)
LMRV=0,6
µg/kg -
UPLC/MS/MS
COUNCIL
REGULATION
(EEC)
N°2377/90,
(HÍGADO)
LMRV=0,5
μg/kg -
UPLC/MS/MS
COUNCIL
DIRECTIVE
96/23/EC
(1996)
PROHIBIDO
PRESENCIA
de β-
AGONISTAS
μg/kg
(HÍGADO) -
UPLC/MS/MS
TOTAL 48 48 48 48 48 48
NEGATIVAS 46 46 - 46 45 -
POSITIVAS 2 2 45 2 3 15
NO DETERMINADAS - - 3 - - 33
Fuente: Wania Espinoza
Espinoza Molina 54
3.4.1. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Codex
Alimentarius.
Una vez evaluada la presencia de clembuterol, aplicado el método de ELISA en las muestras
seleccionadas se pudo observar que las muestras dieron positivo a clembuterol, en relación
a los LMR establecidos en el Codex Alimentarius.
En las Figuras 23 y 24, se muestra el total de las 96 submuestras analizadas, incluyendo
músculos e hígado. En el caso del análisis en músculo, 90% resultó positivo a clembuterol en
músculo, aplicando el método ELISA, dándonos un valor numérico de 43 muestras; en cuanto
al 10% restante, es decir 5 muestras resultaron negativas al analito investigado.
Figura 23. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo, Método ELISA. Normativa Codex CAC - 2014
Fuente: Wania Espinoza
La prueba aplicada a hígados en los bovinos muestreados resultó positiva en 2 individuos del
total de 48 seleccionados, esto representa el 4%, es decir que resultaron negativas 46 de las
48 muestras seleccionadas, representando el 96% (Ver Figura 24).
RESULTADOS DE MÚSCULO VS. CODEX CAC 2014 LMRV=0.2 µg/kg MÉTODO ELISA
5; 10%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
43; 90%
Espinoza Molina 55
Figura 24. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método ELISA. Normativa Codex CAC - 2014
Fuente: Wania Espinoza
3.4.2. Resultados obtenidos con el método UPLC/MS/MS en relación al
Codex Alimentarius.
El método de UPLC/MS/MS, aplicado al músculo de los bovinos muestreados diagnosticó
positivo conforme los límites establecidos en el Codex Alimentarius, en 38 submuestras de
músculo del total de 48 muestras seleccionadas, esto representa un 79%. Resultaron
negativas 10 de las 48 muestras seleccionadas, esto representa el 21% (ver Figura 25).
En cuanto a la aplicación del método UPLC/MS/MS al tejido de hígado en bovinos
muestreados, se determinó que dos muestras resultaron positivas en relación a los límites
definidos por el Codex Alimentarius, representando el 4%. Las 46 muestras restantes, cuyo
resultado fue negativo, representan el 96% (ver Figura 26).
RESULTADOS DE HÍGADO VS. CODEX CAC - 2014
LMRV=0.6 µg/kg MÉTODO- ELISA
2; 4%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
46; 96%
Espinoza Molina 56
Figura 25. Resultado del análisis de clembuterol en tejido de músculo, Método
UPLC/MS/MS. Normativa Codex CAC - 2014
Fuente: Wania Espinoza.
Figura 26. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Codex CAC - 2014
Fuente: Wania Espinoza.
RESULTADOS MÚSCULO VS. CODEX CAC - 2014
LMRV=0.2 µg/kg MÉTODO - UPLC/MS/MS
10; 21%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
38; 79%
RESULTADOS HÍGADO VS. CODEX CAC - 2014 LMRV=0.6 µg/kg
MÉTODO - UPLC/MS/MS
2; 4%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
46; 96%
Espinoza Molina 57
3.4.3. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Council
Regulation (EEC) N°2377/90
El análisis de las submuestras de músculo bovino fue comparado con el LMRV establecido
en el Council Regulation EEC N°2377/90 de la EU, de lo cual se obtiene que mediante el
Método ELISA el 94% de los resultados son positivos, es decir que se encuentran en un nivel
mayor que LMR=0,1 μg/kg (ver Figura 27). El 6% restante corresponde a tres submuestras
cuyos resultaros arrojaron un valor por debajo del LMRV establecido en la norma.
Escenario contrario se presenta en la comparación de los resultados en hígado por el método
ELISA en comparación al LMRV establecido en el Council Regulation EEC N°2377/90. El 4%
de las submuestras, es decir, 2 de las 48 analizadas obtuvieron un resultado positivo; por lo
tanto, el 96% de submuestras restantes se encontraban por debajo del límite, resultando ser
46 submuestras negativas (ver Figura 28).
Figura 27. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo, Método ELISA. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90
Fuente: Wania Espinoza
RESULTADOS MÚSCULO VS. COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90 LMRV=0,1 µg/kg MÉTODO - ELISA
3; 6%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
45; 94%
Espinoza Molina 58
Figura 28. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en hígado, Método
ELISA. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90
Fuente: Wania Espinoza
3.4.4. Resultados obtenidos con el método de UPLC/MS/MS en relación al
Council Regulation (EEC) N°2377/90
El método UPLC/MS/MS determinó como resultado que el 79% de las muestras, representada
por 38 individuos, obtuvo un análisis positivo a la presencia de LMRV de clembuterol en tejido
muscular (ver Figura 29). El 21% restante, no pudo determinarse debido a la sensibilidad del
método la cual establece un LOD 0,125µg/kg. Estos diez individuos al presentar una
concentración menor al LOD pudieran cumplir o no, con el LMRV determinado en la norma.
Paralelamente los resultados del análisis aplicado a las muestras de hígado, y evaluadas
mediante el método UPLC/MS/MS, determinó que el 6%, es decir 3 de las 48 submuestras
arrojaron niveles superiores a los establecidos en la Normativa Council Regulation N°2377/90;
mientras que los 45 restantes resultaron negativos, representando el 94% (ver Figura 30).
