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ANÁLISE MICROBIOLÓGICA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA E ALIMENTOSDE ÁGUA E ALIMENTOS
Análise de alimentosAnálise de alimentos
Utilização de técnicas microbiológicas:
Pesquisar presença de microrganismos;
Estimar número de microrganismos;
Identificar os microrganismos.
Microrganismos estressados
A detecção é feita pelo cultivo dos microrganismos em meios seletivos e não seletivos.
Os microrganismos isolados de alimentos geralmente são submetidos a condições de injúria, tais como aquecimento, refrigeração, conservantes, congelamento, desidratação, acidificação, salga, que irão afetar as células presentes.
Efeitos sobre os microrganismos:
aumento da fase LAG maior sensibilidade aos agentes do
meio de cultivo lesão na membrana citoplasmática lesão em enzimas do ciclo de Krebs deterioração de ribossomas lesão do DNA perda de componentes celulares incapacidade de multiplicação
Etapas da análise microbiológica
Amostragem;
Preparação da amostra;
Contagem de microrganismos;
Isolamento e identificação de microrganismos;
Sorologia.
AmostragemAmostragem
Especificação de dados;
Evitar contaminação com outros alimentos;
Transporte: alimentos perecíveis: 0-4ºC;alimentos congelados:
congelados;
Análise no máximo em 36 horas.
Preparação da amostraPreparação da amostra
Homogeneização da amostra;
Cuidado: velocidade e tempo ⇒ evitar aquecimento da amostra e danos aos microrganismos;
Melhor método: Stomacher.
Contagem de MicrorganismosContagem de Microrganismos
MÉTODOS DIRETOS:
1) Contagem em placa; Método de filtração: Método do Número Mais Provável Contagem direta ao microscópio: Contador Coulter:
MÉTODOS INDIRETOS:
1) Peso seco
2) Medida de turbidez
3) Atividade metabólica
4) Microcalorimetria
Contagem de MicrorganismosContagem de Microrganismos
Isolamento e Identificação de Isolamento e Identificação de MicrorganismosMicrorganismos
Características morfológicasCaracterísticas morfológicas
Morfologia bacteriana = diz pouco sobre as células;
Útil na identificação de algumas bactérias = endoesporos, flagelos, cápsula
Coloração diferencialColoração diferencialColoração de Gram;
GP GN
Coloração de Ziehl-Neelsen;
Coloração de esporos.
COLORAÇÃO DE GRAM
Cora em púrpura Cora em púrpura
Cora em vermelhoPermanece púrpura
Contratingir com Safranina
BACTÉRIASGRAM-POSITIVAS
BACTÉRIASGRAM-NEGATIVAS
Células fixadas à lâmina
Corante principal cristal violeta
Mordente:solução de iodo
Permanece púrpura Permanece púrpura
Permanece púrpura
Descorar com:álcool ou acetona
Testes bioquímicosTestes bioquímicosAtividade metabólica = utilizada para diferenciar bactérias;
Bactérias intimamente relacionadas = separadas por testes bioquímicos;
Reduzir o tempo:Uso de técnicas seletivas:Utilização de meios seletivos e diferenciais
e diferentes condições de cultivo;Utilização de testes rápidos.
