Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita
description
Transcript of Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita
![Page 1: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/1.jpg)
Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita
M.Jarošová, A. Mišurcová,M.Vávrová, D. StříteckáI.patologicko-anatomický ústav FN u sv. Anny, Brno
Rožnov pod Radhoštěm, 2007
![Page 2: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/2.jpg)
Žít s epidermolysis bullosa znamená…
… mít kůži tenkou, křehkou a lehce zranitelnou, jako jsou motýlí křídla.
… vědět, že stačí tlak, tření švu prádla, které způsobí bolavé poranění a puchýře na kůži.
… že při polknutí tuhé stravy mohou být poraněny sliznice v dutině ústní, což
znemožní polknout třeba vlastní sliny … mít puchýře na chodidlech už po deseti
či patnáctiminutové chůzi.… vyřazení z většiny dětských her, protože i
obyčejné hračky mohou neobyčejně ublížit.… denně trávit až tři hodiny ošetřováním
poraněné kůže, bolestivých ložisek.… vyvazovat prsty na rukou, aby se oddálil
jejich srůst.
![Page 3: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/3.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
EB je velice vzácné onemocnění kůže Každý z nás může být nosičem vadného genu V současné době neexistuje žádný způsob
léčby Jedná se o onemocnění genetické, ne
nakažlivé, nepostihuje intelekt Největší nadějí je genová terapie Těžká forma může skončit smrtí pacienta v
raném věku Poraněná kůže je velmi citlivá a rány (defekty)
neustále bolí. Dochází k řídnutí a vypadávání vlasů a ke ztrátě nehtů a zubů
![Page 4: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/4.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
Tvorba puchýřů na kůži, někdy i na sliznicích
Po drobných traumatech (tření, tlak) nebo i spontánně - mechanobulózní dermatózy
Při postižení sliznic nelze pak polknout ani sliny, sousto jídla, tvoří se puchýře v GIT a dýchacím systému
Typické pro EBC – projevy onemocnění se mohou lišit i v rámci jedné rodiny
Rozlišujeme tři formy – simplex, junkční a dystrofickou, z nichž každá má několik podtypů
![Page 5: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/5.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
EB SIMPLEX → rovina štěpení epidermální - uvnitř epidermis jako následek cytolýzy
Je nejběžnější forma onemocnění
Puchýře a rány na rukou a nohou
Je popsána jako nejslabší, neboť kůže nezjizví, ale není možné podceňovat každodenní bolest a omezení
![Page 6: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/6.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
EB JUNKČNÍ (ATROFICKÁ ) → štěpení uvnitř lamina lucida (v oblasti dermoepidermální junkce)
Junkční forma EB má několik podtypů, které se liší svou závažností
Bývají postiženy i průdušky a hrtan
Těžký typ junkční formy EB obvykle končí smrtí dítěte během prvních měsíců života
![Page 7: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/7.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
EB DYSTROFICKÁ → dochází ke štěpení těsně pod lamina densa v oblasti kotvících fibril (subepidermálně)
Dystrofická forma EB může mít různé projevy
Patří mezi nejzávažnější a velice omezuje běžný život člověka
![Page 8: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/8.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) - terapie Obecně - antiseptika, lokální
antibiotika, krytí, zvláčňující krémy, pohodlná obuv, minimum švů, volné bavlněné prádlo
EBS – v rodinách vlastní zkušenosti, jak předejít provokujícím vlivům, autosomálně dominantní dědičnost, rodiče předávají dětem vlastní specifické způsoby terapie
EBJ – obecné zásady lokální terapie stejné jako u ostatních, generalizované formy onemocnění se ošetřují snadněji než EBD
![Page 9: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/9.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) - terapie
EBD – nejnáročnější péče, zahrnuje péči o kůži, prevenci a léčbu komplikací např.
Srůsty prstů → existuje možnost operace - plastická chirurgie – odseparování
Poranění sliznice GIT → tekutá a kašovitá strava
Infekce v dutině ústní → kazivost chrupu, poškozené dásně
Sideropenické anémie → ztráta Fe vlivem krvácení aj.