RESULTADOS HÍGADO VS. COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90
LMRV=0,5 µg/kg MÉTODO - ELISA
2; 4%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
46; 96%
Espinoza Molina 59
Figura 29. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90
Fuente: Wania Espinoza
Figura 30. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90
Fuente: Wania Espinoza.
38; 79%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
NO DETERMINADOS
0; 0%
10; 21%
RESULTADOS MÚSCULO VS. COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90 LMRV=0,1 µg/kg
MÉTODO - UPLC/MS/MS
RESULTADOS HÍGADO VS. COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90 LMRV=0,5 µg/kg
MÉTODO - UPLC/MS/MS
3; 6%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
45; 94%
Espinoza Molina 60
3.4.5. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Council
Directiva 96/23/EC (29 abril 1996)
Conforme la Normativa Council Directive 96/23/EC, misma que establece como requisito la
ausencia de β-agonistas en tejidos bovinos, se estableció por el método ELISA un 94% de
resultados positivos en tejido muscular, representado en 45 individuos. En 3 de las 48
muestras (6%) no es posible determinar su cumplimiento debido a la sensibilidad del método
cuyos resultados indican un contenido menor al LOD de 0,1 µg/kg (Ver Figura 31).
Figura 31. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo, Método ELISA. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996).
Fuente: Wania Espinoza
Referenciando a esta normativa se comparó los resultados obtenidos en tejido de hígado
bovino, en el que encontramos 45 muestras negativas, es decir, el 96%. La población restante
analizada, 3 submuestras que corresponde al 4%, no pudieron ser segregados conforme el
requisito de la norma debido a que presentaron valores por debajo del LOD de 0,1 µg/kg (Ver
Figura 32).
RESULTADOS MÚSCULO VS. COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996)
LMRV= PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS MÉTODO - ELISA
0; 0%3; 6%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
NO DETERMINADOS
45; 94%
Espinoza Molina 61
Figura 32. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método ELISA. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996).
Fuente: Wania Espinoza
3.4.6. Resultados obtenidos con el método de UPLC/MS/MS en relación al
Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996)
El método de UPLC/MS/MS determinó la presencia del compuesto en 79% de las
submuestras, es decir en 38 de las 48 submuestras de tejido muscular analizadas. El 21%
restante representan diez muestras cuyos resultados resultaron ser indeterminados conforme
el LMR establecido en el Council Directive 96/23/EC (ver Figura 33 ).
En tanto, el comparativo del método aplicado a las submuestras en tejido de hígado bovino
obtuvo como resultado un 33% de muestras positivas, esto refiere a 16 de los 48 individuos
analizados. La proporción restante, el 67% corresponden a 32 resultados negativos en
relación de los LMR establecidos en el Council Directive 96/23/EC (ver Figura 34).
RESULTADOS HÍGADO VS. COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996)
LMRV=PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS MÉTODO - ELISA
0; 0%3; 6%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
NO DETERMINADOS
45; 94%
Espinoza Molina 62
Figura 33. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996).
Fuente: Wania Espinoza.
Figura 34. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,
Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996).
Fuente: Wania Espinoza.
38; 79%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
NO DETERMINADOS
0; 0%
10; 21%
RESULTADOS MÚSCULO VS. COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996)
LMRV=PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS MÉTODO - UPLC/MS/MS
RESULTADOS HÍGADO VS. COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996)
LMRV= PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS MÉTODO - UPLC/MS/MS
15; 31%
TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA
TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA
NO DETERMINADOS 0; 0%
33; 69%
Espinoza Molina 63
3.4.7. Relación de los métodos aplicados para la detección de clembuterol en
bovinos
Los resultados obtenidos en relación a los LMRV establecidos en el Codex Alimentarius para
el método UPLC/MS/MS y ELISA, permiten observar la prevalencia de valores positivos de la
presencia de clembuterol en músculo considerando un LMRV de 0,2 µg/kg. Referenciando a
la misma normativa, el escenario es opuesto en el análisis de tejido de hígado bovino, puesto
que se observa prevalencia de resultados negativos en ambos métodos, considerando que el
LMRV es mayor para hígado y corresponde a 0,6 µg/kg (Ver Tablas 21 y 22). Sin embargo,
se detecta clembuterol en hígado en varios casos
De igual manera, en relación a la normativa CEE N°2317/90, en músculo con un LMRV de 0,1
µg/kg, los métodos UPLC/MS/MS y ELISA, guardan estrecha relación con el analito en
investigación. Siendo mayoritariamente positivos al analizarse en músculo con un LMRV de
0,1 µg/kg y presentando una tendencia inversa en la que predominan los valores negativos
en el análisis de tejido de hígado al ser comparados con un LMRV de 0,5 µg/kg (Ver Tablas
21 a 24).
Tabla 21. Resultados de presencia de clembuterol mediante los métodos de ELISA y UPLC/MS/MS en muestras de músculo, en relación a la normativa legal vigente.