Meios seletivos e diferenciais
EMB = identificação de E. coli
Ágar sangue = halo de hemólise
Meios seletivos e diferenciais
Ágar Baird Parker = identificação de S. aures
Ágar MYP = identificação de B. cereus
Testes rápidos = API 20E
Testes rápidos = tubos de compartimentos
Testes rápidos
Contagem de Microrganismos Aeróbios Contagem de Microrganismos Aeróbios MesófilosMesófilos
Pesar a amostra;
Fazer as diluições;
Plaqueamento: Superfície; Profundidade;
Meio utilizado: PCA
Preparação da amostra Homogeneização e Diluição
1mL
10-1
225mL H2O peptonada 0,1%
10-2
9mL H2O pept. 0,1%
10-3
9mL H2O pept. 0,1%
1mL25 g
Método de Profundidade
Método de Superfície
Resultados em placas
Contagem de Bactérias Aeróbias Contagem de Bactérias Aeróbias Mesófilas: Mesófilas: Método ProfundidadeMétodo Profundidade10-1 10-2 10-3
Ágar Padrão de Contagem (PCA)
1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Contagem e Identificação de Contagem e Identificação de Staphylococcus aureus: Staphylococcus aureus: Método SuperfícieMétodo Superfície
10-1 10-2 10-3
Ágar Baird Parker (BP)
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
Diluições
AN
Baird-Parker
IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureusTESTE CATALASE
H2O2 H2O + O2
H2O2
AN
CATALASE
BOLHAS
ESFREGAÇO
IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureusTESTE DNase e COAGULASE
DNase
COAGULASE
Protrombina Trombina
Fibrinogênio Fibrina
COAGULASE
Pesquisa de Pesquisa de SalmonellaSalmonella sp. sp.
H2O peptonada 1,0 %
PRÉ-ENRIQUECIMENTO
Rappaport Vassiliadis
Caldo tetrationato
ENRIQUECIMENTO SELETIVO
HE SS XLD HE SS XLD
PLAQUEAMENTODIFERENCIAL
Provas Bioquímicas
35 - 37ºC/24hs
IDENTIFICAÇÃO
Importância da Análise de ÁguaImportância da Análise de Água
Lavagem de matéria-prima;
Lavagem de utensílios;
Lavagem de superfícies;
Lavagem de carcaças;
Resfriamento;
Composição dos alimentos.
Qualidade da águaQualidade da água
Garantida do mesmo modo que a matéria-prima ou ingrediente;
Programa de garantia de qualidade = fonte, tratamento, distribuição e armazenamento dentro da fábrica;
Inspeção = padrões internos e legais = Portaria 518 de 2004
Frasco limpo e estéril;Sistema de distribuição = esperar 2 a 3 minutos, abrir o frasco, coleta a água e fechar o frasco;Rios, lagos, fontes = cuidado com água parada e material flutuante;Água com cloro = tiossulfato de sódio;Análise = máximo 30 horas após coleta.
Coleta de Água
Análise da água
Não deve ser baseada no isolamento e identificação de MOs patogênicos;
Microrganismos indicadores:Contagem em placas;Coliformes totais;Coliformes fecais.
Análise Microbiológica
Contagem de Coliformes totais e fecais:
Técnica do Número Mais Provável (NMP);
Técnica da membrana filtrante;Técnica do Collilert (Teste do ONPG e
MUG).
COLIFORMES TOTAIS
COLIFORMES TERMOTOLERANTES
IDENTIFICAÇÃO DE E. coli
Técnica do NMP
Número Mais Provável de Coliformes Totais Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes (Fecais)e Termotolerantes (Fecais)
Lauril Sulfato Triptose (LST)
10mL
10mL LST
1mL
9mL LST
0,1mL
9,9mL LST
35-37ºC/24hs
Coliformes Totais
Caldo Verde Brilhante
Coliformes Termotolerantes
Caldo Escherichia coli
Provas Bioquímicas
Agar Eosina Azul de Metileno
44,5-45,5ºC/24hs
Membrana Filtrante
Vantagem de cada método
Filtração:Rápido;Exato;Método de esterilização a frio;
NMP:Recupera microrganismos injuriados;Mais barato;Evita falso negativo.
Desvantagem de cada Método
Filtração:Maior custo;Risco de perda de microrganismos, meio
seletivo;Só pode ser utilizado para água e
alimentos líquidos;
NMP:Demorado;Trabalhoso;
Colilert
Método Rápido – MUG e ONPG
MUG e ONPG - Resultado
Meios utilizados – CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS
PCA (ÁGAR PADRÃO DE CONTAGEM)Triptona 5,0gExtrato de levedura 2,5gDextrose 1,0gÁgar15,0gÁgua destilada 1,0L
CALDO RAPPAPORT - VASSILIADISTriptonaCloreto de magnésioCloreto de sódioVerde malaquitaFosfato de potássio
PESQUISA DE Salmonella sp.