![Page 10: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/10.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
Procentní zastoupení tří skupin EBC
SEB 46%
JEB 10%
DEB 44%
dystrofická simplex
junkční
![Page 11: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/11.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody Biopsie kůže pacienta
provedena raznicí (punch biopsy) velikosti asi 4 mm
Vzorek ihned po dodání ve vlhké komůrce zmražen v propanu chlazeném tekutým dusíkem a uchován v suchém ledu v mrazničce
![Page 12: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/12.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody Zhotoveny kryostatové řezy Metodou nepřímé IMF lze
prokázat antigenní komponenty v oblasti dermoepidermální junkce
Inkubace s normálním sérem Inkubace s primární neznačenou
Ab Inkubace se sekundární Ab
konjugovanou s fluoresceinem (FITC)
Hodnocení vždy s pozitivní a negativní kontrolou ve fluorescenčním mikroskopu, dokumentace každého případu
pacientkontroly
![Page 13: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/13.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody Inkubace s normálním
sérem zvířete, ze kterého je získána sekundární značená protilátka
Například jestliže použijeme jako sekundární protilátku - koza anti králík IgG - FITC,
zvolíme normální kozí sérum k blokaci nespecifických vazeb
Inkubace probíhá 20 minut ve vlhké komořeAnti králík IgG
FITC
![Page 14: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/14.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody
Inkubace s primární protilátkou ředěnou pufrem TRIS/HCl, pH 7,2 – 7,4
Použita myší, krysí a kozí primární protilátka
Čas a konkrétní ředění je uvedeno v tabulce
Při použití vlhké komory jsme inkubovali za pokojové teploty
![Page 15: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/15.jpg)
Protilátka Protilátka anti-anti-
ImunizovaImunizované zvířené zvíře
Ředění Ředění protilátky - protilátky - μl/100μl μl/100μl TRIS/HClTRIS/HCl InkubaceInkubace
BPAg 1BPAg 1 kozakoza 5/1005/10017h, v ledničce 17h, v ledničce při 4°Cpři 4°C
BPAg 2BPAg 2 kozakoza 5/1005/10017h, v ledničce 17h, v ledničce při 4°Cpři 4°C
Cytokeratin Cytokeratin 55 myšmyš 1/1001/100
60min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Cytokeratin Cytokeratin 1414 myšmyš 3/1003/100
60min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Cytoretatin Cytoretatin 10 10 myšmyš 1/1001/100
40min, vlhká 40min, vlhká komorakomora
Integrin α6Integrin α6 krysakrysa 2/1002/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora
Integrin β4Integrin β4 myšmyš 2/1002/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora
Kolagen IVKolagen IV myšmyš 1/1001/10060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Kolagen VIIKolagen VII myšmyš 1/50,1/100,1/2001/50,1/100,1/20060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Laminin 5Laminin 5 myšmyš 3/1003/10040min, vlhká 40min, vlhká komorakomora
PlectinPlectin kozakoza 1/1001/10060min, vlhká 60min, vlhká komorakomora
Epidermolysis bullosa congenita
(EBC) – materiál a metody
![Page 16: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/16.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody Inkubace se sekundární protilátkou
konjugovanou s FITC Pro krysí primární protilátku
používáme koza anti- krysa IgG-FITC Pro kozí primární protilátky
používáme osel anti-koza IgG-FITC Pro myší primární protilátky koza
anti-myš IgG-FITC Ředěno pufrem TRIS/HCl pH 7,2 – 7,4 Inkubace ve vlhké komoře za pokojové
teploty
Ig GFITC
Ig GFITC
Kozí primární protilátka
Krysí a myší
primární protilátka
![Page 17: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/17.jpg)
Sekundární Sekundární protilátkaprotilátka
Ředění v µ/100µl pufru Ředění v µ/100µl pufru TRIS/HClTRIS/HCl Čas inkubace Čas inkubace
Koza anti-krysa Koza anti-krysa IgG FITCIgG FITC 2/1002/100
120 min, vlhká 120 min, vlhká komorakomora
Koza anti-myš IgG Koza anti-myš IgG FITCFITC 1/1001/100
40 min, vlhká 40 min, vlhká komorakomora