MÉTODO ELISA
(MÚSCULO)
MÉTODO UPLC/MS/MS
(MÚSCULO)
RESULTADO
COMPARATIVO
CON LMRV
RE
SU
LT
AD
OS
CO
DE
X C
AC
- 2
01
4
LM
RV
=0
,2 µ
g/k
g
RE
SU
LT
AD
OS
CO
UN
CIL
RE
GU
LA
TIO
N (
EE
C)
N°2
377/9
0,
LM
RV
=0
,1 μ
g/k
g
RE
SU
LT
AD
OS
CO
UN
CIL
DIR
EC
TIV
E
96/2
3/E
C (
29
ab
ril
19
96
) P
RO
HIB
IDO
PR
ES
EN
CIA
de β
- A
GO
NIS
TA
S
RE
SU
LT
AD
OS
CO
DE
X C
AC
- 2
01
4
LM
RV
=0
,2 µ
g/k
g
RE
SU
LT
AD
OS
CO
UN
CIL
RE
GU
LA
TIO
N (
EE
C)
N°2
377/9
0,
(MU
SC
UL
O)
LM
R=
0,1
μg
/kg
RE
SU
LT
AD
OS
CO
UN
CIL
DIR
EC
TIV
E
96/2
3/E
C (
29
ab
ril
19
96
) P
RO
HIB
IDO
PR
ES
EN
CIA
de β
- A
GO
NIS
TA
S
TOTAL,
POSITIVAS
SEGUN
NORMATIVA
43
45
45
38
38
38
TOTAL,
NEGATIVAS
SEGUN
NORMATIVA
5
3
0
10
0
0
CUMPLIMIENTO
NO
DETERMINADO
0
0
3
0
10
10
Espinoza Molina 64
Según el consejo directivo 96/23/EC, del 29 de abril 1996, el mismo que prohíbe la presencia
de β-agonistas, se presenta un alto nivel de semejanza entre los dos métodos. De esta
manera existe predominio de valores positivos en las submuestras de músculo, sin embargo,
se determinó también que debido a la sensibilidad del método no fue posible determinar el
cumplimiento con la normativa en algunas muestras puesto que el resultado del equipo indica
un contenido por debajo del nivel de detección (LOD) en ambos métodos. En cuanto a las
submuestras de hígado, se determinó a través del método ELISA el predominio de resultados
positivos y 3 casos cuyo cumplimiento no puede ser determinado. En el caso de submuestras
de hígado analizadas con el método UPLC/MS/MS no fue posible establecer el cumplimiento
de 33 muestras, teniendo como resultado únicamente 15 individuos con contenido positivo
confirmado.
Tabla 22. Resultados de presencia de clembuterol mediante los métodos de ELISA y UPLC/MS/MS en muestras de hígado, en relación a la normativa legal vigente.
MÉTODO ELISA (HÍGADO)
MÉTODO UPLC/MS/MS
(HÍGADO)
RE
SU
LT
AD
OS
CO
DE
X
CA
C
- 20
14
LM
RV
=0
,6 µ
g/k
g
CO
UN
CIL
R
EG
UL
AT
ION
(E
EC
)
N°2
37
7/9
0 L
MR
V=
0,5
μg
/kg
CO
UN
CIL
D
IRE
CT
IVE
96
/23/E
C (2
9
ab
ril
19
96)
PR
OH
IBID
O
PR
ES
EN
CIA
de β
- A
GO
NIS
TA
S
RE
SU
LT
AD
OS
CO
DE
X
CA
C
- 20
14
LM
RV
=0
,6 µ
g/k
g
CO
UN
CIL
R
EG
UL
AT
ION
(E
EC
)
N°2
37
7/9
0,
LM
RV
=0,5
μg
/kg
CO
UN
CIL
D
IRE
CT
IVE
9
6/2
3/E
C (2
9
ab
ril
19
96)
PR
OH
IBID
O
PR
ES
EN
CIA
de β
- A
GO
NIS
TA
S
TOTAL,
POSITIVAS
SEGUN
NORMATIVA
2
2
45
2
3
15
TOTAL,
NEGATIVAS
SEGUN
NORMATIVA
46
46
0
46
45
0
CUMPLIMIENTO
NO
DETERMINADO
0
0
3
0
0
33
TOTAL
48
48
48
48
48
48
Espinoza Molina 65
Los resultados tienen similar apreciación entre los métodos aplicados para la detección de
clembuterol. Sin embargo, se puede observar que la sensibilidad del método ha sido
determinante al momento de especificar el cumplimiento de una muestra en relación a los
LMRV establecidos en las normas de referencia. De esta manera se encontraron casos cuyos
resultados arrojados por el método correspondiente se encuentran dentro de la zona gris en
la que se genera una zona de incertidumbre cuyos resultados podrían ser positivos o
negativos. Esta condición se genera cuando el LMRV establecido por la norma es inferior al
LOD del método, lo que es más frecuente en los resultados analizados con UPLC/MS/MS.
Los resultados del análisis a través del método ELISA y UPLC/MS/MS, se analizan en función
del tipo de tejido analizado (tejido muscular y tejido de hígado bovino), en las Tablas 23 y 24.
En las Figuras 35 y 36 se puede observar que tanto en el método ELISA como en el método
UPLC/MS/MS los resultados positivos predominan en el tejido muscular, mientras que en el
tejido de hígado se observa mayoría de casos negativos puesto que las normativas proponen
un LMRV mayor.
Tabla 23. Resultados comparativos por tejido analizado con Método ELISA en función de la
norma de referencia.
RESULTADO DEL MÉTODO ELISA TEJIDO SUBMUESTRA
NORMA DE REFERENCIA
HÍGADO MÚSCULO
P
OS
ITIV
O
N
EG
AT
IVO
NO
DE
TE
RM
INA
DO
P
OS
ITIV
O
N
EG
AT
IVO
NO
DE
TE
RM
INA
DO
CODEX CAC - 2014, LMRV=0,2
µg/kg hígado, 0,6 µg/kg músculo.
2
46
0
43
5
0
COUNCIL REGULATION (EEC)
N°2377/90, LMRV=0,1 μg/kg
2
46
0
45
3
0
SEGUN COUNCIL DIRECTIVE
96/23/EC (29 abril 1996)
PROHIBIDO PRESENCIA de β-
AGONISTAS (0 µg/kg)
45
0
3
45
0
3
Espinoza Molina 66
Figura 35. Resultados comparativos entre tejido analizado por Método ELISA en función de
la norma de referencia.
Fuente: Wania Espinoza.
RESULTADOS COMPARATIVOS A NORMAS DE REFERENCIA
COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996) COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90
CODEX CAC - 2014
(ND)6% (ND)6 % (-)6% (+4% (+) 4%
(-)10%
(+)94% (+)94% (+)94% (+)90%
(-)96% (-)96%
Relación de resultados en relación a la normativa. Método ELISA.
HIGADO - POSITIVO HIGADO - NEGATIVO HÍGADO - ND
MUSCULO - POSITIVO MUSCULO - NEGATIVO MÚSCULO - ND
% d
e S
ub
mu
estr
as A
na
lizad
as
Espinoza Molina 67
Tabla 24. Resultados comparativos por tejido analizado con Método UPLC/MS/MS en función de la norma de referencia.