CALDO TETRATIONATOProteose peptonaCarbonato de cálcioSais biliaresTiossulfato de sódioÁgua destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
AGAR Hectoen Enterico
Proteose peptona, Extrato de levedura Salicina, Sais biliares Lactose, Sacarose Tiossulfato de sódio Citrato férrico Cloreto de sódio Azul de bromotimol Fuccina ácida Ágar Água destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
AGAR SS (Salmonella/ Shigella)
Extrato de carne, Proteose peptona Citrato de sódioSais biliaresTiossulfato de sódioCitrato férricoVermelho neutroLactoseÁgarÁgua destilada1,0L
PESQUISA DE Salmonella sp.
ÁGAR CITRATO DE SIMMONSCitrato de sódio Fosfato de amônia Sulfato de manganêsAzul de bromotimolCloreto de sódioFosfato dipotássioÁgarÁgua destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
TSI (TRIPLE SUGAR IRON ÁGAR) Extrato de carne, Extrato de levedura Peptona, Proteose peptona Dextrose Lactose Sacarose Sulfato ferroso Tiossulfato de sódio Cloreto de sódio Vermelho de fenol Ágar Água destilada1,0L
PESQUISA DE Salmonella sp.
CALDO LISINAPeptona de gelatinaGlicoseExtrato de leveduraLisinaPúrpura de bromocresolÁgua destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
ÁGAR URÉIAPeptonaUréiaDextroseCloreto de sódioFosfato monopotássioVermelho de fenolÁgua destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
ÁGAR MIO (MOTILIDADE, INDOL, ORNITINA)Extrato de leveduraOrnitinaPeptonaPúrpura de bromocresolDextroseTriptonaAgarÁgua destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
CALDO VERMELHO DE FENOL Proteose peptona Extrato de carneCloreto de sódioVermelho de fenolÁgua destilada
PESQUISA DE Salmonella sp.
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
BP - BAIRD PARKER AGAR BASE Triptona, Extrato de carne, Extrato de levedura Cloreto de lítio Piruvato de sódio Glicina Ágar Água destilada
Após esterilização, adicionar: Emulsão de gema de ovo, salina Telurito de sódio
ÁGAR DNASEPeptona caseínaÁcido desoxirribonucléicoCloreto de sódioAgarÁgua destilada
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
Teste de Catalase
CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSE (LST)TriptoseCloreto de sódioLactoseLauril sulfato de sódioFosfato de potássio dibásicoFosfato de potássio monobásicoÁgua destilada
CALDO VERDE BRILHANTE BILE 2%PeptonaBile de boiLactose Verde brilhanteÁgua destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
CALDO Escherichia coli (EC)TriptoseCloreto de sódioLactoseSais biliaresFosfato de potássio dibásicoFosfato de potássio monobásicoÁgua destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (EMB)PeptonaLactose SacaroseFosfato de potássio dibásicoAzul de MetilenoEosina amarelaÁgarÁgua destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
ÁGAR CITRATO DE SIMMONSCitrato de sódio Fosfato de amônia Sulfato de magnésioAzul de bromotimolCloreto de sódioFosfato dipotássioÁgarÁgua destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
CALDO TRIPTONA
TriptonaÁgua destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
ÁGAR MOTILIDADE TripticaseFosfato dissódicoGlucoseExtrato de leveduraÁgarÁgua destilada
CALDO VM/VPPeptonaFosfato dipotásicoGlicoseÁgua destilada
EXAME MICROBIOLÓGICO DA ÁGUA
Interpretação dos resultadosProdutos em condições sanitárias satisfatórias:
b. PRODUTO OU LOTE DE ACORDO COM OS PADRÕES LEGAIS VIGENTES.Produtos em condições sanitárias insatisfatórias:
d. PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR.....
e. PRODUTO OU LOTE IMPRÓPRIO PARA CONSUMO HUMANO POR APRESENTAR....