Osel anti-koza IgG Osel anti-koza IgG FITCFITC 4/1004/100
120 min, vlhká 120 min, vlhká komorakomora
Epidermolysis bullosa Epidermolysis bullosa congenita congenita
(EBC) – materiál a metody(EBC) – materiál a metody
![Page 18: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/18.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC) – materiál
a metody
Důkladný oplach destilovanou vodou
Zamontování do DAPI – fluorochrom, váže se na DNA, RNA
Hotové preparáty lze uchovávat v lednici, dle našich zkušeností i po měsíci lze ještě prohlížet
Jádra buněk označena DAPI
![Page 19: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/19.jpg)
Lamina dnesa
Lamina lucida
Cytoskelet
Desmosom CK5,CK 14
BPAg1,Plectin
BPAg2, integriny
Laminin 5
Kolagen IV Kolagen VII
Hemidesmosom
Bazální keratinocyt
Kotvící destička
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
CK 5, CK 14 lLaminin 5
Kolagen VII
Procentní zastoupení tří skupin EBC
SEB 46%
JEB 10%
DEB 44%
![Page 20: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/20.jpg)
Epidermolysis bullosa simplex
snížená nebo chybějící reakce s PL proti CK5 a CK14, mutace v genech pro CK5 nebo CK14
BPAg 1, BPAg 2, laminin 5, kolagen IV v bázi puchýře, nezměněné pozitivní reakce
drobné zbytky bazálních keratinocytů jsou prokazatelně i v bázi puchýře, lze dokázat protilátkami Anti-CK MNF 116 (obsahuje keratiny 5, 6, 8, 18) a Anti-CK HMW (high molecular weight, CK 1, 5, 10, 14)
![Page 21: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/21.jpg)
Epidermolysis bullosa simplex
Pacient, CK 5, fragmentybazálních keratinocytů
Pozitivní kontrola,CK 5
![Page 22: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/22.jpg)
Epidermolysis bullosa junkční
kolagen IV, kolagen VII v bázi puchýře, pozitivní nezměněná reakce
BPAg 1, CK 1, 5, 10, 14 nezměněná pozitivní reakce
reakce s lamininem 5 (GB3) je zeslabena nebo chybí úplně, mutace v genu pro laminin 5
BPAg 2 ve stropu puchýře
![Page 23: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/23.jpg)
Epidermolysis bullosa junkční
Pozitivní kontrolaLaminin 5
Pacient, EBJ,Laminin 5 chybí
![Page 24: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/24.jpg)
Epidermolysis bullosa junkční
Pacient, kolagen VII v bázi puchýřePacient, BPAg 2 ve stropu puchýře
![Page 25: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/25.jpg)
Epidermolysis bullosa junkční
Pacient, kolagen IV v bázi puchýřePacient, junkční puchýř, BPAg1
![Page 26: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/26.jpg)
Epidermolysis bullosa dystrofická
EBD - snížená nebo chybějící rekce s PL anti-kolagenVII, mutace v genu pro kolagen VII (COL7A1)
všechny Ag (antigeny) keratinocytů a Ag lamina lucida (laminin 5 (GB3), α6β4 integrin) pozitívní nezměněná reakce
Kolagen IV (lamina basalis), BPAg1, laminin 5 ve stropu puchýře
![Page 27: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/27.jpg)
Epidermolysis bullosa dystrofická
Pozitivní kontrolaKolagen VII
Pacient EBD Chybí kolagen VII
![Page 28: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/28.jpg)
Epidermolysis bullosa congenita (EBC)
Antigenní mapování slouží k navedení molekulárně-genetické laboratoře ve vyšetřování genetických změn a přesnější subtypizaci onemocnění
![Page 29: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/29.jpg)
ZDROJE INFORMACÍ
Buček, J., Bučková, H., Epidermolysis bullosa congenita, IDVPZ, Brno, 2000
Internetové stránky organizace DEBRA www.debra-cz.org
Internetové stránky Univerzity Groningen, http://dissertations.ub.rug.nl/faculties/medicine/2006/a.m.g.pasmooij/
Weedon, D.: Skin Pathology. Churchill, Livingstone, Edinburgh, 1997, s. 17-28
J.D. Fine, L.T.: Smith,Nonmolecular Diagnostic Testing of Inherited Epidermolysis Bullosa. chapter 3, s.60-73
![Page 30: Antigenní mapping v nemolekulární diagnostice epidermolysis bullosa congenita](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062502/56815a03550346895dc74f73/html5/thumbnails/30.jpg)
Děkujeme za pozornost