RESULTADO DEL MÉTODO
UPLC/MS/MS
TEJIDO SUBMUESTRA
NORMA DE REFERENCIA
HÍGADO MÚSCULO
PO
SIT
IVO
NE
GA
TIV
O
NO
DE
TE
RM
INA
DO
PO
SIT
IVO
NE
GA
TIV
O
NO
DE
TE
RM
INA
DO
CODEX CAC - 2014,
LMRV=0,2 µg/kg
2
46
0
38
10
0
COUNCIL REGULATION
(EEC) N°2377/90, LMRV=0,1
μg/kg
3
45
0
38
0
10
SEGUN COUNCIL
DIRECTIVE 96/23/EC (29
Abril 1996) PROHIBIDO
PRESENCIA de β-
AGONISTAS
15
0
33
38
0
10
Figura 36. Resultados comparativos por tejido analizado con Método UPLC/MS/MS en
función de la norma de referencia.
Fuente: Wania Espinoza.
RESULTADOS COMPARATIVOS A NORMAS DE REFERENCIA
COUNCIL REGULATION (EEC) COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996) N°2377/90
CODEX CAC - 2014
(+)6 (+)4%
(ND)21% (ND)21% (--)21
(+)31
(ND)69%
(+)79% (+)79 (+)79
(-)94%
MUSCULO - NEGATIVO MÚSCULO - ND
(-)96%
HÍGADO - ND HIGADO - NEGATIVO HIGADO - POSITIVO
MUSCULO - POSITIVO
Relación de resultados en relación a la normativa. Método UPLC/MS/MS
% d
e S
ub
mu
estr
as A
na
lizad
as
Espinoza Molina 68
CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN
El análisis de las submuestras de hígado y músculo mediante el método de ensayo por
inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y el método basado en cromatografía liquida
acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC/MS/MS) permitió evaluar la presencia
del β-adrenérgico clembuterol, de manera cuantitativa expresado en partes por billón o ppb
(µg/Kg) y de manera cualitativa, evaluando dichos resultados con referencia a los límites
máximos de residuos veterinarios LMRV establecidos en la normativa internacional vigente.
Las etapas del muestreo, conservación de las muestras, el posterior procesamiento y la
aplicación de los protocolos de análisis descritos en el capítulo dos, para la extracción del
compuesto y análisis de las submuestras mediante los métodos planteados, fueron viables y
permitieron una correcta lectura de los resultados en los equipos proporcionados por
AGROCALIDAD.
Es necesario considerar que según Meyer y Rinke, cuando el anabólico se administra a
ganado vacuno, con niveles relativamente altos de clembuterol se pueden detectar en el
hígado (Meyer & Rinke, 1991) por el proceso de metabolismo que se realiza en este órgano.
En consecuencia, varios casos de intoxicación humana tienden a estar relacionado con el
consumo de hígado de animales tratados con estas drogas (Martínez Navarro, 1990). Cuando
se aplica el clembuterol vía oral a bovinos con las dosis 7,5 µg/Kg por 2 días y luego 3 µg/Kg
en los próximos 8 días, la presencia del anabólico en la orina del bovino puede durar hasta 12
semanas; cuando la muestra permanece en un estado de almacenamiento de +4°C y
congelación puede durar 20 semanas en el caso del hígado. Además, las muestras se pueden
almacenar a -20° y -60° C durante al menos 20 semanas, sin diferencias entre estas
temperaturas, y pueden ser sometidos 6 veces a manipulación entre congelar y descongelar
durante ese tiempo ya que no habría una pérdida o degradación significativa predecible de
clembuterol en los tejidos (Pinheiro, y otros, 2009).
Con estos antecedentes la probabilidad de detectar la presencia de clembuterol en el presente
estudio y aplicando las dos técnicas utilizadas (ELISA y UPLC-MS-MS), era alta.
4.1. Resultados cuantitativos del análisis de músculo e hígado mediante el
método ELISA y UPLC/MS/MS
La aplicación de los métodos ELISA y UPLC/MS/MS en las submuestras de hígado y músculo
permitieron medir el contenido de clembuterol (expresado en ppb) en función de los límites de
detección y cuantificación especificados para cada método. En este sentido se pudo observar
que el método ELISA presentó un mejor límite de detección teórico para la cuantificación,
debido a la baja concentración del compuesto que es capaz de detectar,
Espinoza Molina 69
(LOD: 0,1 µg/Kg). En el caso del método UPLC/MS/MS, considerando los parámetros propios
del equipo como son el límite de detección LOD:0.125 µg/Kg, el intervalo denominado como
zona gris del método ( 0.125-0.250 µg/Kg) , mismo que no permite evaluar cuantitativamente
el contenido de clembuterol y el límite de cuantificación LOQ: 0,250 µg/Kg, permitió medir el
contenido de clembuterol en las muestras cuya concentración se encontraba sobre el límite
de cuantificación LOQ: 0,250 µg/Kg y determinar la presencia del compuesto en aquellos
individuos que presentaron contenido por encima del límite de detección LOD: 0,125 µg/Kg
intervalo denominado como zona gris del método.
Esta diferencia entre los límites de detección y límite de cuantificación propios de cada método
aplicado nos permite establecer como premisa que el método ELISA puede ser considerada
como una buena herramienta alternativa para la determinación cualitativa y cuantitativa de
tipo screening y que el método UPLC-MS-MS puede ser concebido como método
confirmatorio por su alta especificidad y el cual se podría optimizar para reducir su LOQ y LOD
Las muestras de músculo analizadas mediante el método ELISA fueron mayoritariamente
superiores al límite de detección LOD. Es decir el método encontró el compuesto en
concentración mayor a 0,100 µg/Kg en 45 de las 48 muestras. En el caso del método
UPLC/MS/MS se encontró una cantidad cuantificable en 38 de las 48 muestras analizadas.
Esto representa que el método ELISA detecto un 15,5% más de casos que el método
UPLC/MS/MS.
En el caso de los resultados de las muestras de hígado, el método ELISA permitió cuantificar
45 muestras de las 48 analizadas, las cuales presentaron un contenido mayor al límite de
detección LOD: 0,100 µg/Kg. En el mismo análisis realizado con el método UPLC/MS/MS
apenas 9 de las 48 muestras arrojaron un resultado cuantitativo, es decir que presentaron
valores mayores al límite de cuantificación LOQ. Esto representa que con el ensayo ELISA se
pudieron detectar 80% más casos positivos que con el método UPLC/MS/MS con un
contenido de clembuterol superior a 0,100 µg/Kg.
Se analizó mediante histograma de frecuencias la tendencia de los resultados obtenidos del
análisis con los métodos ELISA y UPLC/MS/MS. Las submuestras de hígado analizadas con
el método ELISA presentaron resultados con una distribución anormal y se destaca la
aparición de dos puntos anómalos en relación al universo de muestras. El análisis de hígado
con el método UPLC/MS/MS presentó 9 resultados cuantitativos los cuales se consideran
insuficientes para analizar la distribución de los mismos, siendo necesario contar al menos
con quince muestras.
En el caso de los resultados de análisis de submuestras de músculo se observó que las
muestras analizadas con ELISA presentaron una distribución anormal de los datos. Se
destaca la aparición de un dato anómalo en relación al universo de muestras. En el caso de
UPLC_MSMS se observó una distribución normal, no presentando datos demasiado
dispersos y descartando aquellos valores que se atribuyen a la zona gris del método.
Espinoza Molina 70
La aplicación de la prueba t de student para medias de muestras relacionadas se realizó con
la finalidad de confirmar o descartar la hipótesis de similitud entre los métodos aplicados. En
el caso de los resultados de las submuestras de hígado no fue posible determinar si existe o
no una diferencia significativa entre las medias de los métodos, debido a que en el método
UPLC/MS/MS se disponía únicamente de 9 casos con resultados cuantitativos.
Para la prueba t de student aplicada a los resultados de las submuestras de músculo, se
determinó que no existe una diferencia significativa entre las medias de los dos métodos. El
intervalo de confianza al 95% indica que la diferencia verdadera se encuentra entre - 0,10380
y 0,12965 entre los métodos ELISA y UPLC/MS/MS.
La potencia calculada por el programa Minitab ® está en función de los tamaños de las
muestras y de las desviaciones estándar. Para detectar diferencias más pequeñas, el
programa sugiere considerar aumentar los tamaños de las muestras.
En el análisis aplicado mediante Excel a los resultados de los métodos ELISA y UPLC/MS/MS
se obtuvo un valor de P (p value) de 0,43 > α 0,05. Con lo cual se aceptaría la hipótesis nula
que indica que. De igual manera el valor de t obtenido -0,1798 < t crítico 1,6909 con lo cual
se acepta la hipótesis nula. Sin embargo, el coeficiente de correlación de Pearson de 0,1915
presenta una correlación positiva muy baja entre los resultados de ambos métodos.
4.2. Resultados cualitativos del Análisis de Músculo e Hígado mediante el método
ELISA y UPLC/MS/MS
Los resultados presentados en el Capítulo 3 permitieron establecer un panorama previo de la
problemática en la provincia de Manabí, respecto al posible uso inadecuado para la engorda
en bovinos, al haberse detectado la presencia de clembuterol en los tejidos de hígado y
músculo, en las submuestras analizadas con el método ELISA y con el método UPLC/MS/MS.
Los límites máximos de residuos veterinarios establecidos en las normativas internacionales,
al ser comparados con los resultados obtenidos permitieron evaluar la situación actual del
cumplimiento normativo a nivel de la provincia de Manabí.
De manera general, el análisis comparativo de los resultados obtenidos en tejido muscular e
hígado bovino, con los métodos ELISA y UPLC/MS/MS se detectó mayoritariamente el
residual en el tejido muscular. Este comportamiento se puede atribuir al metabolismo del
compuesto dentro del organismo del animal, siendo eliminado en mayor proporción en el
hígado mientras que los residuales dentro del músculo se mantienen por un tiempo más
prolongado. Sin embargo, dicha tendencia se presenta también debido a que en normativas
como Codex Alimentarius y Council Regulation N°2377/90 se consideran límites más
permisivos para la presencia en matriz hígado.
Espinoza Molina 71
Este comparativo se evidencia en las Figuras 31 y 32, adicionalmente se puede inferir que la
detección del anabólico en los tejidos del bovino se encontraría también en función de las vías
de administración empleadas (oral o intramuscular) y del tiempo transcurrido entre la
administración hasta la faena del animal.
Así también se puede observar en las Figuras 31 y 32 la diferencia en los niveles de detección
sobre los diferentes tejidos hígado y músculo, así como entre los diferentes métodos
aplicados. Se establece que con el método ELISA fue detectado 11% más casos positivos en
hígado y músculo que con el método UPLC/MS/MS, considerando la sensibilidad de 0,100
µg/Kg, pudiendo detectar niveles incluso menores a los establecidos en el Codex
Alimentarius.
Esta diferencia en el nivel de detección se atribuye a la sensibilidad expresada en el límite de
detección, la cual fuera de 0,10 µg/kg (o ppb) para el método ELISA y 0,125 µg/kg para el
método UPLC/MS/MS. El método ELISA aporta, además, entre otras ventajas, a realizar un
análisis rápido permitiendo tratar un elevado número de muestras y repeticiones en busca de
posibles resultados no conformes. Los resultados positivos deben ser confirmados por
métodos específicos en este caso el método es UPLC/MS/MS que constituye el método
confirmatorio para este tipo de evaluaciones por su especificidad.
Si comparamos los resultados de la matriz de músculo, presentado en las Figuras 18 y 20 del
método ELISA y UPLC/MS/MS con la normativa del CODEX CAC 2014, con un LMRV
permitido para uso terapéutico de 0,2 µg/Kg, se puede aseverar que en varios casos existe
presencia de clembuterol por encima de los límites permitidos por la normativa de referencia,
por lo tanto, no se cumple con las exigencias de LMRV establecidas en el Codex Alimentarius.
En el caso de hígado bovino, debido a sus límites más permisivos se encontró un
cumplimiento mayoritario en cuanto al LMRV establecido en esta normativa (Figuras 19 y 21).
Similar situación se presenta al evaluar los resultados cualitativos con la Normativa Europea
Council Regulation N°2377/90, puesto que los LMRV varían ligeramente respecto al Codex.
Con un LMRV permitido para uso terapéutico de 0,100 µg/Kg, se determinó también la
presencia de clembuterol por encima de los límites permitidos por la normativa y por lo tanto
el incumplimiento de las muestras con esta regulación según los resultados obtenidos con
ambos métodos (Figuras 22 y 24). En el caso de las muestras de hígado, con un LMRV
permitido de 0,500 µg/Kg el cumplimiento con la normativa es mayoritario.
Desde el punto de vista de las exigencias de la Unión Europea Council Directive 96/23/EC (29
abril 1996) PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS, estos resultados son totalmente
desfavorables en términos de cumplimiento de la normativa vigente, considerando que se
prohíbe la aplicación del clembuterol en los bovinos, debido al registro de casos de
intoxicación alimentaria tras su consumo, mismos que atentan a la salud pública.
Espinoza Molina 72
En función de los LMRV establecidos en las normativas internacionales tomadas como
referencia para el presente estudio, se observó que el método basado en cromatografía liquida
acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC/MS/MS) presenta una zona gris
comprendida por los límites de detección y cuantificación (LOD y LOQ) que dificulta la
segregación de casos que se encuentren cercanos a los límites de las regulaciones
internacionales. Sin embargo, es importante destacar la especificidad del método y proponer
una optimización del método con niveles de detección y cuantificación inferiores a los
utilizados, y a su vez que sean acogidas con respecto a las normativas vigentes, actividad
que se encuentra fuera del alcance de este estudio.
Espinoza Molina 73
CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES
Se puede concluir que la población bovina de la provincia de Manabí, sometida al muestreo y
evaluación de este estudio, representa el 18,3% del movimiento ganadero en la República del
Ecuador en el 2014. En la provincia de Manabí se extrajeron 48 submuestras de hígado y 48
submuestras de músculos bovinos que fueron analizados con los métodos de ensayo por
inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y el método basado en cromatografía liquida
acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC/MS/MS). Dentro de la evaluación con
el método de ELISA el 90% de la población evaluada mostró presencia de clembuterol
superior a 0,2 µg/kg en el tejido del músculo y el 4% resultó positivo a la presencia de
clembuterol superior a 0,6 µg/kg en el tejido del hígado. ( LMRV Codex)
El análisis estadístico de resultados permitió establecer que no existe una diferencia
significativa entre las medias de los resultados del análisis de músculo bovino con los métodos
ELISA y UPLC/MS/MS. Sin embargo, el análisis con el coeficiente Poisson presentó una
correlación positiva muy baja entre los resultados. Esto puede relacionarse a la sensibilidad y
especificidad de los métodos, así como a la supresión de casos no cuantitativos en el método
UPLC/MS/MS por lo que es necesario realizar un análisis profundo con un mayor número de
casos de estudio.
El clembuterol también es posible de ser detectado en personas, dentro de las 48 horas
posteriores a la ingesta del alimento implicado, por medio de los métodos como los usados
en esta tesis, así como en muestras de animales y alimentos sospechosos. El periodo corto
de permanencia del anabólico en el organismo, en muchos casos representa una dificultad
para su detección y levantamiento de una estadística epidemiológica. En el Ecuador no existe
un registro o estudio de este tipo, por lo que, pese a determinarse la presencia del compuesto
en productos de consumo humano, no es posible dimensionar el impacto actual que
representa su uso a la salud de los consumidores.
Tras los resultados obtenidos se confirma que la problemática existe en Ecuador. No hay un
valor mínimo en la determinación del clembuterol que se pueda considerar seguro, e
idealmente no debería existir esta sustancia en el alimento a consumir al estar incluido en el
listado de referencia de las clases de sustancias dopantes y de métodos de dopaje, como
otros agentes anabolizantes BOE-A-1995-14474, 1995.
Una vez se establezca en la legislación en Ecuador la legalidad o no del uso del anabólico
clembuterol, se podrán realizar las inspecciones correspondientes en los mataderos por parte
de AGROCALIDAD, aplicando los métodos propuestos en la presente investigación (ELISA y
UPLC/MS/MS). Sin embargo, se puede realizar controles considerando lo establecido en los
LMRV del Codex al ser nuestro país signatario del mismo
Espinoza Molina 74
El límite de detección del kit para el ensayo ELISA es altamente sensible y está alineado con
los requisitos del Reglamento del Consejo de la Unión Europea N°2377/90, por tal motivo, del
total se logró determinar en las submuestras de músculo analizadas con el método ELISA un
índice de positividad de 94% (valores superiores a 0,1 µg/Kg)
Si consideramos la Directiva de Consejo 96/23 EC, el método de ELISA para determinar
clembuterol, los rangos de trabajo de este se encuentran acordes para estudios futuros y
establecer patrones de calidad e inocuidad que garanticen el consumo de carne en la
República del Ecuador. El método de UPLC/MSMS también fue evaluado como método
cuantitativo altamente selectivo y confirmatorio en contenidos superiores a 0,250 µg/kg.
En cuanto al método UPLC/MS/MS es importante considerar para futuros estudios, minimizar
la zona gris del método optimizando el método a niveles inferiores al LOQ de 0,250 µg/Kg de
manera que se incremente la sensibilidad del estudio y, por lo tanto, sea éste igualmente
aplicable para el análisis cualitativo y cuantitativo en relación a los LMRV establecidos en las
normas de referencia.
Por otra parte, SAGARPA (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentación de México), prohibió el uso de clembuterol como ingrediente activo y aditivo
alimentario destinado al consumo de animales, publicado en el Diario Oficial de la Federación
el 11 de octubre de 2000, puesto que su uso incrementa el riesgo hacia la salud pública y del
animal. En las Especificaciones técnicas para el control del uso de beta- agonistas en los
Animales, NOM-EM-015-ZOO-2002, manifiesta en su punto 4 “Disposiciones Generales: Con
excepción de aquellos productos beta-agonistas que cuenten con el registro y autorización de
la Secretaría para su uso o consumo por animales, queda prohibida la producción,
manufactura, fabricación, elaboración, preparación, acondicionamiento, transportación,
tráfico, comercialización, importación, suministro y/o utilización de los siguientes principios
activos como ingredientes activos, aditivos, alimenticios y/o medicamentos en formulación de
productos alimenticios destinados para consumo y uso en animales, tales como:
bromobuterol, carbuterol, cimaterol, cimbuterol, clembuterol, fenoterol, isoproterenol,
mabuterolde, mapenterol, orciprenaline, pirbuterol, ractopamina, salbutamol, terbutaline,
zilpatero.
Comparando los resultados obtenidos con referencia a la normativa mexicana, se estarían
violando los artículos 172, 173 y 174 de la Ley Federal de Sanidad Animal, en donde refiere
una sanción de cuatro a ocho años de prisión y multa de quinientas hasta tres mil veces el
salario mínimo vigente en la zona económica donde se cometió el delito (SAGARPA, 2013).
En el Ecuador el uso de clembuterol no está regulado o sancionado, sin embargo, los niveles
en productos pecuarios no deben exceder a lo estipulado por el CODEX.
Con estos resultados la Republica de Ecuador, a través de La Agencia Ecuatoriana de
Aseguramiento de la Calidad del Agro – AGROCALIDAD, como Autoridad Nacional Sanitaria,
Fitosanitaria y de Inocuidad de Alimentos tendrá una línea base para establecer
Espinoza Molina 75
criterios de control que conlleven el levantamiento de información estadística nacional y que
propicie un mejor control en el sector.
Para ello es recomendable establecer jornadas permanentes de control de los bovinos para
consumo humano en el país, y así cumplir con el marco legal descrito en La Constitución de
la República del Ecuador, en su Título II. Derechos, Capítulo segundo. Derecho del buen vivir.
Sección primera: Agua y Alimentación. Artículo 13 indica que: Las personas y colectividades
tienen derecho al acceso seguro y permanente a alimentos sanos, suficientes y nutritivos;
preferentemente producidos a nivel local y en correspondencia con sus diversas identidades
y tradiciones culturales. También se menciona que El Estado Ecuatoriano promoverá la
soberanía alimentaria. Título III. Garantías Constitucionales. Capítulo segundo. Políticas
públicas, servicios públicos y participación ciudadana. Art. 85. La formulación, ejecución,
evaluación y control de las políticas y servicios públicos que garanticen los derechos
reconocidos por la Constitución, se regularán de acuerdo con las siguientes
disposiciones:3……En la formulación, ejecución y control de las políticas públicas y servicios
públicos se garantizará la participación de las personas, comunidades, pueblos y
nacionalidades. Título VI. Régimen de desarrollo. Capítulo tercero. Soberanía Alimentaria, Art.
281: La soberanía alimentaria constituye un objetivo estratégico y una obligación del Estado
para garantizar que las personas, comunidades, pueblos y nacionalidades alcancen la
autosuficiencia de alimentos sanos y culturalmente apropiados de forma permanente. Para
ello, será responsabilidad del Estado: 7. Precautelar que los animales destinados a la
alimentación humana estén sanos y sean criados en un entorno saludable. 8. Asegurar el
desarrollo de la investigación científica y de la innovación tecnológica apropiada para
garantizar la soberanía alimentaria. El Plan Nacional del Buen Vivir, en su Objetivo 10.
Impulsar la transformación de la matriz productiva. 10,1 diversificar y generar mayor valor
agregado en la producción nacional. 10,1.e Fortalecer el marco institucional y regulatorio que
permita una gestión de la calidad en los procesos productivos y garantice los derechos de
consumidores y productores.
Espinoza Molina 76
CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES
Acorde a la necesidad de salvaguardar la salud pública, y basándonos en el concepto de que
la seguridad alimentaria conlleva a un buen vivir mediante la obtención de un producto inocuo,
apto para el consumo humano y promoviendo de esta manera la soberanía alimentaria de
nuestro país, es de interés nacional establecer, estandarizar y validar los métodos para
verificar y cuantificar la presencia de residuos veterinarios, como es el caso del β-agonista
Clembuterol, en productos pecuarios bovinos en el país.
Se considera necesario fortalecer y equipar los laboratorios de control a nivel nacional, así
como desarrollar e implementar las metodologías inherentes que apoyarán dicha
identificación y cuantificación de residuos veterinarios y otros, en distintas matrices (músculo,
hígado) y de esta manera poder determinar la magnitud de esta problemática a nivel país.
En virtud de asegurar el consumo saludable y de calidad de la producción nacional para la
población, se recomienda desarrollar y fortalecer las investigaciones en materia de residuos
de productos veterinarios como también de más grupos de fármacos, plaguicidas, pesticidas
y controles microbiológicos, considerando además que el Ecuador posee potencial para
exportar carne, leche y demás productos de producción primaria, así como los exigentes
controles de las autoridades extranjeras.
El uso inadecuado y fraudulento de este tipo de compuestos derivan en un severo peligro para
la salud de la población, razón por la cual deben llevarse a cabo controles permanentes por
parte de la Autoridad Nacional competente mediante la formulación y aplicación de políticas
públicas en materia de seguridad alimentaria, como resultado del desarrollo de ciencia y
tecnología promovida por la presente investigación.
Cabe recalcar la importancia de elaborar una línea base estadística con indicadores en salud
pública sobre los distintos casos de intoxicación alimentaria, en función de las investigaciones
existentes y desarrollando nuevos campos de investigación referentes al tema, permitiendo,
a las autoridades de control, actuar con planes y programas acorde a la realidad del país, que
involucren una alimentación saludable.
Desarrollar e implementar herramientas de control integral fortaleciendo a nivel de fronteras
el cerco sanitario aplicable al control de la producción primaria y de la cadena de valor,
importada o para exportación, como un sistema de alerta que a más de identificar o
diagnosticar un problema sanitario, involucre articular con entes regulatorios. De esta manera
se podrán tomar acciones que mejoren el estatus de salud pública interna del país y mejorar
la calidad e inocuidad tanto de los productos de consumo interno, como también de la
producción primaria con potencial de exportación.
Espinoza Molina 77
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Espinoza Molina 80
ANEXOS
Anexo 1. Plan de muestreo para el estudio de residuos de medicamentos veterinarios
(anabólicos) a Nivel Nacional.
Espinoza Molina 81
Espinoza Molina 82
Espinoza Molina 83
Espinoza Molina 84
Espinoza Molina 85
Espinoza Molina 86
Espinoza Molina 87
Espinoza Molina 88
Espinoza Molina 89
Espinoza Molina 90
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Espinoza Molina 92
Espinoza Molina 93
Anexo 2. Autorización desarrollo de tesis maestría “Evaluación de clembuterol en productos pecuarios bovinos.
Espinoza Molina 94
Anexo 3. Reunión coordinación proyecto de análisis residuos veterinarios
Espinoza Molina 95
D
D
D
D
Anexo 4. Planificación muestreo en mataderos de Manabí
PROGRAMA
FECHA
ITINERARIO
TEMA
# MUESTRAS A TOMAR/CAMAL
PERSONAL
PARTICIPANTE TUMBACO
PERSONAL
PARTICIPANTE COORDINACIÓN MANA
BÍ
CAPACITACIÓN TEÓRICA OFICINA DE REUNIONES
DE COORDINACIÓN MANABÍ)
(
24/08/2015
14h30-16H00
CAPACITACIÓN TEÓRICA
OFICINA DE REUNIONES DE COORDINACIÓN
MANABÍ)
(
PAULETTE ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO ANDINO/ DIEGO
TECNICO DE INOCUIDA
LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL
,
ALVAREZ
PAULETTE TECNICO DE INOCUIDA
LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL
MUESTREO CAMAL
PORTOVIEJO
24/08/2015
17H00 -19H00
MUESTREO CAMAL
PORTOVIEJO
15
ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO
,
ANDINO/ DIEGO
ALVAREZ
MUESTREO CAMALES
DESTINADOS
25/08/2015
SEGÚN DISPONIBILIDA
DE FAENAMIENTO
MUESTREO CAMALES DESTINADOS (
COGAMANTASA MANTA SANTA ANA/ TOSAGUA)
/
23
PAULETTE ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO
TECNICO DE INOCUIDA
LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL
,
PAULETTE
TECNICO DE INOCUIDA LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL
MUESTREO CAMALES DESTINADOS
26/08/2015
SEGÚN DISPONIBILIDA DE FAENAMIENTO
MUESTREO CAMALES DESTINADOS ( CALCETA
)
3
ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO
,
ANDINO/ DIEGO
ALVAREZ
PAULETTE
MUESTREO CAMALES
DESTINADOS
27/08/2015
SEGÚN DISPONIBILIDA
DE FAENAMIENTO
PREPARACIÓN DE MATERIALES, MUESTRA
Y RETORNO
S
ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO ANDINO/ DIEGO
TECNICO DE INOCUIDA
LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL
,
ALVAREZ
Espinoza Molina 96
Anexo 5. Oficio dirección de tesis de maestría de Wania Fernanda Espinoza Molina.
Espinoza Molina 97
Anexo 6. Oficio co-dirección como investigador del Proyecto Prometeo y Agrocalidad de la
tesis de maestría de Wania Fernanda Espinoza Molina.
Espinoza Molina 98
Anexo 7. Formato Orden de trabajo de las muestras del proyecto “Evaluación de clembuterol en productos pecuarios bovinos de la provincia de Manabí.
Espinoza Molina 99
Anexo 8. Formato Registro de toma de muestras.
Espinoza Molina 100
Anexo 9. Formato registro de análisis de ELISA
Espinoza Molina 101
Anexo 10. Informe de cumplimiento de comisión para la toma de muestras en la provincia de Manabí.
Espinoza Molina 102
Anexo 10. Informe de cumplimiento de comisión para la toma de muestras en la provincia
de Manabí. (Continuación)
Espinoza Molina 103
Anexo 11. Informe de comisión de servicios institucionales para la toma de muestras de productos pecuarios bovinos en la provincia de Manabí.
Espinoza Molina 104
Anexo 12. Capacitación Método de ELISA para clembuterol y demostración.
Espinoza Molina 105
Anexo 12. Capacitación método de ELISA para clembuterol y demostración. (Continuación)
Espinoza Molina 106
Anexo 13. Certificado de formación completa sobre el Método de ELISA para clembuterol.
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Anexo 14. Seteo de masas clembuterol en el equipo UPLC/MS/MS
Espinoza Molina 108
Anexo 15. Laboratorio de contaminantes productos pecuarios, análisis de clembuterol por el método de ELISA. (Recepción de muestras, codificación, extracción de la porción analítica)
Espinoza Molina 109
Anexo 16. Figuras de participación en formación y desarrollo del método ELISA clembuterol, impartida por la empresa Biooscientific – Inventagri.
Espinoza Molina 110
Anexo 17. Figuras del proceso de análisis por el método cromatográfico UPLC/MS/MS (Preparación de estándares, recepción, codificación, preparación, extracción de las muestras de hígado y músculo, previo a la inyección en el equipo)
Espinoza Molina 111
Anexo 18. Figuras Acondicionamiento del equipo (gradiente)